CN108866202A

CN108866202A - 中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN108866202A
Application number: CN201810605251.0A
Authority: CN
Inventors: 王淑辉; 孙秀柱; 李泽; 樊路杰; 王国艳; 江钧益
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明公开了一种中国黄牛PLAG1基因19‑bp重复缺失多态性的检测方法及其应用。该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1通过PCR扩增中国黄牛PLAG1基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；该基因的重复缺失多态性不同基因型分别与四种中国黄牛，包括秦川牛、南阳牛、郏县牛与鲁西牛的体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状之间显著相关。该方法可在肉牛生长性状的标记辅助选择育种中应用，有利于快速建立生长性能优良的肉牛遗传资源群体。

Description

中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入缺失(inde)的检测，特别涉及一种黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用，采用该方法能够快速、准确检测中国黄牛PLAG1基因AC_000171.1位点19-bp重复缺失多态性。

背景技术

为了优化生产和满足人类对动物产品日益增长的需求，家畜的选育方向和育种技术都经历了一系列历史性的变化。我们通常采用杂交改良、品系选育等传统育种对肉牛品种进行不断改良，而其效率取决于高价值个体的识别，选择强度，繁殖与育种周期和有限的遗传多样性等。因此传统育种技术手段面临突变频率低、繁殖与育种周期长、遗传资源限制等诸多挑战。自分子生物学技术的快速发展，使基于大量样本的分子标记挖掘和鉴定变得更加简便，大幅推动了分子育种技术的发展。畜牧产业发达的国家针对本国家畜品种的重要经济性状进行数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)定位和主效基因挖掘，利用基因辅助育种(gene-assisted selection，GAS)和分子标记辅助育种 (marker-assisted selection，MAS)技术提高了目标性状的选育速度和准确度，培育出一批性状优良的国际知名的优良家畜品种。

牛肉富含蛋白质、铁、锌、维生素B和必需的多不饱和脂肪酸，是人类高质量营养的来源。伴随肉牛产业的逐步发展，世界牛肉消费量总体保持增长。据经济合作与发展组织(OECD)、联合国粮农组织(FAO)预测，世界对牛肉产品的需求将持续增加。伴随着人们对牛肉需求的增加及消费偏好的改变，保护我国特有黄牛品种遗传资源，促进引进品种的本土化选育与专门化新品系培育，提升优质良种肉牛种用价值与种畜培育技术，减少对国外肉牛品种的依赖是我们的当务之急。肉牛品种对于牛肉的产量和质量有着决定性作用。进而良种产业化是肉牛产业发展的关键。随着世界肉牛产业科技的快速发展，我国肉牛产业的整体水平得到明显提高并取得丰硕成果。肉牛育种技术实现了由常规杂交育种向分子标记辅助育种技术跨越，揭示出大量与生长发育、肉质品质、繁殖与疾病等相关的候选基因与分子标记，并逐步应用于肉牛育种实践。

我国是世界上牛品种最多的国家，拥有73个黄牛品种。种质资源是培育一切新品种的源头，种质资源越多，开发的越深，可利用的遗传基因就越多。重大育种突破的关键在于优良种质资源的发掘与利用。我国固有地方品种是数千年来驯养和选育出的适应于本地环境的精华物种，蕴藏着丰富的有益基因，其中繁殖性能、抗逆性及肉质品质等是最受国际关注、最具特色和国际竞争力的经济性状。随着国家对地方优良品种保护力度的逐年加强，对自主制种能力的需求逐年提高。可以肯定的是，通过大力发展分子育种，培育出适合我国各地自然、气候和市场的优良牛肉品种指日可待。

多形性腺瘤基因1(Peomorphic adenoma gene 1，PLAG1)作为锌指转录因子的一个成员，在调节哺乳动物的正常生理功能方面起着重要作用。研究发现， PLAG1是一种转录因子，调控着多种生长因子，包括胰岛素样生长因子II(IGF II)、细胞因子1(CLF1)、骨源生长因子(BPGF1)、Chorio促性腺激素beta链 (CGB)、血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PGF)。PLAG1基因敲除小鼠生长发育迟缓有显著相关性。在家猪中，PLAG1被发现与背部的伸长和椎骨的增加有很大的关系。总的来说，基于全基因组分析和之前的研究，研究PLAG1在调节牛的生长性状方面的作用是至关重要的。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用，即利用PCR扩增方法检测中国黄牛PLAG1基因的插入/ 缺失多态性，从而加快良种选育速度。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1通过PCR扩增中国黄牛 PLAG1基因部分片段(具体位于基因的内含子区)；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；

