CN105671189A - 一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法，以包含Angptl8基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Angptl8基因，获得PCR扩增产物，用限制性内切酶Hinf？I消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段，对酶切产物片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛Angptl8基因第-308位具有单核苷酸多态性，同时，将黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性检测结果与黄牛的生长性状进行关联性分析，并将合适的基因型用于提高黄牛生长性状的分子育种，有助于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。在二倍体生物群体中，SNP理论上可由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNP很罕见，故SNP通常被称为二等位基因分子标记。根据SNP在基因组中分布的位置，SNP又可划分为基因编码区SNP(cSNP)、基因周边SNP(pSNP)和基因间SNPs(iSNP)等类型。其中cSNP造成的影响较大，可能影响到蛋白质的功能。近年来的研究发现，5’侧翼区的SNPs，即pSNP对基因的功能也具有非常重要的调控作用，能够影响整个基因的转录效率。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(MolecularMark-AssistSelection，MAS)，是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，实现新品种的选育。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术的日渐成熟与丰富，覆盖整个基因组的标记越来越多，通过与QTL(quantitativetraitlocus)间的连锁分析，可间接实现辅助选择性状的目的。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。在肉牛育种中，人们期望通过对与生长性状有密切相关、并且与数量性状紧密连锁的DNA标记进行选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得较大的研究进展。

目前，主要采用几种不同的路线来筛别SNP：包括DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核苷酸连接反应、PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP方法等。在这些SNPs检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是其检测费用昂贵，需要有DNA测序仪等大型仪器，同时需要非常熟练的技术人员和丰富的经验，因此该方法不是一种应用于生产实际的理想SNPs检测方法；利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNPs检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，利用PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP技术进行SNP检测可能是当前检测SNP最理想的遗传标记方法。本试验中的forced-PCR-RFLP是在发现SNP位点后通过对引物中引入错配碱基，使之与SNP位点共同构成酶切位点实现基因分型的一种方法。通过PCR扩增，使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNPs位点。该方法既具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，是目前可实际应用于生产实践的方法。

血管生成素样蛋白(Angiopoietin-likeproteins，Angptls)是一类既与血管生成有关，又与脂类、葡萄糖、能量代谢和胰岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子，先后发现了该家族的8个成员，命名为Angptl1-8。其中Angptl8是最近发现的能在肝脏和脂肪组织中表达并具有多种功能的活性多肽，又称为促胰岛生长素(betatrophin)。在人类及小鼠中，Angptl8是一种由198个氨基酸组成的22kD的分泌蛋白。在培养的肝细胞中，Angptl8可促进Angptl3的剪切，释放出Angptl3的N端，该N端结构域可抑制脂蛋白脂肪酶的活性。另有研究表明，在小鼠中单独表达Angptl3不会改变血浆中三酰甘油的水平，而与Angptl8共表达后将引起高甘油三酯血症；免疫共沉淀的结果显示Angptl8与Angptl3的N端结构域存在一定的相互作用，Angptl8可能是通过激活Angptl3调节血浆中的甘油三酯水平。采用Angptl8基因缺失的小鼠做模型时也发现Angptl8基因缺失可严重扰乱甘油三酯的新陈代谢，重组Angptl8蛋白还会抑制LPL的活性。以上研究表明Angptl8是脂类、葡萄糖和能量代谢的调制器，在糖脂代谢方面发挥着重要的调控作用。

SNP多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术和直接测序等，但是，单链构象多态技术操作繁琐，影响因素较多，容易出现假阴性问题，而直接测序法成本较高。加之，中国地方黄牛Angptl8基因遗传变异的研究仍是空白。因此，有必要探索一种可以快速检测基因组DNA序列中的单核苷酸多态性，以及基于该多态性的分子育种方法，用以改良我国地方黄牛品种。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法，寻找与黄牛生长性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法，以包含Angptl8基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Angptl8基因，获得PCR扩增产物；

