JP5897704B2 - ブラキスパイナ突然変異の検出 - Google Patents

Description

発明の背景

技術分野
本発明は、常染色体劣性遺伝による遺伝的欠損であるブラキスパイナに罹患しているか、またはそのキャリアであるウシの検出のための方法に関する。本発明は、ウシがブラキスパイナに罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムＤＮＡまたはそのＲＮＡを分析することにより判定するための方法を提供する。本方法は、ウシ由来のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含有する材料のサンプルを得ること、およびブラキスパイナ症候群を引き起こす突然変異である、ウシＦＡＮＣＩ遺伝子のエキソン２５、２６および２７を欠く３．３Ｋｂ（ｂＴａｕ４．０ゲノムビルドのヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番）の欠失の存在に関して前記核酸の遺伝子型を判定することを含む。

背景技術
家畜における遺伝子欠損に対するマーカー利用選抜(marker assisted selection)
家畜において所望の特徴を鋭意選抜すると、多くの場合、ますます同系交配が進み、新規な劣性欠損の出現の原因となる。ホルスタイン−フリージアン牛におけるこのような勃発の例として、ウシ白血球接着不全症（ＢＬＡＤ）（１）および複合脊椎形成不全症（ＣＶＭ）（２）がある。このような欠損からのウシの死亡率は、重大な経済損失を招き、健康上の問題を浮上させる。

ほとんどの遺伝欠損は常染色体劣性であり、一般に必須遺伝子における機能欠失型突然変異（記号「ｄ」）によるものである。健康であるが、１コピーの突然変異を有する動物（遺伝子型「＋／ｄ」、すなわち「キャリア」）間の交配は、罹患型となる同型接合性突然変異動物（遺伝子型「ｄ／ｄ」）を２５％生じる。＋／ｄキャリア動物の同定を可能とする診断検査を用いれば、キャリア動物を選別し、それにより前記突然変異を除去し、従って集団から排除すること、またはキャリアの父牛と母牛間の「リスクのある」交配を避けることができる。最近、極めて有効なゲノムツールが開発されたことで、今や、原因となる「ｄ」突然変異の分子レベルでの迅速同定が可能である（３）。それが同定されれば、当業者に周知の一定範囲の一般的なＤＮＡに基づく技術を用いて有効な診断検査を開発することができる。

ブラキスパイナ症候群および遺伝子座
最近（４）、ブラキスパイナ症候群と呼ばれる新たな遺伝子欠損が、ホルスタイン−フリージアン乳牛において同定された。罹患動物は重篤な体重減少、成長遅滞、脊椎の著しい短縮を伴う重篤な脊椎奇形（ブラキスパイナ）および細長い四肢を特徴とする。さらに、罹患動物は劣ったブラキグナチズム(brachygnatism)ならびに内部臓器、特に、心臓、腎臓および精巣の奇形を呈する。報告された症例は総て、父方および母方の双方で共通の先祖に遡り、常染色体劣性伝達が示唆された。

本発明者らは、これまでに、最近開発された５０Ｋ ＳＮＰアレイおよび「自己接合性マッピング」（３）と呼ばれる統計学的アプローチを用いて、ウシ第２１染色体上の２．４６Ｍｂゲノムセグメントにブラキスパイナ遺伝子座の位置を突きとめた（５）。これらの発見に基づき、本発明者らは、ブラキスパイナ遺伝子座にわたるＳＮＰマーカーのパネルに基づく「間接的」診断検査を開発した。このような間接的検査は、しばしばハプロタイプに基づく検査と呼ばれ、＋／ｄキャリア動物を検出するために使用でき、すでに使用されている。しかしながら、「ｄ」対立遺伝子を生じる疾患とＳＮＰ対立遺伝子の間の関連は完全ではないので、このような間接的検査には感受性と特異性が不足するという問題がある。同型接合＋／＋動物には誤ってキャリアとされるものがあり、また＋／ｄキャリア動物が見逃されるものもある。理想的には、原因となる突然変異の検出に基づく、従ってほぼ完全な感受性と特異性を備えた改良された診断検査が必要である。

ブラキスパイナ症候群の繁殖力への影響
本発明者らは、これまでに（５）、ブラキスパイナ突然変異を有する父牛からの精子を注入した雌牛は、受胎率（妊娠成功の結果として発情に戻らないということ）の低下、死産率の増加、および淘汰率の増加を示すことを報告した。これらの特徴は総て、受胎産物の〜４％の胚および胎児死亡率をもたらすと思われる。従って、ブラキスパイナ症候群を引き起こすことに加え、ブラキスパイナの１または複数の突然変異は、乳牛育種における最も重要な経済形質の２つである雄および雌の繁殖力に重大な影響を及ぼす。従って、適当な診断試験によってブラキスパイナ突然変異を検出できることは、ホルスタイン−フリージアン種の乳牛の繁殖力の改良に重大な影響を持つ。

上記の点から、本発明の基本的な技術的問題は、畜牛におけるブラキスパイナまたはこの疾患のキャリア状態の選択的かつ便利な診断を可能とする手段および方法を提供することであった。前記の技術的問題の解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって達成される。本発明は、畜牛においてブラキスパイナ症候群を引き起こす突然変異の特徴を初めて提供する。