所述的引物对P1为：

上游引物：5’-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

根据本发明，所述中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛PLAG1基因AC_000171.1g.3747444-3747462位点上存在的19-bp重复缺失多态性片段GAACACACAGCCCACAAGG。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95.0℃预变性5min；95.0℃变性 30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温 2-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，4℃条件下存扩增产物。

所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。

所述电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失(Indel)多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为262bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为262bp和243bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为243bp一条带纹。

其中，缺失/缺失(ID)基因型作为中国黄牛繁殖性状的分子标记。能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状的分子标记。

一种中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增中国黄牛PLAG1基因上19-bp重复缺失多态性位点的引物对P1，所述的引物对P1为：

上游引物：5'-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

根据申请人的研究表明，中国黄牛PLAG1基因AC_000171.1g.3747444-3747462位存在19-bp重复缺失多态性位点能够在中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法的有益效果体现在：

根据中国黄牛PLAG1基因AC_000171.1g.3747444-3747462位存在的19-bp 重复缺失多态性设计引物，以中国黄牛基因组DNA为模板，进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测中国黄牛PLAG1 基因AC_000171.1g.3747444-3747462位的插入缺失多态性。

根据对中国黄牛PLAG1基因第3747444-3747462位重复缺失多态性位点进行基因型和基因频率分析，及对上述重复缺失多态性位点与中国黄牛相关生长性状(体高、胸围、胸宽、胸深、腰高、十字部高、体斜长、臀长、腰角宽、腹围、十字部高、体重、重高比)进行关联分析，结果表明该位点能够作为中国黄牛体尺性状(P<0.05或P<0.01)的分子标记，选择具有杂合(ID)基因型的个体，有利于快速建立进传资源优良的中国黄牛种群，从而加快具有优良繁殖性状的中国黄牛的良种选有速度。

附图说明

图1为引物对P1扩增中国黄牛PLAG1基因3％琼脂糖疑胶电泳的结果图，图中，M表示Marker；

图2为中国黄牛PLAG1基因PCR扩增产物测序图；其中，(a)图是II基因型，(b)图是DD基因型，实线方框标出的部分表示19-bp重复缺失序列： AC_000171.1g.3747444-3747462del GAACACACAGCCCACAAGG；虚线方框标出的部分表示19-bp重复缺失序列的重复序列。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。

具体实施方式

本实施例给出一种以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1通过 PCR扩增中国黄牛PLAG1基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；

所述的引物对P1为：

上游引物：5’-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

其中，所述中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛 PLAG1基因AC_000171.1g.3747444-3747462位点上存在的19-bp重复缺失多态性片段GAACACACAGCCCACAAGG。

本实施例中，PCR扩增的反应程序为：95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s， 68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min， 4℃条件下存扩增产物。

本实施例中，琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。

电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为262bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为262bp和243bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为243bp一条带纹。

其中，插入/缺失多态性位点的缺失/缺失(ID)基因型作为中国黄牛繁殖性状的分子标记。

上述中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法可以扩展到中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测试剂盒的应用，该试剂盒至少包括用于PCR扩增中国黄牛PLAG1基因上19-bp重复缺失多态性位点的引物对P1，所述的引物对P1为：

上游引物：5'-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

以下是发明人给出的具体实施例。

该实施例利用PCR扩增方法对中国黄牛PLAG1基因在AC_000171.1 g.3747444-3747462位点突变可能产生的重复缺失多态性进行检测，并将其与中国黄牛相关生长性状(体高、胸围、胸宽、胸深、腰高、十字部高、体斜长、臀长、腰角宽、腹围、十字部高、体重、重高比)进行关联分析，验证其是否可以作为中国黄牛分子有种中辅助选择的分子标记。

1、实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：

②2×Taq PCR Mastermix(含染料，购自杭州宝赛生物科技有限公司)；

②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；

③Marker(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、EDTA、NaCl、 NaOH、KCl、Na₂HPO4、KH₂PO4、Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、核酸染料、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034x10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

具体的溶液与缓冲液如下：

琼脂糖电泳分析所用溶液：0.5×TAE缓冲液：10×TAE 50mL定容至 1000mL。

2、设计中国黄牛PLAG1基因Indel引物

在NCBI.上检索猪PLAG1基因的序列(猪PLAG1基因参考序列 AC_000171.1)，并利用Primer-BLAST(NCBI)设计能够扩增包含中国黄牛 PLAG1基因第3747444-3747462位点的PCR引物对P1，其引物序列如下，参见图3(设计完成时间为2017年10月)：