用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段；

对酶切产物片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛Angptl8基因中第-308位具有单核苷酸多态性，所述单核苷酸多态性为：TT基因型表现为148bp一条条带；CC基因型表现为132bp和16bp两条条带；TC基因型表现为148bp、132bp和16bp三条条带；

分别分析TT基因型与黄牛生长性状、CC基因型与黄牛生长性状、TC基因型与黄牛生长性状的关联性，得出TT基因型有利于黄牛生长性状的提高；

将TT基因型作为提高黄牛生长性状的分子遗传标记，用于黄牛的分子育种；

所述引物对P包括上游引物P1和下游引物P2，其中

上游引物P1的碱基序列为：5′-GGGGCAGCTCCGGGTGAAT-3′；

下游引物P2的碱基序列为：5′-GGGCACTGGTGAGAGGATAGGC-3′。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为：

95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30～35个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的聚丙烯酰胺凝胶中，聚丙烯酰胺的质量浓度是12％。

优选的，将TT基因型作为提高郏县红牛或南阳黄牛的生长性状的分子遗传标记。

优选的，将TT基因型作为提高郏县红牛的胸围、腹围、腰角宽以及十字部高性状的分子遗传标记。

优选的，将TT基因型作为南阳黄牛的体斜长性状的分子遗传标记。

本发明基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法，表明Angptl8基因第-308位的单核苷酸多态性能够作为提高郏县红牛胸围、腹围、腰角宽、十字部高和南阳黄牛体斜长的分子遗传标记，用于黄牛的分子育种，对提高黄牛的生长性状、改良黄牛品种具有重要作用，有助于快速建立遗传资源优良的黄牛种群；

本发明鉴定出Angptl8基因第-308位的单核苷酸多态性的方法，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。

附图说明

图1为黄牛Angptl8基因扩增包含第-308位的多态位点的148bpPCR产物的琼脂糖电泳结果图；

图2为HinfIforced-PCR-RLFP方法检测黄牛Angptl8基因5’侧翼区SNP序列分析图；

图3为黄牛Angptl8基因第-308位不同基因型聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；

图4为Angptl8基因第-308位的SNP多态性测序结果图。

具体实施方式

本发明根据已公布牛Angptl8基因(NCBI：AC_000164.1)的序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛Angptl8基因的部分序列与NCBI公布的序列(NCBI：AC_000164.1)进行对比，发现在Angptl8基因的第-308位存在SNP多态性，将其用于中国黄牛生长形状的分子育种，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。下面结合具体样本的Angptl8基因单核苷酸多态性和生长性状的关联性对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、以下实施例中所用的主要试剂来源

1、生化试剂与生物学试剂

TaqDNA聚合酶，购自北京天根生化科技有限公司；

2×buffer，内含Mg²⁺、dNTPs等，购自北京天根生化科技有限公司Mix；

限制性内切酶HinfI，购自TAKARA公司；

蛋白酶K，购自华美生物工程公司；

MarkerDL500，购自TAKARA公司。

2.普通试剂

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、硼酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、乙酸、蔗糖、琼脂糖等。

3.溶液及其制备方法、缓冲液及其制备方法

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

(1)样品采集所用溶液

抗凝剂ACD：柠檬酸2.4g，柠檬酸三钠6.6g，葡萄糖7.35g，定容至50mLddH₂O中，高压灭菌。每10mL新鲜血液中加入0.2mL的ACD液。这一抗凝剂优于肝素，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-80℃长期保存。

(2)血样基因组DNA分离所用溶液

①PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌。

②10％SDS：10gSDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL。

③0.5mol/LEDTA：EDTA186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

④1mol/LTris·HCl：121.14gTris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存。

⑤5mol/LNaCl：NaCl292.2g溶于1000mL超纯水中。

⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mol/LEDTA40mL，1mol/LTris·HCl10mL，5mol/LNaCl4mL，10％SDS20mL，超纯水定容至100mL。实际浓度为200mmol/LEDTA，pH8.0；100mmol/LTris·HCl，pH8.0；200mmol/LNaCl，2％SDS。RNase20μg/mL。