よって、第１の実施形態において、本発明は、ウシ生体サンプルからブラキスパイナ症候群を検出する方法であって、ブラキスパイナを引き起こす欠失に関してポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡの遺伝子型を判定することを含んでなる方法に関する。特に、本発明は、ウシがブラキスパイナ(brachyspina)（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムＤＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ）前記ウシから得られた前記ゲノムＤＮＡを含有する生体材料のサンプルからＤＮＡを抽出する工程、
ｂ）ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）の区間における欠失に関して前記ＤＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
ｃ）前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
を含んでなる方法に関する。

図１は、ブラキスパイナ遺伝子座の概略図を表す。（Ａ）ウシ第２１染色体上にブラキスパイナ遺伝子座の位置を決定する自己接合性マッピングの結果、（Ｂ）６つのブラキスパイナ症例および３つの健常対照の、第２１染色体上の１，２６９のＳＮＰマーカーに関する遺伝子型、自己接合性の２．４６Ｍｂ領域を白黒で示す、（Ｃ）２．４６Ｍｂ領域の遺伝子内容、（Ｄ）３．３Ｋｂブラキスパイナ欠失の位置を示したＦＡＮＣＩ遺伝子の構造を示す。 図２は、ブラキスパイナ突然変異の概略図を表す。（Ａ）ウシＦＡＮＣＩ遺伝子のエキソン２５、２６および２７を欠失させる３．３Ｋｂブラキスパイナ欠失の詳細図。欠失切断点を挟み込む配列が示される。（Ｂ）ウシＦＡＮＣＩタンパク質の構造に対する３．３Ｋｂブラキスパイナ欠失の推定される影響。 図３は、ブラキスパイナ５’エキソヌクレアーゼ試験で得られた結果の例を表す。各動物を点で表し、三つのクラスターはそれぞれ＋／＋、＋／ｄ、およびｄ／ｄ動物に相当し、非鋳型対照(ＮＴＣ)をｘで表示する。

発明の具体的説明

同様に好ましくは、ウシがブラキスパイナ（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはブラキスパイナ（ＢＳ）のキャリア(carrier)であるか否かを、そのゲノムＤＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ）前記ウシからの前記ゲノムＤＮＡを含有する材料のサンプルを得る工程、
ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する工程、
ｃ）ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）間の区間における欠失に関して前記ＤＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
ｄ）前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
を含んでなる方法も好ましい。

本発明に従う用語「ウシ」とは、ボースタウルス（家畜種）(Bos taurus)由来の総ての畜牛または畜牛品種を包含する。本発明の方法の好ましい実施形態では、ウシはホルスタイン種、フリージアン種およびホルスタイン−フリージアン交配種、ブリティッシュおよび／またはオランダフリージアン種からなる群から選択される。

用語「ブラキスパイナのキャリア」とは、（父牛から遺伝したものであれ母牛から遺伝したものであれ）その染色体の一方にブラキスパイナ欠損を引き起こす突然変異を有し、他方の染色体に野生型対立遺伝子を有するウシを意味する。

本発明による用語「サンプル」または「生体サンプル」とは、前記被験ウシ由来の核ＤＮＡを含有するいずれの材料も意味する。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される生体サンプルは、血液、精子、毛根、乳汁、ならびに有核細胞を含む体液からなる群から選択される。生体サンプルとしていっそうより好ましいのは、有核細胞を含む１または複数の組織である。

よって、さらなる実施形態では、生体サンプルにおいてウシがａ）ブラキスパイナに罹患しているか否か、ｂ）ブラキスパイナを有するか否か、またはｃ）前記疾患のキャリアであるか否かを判定するための方法が提供される。

ＤＮＡの抽出／単離および精製方法は当技術分野で周知であり、本発明において適用可能である。ゲノムＤＮＡを単離するための標準的プロトコールは、とりわけ、Sambrook, J., Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1.31-1.38, 2001およびSharma, R.C., et al., A rapid procedure for isolation of RNA-free genomic DNA from mammalian cells, BioTechniques, 14, 176-178, 1993に示されている。

本発明に従う用語「ブラキスパイナ突然変異」、「ブラキスパイナ欠失」、または「欠失」とは、ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）の区間における欠失を意味する。よって、好ましい側面では、この欠失は、ウシ第２１染色体上の、ウシＦＡＮＣＩ遺伝子中のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）にわたる３，３２９塩基対（本明細書では３．３Ｋｂの欠失とも呼ばれる）を包含する。好ましい欠失は、ウシＦＡＮＣＩ遺伝子からエキソン２５、２６および２７を除去する。ブラキスパイナ突然変異／欠失は、アミノ酸８７７番でフレームシフトを引き起こして、４５１カルボキシ末端アミノ酸を２６残基長の非正統的ペプチドに置き換えると予想される。さらに、その次のエキソン２８における停止コドンはナンセンス変異依存ＲＮＡ分解を引き起こすと思われる。

