CN107022604B - 猪ntf3启动子区snp作为公猪繁殖性状分子标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及猪NTF3启动子区SNP作为公猪繁殖性状分子标记与应用。该分子标记克隆自猪NTF3基因的5’侧翼启动子片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的第92位碱基处分别存在一个A/G和G/A的等位基因突变，该等位基因的突变引起MvaI‑RFLP的多态性。利用该标记对大白猪和杜洛克猪的公猪繁殖性状进行了关联分析。所述繁殖性状包括公猪精子活力和精子密度性状。本发明还公开了该标记的分型检测方法，为公猪繁殖性状选择提供了新的标记。可应用于公猪繁殖性状评测和种公猪繁殖性能的遗传改良。

Description

猪NTF3启动子区SNP作为公猪繁殖性状分子标记与应用

技术领域

本发明涉及猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及一种猪NTF3启动子区SNP作为公猪繁殖性状分子标记与应用。本发明与猪育种和标记辅助选择技术领域相关

背景技术

分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子标记直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织各个发育阶段均可检测到，不受季节环境限制；多态性丰富，数量多；大多数为共显性，能区别纯合体和杂合体。因此，分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩短世代间隔。利用分子标记辅助选择进行分子育种与常规育种相结合，可以加快品种改良的速度。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象，它具体是指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区SNP(coding-region SNP，cSNP)、基因周边SNP(perigenic SNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)三类。SNP在DNA分子上分布不均匀，在非转录区SNP频率要高于转录区SNP频率，这可能是受进化中选择的压力影响。转录区的SNP一般与蛋白的表达有关，而非转录区的SNP则可以调控基因的表达。所以这两类SNP不仅都可以作为分子标记，还可能与一些动物的生产性状有直接关系。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，位于结构基因5′端上游区，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它。因此，研究功能基因5’侧翼序列启动子中的SNP可能有更重要的生物学功能，能够影响基因的表达。

神经营养因子3(Neurotrophin 3，NTF3)是神经营养因子家族的3个重要成员之一，NTF3在体外及离体的情况下，具有正常神经元的发育、存活及其功能的重要作用(BardeYA 1994)。在有关大鼠的研究中，发现当大鼠脊髓损伤后，NTF3基因表达增多，说明NTF3可能在脊髓损伤的早期修复中发挥作用(罗伟等2006)，同样在大鼠的研究中，NTF3基因能在支持细胞中表达，能够诱导细胞从中肾迁移到睾丸中，这种细胞迁移是睾丸索早期形态学形成的一个关键过程。NTF3启动子可以与雄性性别决定基因SRY在体内外相互作用，而SRY能够启动睾丸发育的过程(Clement et al 2011)。Barrionuevo等(2012)报道，NTF3基因参与支持细胞的表达和分化过程，具有促进和维护睾丸的功能，当NTF3表观突变(甲基化)时，可能会导致雄性不育。我们前期研究表明NTF3在不同品种以及不同发育时期的猪睾丸中差异表达，主要定位在曲细精管壁的精原细胞中，同时在成熟睾丸的精母细胞和精子细胞中也有表达，推测NTF3可能在雄性动物的性成熟和精子发生过程中发挥重要作用。但有关公猪NTF3启动子区SNP的研究至今还未见报道。因此在分子水平上研究公猪NTF3基因启动子区的SNP，分析其与公猪繁殖性状的关系，具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于克隆一个涉及公猪繁殖性状的分子标记，所述的分子标记克隆自猪NTF3基因的5’侧翼启动子片段(序列长度为177bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1(杜洛克猪)或SEQ ID NO:2(梅山猪)所示，在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的第92位碱基处分别存在一个A/G或G/A的等位基因突变，这些等位基因的突变引起MvaI-RFLP的多态性。上述SNP位点如图2所示。通过对2个猪种的上述序列进行Cluster W比对，寻找SNP位点，建立相应的SNP分型方法，分析其与公猪繁殖性状的关系，利用该标记对大白猪和杜洛克猪的公猪繁殖性状进行了关联分析。所述繁殖性状包括公猪精子活力和精子密度性状。

具体地，本发明通过以下技术方案实现：

选择中国地方猪种梅山猪和外来猪种杜洛克猪为实验材料，从猪血液中提取基因组DNA，以猪NTF3基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计了如下引物：

正向引物F：5’CTGGACCTCACAGGGGATG 3’，

反向引物R：5’CGATGGACACCTTGTTCACC 3’。

利用该引物进行PCR扩增，通过PCR产物回收、克隆、测序后，再利用Cluster W进行序列比对。

申请人通过筛选，得到一种与公猪精子活力、精子密度性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

ctggacctcacaggggatgctctccaaggatggtggtgtctgctctctcctcctcgccttcctgggatcctcaggctcac gtagctggtccR(a/g)ggatgacacgcgcccagctgccactgcccgctgctaacacctgtgtctccttttcagctcttacaggt gaacaaggtgatgtcca，