⑦NaAc缓冲液：NaAc·3H₂O20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL。

⑧TE缓冲液：1mol/LTris·HCl(pH8.0)1mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.02mL，超纯水定容至100mL，高压灭菌，4℃保存。

⑨蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存。

(3)琼脂糖电泳分析所用溶液

①1×TBE缓冲液：取10×TBE100mL定容至1000mL。

②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

二、黄牛Angptl8基因PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛Angptl8(GenBank：AC_000164.1)序列为参考，利用Primer5.0设计能够包含黄牛Angptl8基因第-308位的PCR引物对P’(包括上游引物P’1和下游引物P’2)，其碱基序列如下：

上游引物P’1的碱基序列，如SEQIDNO.1所示，为：5′-CCAGCAGAGCCTTTGTCAT-3′；

下游引物P’2的碱基序列，如SEQIDNO.2所示，为：5′-AGCCTCCGTTTCCCATCT-3′。

以包含上游引物P’1和下游引物P’2的引物对P’为引物，对黄牛基因组DNA进行PCR扩增，能够扩增包含黄牛Angptl8基因(AC_000164.1序列)第-726～-233区段的494bp的基因片段，其碱基序列如SEQIDNO.3所示，对扩增的片段进行测序鉴定后，并与NCBI公布的序列进行比对，发现Angptl8基因第-308位存在SNP多态性。其中，第-342～-273区段的序列如下所示：

CTGTGTGATAGCAGTGGGGCAGCTCCGGGTGAACACTGGCGATCATAAAAGCCTCACCGTTATTGTCGT；

由于第-308位所在位置没有自然酶切位点，需重新设计酶切引物对P，即上游引物P1和下游引物P2。其中上游引物P1的第19位引入错配碱基T，与SNP共同构成HinfI的酶切位点。上游引物P1和下游引物P2的碱基序列如下：

上游引物P1的碱基序列，如SEQIDNO.4所示，为：5′-GGGGCAGCTCCGGGTGAAT-3′，

下游引物P2的碱基序列，如SEQIDNO.5所示，为：5′-GGGCACTGGTGAGAGGATAGGC-3′。

其中，上游引物P1中的“T”表示为了形成酶切位点引入的错配碱基，它可与-308位的SNP共同构成HinfI的识别位点。

以包含上游引物P1和下游引物P2的引物对P为引物，对黄牛基因组进行PCR扩增，能够扩增包含黄牛Angptl8基因(AC_000164.1序列)第-327～-180区段的148bp的基因片段，其碱基序列如SEQIDNO.6所示，其PCR产物琼脂糖电泳结果如图1所示，其中，泳道1～6为检测片段，泳道M为MarkerDL500(500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp)。

当引物对P扩增Angptl8基因的第-312～-308的序列为GAATT时，其不能被限制性内切酶HinfI识别；当上述该位点发生T＞C突变时，PCR扩增Angptl8基因的第-312～-308的序列为GAATC，此时能被限制性内切酶HinfI所识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

三、以引物对P进行PCR扩增待测黄牛Angptl8基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以5个中国地方黄牛品种共计465个个体作为检测对象，具体样本基本情况见表1。(所有样本均为血样，从供试牛颈静脉采集，ACD抗凝。)

表1试验牛基本信息

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K(20mg/mL)至3μL并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(体积比为24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(体积比为25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，紫外分光光度计测其浓度，然后稀释至50ng/μL的工作液。

3、PCR扩增

以包含Angptl8基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Angptl8基因，获得PCR扩增产物。

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1.5mL离心管中，混匀后瞬时离心，分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