本発明に従う用語「ブラキスパイナ突然変異に関して前記ＤＮＡの遺伝子型を判定する」または「ブラキスパイナ欠失に関して前記ＤＮＡの遺伝子型を判定する」とは、ＤＮＡサンプルに特定のヌクレオチド配列が存在するか否かを判定または同定するための方法を意味する。ＤＮＡサンプルにこのようなヌクレオチド配列が存在するか否かを判定するための、例えば（６）などの、当業者に公知のいくつかの方法がある。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他のいずれかの増幅法による前記突然変異を包含するＤＮＡセグメントの増幅、ならびに対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、または３’エキソヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎアッセイ）、または蛍光色素および消光剤に基づくＰＣＲアッセイ、または対立遺伝子特異的制限酵素（ＲＦＬＰに基づく技術）の使用、または直接シーケンシング、またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、またはピロシーケンス、またはインベーダーアッセイ、またはミニシーケンシング、またはＤＨＰＬＣに基づく技術、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、または対立遺伝子特異的ＰＣＲ、または変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）、異種二本鎖分析に基づく系、質量分析に基づく技術、侵入切断アッセイ、多型比シーケンシング（ＰＲＳ）、マイクロアレイ、ローリング・サークル・エクステンション・アッセイ(rolling circle extension assay)、ＨＰＬＣに基づく技術、伸長に基づくアッセイ、ＡＲＭＳ（アンプリフィケーション・レフラクトリー・ミューテーション・システム(Amplification Refractory Mutation System)、ＡＬＥＸ（アンプリフィケーション・レフラクトリー・ミューテーション・ライナー・エクステンション(Amplification Refractory Mutation Linear Extension)、ＳＢＣＥ（一塩基伸長）、モレキュラービーコンアッセイ、インベーダー（Ｔｈｉｒｄ ｗａｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リガーゼ連鎖反応アッセイ、５’−ヌクレアーゼアッセイに基づく技術、ハイブリダイゼーションキャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）、タンパク質トランケーションアッセイ（ＰＴＴ）、イムノアッセイおよび固相ハイブリダイゼーション（ドットブロット、リバースドットブロット、チップ）によるアンプリコンの調査が含まれる。この方法の一覧は限定を意味するものではなく、多様な利用可能な方法を単に例示することを意味する。これらの方法のいくつかは、本発明の方法に従ってマイクロアレイ形式（マイクロチップ）でまたはビーズ上で行うことができる。

よって、本発明はまた、プライマーまたはプライマー対の使用に関し、この場合、前記プライマーまたはプライマー対は、ブラキスパイナ欠失に相当するＤＮＡ（ヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０））もしくはそれを挟み込むＤＮＡ（すなわち、例えば、ヌクレオチド２０５２７０１７番〜２０５３７０１７番および２０５４０３４６番〜２０５５０３４６番（ｂＴａｕ４．０））、または相補鎖とストリンジェント条件下でハイブリダイズする。

好ましくは、本発明のプライマーは、少なくとも１４ヌクレオチド、例えば１７または２１ヌクレオチドの長さである。

本診断検査の一実施形態では、２つのプライマーセットを同時に用いて、野生型および変異型対立遺伝子をそれぞれ増幅する。対応するアンプリコンは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で野生型および変異型対立遺伝子をそれぞれ認識する内部プライマーを用いた５’エキソヌクレアーゼアッセイを用いてそれぞれ検出される。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件」は周知であるか、または当業者ならば従来のプロトコールに従って確立することができる。各配列に適当なストリンジェント条件は、温度、核酸分子の組成、塩条件などの周知のパラメーターに基づいて確立することができる、例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989またはHiggins and Hames (eds.), "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford 1985参照、特に3-15のBritten & Davidsonによる"Hybridization Strategy"の章を参照。典型的な（高ストリンジェント）条件は、６５℃にて０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、または４２℃にて５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションを含んでなる。ハイブリダイゼーションの後に通常、非特異的シグナルを除去するための洗浄が行われる。洗浄条件には、６５℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは２５℃〜６５℃にて０．３×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳなどの条件が含まれる。

用語「ウシ第２１染色体の塩基２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番」とは、例えばＵＣＳＣ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、およびＮＣＢＩゲノムブラウザから検索することができるウシボースタウルス（家畜種）参照配列（ｂＴａｕ４．０）を意味する。このＢｔａｕ＿４．０は、ベイラー医科大学ヒトゲノム解析センターでアトラスゲノムアセンブリシステムにより作成されたものである。このシーケンシング戦略は、ＢＡＣショットガンリードと小インサートライブラリーからの全ゲノムショットガンリードならびにＢＡＣ末端配列を組み合わせたものである。本明細書に言及されるウシ第２１染色体の塩基２０１５６９６１番〜２２４９９１２２番（ｂＴａｕ＿４．０）にわたる本発明のヌクレオチド参照配列は本発明の範囲内に含まれ、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８１９０号公報の配列番号１に示される。

ウシＦＡＮＣＩ遺伝子の野生型対立遺伝子配列は、本明細書では配列番号１として示される。この配列は、ウシ第２１染色体上の参照配列ｂＴａｕ４．０のヌクレオチド２０，４８５，３２７番〜２０，５５１，０２６番の区間に位置する。

