CN109082473A - 一种公牛znf280ay基因拷贝数变异的检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法及应用,方法包括：以公牛基因组DNA为模板，利用PCR扩增引物对，该PCR扩增引物对包括引物对P1和引物对P2，通过实时定量PCR分别扩增牛种ZNF280AY基因和SRY参照基因，根据定量结果计算公牛ZNF280AY基因的拷贝数。本发明采用基于荧光定量PCR的拷贝数变异检测方法，该方法具有灵敏度高，成本低，操作简单快捷，便于实验室常规操作的优点；还可实现大样本检测。此外，本发明将拷贝数变异与繁殖性状作关联性分析，以期将ZNF280AY基因作为公牛繁殖性状选择的有效分子标记，从而加速公牛繁殖力的选育效果。

Description

一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种公牛ZNF280AY基因(Zinc fingerprotein 280A，Y-linked)拷贝数变异的检测方法及应用。该检测方法利用qPCR技术，以SRY基因(Sex-determining region Y)为参照，采用校正样本绝对定量的方法来计算检测样本ZNF280AY基因的拷贝数，并将拷贝数变异与种公牛繁殖性状进行关联分析。

背景技术

随着分子生物学的不断发展，基因组结构变异研究的不断深入，学者们挖掘出越来越多的基因组结构变异类型。拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)成为继微卫星(Simple Sequence Repeat，SSR)和单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)之后新的基因组结构变异类型。大量的研究报道CNV在人类疾病易感性方面扮演着重要角色，比如CCL3L1基因和HIV、AIDS，FCGR3B基因和血管球性肾炎，DEFB4A基因和克罗恩病等，证实了基因CNV参与调节神经功能、细胞生长、物质代谢和疾病发生。随着牛全基因组测序工作的完成，大量的研究报道了牛基因组上CNV和牛数量性状密切相关，通过结合CNVs和SNPs为牛种全基因组关联性分析(GWAS)选择重要经济性状的候选基因提供有力支撑，从而加快育种进程和提高遗传改良效果。

牛作为反刍动物的代表，是哺乳动物的重要分支，研究牛基因组结构，尤其是Y染色体结构为反刍动物及哺乳动物的生物特性及进化提供重要参考。2009年美国哈佛大学的研究人员完成了牛Y染色体的组装。2013年通过睾丸转录组测序进一步研究了牛Y染色体的结构，研究结果表明牛Y染色体是牛所有染色体中最短的染色体(～51Mb)，由拟常染色体区(～6Mb)和不与X染色体发生同源重组的雄性特异区(～45Mb)两部分组成。拟常染色体区位于Y染色体短臂的末端，它在减数分裂时可以和X染色体上的同源序列发生重组。雄性特异区主要由三部分组成：X-退化区、Y-扩增区和Y-转移区。X-退化区中包含12个单拷贝基因，这些单拷贝基因大多在X染色体上有同源基因并在机体各组织中广泛表达。Y-扩增区长达34.8Mb占据雄性特异区的85％，主要包含5个多拷贝基因家族(HSFY、TSPY、ZNF280AY、ZNF280BY、EGLY)，这些多拷贝基因家族在进化过程中大量扩增，并在睾丸组织中主要或者特异性表达。Y-转移区中包含的两个多拷贝基因家族TSPY和PRAMEY同样也在睾丸组织中特异性的表达，暗示这些多拷贝基因对雄性睾丸发育、精子发生起到重要作用，通过对多拷贝基因HSFY、TSPY、ZNF280BY和PRAMEY拷贝数变异的研究验证了这些基因拷贝数变异与公牛繁殖性状显著相关。对于牛Y染色体雄性特异区(MSY)基因功能的研究能够促进关于雄性特征及精子发生的相关研究。此外，通过挖掘与雄性繁殖性状相关的候选基因对雄性家畜繁殖力的早期选择和育种工作的实施提供重要的理论依据。