上游引物：5'-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

用上述引物对P1对中国黄牛基因组进行PCR扩增，能够扩增包含中国黄牛PLAG1基因(AC_000171.1g.3747444-3747462序列)的片段。对照NCBI 数据库，当牛PLAG1基因(AC_000171.1g.3747444-3747462序列)的3747444nt 与3747462nt之间的核苷酸序列GAACACACAGCCCACAAGG缺失时，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条243bp大小的带纹；当牛PLAG1基因 (AC_000171.1g.3747444-3747462序列)的3747444nt与3747462nt之间的核苷酸序列GAACACACAGCCCACAAGG存在时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条262bp大小的带纹。当牛PLAG1基因(AC_000171.1 g.3747444-3747462序列)的3747444nt与3747462nt之间的核苷酸序列 GAACACACAGCCCACAAGG同时出现插入和缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现243bp和262bp两条带纹。如图1扩增后电泳结果所示，左起第1泳道为Marker(由大到小依次是600bp，500bp，400bp，300bp，200bp 和100bp)，第2～7泳道为检测样本。根据理论分析结果，II基因型表现为一条 262bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第5泳道，测序峰图为图2 (a)所示；DD基因型表现为一条243bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第3、6泳道，测序峰图为图2(b)所示。ID基因型表现为243bp和262bp 两条带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第2、4和7泳道。

3.引物对P1扩增中国黄牛PLAG1基因片段

3.1中国黄牛血样的采集

实验所用的组织样本最后完成采集时间截止到2017年4月。实验所用的动物为秦川牛(n＝255)、郏县牛(n＝138)、鲁西牛(n＝110)、南阳牛(n＝136)，共计639个样本，分别采集陕西省、河南省等地。采用颈动脉采血方式采取个体样品，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

3.2血样中DNA的分离、提取

1)300μl抗凝全血加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

2)去上清液，加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

3)去上清液，加500μl的消化Buffer(配方为：100mg·L-1蛋白酶K， 10mmol·L-1Tris-HCI，15mmol·L-1 NaCl，10mmol·L-1 EDTA，4g·L-1 SDS， pH8.0)，充分混匀，55℃水浴16h。

4)加500μl 25：24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

5)取上清液，加等量的25：24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

6)取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀(未见沉淀提示DNA量不多)。

7)15000rpm离心3min。

8)去上清液，加500ul浓度为70％的乙醇，充分混匀，15000rpm离心3min。

9)去上清液，晾干，加50ul的TE至完全溶解，在-20℃条件下保存。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将电泳槽洗干净，将干净的制胶底板放入胶盒中，插上梳子；

2)制作浓度为2％的琼脂糖凝胶：

称取0.80g琼脂糖，倒入三角瓶中，加入0.5×TAE40mL使其悬浮，微波炉中加热。待煮沸至溶液透明，没有半透明的颗粒存在时拿出，待其冷却至不烫手时(约60℃)加入1μL的核酸染料，轻微摇动；

3)混匀后，将琼脂糖凝胶立即到入槽内，如出现气泡，用移液器枪头将气泡移出；

4)约20-30min后，待凝胶完全冷却凝固，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中；

5)向电泳槽中加入0.5×TAE缓冲液，使液面高出胶面2-5mm；

6)取DNA样品6μL，统一上样，并将DNA Marker加在一边；

7)120V电压，电泳35min；

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，需重新提取相应样品的DNA。

3.4DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入浓度为10％的SDS，使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100g/mL，55℃保温10h左右；

2)等体积苯酚：氯仿：异戊醇混合液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)和氯仿分别抽提一次；

3)2000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

4)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

5)倒掉液体，用浓度为70％的乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA 含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的于-40℃条件下存放。

3.6 PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到一个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR 管中，然后加入模板DNA，再瞬时高心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2 ×Taq PCR Mastermix(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、优化的反应缓冲液和染料)7.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL(上、下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL)0.5uL；去离子水5pL；共15μL体积的PCR扩增体系。

3.7 PCR反应的程序

PCR扩增反应程序为：

95.0℃预变性5min，94.0℃变性30s，68℃退火30s，72.0℃延伸25s，2个循环；

之后每2个循环降退火温度2-3℃；94.0℃变性30s，51℃退火30s，72.0℃延伸25s，30个循环：最后72.0℃延伸10min，4℃保存扩增产物。

4、扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分以下3步：

1)制作质量浓度为3％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压，电泳60～80min；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析Indel多态性。