ＦＡＮＣＩ遺伝子における、本発明に従うウシ「ブラキスパイナ突然変異」または「ブラキスパイナ欠失」の例示的および特に好ましい変異型対立遺伝子配列は、本明細書では配列番号２として示される。この配列は、ウシ第２１染色体上の参照配列ｂＴａｕ４．０のヌクレオチド２０，４８５，３２７番〜２０，５５１，０２６番の区間に位置する。

本発明のさらなる実施形態では、ウシがブラキスパイナ（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かをそのゲノムＲＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ）前記ウシから得られた前記ゲノムＤＮＡを含有する生体材料のサンプルからＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）の区間における欠失に関して前記の遺伝子型を判定する工程、および
ｃ）前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
を含んでなる方法が提供される。

好ましい側面では、前記欠失は、ウシＦＡＮＣＩ遺伝子における、ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）にわたる３，３２９塩基対を包含する。

同様に好ましくは、ウシがブラキスパイナ（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはブラキスパイナ（ＢＳ）のキャリアであるか否かを、そのゲノムＲＮＡを分析することにより判定する方法であって、
ａ）前記ウシからの前記ゲノムＲＮＡを含有する材料のサンプルを得る工程、
ｂ）前記サンプルからＲＮＡを抽出する工程、
ｃ）ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）間の区間における欠失に関して前記ＲＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
ｄ）前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
を含んでなる方法も好ましい。

また、好ましい側面では、前記欠失は、ウシＦＡＮＣＩ遺伝子における、ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）にわたる３，３２９塩基対を包含する。

本明細書に言及される「ＲＮＡ」は、あらゆる種類のＲＮＡを包含する。当技術分野で周知の技術が全ＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの単離のために使用可能である。当業者ならば、供試サンプルの性質に応じて、たやすく好適な抽出法を選択することができる。

ＲＮＡを含有するサンプルを本発明に従って増幅反応の鋳型として使用する場合、増幅を行えるようにするためにはその前に前記ＲＮＡを転写してｃＤＮＡとする必要がある。この場合にも、これを行うための技術は当業者に周知である。一例として、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製してもよい。その後、例えばスーパースクリプト（商標）チョイスシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。

本発明の別の実施形態では、ウシがブラキスパイナ症候群（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ）前記ウシから得られた前記ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体材料のサンプルからＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）間の区間における欠失に関して前記ＤＮＡまたはＲＮＡの遺伝子型を判定し、さらにブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカーを含んでなる工程、および
ｃ）前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
を含んでなる方法が提供される。

本発明のさらなる実施形態では、ウシがブラキスパイナ症候群に罹患しているか否か、またはブラキスパイナのキャリアであるか否かを、そのＤＮＡまたはＲＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ．前記ウシから前記ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含有する材料のサンプルを得る工程、
ｂ．前記サンプルからＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する工程、
ｃ．ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカーに関して前記ＤＮＡまたはＲＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
ｄ．前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを連鎖解析(linkage analysis)により確認する工程
を含んでなる方法が提供される。

よって、本発明のさらなる好ましい側面では、特許請求される方法の遺伝子型判定工程は、ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカーをさらに用いる。

本発明に定義される用語「ブラキスパイナ遺伝子座」とは、変異または欠失した場合にブラキスパイナの原因となるか、またはブラキスパイナキャリア状態をもたらす、第２１染色体上のウシＦＡＮＣＩ遺伝子中のポリヌクレオチド配列を意味する。好ましい実施形態では、「ブラキスパイナ遺伝子座」は、ウシＦＡＮＣＩ遺伝子における、ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）にわたる３，３２９塩基対を包含する領域である。

用語「ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカー」とは、ブラキスパイナ遺伝子座から５０％未満の遺伝子組換え単位でウシ第２１染色体上に位置し、かつ、本発明に従って使用することができる、マイクロサテライトマーカーまたは一塩基マーカー（ＳＮＰ）などのＤＮＡ配列変異体を意味する。ウシでは、５０％遺伝子組換え単位はおよそ５０００万塩基対に相当する。本発明の好ましい遺伝子マーカー分子は、ＦＡＮＣＩ遺伝子から１００万塩基対以内に位置するＳＮＰマーカーからなる群から選択される。

用語「前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを連鎖解析により」「確認する」もしくは「判定する」、または「前記動物がブラキスパイナ欠失を有しているか否かを連鎖解析により」「確認する」もしくは「判定する」とは、ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカーのいずれかでどの対立遺伝子が既知のキャリア親（父牛、母牛のいずれか一方または両方であり得る）のブラキスパイナ突然変異と関連しているかを判定すること、およびこのような連鎖マーカー対立遺伝子が供試個体に伝達されるか否かを当業者に周知の標準的連鎖解析手順を用いて判定することを意味する。標準的連鎖解析手順はとりわけ（７）に示されている。

さらに、ウシがブラキスパイナ症候群（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ）前記ウシから得られた前記ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体材料のサンプルからＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番（ｂＴａｕ４．０）間の区間における欠失に関して前記ＤＮＡまたはＲＮＡの遺伝子型を判定する工程であって、さらにブラキスパイナ遺伝子座と連鎖不平衡にある遺伝子マーカーを含んでなる工程および
ｃ）前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程であって、連鎖解析または関連解析(association analysis)を含んでなる工程、
を含んでなる方法が提供される。