ZNF280AY基因为牛科动物Y染色体上特有的多拷贝基因，编码一种锌指蛋白。锌指蛋白是哺乳动物基因组中最庞大的家族之一，具有非常广泛的生物学作用。ZNF280AY基因通过位于17号常染色体上的同源基因ZNF280A转位获得。根据锌指蛋白的功能推测ZNF280AY基因可能起重要的转录调控作用。ZNF280AY基因拷贝数的变异可能会导致Y染色体结构的改变及相应基因表达量的变化，并可能与公牛的繁殖形状相关。但截至目前，尚未发现有关检测牛ZNF280AY基因拷贝数变异的方法报道。因此，检测牛ZNF280AY基因拷贝数可以研究牛Y染色体的结构变异，研究ZNF280AY基因拷贝数变异与公牛繁殖性状的相关关系，鉴定ZNF280AY基因作为公牛繁殖力早期选育的分子标记，加快育种进程。

发明内容

针对现有技术存在的问题以及研究牛ZNF280AY基因拷贝数变异的重要意义，本发明提供一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法及应用。通过利用已测序验证为单拷贝SRY基因作为参照，采用绝对定量的方法来鉴定ZNF280AY基因的拷贝数。并且在本发明中为了提高结果的准确性，根据标准化实时荧光定量操作要求进行严格的实验操作，采取的实验方案包括：确保提取高质量的基因组DNA，进行严格的目标基因引物设计，通过PCR鉴定所设计引物的雄性特异性，通过标准曲线的建立，来评价qPCR的扩增效率，确定目的基因和参照基因具有较高的扩增效率，同时设立校正样本，减少不同qPCR扩增批次间的实验误差。

本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的PCR扩增引物对，包括引物对P1和引物对P2，所述引物对P1由上游引物F1和下游引物R1组成，所述引物对P2由上游引物F2和下游引物R2组成，所述上游引物F1、所述下游引物R1、所述上游引物F2和所述下游引物R2分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

第二个方面，本发明提供一种用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的试剂盒，所述试剂盒包括上述PCR扩增引物对。

第三个方面，本发明提供一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法，包括以下步骤：以公牛基因组DNA为模板，利用上述PCR扩增引物对，通过实时定量PCR分别扩增牛种ZNF280AY基因和SRY参照基因，根据定量结果计算公牛ZNF280AY基因的拷贝数。

进一步地，所述利用上述PCR扩增引物对，通过实时定量PCR分别扩增牛种ZNF280AY基因和SRY参照基因的具体反应过程为：qPCR扩增体系以10μL计为：5ng/μL模板DNA 1μL，10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR GreenqPCR Mix 5μL，去离子水3μL，加样后混合均匀，先于95℃预变性3min；再于95℃变性10s，降温至62.5℃退火30s，升温至72℃延伸30s，该过程进行39个循环；最后于72℃终延伸5min。

第四个方面，本发明提供公牛ZNF280AY基因拷贝数变异作为分子标记在公牛辅助选择和分子育种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明采用基于荧光定量PCR的拷贝数变异检测方法，该方法与多重连接探针扩增、AccuCopy多重CNV检测、荧光原位杂交技术相比具有灵敏度高，成本低，操作简单快捷，便于实验室常规操作的优点；还可实现大样本检测，克服了测序法成本高和探针杂交法信噪比高的缺点。此外，本发明将拷贝数变异与繁殖性状作关联性分析，以期将ZNF280AY基因作为公牛繁殖性状选择的有效分子标记，从而加速公牛繁殖力的选育效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中的引物对P1和引物对P2雄性特异性鉴定电泳图。

图2为本发明实施例1中ZNF280AY和SRY基因标准曲线，其中，图2-1为ZNF280AY基因标准曲线，图2-2为SRY基因标准曲线。

图3为本发明实施例1中ZNF280AY基因和SRY基因qPCR溶解曲线。

图4为本发明实施例2中不同牛品种ZNF280AY基因拷贝数的箱线图分析。。

图5为本发明实施例2中不同血统来源黄牛ZNF280AY基因中值拷贝数的比较图。

图6为本发明实施例2中ZNF280AY基因拷贝数变异与精子密度(6-1)和精子畸形率(6-2)的关联性分析图，其中图6-1为ZNF280AY基因拷贝数变异与精子密度的关联性分析图，图6-2为ZNF280AY基因拷贝数变异与精子畸形率的关联性分析图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例利用实时荧光定量PCR技术对牛科动物特有的Y染色体ZNF280AY基因拷贝数变异进行检测，主要包括以下步骤：