该序列的的92位碱基处的R是A或G，该突变导致MvaI酶切位点的改变，并引起MvaI-RFLP多态性；

或所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：

ctggacctcacaggggatgctctccaaggatggtggtgtctgctctctcctcctcgcctt cctgggatcctcaggctcacgtagctggtccR(g/a)ggatgacacgcgcccagctgccactgcc cgctgctaacacctgtgtctccttttcagctcttacaggtgaacaaggtg atgtcca，

该序列的的92位碱基处的R是G或A，该突变导致MvaI酶切位点的改变，并引起MvaI-RFLP多态性。

申请人设计一种克隆猪NTF3基因5’侧翼序列和上述分子标记的引物对，所述引物对的的DNA序列如下所示：

正向引物F：CGGTGTTGATGGGTTAGG，

反向引物R：TTGGAGCCACGGAGATAC。

本发明的分子标记在公猪精子活力、精子密度性状选择中的应用。

本发明提供了检测上述序列的92位碱基处A/G变异的MvaI-RFLP基因型分型方法。

进一步，本发明提供了利用MvaI-RFLP方法确定不同基因型个体与公猪繁殖性状之间的相关关系的关联分析的应用。

本发明还公开了该标记的分型检测方法，为公猪繁殖性状选择提供了新的标记。可应用于公猪繁殖性状评测和种公猪繁殖性能的遗传改良。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆到的杜洛克猪NTF3基因5’侧翼启动子区的核苷酸序列(即本发明筛选得到的分子标记之一)。序列长度为177bp。

序列表SEQ ID NO:2是克隆到的梅山猪NTF3基因5’侧翼启动子区的核苷酸序列(即本发明筛选得到的另一个分子标记)。序列长度为177bp。

图1：是杜洛克猪和梅山猪NTF3基因5’侧翼启动子区177bp片段的扩增条带。附图标记说明：图中泳道：M为DS2000Marker，其他泳道为猪NTF3基因5’侧翼启动子区177bp片段的扩增条带。

图2：是杜洛克猪和梅山猪NTF3基因5’侧翼启动子区177bp序列的比对结果和SNP位点。

图3：是猪NTF3基因5’侧翼区PCR-MvaI-RFLP检测结果。琼脂糖浓度为3﹪。附图标记说明：泳道M为50bp ladder，泳道1、5为BB基因型，泳道2、3、4、6、7为AA基因型，泳道8、9为AB基因型。

图4：是本发明其中一个分子标记的核苷酸直观序列。即SEQ ID NO：1序列中显示的SNP位点，在SEQ ID NO:1所述序列的的92位碱基处的“R”存在一个A/G的突变，该突变导致MvaI酶切位点的改变，并引起MvaI-RFLP多态性。

图5：是本发明中另一个分子标记的核苷酸直观序列。即SEQ ID NO：2序列中显示的SNP位点，在SEQ ID NO:2所述序列的的92位碱基处的“R”存在一个G/A的突变，该突变导致MvaI酶切位点的改变，并引起MvaI-RFLP多态性。

具体实施方式

实施例1利用苯酚抽提法提取公猪精液基因组DNA

将现场所采公猪(来自中国，广西扬翔猪基因科技有限公司下属的亚计山猪人工授精中心，该公主为常规报道的美系杜洛克猪、大白猪品种，下同)新鲜精液注入10ml离心管中，于-20℃冷冻保存。在0℃以下冷链运输至实验室，然后水浴解冻，提取公猪精液基因组DNA。具体步骤如下：

(1)取1ml精液，置于一支2ml离心管中，5000rpm 7min离心，弃上清。

(2)每支离心管加入1000ul精子洗涤液或生理盐水，反复吹打混匀，12000rpm7min离心，弃上清。

(3)重复以上洗涤步骤1～2次。

(4)每支离心管加入1000ul精子裂解液和15～20ul蛋白酶K(10mg/ml)，充分吹打混匀，55℃消化过夜(约12h左右)。

(5)每支离心管加入样品等体积约1000ul苯酚，剧烈颠倒震荡10min使两相充分混匀，直至形成乳白色偏黄的乳浊液，4℃12000rpm离心15min，转移上清液至另一干净离心管；离心后液体分3层，下层淡黄色液体为苯酚，中层乳白色的为蛋白质，上层清亮上清液溶有DNA。吸取上清液时缓慢吸取，小心不要吸到蛋白质，可以事先准备好剪掉尖端的蓝色移液枪头以减少机械剪切力，并防止搅动液面。由于精液提取DNA蛋白质较多，容易蛋白污染，以上苯酚抽提步骤根据情况可以重复1～2次。

(6)分别加入上清液等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，充分颠倒震荡10min，4℃12000rpm离心10min，转移上清液至另一干净离心管。

(7)往上清液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24:1)，重复上述抽提步骤。

(8)向最后获得的上清液中加入2.5倍体积(约1300ul)的无水乙醇(-20℃过夜预冷)和十分之一体积(约60ul)的醋酸钠(NaAC)(pH 5.2)以沉淀DNA，颠倒晃动离心管，若提取成功，应能看到絮状成团的DNA分子。