同様に、ウシがブラキスパイナ症候群に罹患しているか否か、またはブラキスパイナのキャリアであるか否かを、そのＤＮＡまたはＲＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
ａ．前記ウシから前記ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含有する材料のサンプルを得る工程、
ｂ．前記サンプルからＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する工程、
ｃ．ブラキスパイナ遺伝子座と連鎖不平衡にある遺伝子マーカーに関して前記ＤＮＡまたはＲＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
ｄ．前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを関連解析または連鎖解析により確認する工程
を含んでなる方法が提供される。

よって、本発明のさらなる好ましい側面では、本発明の方法の判定工程は連鎖解析または関連解析をさらに含んでなる。

用語「ブラキスパイナ遺伝子座と連鎖不平衡にある遺伝子マーカー」とは、畜牛集団においてブラキスパイナ(brachypsina)遺伝子座と連鎖不平衡にある、マイクロサテライトマーカーまたは一塩基マーカー（ＳＮＰ）などのＤＮＡ配列変異体を意味する。連鎖不平衡は、配偶子会合または会合とも呼ばれ、一般集団における異なる遺伝子座での対立遺伝子の非ランダムな分布を意味する。本場合には、これらは、ある対立遺伝子が一般集団において単に偶然によって期待されるものよりも高頻度でブラキスパイナ突然変異に関連しているＤＮＡ配列変異体である。前記ウシの場合には、これらには、ウシ第２１染色体上のヌクレオチド２０００万番〜２２５０万番（ｂＴａｕ４．０）間の区間に位置する、マイクロサテライトであれＳＮＰであれ遺伝子マーカーが含まれる。

用語「前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを関連解析により確認する」または「前記動物がブラキスパイナ欠失を有しているか否かを関連解析により確認する」とは、その遺伝子型の、ブラキスパイナ(brachypsina)突然変異と連鎖不平衡にあるＤＮＡ配列変異体における分析から、前記動物がブラキスパイナ突然変異のキャリアであるか否かを決定することを示す。関連解析は、考えられるＤＮＡ配列変異体からの連鎖不平衡情報を個々に抽出すること（「単点解析」）によるか、またはＤＮＡ配列変異体をまとめて考えること（「ハプロタイプに基づく解析」を含む「多点解析」）によって行うことができる。関連研究の原理は当業者には公知であり、例えば（８）に記載されている。

さらに、ブラキスパイナ突然変異のキャリアである動物を検出することができれば、繁殖力を高めるためのマーカー利用選抜に利用することができる。本発明者らは、ブラキスパイナのキャリア状態は、畜牛において最も重要な経済形質の一つである繁殖力と強く相関することを実際に証明した。本発明者らは、本発明で、ブラキスパイナ突然変異はホルスタイン−フリージアン種の動物の〜７．５％に存在し、これはこの疾患の見掛け上低い罹患率から予想できるものよりも多いことを示す。よって、ブラキスパイナは、罹患出生仔牛の罹患率に現れるもの以上に、畜牛においてはるかに重大な問題である。従って、ブラキスパイナキャリアの同定は、繁殖力を高めるためのマーカー利用選抜に使用可能である。

本発明の結果として、今や、前記動物に由来する生体サンプルから抽出された核酸に対して行う簡単な遺伝子検査によってブラキスパイナのキャリア動物を検出し、本発明の方法によって得られる情報を、高い繁殖力のためのマーカー利用選抜に使用することができる。

本発明に従う用語「高い繁殖力のためのマーカー利用選抜」とは、ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖しているか、またはそれと連鎖不平衡にあるかのいずれかであるＤＮＡ配列変異体による、ブラキスパイナ突然変異の直接的検出かその間接的検出かのいずれかに相当するＤＮＡ配列変異体情報の使用、上記の手順の後にブラキスパイナのキャリアである動物を同定し、それにより、雄または雌の繁殖力に関連する表現型に対する育種価に関する情報を得ることを意味する。「ゲノム選抜」と呼ばれる新規な形態のマーカー利用選抜が最近紹介されたことは注目すべきことである（例えば、参照文献９参照）。もしこのゲノム選抜法が雄および雌両方の繁殖力に関連する形質に対して適用されるならば、ブラキスパイナ突然変異の有無に関する情報が利用できるであろう。従って、このような形質のゲノム選抜では、本発明に開示される情報が利用できるであろう。

よって、さらなる実施形態において、本発明は、前記ウシにおける高い繁殖力のためのマーカー利用選抜またはゲノム選抜を実施するための本方法の使用を提供する。

本発明によれば、ウシまたはウシ集団において繁殖力を高める方法であって、
ａ）前記ウシから前記ゲノムＤＮＡを含有する材料のサンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出すること、
ｃ）本明細書に記載されるようにブラキスパイナを引き起こす欠失に関して前記ＤＮＡの遺伝子型を判定すること、および
ｄ）ブラキスパイナのキャリアであるウシを同定すること
を含んでなる方法が提供される。