利用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断Indel的多态性，参见图1，中国黄牛基因组PLAG1基因的19-bp重复缺失多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

ID基因型表现为243bp和262bp两条带纹；

II基因型表现为262bp一条带纹；

DD基因型表现为243bp一条带纹。

5、中国黄牛PLAG1基因Indel位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_nm＝N_nn/N，其中P_nm代表某一位点的nn基因型频率；N_nn表示群体中具有 nn基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：

P_n＝(2N_nn+N_na1+N_na2+N_na3+N_na4+....+N_nam)/2N

式中，P_n表示等位基因n频率，N_nn表示群体中具有nn基因型的个体数量， N_nai表示群体中具有nai基因型个体数量，a1-am为等位基因n的m个互不相同的复等位基因。

四种中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表1所示。秦川牛的等位基因“I”的频率为0.749，相应的等位基因“D”的频率为0.251；南阳牛的等位基因“I”的频率为0.691，相应的等位基因“D”的频率为0.309；郏县牛的等位基因“I”的频率为0.696，相应的等位基因“D”的频率为0.304；鲁西牛的等位基因“I”的频率为0.591，相应的等位基因“D”的频率为0.409；等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，属于稳定存在的Indel类型。

6、中国黄牛PLAG1基因Indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后根据琼脂糖凝胶电泳判断的基因型。

体尺数据：体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高、十字部高、臀长、腰角宽、腹围、十字部高、体重、重高比。

关联分析模型：利用SPSS(23.0)软件来分析品种、不同因素与生长性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等体尺指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：

Y＝p+G+E，其中，Y表示个体表型记录；p表示总体均值；G表示标记基因型效应；E表示随机误差。

结果表明，中国黄牛PLAG1基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对四种中国黄牛相关生长性状(体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高)有显著影响。

由表2可以看出，PLAG1基因19-bp重复缺失多态性对秦川牛的臀长有显著影响(P<0.05)，对秦川牛的体高、胸围、胸宽、胸深、腰高、臀高、身长、体重有极显著影响(P<0.01)；对南阳牛的体重与重高比有显著影响(P<0.05)，对南阳牛的体高、体长有极显著影响(P<0.01)。在这些个体中，ID基因型个体性状显著优于II与DD基因型个体。

结论：ID基因型可以作为四种中国黄牛生长性状的遗传标记。

总之，本实施例给出的上述中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法，为中国黄牛繁殖性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践支撑。

表1：关于牛PLAG1基因的新型SNP和19bp Indel的遗传参数

注：LX为鲁西牛；QC为秦川牛；NY为南阳牛；JX为郏县牛。

表2：牛PLAG1基因的19bp Indel与两个牛品种的生长性状的关联分析

注：LSM表示最小二乘法；SE表示标准误差；QC为秦川牛；NY为南阳牛；II表示插入/插入基因型；ID表示插入/缺失基因型；DD表示缺失/缺失基因型。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120>中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用

<160>

<210> 1

<211> 18

<212>引物对P1的上游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5’- GATCCCACCTGACAAACG-3'

<210> 2

<211> 18

<212>引物对P1的下游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'

<210> 3

<211> 19

<212>中国黄牛PLAG1基因AC_000171.1g.3747444-3747462位点上存在的19-bp重复缺失多态性片段

<213> DNA

<220>

<400>

CAACACACAGCCCACAAGG

Claims

1.一种中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1通过PCR扩增中国黄牛PLAG1基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；

所述的引物对P1为：

上游引物：5’-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛PLAG1基因AC_000171.1g.3747444-3747462位点上存在的19-bp重复缺失多态性片段GAACACACAGCCCACAAGG。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，4℃条件下存扩增产物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电泳结果鉴定中国黄牛PLAG1基因上的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为262bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为262bp和243bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为243bp一条带纹。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述插入/缺失多态性位点的缺失/缺失(ID)基因型作为中国黄牛繁殖性状的分子标记。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中国黄牛选自秦川牛，南阳牛，鲁西牛或郏县牛。

8.一种中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增中国黄牛PLAG1基因上19-bp重复缺失多态性位点的引物对P1，所述的引物对P1为：

上游引物：5'-GATCCCACCTGACAAACG-3'；

下游引物：5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'。

9.权利要求1所述的中国黄牛PLAG1基因19-bp重复缺失多态性的检测方法用于中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。