(9)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水溶解DNA。

(10)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测DNA提取质量。

实施例2:公猪NTF3 5’侧翼启动子区特异DNA片段的获得及SNP检测方法的建立

选择外来血缘猪“杜洛克猪”和中国地方猪种“梅山猪”(来自华中农业大学试验猪场，为常规报道的品种)为试验材料，以猪NTF3基因(GeneBank登录号DQ917625.1)的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物：

正向引物F：5’CTGGACCTCACAGGGGATG 3’

反向引物R：5’CGATGGACACCTTGTTCACC 3’

分别以杜洛克猪(国外血缘猪品种)和梅山猪(中国地方猪品种)血液基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增,结果见图1。

PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件见表2所示

表2 PCR反应条件

PCR产物经回收、克隆后，进行序列测定。测序工作由北京奥科鼎盛生物有限公司完成。经Cluster W比对分析，序列比对结果见图2。上述片段大小为177bp，在该序列的92为碱基处存在A/G变异，该等位基因的突变引起了MvaI酶切位点多态性。

取PCR扩增产物10μl，加入限制性内切酶MvaI 1μl，10×bufferR 2μl，ddH₂O 7μl37℃酶切。酶切产物经3﹪琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。酶切后片段分为3种基因型：AA基因型有114bp、63bp两条带；GG基因型有85bp、63bp和29bp三条带；AG基因型有114bp、85bp、63bp和29bp四条带。结果如图3所示。

实施例3：本发明克隆的分子标记在公猪繁殖性状的关联分析中的应用

基因型频率和等位基因频率的统计

基因型频率：是指一个群体中特定基因型占群体内全部基因型的比例。基因型频率的统计方法为：基因型频率＝该基因型个体数/测定群体总数

等位基因频率：是指一个群体中某一基因占该位点上总基因的相对比例。等位基因频率的统计方法：该基因纯合子基因型频率+含有该基因的杂合子基因型频率/2

表3 NTF3启动子区SNP在3个品种猪中基因型频率和等位基因频率

为了确定猪NTF3基因5’侧翼启动子区SNP与公猪繁殖性状表型差异是否相关，选择了中国，广西扬翔猪基因科技有限公司下属的亚计山猪人工授精中心公猪群中278头公猪为试验材料，其中杜洛克猪206头、大白猪72头，采用PCR-MvaI-RFLP方法进行多态性检测，进行基因型频率和等位基因频率的统计，并分析猪NTF3基因5’侧翼启动子区SNP不同基因型与公猪繁殖性状的相关关系。采用SAS统计软件glm程序进行单标记方差分析，模型如下：

模型Y_ijkl＝μ+G_i+P_j+A_k+S_l+e_ijkl

Y_ijkl为公猪繁殖性状值，μ为群体均值，G_i为基因型效应，P_j为家系效应，A_k为年龄效应，S_l为季节效应，e_ijkl为随机残差，并假定服从N(0，S²)。文中关联分析数据采用最小二乘均值±标准误表示。

表4杜洛克公猪中NTF3基因不同基因型与公猪繁殖性状的统计分析

表4说明：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)；基因效应^*表示p<0.05，^**表示p<0.01

由表3可知，在精子活力方面，AA基因型公猪活力显著高于GG基因型(p<0.05)，杂合子AG基因型和和两个纯合子基因型之间均无明显差异，在此项分析中加性效应是显著的，说明A等位基因为有优势的等位基因。而在精子密度方面，AA基因型和AG基因型公猪密度显著大于GG基因型公猪(p<0.05)，且加性效应也是显著的，说明A等位基因为有优势的等位基因。在精子活力和精子密度方面，AA型均显著高于GG型，说明在杜洛克猪中，NTF3基因纯合子AA基因型为优势的基因型。

表5大白猪中NTF3基因不同基因型与公猪繁殖性状的统计分析

由表5可知，在睾丸体积方面，纯合子AA型公猪显著大于杂合子AG型(P<0.05)；在射精量方面，AA基因型公猪均值大于AG基因型，但无显著差异(P>0.05)；在精子活力方面，AG基因型显著高于AA基因型(P<0.05)；在精子密度方面，AA基因型和AG基因型均显著大于GG基因型，(P<0.05)，纯合子AA基因型和杂合子AG基因型之间无显著差异。

Claims (1)

1.一种适用于非诊断目的的公猪精子活力、精子密度性状关联分析的分子标记在猪分子标记辅助选育中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

ctggacctcacaggggatgctctccaaggatggtggtgtctgctctctcctcctcgccttcctgggatcctcaggctcac gtagctggtccRggatgacacgcgcccagctgccactgcccgctgctaacacctgtgtctccttttcagctcttacaggt gaacaaggtgatgtcca，

该序列的92位碱基处的R是A或G，该突变引起MvaI-RFLP多态性。

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