15μL反应体系包括0.5UTaqDNA聚合酶，2×Buffer7.5μL(内含Mg2+、dNTPs等)，50ng/μL含Angptl8基因的黄牛基因组DNA1.0μL，10pmol/μL的上游引物P10.25μL，10pmol/μL的下游引物P20.25μL；

PCR反应程序：

对5个黄牛品种的465个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得465个个体的黄牛Angptl8基因中包含该SNP位点的148bp的DNA片段。

四、用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物

用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段，即用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增的Angptl8基因片段。

1、HinfI酶切反应消化体系(20μL)：5μLPCR产物，10×HBuffer缓冲液2.0μL，HinfI(10U/μL)0.5μL，灭菌超纯水(H₂O)12.5μL。

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

五、对酶切产物片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛Angptl8基因第-308位具有单核苷酸多态性，即HinfI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

1、制作12％的聚丙烯酰胺凝胶，点样后200V电压电泳2h，电泳结束后硝酸银染色，聚丙烯酰胺凝胶中，聚丙烯酰胺的质量浓度是12％；

2、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Angptl8基因第-308位的单核苷酸多态性：

PCR扩增Angptl8基因第-312～-308位的序列为GAATT时，其不能被限制性内切酶HinfI识别；当上述该位点发生T＞C突变时，PCR扩增Angptl8基因第-312～-308的序列为GAATC，此时能被限制性内切酶HinfI所识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

因此，黄牛基因组的Angptl8基因第-308位的SNP多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为：TT基因型表现为148bp一条条带；CC基因型表现为132bp和16bp两条条带；TC基因型表现为148bp、132bp、16bp三条条带。

图2为HinfIforced-PCR-RLFP方法检测黄牛Angptl8基因5’侧翼区SNP(AC_000164.1：g.-308T＞C)序列分析图。图2中，分别对应上游和下游引物序列，或表示突变位点，GAATC表示内切酶识别序列，T表示引入的错配碱基。AC_000164.1_g.Angptl8代表牛Angptl8基因5’侧翼区的NCBI公布的序列；g.Angptl8_5’F1anking-RegionTT代表牛Angptl8基因5’侧翼区的AC_000164.1：g.-308T等位基因的序列；g.Angptl8_5’Flanking-RegionCC代表牛Angptl8基因5’侧翼区的AC_000164.1：g.-308C等位基因的序列。

图3为黄牛Angptl8基因第-308位不同基因型聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图，结果表明：TT基因型个体(148bp)；CC基因型个体(132bp，16bp)；TC基因型个体(148bp，132bp，16bp)；M：DL500(500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp)。

需要说明的是，16bp是根据扩增的PCR产物中所含酶切位点的位置分析出来的，理论上应该有，但是由于16bp条带太短，在琼脂糖凝胶电泳还是聚丙烯酰胺凝胶电泳时会跑出胶外，在胶图上不显示，但不影响带型的判定。

3、不同基因型个体PCR产物的测序验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行反向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含148bp，132bp和16bp条带的杂合子TC基因型个体其-308位的测序结果的确表示为T或C(由于是反向测序，这里的峰图表现为互补序列A或G)，如图4所示，自左向右第7个峰为两个峰。而TT、CC基因型分别为T和C，测序峰图表现为互补序列A和G，为单一峰，如图4所示。需要说明的是，为突变位点，“方框”为该位点引物中引入的错配碱基。

六、黄牛Angptl8基因SNP位点的频率统计分析

1)基因型频率和等位基因频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

等位基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+......+N_Tan)/2N式中，PT表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1～an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为：

P_T＝(2N_TT+N_TC)/2N

P_C＝(2N_CC+N_TC)/2N

式中，P_T，P_C分别表示等位基因T和C等位基因的频率，N_TT、N_TC和N_CC分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

如表3所示的基因频率分布表，在不同黄牛品种中，Angptl8基因SNP位点的T等位基因频率变化幅度在44.2％～76.2％，C等位基因频率变化幅度在23.8％～55.8％之间。符合等位基因频率大于1.0％的SNP的定义，故本位点为单核苷酸多态位点。

