CN103605913B - 一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定方法，本发明属于基因组分子标记技术领域，具体步骤如下：1）在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点；2）建立子代和亲本的基因型数据库文件，利用Cervus3.0软件获得各SNP位点的遗传参数；3）利用Cervus3.0软件，根据各位点的等位基因频率进行家系模拟鉴定分析，然后进行实际家系鉴定分析，计算候选亲本对的LOD值，选择LOD值最高且为正值的亲本对作为真正父母本。本发明开发出一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的SNP标记方法，并优化了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明这些引物具有重复性好、稳定性高、溶解曲线分辨率高等特点，为太平洋牡蛎的家系选育奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于基因组分子标记技术领域，涉及一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的方法。
背景技术
牡蛎隶属软体动物门、双壳纲、珍珠贝目，其肉味鲜美，营养丰富，从远古时代就被人类所食用，具有很高的经济价值和药用价值。牡蛎为世界性分布类群，目前已发现100多种，世界各临海国家几乎都有生产，是目前我国及世界产量最大的经济贝类。
作为世界第一大养殖贝类，牡蛎的遗传改良历来受到国内外专家和学者的普遍重视，并开展了大量研究工作。我国虽然是牡蛎养殖大国，但还并不是牡蛎养殖强国，存在遗传改良研究相对滞后、遗传基础研究相对薄弱、良种匮乏等问题，严重影响和制约了我国牡蛎的健康养殖及遗传改良工作。家系选择育种是保持优良经济性状以及获得优良品种和品系的重要手段，已在动植物中广泛应用。完整、准确的系谱信息能够避免近交、保持物种的遗传多样性，对促进贝类的遗传改良工作有重要的现实意义。SNP（单核苷酸多态性）是指DNA序列上的单个碱基变异，是继微卫星标记后的第三代分子遗传标记，具有基因组分布广、易于检测、高遗传稳定性等优点，在家系鉴定中有着明显的优势。高分辨熔解曲线（HRM）是一种基于高分辨率溶解分析的SNP分型新技术，具有高通量、低成本、易操作的特点，已广泛应用于遗传学、基因组学、生物学等领域的研究。利用现代分子标记新技术，建立一套适用于太平洋牡蛎的SNP家系鉴定体系，将为确定个体间亲缘关系提供有效途径，为避免近交衰退提供有力的科学依据，为牡蛎的家系选育、构建近交系、种质资源保护等研究工作奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的方法，有助于快速、准确鉴别不同家系的太平洋牡蛎，为太平洋牡蛎的家系选育和种质资源保护有重要的应用价值。
一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的方法，具体步骤如下：
1）在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点，所述的突变位点为C/T&G/A和C/A&G/T；
2）建立子代和亲本的基因型数据库文件，利用Cervus3.0软件获得各SNP位点的遗传参数；
3）利用Cervus3.0软件，根据各位点的等位基因频率进行家系模拟鉴定分析，然后进行实际家系鉴定分析，计算候选亲本对的LOD值，选择LOD值最高且为正值的亲本对作为真正父母本，计算家系鉴定成功率。
进一步，所述的实际家系鉴定分析的步骤包括提取亲本和子代的DNA，构建PCR反应体系，在Roche LightCycler480进行HRM分析。
进一步，所述的实际家系鉴定分析中的PCR引物为表1中的任何一对。
进一步，所述的实际家系鉴定分析中的PCR反应体系为10μl：5ng/μL模板DNA1μＬ，Roche HRM Master5μＬ，25ng/ul MgCl21.2-1.4μＬ，10ng/ul引物各0.2μL余量双蒸水补足；PCR扩增条件为：94℃预变性10min，94℃变性10s，62-55℃退火10s，72℃延伸5s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
进一步，所述的实际家系鉴定分析中PCR引物的筛选方法：
1）在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点（C/T&G/A，C/A&G/T），在位点的侧翼序列利用Primer3.0（http://primer3.ut.ee/）设计引物；设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现；2）利用Qiagen试剂盒提取个体太平洋牡蛎基因组DNA，用PicoGreen荧光染料试剂盒进行DNA的定量分析，将样品DNA浓度调整至5ng/μL，用于SNP标记的筛选和优化；
3）以定量后的DNA做模板使用Roche LightCycler480进行HRM检测，通过改变退火温度和Mg2+浓度筛选出扩增效率高、溶解曲线清晰的引物，并获得最优的PCR反应体系和引物的最佳退火温度。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明开发出一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的方法，并优化了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明这些引物具有重复性好、稳定性高、溶解曲线分辨率高等特点，可应用于太平洋牡蛎的家系亲权鉴定分析，为太平洋牡蛎的家系选育奠定基础。
附图说明
图1：191-153位点中等位基因在亲本和子代的遗传；
图2：亲本鉴定的LOD值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
1）引物设计和优化。