本発明の別の側面は、上記で同定されたブラキスパイナ突然変異／欠失の検出のための方法であって、例えば当技術分野で十分確立され、かつ、本発明の範囲内に包含される技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ウシから得られた単離ＤＮＡを、前記突然変異に対する特異的プライマーを用いて増幅することを含んでなる方法を対象とする。限定されない例として、配列番号５および６に示されるヌクレオチド配列は、ブラキスパイナの検出のための変異型ＰＣＲプライマー対として適用することができる。本発明によれば、配列番号３および４に示されるヌクレオチド配列は、野生型対照ＰＣＲプライマー対として使用することができる。好ましくは、遺伝子型判定工程は、変異型および野生型対立遺伝子を同時に検出するために行われる。ブラキスパイナの検出のためのさらなる特異的プライマーまたはプライマー対を設計することが意図される。よって、上記で定義された突然変異に隣接するか、または前記突然変異を挟み込む特異的配列に対するプライマーは、本発明の範囲内にある。好ましくは、本明細書に開示される突然変異の前後１〜５００ヌクレオチド以内、好ましくは１〜１００ヌクレオチド以内または一層より好ましくは１〜５０ヌクレオチド以内の領域に特異的に結合するプライマーが含まれる。

本発明のさらなる実施形態では、ウシから得られた単離ＤＮＡを例えばＰＣＲにより増幅すること、およびさらに本明細書に言及されるブラキスパイナ遺伝子座に対する特異的プローブを利用することを含んでなる、開示されるブラキスパイナ突然変異の検出のための方法が提供される。限定されない例として、本発明によれば５’ＨＥＸ−ＡＧＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＧＡ−３’ＩＡＢｋＦＱ（野生型）（配列番号７）および５’ＦＡＭ−ＣＣＡ ＴＴＣ ＣＡＣ／ＺＥＮ／ＣＴＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＧＴ ＧＴＣ ＣＴ−３’ＩＡＢｋＦＱ（変異型）（配列番号８）のようなプローブが使用可能である。また、本発明のさらなる実施形態では、上記で定義された突然変異を挟み込むヌクレオチド配列に対するさらなる特異的プローブを設計することが企図される。好ましくは、本明細書に開示される突然変異の前後１〜１０００ヌクレオチド以内、好ましくは１〜５００ヌクレオチド以内、より好ましくは１〜１００ヌクレオチド以内またはいっそうより好ましくは１〜５０ヌクレオチド以内の領域に特異的に結合するプローブが含まれる。

本発明のさらなる側面において、プローブは蛍光団(fluorophore)で標識される。蛍光団は当技術分野で周知である。好ましくは、本発明の方法および使用に適用されるものは、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。また、本明細書で提供される方法および使用に適用される１または複数のプローブは消光剤をさらに含んでなることも、本発明により企図される。一層より好ましくは、蛍光団と消光剤の距離が２０〜３０塩基離れた内部消光剤である。最も好ましいのは、長さをわずか９塩基前後にしたＺＥＮ（商標）消光剤である。

発明の詳細な説明
自己接合性マッピングは、２．５ＭｂのＢＴＡ２１区間のブラキスパイナ遺伝子座の位置を決定する
２００８年１月〜２００９年１２月の間に、本発明者らは、ブラキスパイナを有すると診断された６頭のホルスタイン−フリージアン種の仔牛から生体材料を得た。これまでに報告されている場合としては（例えば、４）、これらの６頭の罹患動物は父方および母方において、かつての一般的人工授精（ＡＩ）ホルスタイン−フリージアン種の雄牛であるスィート・ヘブン・トラディション(Sweet Haven Tradition)に遡った。標準的手順を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、従前に記載されているウシ５０Ｋ ＳＮＰアレイ（３）を用いて遺伝子型の判定を行う。ブラキスパイナが実際に常染色体劣性欠損として遺伝し、ホルスタイン−フリージアン種で遺伝的にホモであるとすると（系統分析から示唆）、この６症例は、原因となる突然変異を包含する共通のハプロタイプの同型接合であると予想される。本発明者らは、ＡＳＳＩＳＴプログラム（３）および対照として１５頭の健常なホルスタイン−フリージアン種雄牛を用いて自己接合性マッピングを行い、第２１染色体（ＢＴＡ２１）上に全ゲノムで単一の有意なピーク（ｐ＜０．００１）を同定した。この共通のハプロタイプは、５６の注釈付き遺伝子を包含する２．４６Ｍｂ（ｂＴａｕ４．０：２０，１３２，７６７〜２２，５８８，４０３）にわたる（図１）。