表3黄牛Angptl8基因第-308位的基因型和等位基因频率分布表

七、黄牛Angptl8基因SNP位点基因效应的关联性分析

分别分析TT基因型与黄牛生长性状、CC基因型与黄牛生长性状、TC基因型与黄牛生长性状的关联性，找出有利于黄牛生长性状的基因型。

基因型数据：HinfI识别的基因型(TC和CC)

生产数据：郏县红牛成年体尺性状，包括体高、体斜长、胸围、腹围、腰角宽、坐骨端宽、十字部高、体重、重高比；南阳黄牛不同月龄生长性状，包括初生重，6月龄、12月龄、18月龄和24月龄的体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽和平均日增重。

关联性分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(18.0)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BFi+M_onthj+G_k+e_ijkl

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，M_onthj为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

郏县红牛的结果表明(见表4)：在郏县红牛群体中，TT基因型个体的胸围、腰角宽、十字部高均显著高于TC基因型个体(P＜0.05)，TT基因型个体的腹围极显著高于TC基因型个体(P＜0.01)，表明TT基因型有利于郏县红牛胸围、腹围、腰角宽以及十字部高性状的提高，TT基因型可以作为提高郏县红牛的胸围、腹围、腰角宽以及十字部高性状的分子遗传标记，用于郏县红牛的分子育种。

南阳黄牛的结果表明(见表5)：在南阳黄牛群体中，18月龄和24月龄TT基因型个体的体斜长显著高于TC基因型个体(P＜0.05)，表明TT基因型有利于提高南阳黄牛的体斜长形状，TT基因型可以作为提高南阳黄牛体斜长性状的分子遗传标记，用于南阳黄牛的分子育种。

表4Angptl8基因第-308位多态性位点与郏县红牛生产指标间的方差分析

注：数字肩部具有不同字母a或b，表示差异显著(P＜0.05)；具有不同字母A或B，表示差异极显著(P＜0.01)；具有相同的字母，表示差异不显著(P＞0.05)。

表5Angptl8基因第-308位多态位点与南阳黄牛初生重及各月龄生产指标间的方差分析

注：数字肩部具有不同字母a或b，表示差异显著(P＜0.05)；具有不同字母A或B，表示差异极显著(P＜0.01)；具有相同的字母，表示差异不显著(P＞0.05)。

Claims (6)

1.一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法，其特征在于，

以包含Angptl8基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Angptl8基因，获得PCR扩增产物；

用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段；

对酶切产物片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛Angptl8基因中第-308位具有单核苷酸多态性，所述单核苷酸多态性为：TT基因型表现为148bp一条条带；CC基因型表现为132bp和16bp两条条带；TC基因型表现为148bp、132bp和16bp三条条带；

分别分析TT基因型与黄牛生长性状、CC基因型与黄牛生长性状、TC基因型与黄牛生长性状的关联性，得出TT基因型有利于黄牛生长性状的提高；

将TT基因型作为提高黄牛生长性状的分子遗传标记，用于黄牛的分子育种；

所述引物对P包括上游引物P1和下游引物P2，其中，

上游引物P1的碱基序列为：5′-GGGGCAGCTCCGGGTGAAT-3′；

下游引物P2的碱基序列为：5′-GGGCACTGGTGAGAGGATAGGC-3′。

2.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：

95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的聚丙烯酰胺凝胶中，聚丙烯酰胺的质量浓度是12％。

4.根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，将TT基因型作为提高郏县红牛或南阳黄牛的生长性状的分子遗传标记。

5.根据权利要求4所述的分子育种方法，其特征在于，将TT基因型作为提高郏县红牛的胸围、腹围、腰角宽以及十字部高性状的分子遗传标记。

6.根据权利要求4所述的分子育种方法，其特征在于，将TT基因型作为南阳黄牛的体斜长性状的分子遗传标记。