一、公牛冻精样本的采集及基因组DNA的提取

1、冻精细管样本的采集

本实施例采集荷斯坦牛、西门塔尔牛、夏洛莱牛、利木赞牛和安格斯牛5个品种的冻精样本，每个样本3支冻精，运输过程中置于液氮罐中，实验室中置于-80℃超低温冰箱备用。具体信息如表1所示。这些收集的冻精样品中107头西门塔尔牛具有精液质或睾丸大小记录、142头荷斯坦牛具有精子质量参数，可以作为公牛繁殖性状评定的重要指标。

表1冻精样品来源表

2、冻精基因组DNA的提取

(1)取2mL离心管，放入一整支细管冻精(约250μL)。

(2)加入500μL生理盐水涡旋混匀，12000rpm离心1min，倒去上清液保留沉淀(透明冻精12000rpm离心2min)。

(3)重复步骤(2)一次。

(4)向沉淀中加入400μL牛冻精裂解液，再加入100μL 20％SDS，涡旋，使沉淀完全溶于裂解液，再加入20μL蛋白酶K，颠倒混匀。

(5)将混匀的样品放到56℃分子杂交炉中，消化20-22h左右。

(6)取消化好的样品，向离心管中加入300μL饱和食盐水，颠倒2-3min，放入冰箱静置10min。4℃离心机12000rpm离心10min。将离心后的上清转移到新的离心管中，弃掉沉淀。

(7)向离心管中加入1000μL冰镇的无水乙醇，颠倒1-2min，12000rpm离心2min，弃掉上清液，保留DNA沉淀。

(8)向离心管中加入500μL 75％酒精，颠倒1-2min，12000rpm离心2min，弃掉上清液，保留DNA沉淀。

(9)重复步骤(7)一次，开盖放置5min左右，使残余的酒精挥发。

(10)向离心管中加入300μL 56℃的TB(如果沉淀较少，则用200μL)，4℃过夜使DNA沉淀充分溶解，用紫外分光光度计和凝胶电泳检测提取质量。

(11)将检测合格的基因组DNA放置于4℃暂时保存或-20℃长期保存。

上述牛冻精裂解液的配方见表2(以80mL为例)：

表2牛冻精裂解液配方表

二、公牛血液、组织样本的采集及基因组DNA的提取

1、公牛血液、组织样本及DNA原液的采集

本实施例中除收集冻精样本以外，还采集了13个中国地方牛种以及2个国外瘤牛牛种，其中地方牛种中，西藏黄牛采集耳组织样，其余牛种均采集血液样本。具体信息见表3。

表3 15个牛品种样品信息表

2、公牛血液、组织样本基因组DNA的提取

2.1、公牛血液样本基因组DNA的提取

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)，充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀消失，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管中。(5)加氯仿500μL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的超纯水溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，-20℃保存。

2.2、公牛耳组织样本基因组DNA的提取

(1)剪取部分耳组织样品放于DEPC水处理过的研钵中充分研磨至粉末，研磨过程中使样本处于液氮中，取10mg粉末加入1.5mL Eppendorf管中。

(2)在离心管中加入组织裂解液700μL，充分混匀，使组织细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。

剩余步骤与血液DNA提取相同。

2.3、基因组DNA质量检测

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD 260/OD280的比值。如OD 260/OD 280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

(3)DNA原液的稀释

本发明中为了得到更加准确的定量结果，按照标准qPCR的要求将实验中检测样本的部分DNA统一稀释至5ng/μL。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD 260值×稀释倍数