標的全ゲノムリセンテンシングはＦＡＮＣＩ遺伝子における原因３．３Ｋｂブラキスパイナ欠失を同定する
前記区間の５６遺伝子のいくつかは、マウスにおいてノックアウトされると、胚致死を引き起こすことが知られている。本発明者らは、症例および対照のゲノムＤＮＡから対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅したが、明らかな破壊を示すＤＮＡ配列変異体（ＤＳＶ）は見つからなかった。次に、本発明者らは、２．４６Ｍｂ区間全体の標的シーケンシングを行った。注文配列捕捉アレイ（Ｒｏｃｈｅ Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ）をウシｂＴａｕ４．０ビルドに基づいて設計し、これを用いて２頭の罹患個体の全ゲノムＤＮＡから対応する配列を富化した後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩｘ装置にてペアード・エンド・シーケンシング(paired-end sequencing)（２×３６ｂｐ）を行った。得られた配列出力を、Ｍｏｓａｉｋ(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab)を用いてｂＴａｕ４．０ビルドにマッピングした。標的領域において、非反復塩基のカバー率は第１サンプルでは平均９０．４５（範囲：０〜３３６）、第２サンプルでは６１．２８（範囲：０〜１８９）であり、標的領域外の第１サンプルの０．０１（範囲：０〜２４）および第２サンプルの０．０１（範囲：０〜１０４）と比較される。カバー率が１０を超える標的非反復塩基の割合は両サンプルとも０．１２であった。本発明者らはＧｉｇａＢａｙｅｓソフトウエア（Ｇａｂｏｒ Ｔ． Ｍａｒｔｈ、ボストン大学、http://bioinformatics.bc.edu/marthlab）を用いてＤＳＶを同定し、全部で２，９４０ＤＳＶに対して２，３６８のＳＮＰおよび５７２のｉｎｄｅｌを検出した。これらのうち１，０３２は、ホルスタイン−フリージアン種以外の品種でこれまでに報告されているＤＳＶに相当し、従って、候補となる原因突然変異としては排除した。残りの１，９０８のＤＳＶのうち一つだけが、ミオシン軽鎖キナーゼ様タンパク質をコードするＬＯＣ５１６８６６遺伝子においてセリンからグリシンへの置換を引き起こすコードであった。このＤＳＶは、ブラキスパイナの基礎にある信頼できる候補突然変異であるとは考えられなかった。

次に、本発明者らは、一つのブラキスパイナ症例および３つの無関係の健常対象の自己連結した４．８Ｋｂ（±０．３５Ｋｂ）断片からメイトペア(mate-pair)ライブラリーを作成し、各動物についてＩｌｌｕ１ｍｉｎａ ＧＡＩＩｘ装置にて３．７Ｇｂ未満の配列を作成した。得られた出力を、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）（１０）を用いてｂＴａｕ４．０ビルドにマッピングし、これらのアライメントをＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（１１）で表示した。２．４６Ｍｂの区間にマッピングされたこれらのリードの分析を行ったところ、ＦＡＮＣＩ（ファンコニ貧血相補群Ｉ）遺伝子を含んでなる３７のうちのエキソン２５〜２７を取り去る３．３Ｋｂの欠失が容易に明らかとなった。この領域における通常の均一なカバー率を示す３つの対照とは対照的に、この欠失は、ｂＴａｕ４．０ビルド上に〜８Ｋｂ離れてマッピングされる２７メイトペアのクラスターから、また、ブラキスパイナ症例の欠失セグメントにマッピングされるリードの完全な不在から明らかであった。罹患個体から捕捉された配列出力の遡及的解析を行ったところ、正確に同じ位置におけるカバー率の急低下が確認された。本発明者らは、罹患動物およびキャリア動物のゲノムＤＮＡからの４０９ｂｐ産物の豊富な増幅を可能とするが、同品種またはその他の品種からの無関係の健常対照からは増幅させない、推定欠失にわたるプライマー対を設計した。このアンプリコンのシーケンシングにより欠失切断点が定義され、３，３２９ｂｐの欠失が確認された（図２Ａ）。罹患個体から捕捉された配列出力の遡及的解析により、いくつかのリードブリッジングが同定され、切断点が確認された。逆に、欠失内で設計されたプライマー対は、健常個体に比べて罹患個体のＤＮＡからの増幅は見られなかった。

エキソン２５〜２７の欠失がｍＲＮＡのエキソン２４および２８の近位で起こるとすれば、３．３Ｋｂの欠失は、８７７番アミノ酸においてフレームシフトが起こり、４５１カルボキシ末端アミノ酸が２６残基長の非正統的ペプチドで置換されると推定される。さらに、次のエキソン２８内の停止コドンは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解を引き起こすと思われる（図２Ｂ）。

そのホモログであるＦＡＮＣＤ２を用いると、ＦＡＮＣＩタンパク質は障害誘導性のクロマチンフォーカスに局在するＩＤ複合体を形成する。ＦＡＮＣＩは、ＤＮＡ鎖間架橋修復に不可欠である。ＦＡＮＣＤ２同様、ＦＡＮＣＩは、ユビキチンリガーゼＦＡコア複合体によりモノユビキチン化され、ＡＴＭ／ＡＴＲキナーゼによりホスホリル化される（例えば、１２）。ＦＡＮＣＩ遺伝子のミスセンス、ナンセンスおよびスプライス部位変異体は、ヒトにおけるファンコニ貧血（ＦＡ）症例の〜２％の基礎にある（１２、１３）。ＦＡ患者は、成長遅滞、骨格異常、腎臓、心臓、消化管および生殖器官の奇形（ウシブラキスパイナを想到）、ならびに骨髄不全、癌の早期発症および若年での死亡を含む異質な症状を呈する。