在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点（C/T&G/A，C/A&G/T），在位点的侧翼序列利用Primer3.0（http://primer3.ut.ee/）设计引物。设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。引物长度为18-30bp,退火温度为55-65℃，扩增片段长度为50-180bp。利用Qiagen试剂盒提取6个个体太平洋牡蛎基因组DNA，用PicoGreen荧光染料试剂盒进行DNA的定量分析，将样品DNA浓度调整至5ng/μL，用于SNP标记的筛选和优化。以定量后的DNA做模板使用Roche LightCycler480进行HRM检测，通过改变退火温度和Mg2+浓度筛选出扩增效率高、溶解曲线清晰的引物，并获得最优的PCR反应体系和引物的最佳退火温度。10μl PCR反应体系如下：5ng/μL模板DNA1μL，Roche HRMMaster5μＬ，25ng/ulMgCl21.4μＬ，10ng/ul引物各0.2μL，余量双蒸水补足。PCR扩增条件为：94℃预变性10min，94℃变性10s，62-55℃退火10s，72℃延伸5s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
2）牡蛎基因组DNA提取及定量。
对所有18个候选亲本和78个子代用Qiagen试剂盒提取基因组DNA，利用PicoGreen荧光染料试剂盒进行DNA的定量分析，调整终浓度至5ng/μL，4℃保存用于家系鉴定分析。
3）基于HRM的SNP家系鉴定体系的构建
在Roche LightCycler480进行HRM分析，10μl PCR反应体系如下：5ng/μL模板DNA1μL，Roche HRM Master5μＬ，25ng/ul MgCl21.4μＬ，10ng/ul引物各0.2μL，余量双蒸水补足。PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性10s，Ta（各引物优化的最佳退火温度）退火10s，72℃延伸5s，共35个循环，最后72℃延伸10min。根据孟德尔遗传规律和特征溶解曲线的形状，筛选出38对重复性好、稳定性高的SNP引物，能够清楚地区分纯合子和杂合子基因型（如图1），引物详细信息见表1，应用于太平洋牡蛎的家系鉴定与分析。
4)太平洋牡蛎家系的亲权鉴定分析
建立子代（n=78）和亲本（N=18）的基因型数据库文件，在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点，利用Cervus3.0软件获得各SNP位点的遗传参数，包括等位基因数、杂合度、多态信息含量、排除概率及累积排除概率等信息（见表2）。利用Cervus3.0软件，根据各位点的等位基因频率进行家系模拟鉴定分析，然后进行实际家系鉴定分析。所述的实际家系鉴定分析具体步骤如下：利用步骤2）定量后的DNA，在Roche LightCycler480进行HRM分析，PCR反应体系：10μl PCR反应体系如下：5ng/μL模板DNA1μL，Roche HRM Master5μＬ，25ng/ul MgCl21.4μＬ，10ng/ul引物各0.2μL（引物为_F-TCTCATCCTCATCCAAGTC，R-CACACGTGTAAGAAAGGATG，也可以是表1引物中的任何一对），余量双蒸水补足。PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸5s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
计算最佳候选亲本对的LOD值（见图2），选择LOD值最高且为正值的亲本对作为真正父母本，计算家系鉴定成功率。结果表明，93.2%的个体被成功分配到了9个家系中,另外，有6.8%的个体未指定到正确的亲本，可能因为亲本样品缺失导致的。
表1太平洋牡蛎家系鉴定体系的38个SNP标记的引物信息
表238个SNP位点在太平洋牡蛎家系中的遗传参数分析结果
Claims (3)
1.一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定方法，其特征在于具体步骤如下：
1)在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点，所述的突变位点为C/T&G/A和C/A&G/T；
2)建立子代和亲本的基因型数据库文件，利用Cervus3.0软件获得各SNP位点的遗传参数；
3)利用Cervus3.0软件，根据各位点的等位基因频率进行家系模拟鉴定分析，然后进行实际家系鉴定分析，计算候选亲本对的LOD值，选择LOD值最高且为正值的亲本对作为真正父母本，计算家系鉴定成功率；
所述的实际家系鉴定分析的步骤包括提取亲本和子代的DNA，构建PCR反应体系，在Roche LightCycler480进行HRM分析；
所述的实际家系鉴定分析中的PCR引物为表1中的任何一对；
表1 太平洋牡蛎家系鉴定体系的38个SNP标记的引物信息
2.根据权利要求1所述的一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定方法，其特征在于所述的实际家系鉴定分析中的PCR反应体系为10μL：5ng/μL模板DNA1μL，Roche HRM Master5μL，25ng/ul MgCl2 1.2～1.4μL，10ng/ul引物各0.2μL余量双蒸水补足；PCR扩增条件为：94℃预变性10min，94℃变性10s，62～55℃退火10s，72℃延伸5s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定方法，其特征在于所述的实际家系鉴定分析中PCR引物的筛选方法：
1)在Illumina GoldenGate方法获得的SNP数据库中，搜索一类和二类SNP突变位点，所述的突变位点为C/T&G/A和C/A&G/T，在位点的侧翼序列利用Primer3.0设计引物；设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现；
2)利用Qiagen试剂盒提取个体太平洋牡蛎基因组DNA，用PicoGreen荧光染料试剂盒进行DNA的定量分析，将样品DNA浓度调整至5ng/μL，用于SNP标记的筛选和优化；
3)以定量后的DNA做模板使用Roche LightCycler480进行HRM检测，通过改变退火温度和Mg2+浓度筛选出扩增效率高、溶解曲线清晰的引物，并获得最优的PCR反应体系和引物的最佳退火温度。
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