3、目标基因及参考基因的扩增

(1)目标基因及参考基因引物设计

Y染色体基因组测序的海福特公牛表明基因ZNF280AY具有80个拷贝。利用NCBI中的Splign工具将ZNF280AY基因的mRNA序列(GenBank acc.no.HQ014564)比对到牛Y染色体基因组草图(GenBank acc.no.CM001061.2)，通过比对得到80条位于不同基因座的同源序列，并用MEGA5.0软件做调准，用Primer Premier 5.0软件在序列的保守区设计qPCR引物。参照基因SRY为已知的牛Y染色体单拷贝基因，其引物对序列信息如表4所示。

表4 qPCR引物信息

(2)目标基因及参考基因引物的雄性特异性鉴定

通过PCR检测所设计引物的雄性特异性。根据PCR产物电泳图(如图1所示)，参照基因和目标基因在公牛基因组DNA中有明亮条带(泳道2、5)，在阴性对照母牛基因组DNA(泳道1、4)和空白对照ddH2O(泳道3、6)中均没有扩增条带，且扩增长度与设计长度一致，表明所设计的引物为雄性特异性引物，可用于后期的qPCR。其中，PCR扩增分别以公牛基因组DNA，母牛基因组DNA和灭菌超纯水为模板，用设计的目的基因引物对P1和参照基因引物对P2进行PCR扩增，PCR反应体系计为25μL，见表5；PCR反应程序，见表6。

表5 PCR反应体系

表6 PCR反应程序

(3)目标基因及参考基因引物标准曲线的构建及qPCR扩增

随机选取一头公牛的基因组DNA，将原始浓度依次稀释为：40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL和2.5ng/μL。以不同浓度DNA为模板得到的Ct值绘制标准曲线，利用公式E＝10-1/slope计算得到SRY和ZNF280AY的引物效率分别为1.95和2.00，均达到qPCR引物扩增效率要求。通过绘制目标基因与参照基因的标准曲线(如图2所示)和溶解曲线(如图3所示)来确定引物是否适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各检测样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(如图3所示)。

其中，进行qPCR所用的扩增体系为10μL：DNA模板1μL，10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix 5μL，去离子水3μL。

qPCR扩增反应程序为：(1)预变性：95℃3min；(2)扩增反应：95℃变性10s，62.5℃退火30s，72℃延伸30s，39个循环；(3)延伸：72℃延伸5min；(4)绘制溶解曲线：65℃～95℃，0.01℃/s。

qPCR反应体系加到96孔加样板中，每板设置校正样本和阴性对照，在加样板上同时检测校正样本和检测样本ZNF280AY基因及SRY基因的Ct值，每个样本做两个技术重复。

4.拷贝数的计算

每个样品分别用目标基因和参照基因的引物进行扩增，并且每个个体做2个技术重复。目标基因的拷贝数计算利用以下三个公式。

首先将每板中校正样本的Ct值平均，利用平均值计算校正样本的拷贝数：

接着利用校正样本的平均值，将不同板中的样本校正到同一个水平。即计算检测样本跟校正样本的校正系数：

最后利用校正样本的拷贝数以及各检测样本相对校正样本的校正系数计算各检测样本的拷贝数：

检测样本拷贝数＝校正样本拷贝数×校正系数 (公式三)