３．３Ｋｂ ＦＡＮＣＩ欠失を直接調査する診断検査の開発およびその因果関係の確認
本発明者らは、変異型および野生型対立遺伝子を同時に調査する５’エキソヌクレアーゼ遺伝子型判定アッセイを開発した。このアッセイでは、野生型ＰＣＲプライマー対としての５’−ＴＧＴ ＴＡＧ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＧＡ−３’（配列番号３）および５’−ＡＴＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＣＣＡ ＣＴＡ ＧＡＴ ＧＴＣ−３’（配列番号４）と、変異型ＰＣＲプライマー対としての５’−ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＡＴ ＣＴＴ ＡＣＧ ＧＴＡ Ｃ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＴＧ Ｇ−３’（配列番号６）の組合せ、ならびにプローブとしての５’ＨＥＸ−ＡＧＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＧＡ−３’ＩＡＢｋＦＱ（野生型）（配列番号７）および５’ＦＡＭ−ＣＣＡ ＴＴＣ ＣＡＣ／ＺＥＮ／ＣＴＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＧＴ ＧＴＣ ＣＴ−３’ＩＡＢｋＦＱ（変異型）（配列番号８）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いる。対立遺伝子識別反応は、ＡＢＩ７９００ＨＴ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒｓ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）にて、終濃度２５０ｎＭの各プローブ、５００ｎＭの野生型プライマー、３５０ｎＭの変異型プライマー、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＸ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒｓ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および１０ｎｇのゲノムＤＮＡを含む２．５μｌ容量で４０サイクル行った。典型的な結果を図３に示す。

予想されたように、利用可能な総てのブラキスパイナ症例は、これらの試験により、前記欠失に関して同型接合であることが示された。この欠失は、ホルスタイン以外の１０品種に相当する１３１頭の父方健常動物のサンプルには存在しないことが分かった。次に、本発明者らは、３，０３８頭の健常ホルスタイン−フリージアン種動物の無作為サンプルの遺伝子型を判定した。前記欠失のキャリアはこれらのサンプルの７．４％を占めたが、同型接合であることが分かった動物は存在しなかった。ハーディ・ワインベルグ平衡を仮定すると、３，０３８個体のサンプル中に同型接合動物が存在しない確率は５％未満であった。このことは、この突然変異の同系接合性は正常な健康個体とは適合しない、すなわち、３．３Ｋｂ ＦＡＮＣＩ欠失が原因であるということを強く示唆する。

参考文献

Claims (11)

1. ウシがブラキスパイナ症候群（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムＤＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
   ａ）ウシから得られた前記ゲノムＤＮＡを含有する生体材料のサンプルからＤＮＡを抽出する工程、
   ｂ）ウシｂＴａｕ４．０、第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番の区間における欠失に関して前記ＤＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
   ｃ）連鎖解析または関連解析により、前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
   を含んでなり、該ウシがボースタウルスから選択されるものである、方法。
2. ウシがブラキスパイナ症候群（ＢＳ）に罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムＲＮＡを分析することにより判定するための方法であって、
   ａ）ウシから得られた前記ゲノムＲＮＡを含有する生体材料のサンプルからＲＮＡを抽出する工程、
   ｂ）ウシｂＴａｕ４．０、第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番の区間における欠失に関して前記ＲＮＡの遺伝子型を判定する工程、および
   ｃ）連鎖解析または関連解析により、前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程
   を含んでなり、該ウシがボースタウルスから選択されるものである、方法。
3. ウシがａ）ブラキスパイナに罹患しているか否か、ｂ）ブラキスパイナを有するか否か、またはｃ）前記疾患のキャリアであるか否かを判定することをさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
4. 遺伝子型判定工程ｂ）が、ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカーをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. サンプルが血液、精子、毛根、乳汁、体液、および／または有核細胞を含む組織からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ウシがホルスタイン種、フリージアン種およびホルスタイン−フリージアン交配種、ブリティッシュおよび／またはオランダフリージアン種からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ウシにおける高い繁殖力のためのマーカー利用選抜またはゲノム選抜を行うための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ブラキスパイナ突然変異の検出のための方法であって、
   ａ）ウシから得られたサンプルから単離されたＤＮＡを、ウシｂＴａｕ４．０、第２１染色体上のヌクレオチド２０５３７０１７番〜２０５４０３４６番の区間における欠失に対する特異的プライマーにより増幅すること、および
   ｂ）前記ウシがブラキスパイナ突然変異を有するか否かを判定すること
   を含んでなる、方法。
9. 前記特異的プライマーが配列番号５および６に示されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項８に記載の方法。
10. 配列番号３および４に示される特異的プライマーをさらに含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
11. ａ）ｉ）ブラキスパイナ遺伝子座を突然変異に対する特異的プローブで標識する工程をさらに含んでなり、該プローブが蛍光団をさらに含んでなり、該蛍光団が６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であり、かつ該プローブが消光剤または内部消光剤をさらに含んでなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。