其中校正样本为随机选取一头DNA质量较好的荷斯坦公牛样本。在上述公式中E为引物的扩增效率。

实施例2

1.不同牛种ZNF280AY基因拷贝数的鉴定。

本实施例中，鉴定不同牛种(表3、表4)ZNF280AY基因拷贝数变异范围和中值拷贝数(表7、图4)。

表7 20个牛品种ZNF280AY基因的拷贝数变异

通过数据分析得出ZNF280AY基因拷贝数在种间和种内存在显著差异，在总体检测样本中的中值拷贝数为48，拷贝数从11到154之间变化(表7)。其中吉尔牛拷贝中值数最高，为76。而安西牛拷贝中值数最低，为14(如图4所示)。此外，利用非参数U检验分析不同Y染色体单倍型之间ZNF280AY基因拷贝数的变异，发现ZNF280AY基因中值拷贝数在Y1单倍群中(40)显著的低于Y2(53)和Y3(57)单倍群(p<0.001；图5)，但在Y2与Y3单倍型中没有显著差异，结果说明不同Y染色体单倍群具有不同的ZNF280AY中值拷贝数。另外将所有检测的个体分为普通牛(Y1和Y2)和瘤牛(Y3)，基于两独立样本的非参数U检验，表明普通牛和瘤牛的ZNF280AY基因拷贝中值数存在显著差异，即普通牛群体的拷贝中值数(46)显著的低于瘤牛群体的拷贝中值数(57)(p<0.001；图5)，普通牛群体与瘤牛群体拷贝中值数的差异可能与其Y染色体结构的差异有关。

2.ZNF280AY基因拷贝数变异与繁殖性状的关联分析

利用皮尔逊相关分析(Pearson’s correlation)分析ZNF280AY基因拷贝数与107头西门塔尔牛及142头荷斯坦牛繁殖性状(精液品质参数或睾丸大小)的相关关系(表8、表9、表10)。

表8 ZNF280AY基因CNV与42头西门塔尔牛精液品质的关联分析

表9 ZNF280AY基因CNV与65头西门塔尔牛24月龄睾丸大小的关联分析

表10 ZNF280AY基因CNV与142头荷斯坦牛精液品质的关联分析

本次发明中，利用皮尔逊相关分析检测ZNF280AY基因拷贝数与荷斯坦牛和西门塔尔牛雄性繁殖性状的关系。结果表明，在107头西门塔尔牛品种中ZNF280AY基因拷贝数与公牛的精液品质参数或睾丸大小均无显著性的相关性(p>0.05；表8、表9)；在142头荷斯坦牛中ZNF280AY基因拷贝数与精子密度呈显著负相关(r＝-0.148，p＝0.042；图6-1)，而与精子畸形率呈显著正相关(r＝0.206，p＝0.008；图6-2)，与射精量、原精活力、解冻后活力均无显著相关(p>0.05；表10)，说明公牛个体中ZNF280AY基因的拷贝数越高对应公牛的精子畸形率越高，精子密度越低。进一步推测ZNF280AY基因可能在精子发生后期的成熟过程中扮演重要角色。

综上，在本发明具体实施例中，采用基于荧光定量PCR的拷贝数变异检测方法，该方法与多重连接探针扩增、AccuCopy多重CNV检测、荧光原位杂交技术相比具有灵敏度高，成本低，操作简单快捷，便于实验室常规操作的优点；还可实现大样本检测，克服了测序法成本高和探针杂交法信噪比高的缺点。此外，本发明具体实施例将拷贝数变异与繁殖性状作关联性分析，以期将ZNF280AY基因作为公牛繁殖性状选择的有效分子标记，从而加速公牛繁殖力的选育效果。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种公牛 ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaacagggt gggaaact 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctatggacag catacaagag at 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaattaagc cggtcacagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacaagaaa gtccaggctc 20

Claims (5)

1.一种用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的PCR扩增引物对，其特征在于，包括引物对P1和引物对P2，所述引物对P1由上游引物F1和下游引物R1组成，所述引物对P2由上游引物F2和下游引物R2组成，所述上游引物F1、所述下游引物R1、所述上游引物F2和所述下游引物R2分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.一种用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR扩增引物对。

3.一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以公牛基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的PCR扩增引物对，通过实时定量PCR分别扩增牛种ZNF280AY基因和SRY参照基因，根据定量结果计算公牛ZNF280AY基因的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法，其特征在于，所述利用上述PCR扩增引物对，通过实时定量PCR分别扩增牛种ZNF280AY基因和SRY参照基因的具体反应过程为：qPCR扩增体系以10μL计为：5ng/μL模板DNA 1μL，10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix 5μL，去离子水3μL，加样后混合均匀，先于95℃预变性3min；再于95℃变性10s，降温至62.5℃退火30s，升温至72℃延伸30s，该过程进行39个循环；最后于72℃终延伸5min。

5.公牛ZNF280AY基因拷贝数变异作为分子标记在公牛辅助选择和分子育种中的应用。