CN101253198A

CN101253198A - 使用鸵鸟产生的抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN101253198A
Application number: CNA2006800318107A
Authority: CN
Inventors: 本康浩
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Osaka Prefecture University PUC
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Osaka Metropolitan University
Priority date: 2005-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2008-08-27
Also published as: JPWO2007026689A1; JP4487051B2; AU2006285850A1; WO2007026689A1; US8765133B2; US20110301336A1; EP1930346A1; US20110300153A1; EP1930346A4; EP1930346B1; US8815244B2; US20090306347A1

Abstract

本发明提供使用鸵鸟制备的抗体及其制备方法。通过使用鸵鸟，可以使用1只鸵鸟，大量、均质且简单地生产用小鼠、大鼠等哺乳类难以制备的抗体(特别是医疗用抗体)。由此，可以解决以往使用其它动物制备多克隆抗体时的批间差异的问题。

Description

使用鸵鸟产生的抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及使用鸵鸟产生的抗体及其制备方法。本发明提供在人的治疗、诊断中使用的医疗用抗体的大量生产、及其它可以利用抗体的各种领域中有用的技术。

背景技术

以往，抗体的制备中使用小鼠、大鼠、绵羊、山羊等动物。但是，由于这些哺乳类的蛋白质与人类蛋白质的相似性很高，因此多难以制备抑制人类蛋白质功能的抗体。即，即便免疫与人类疾病有关的分子(主要是蛋白质)，在上述动物中也难以获得目标抗体(特别是治疗抗体)。

另一方面，最近尝试使用与人类的关系较远的鸡(家鸡)制备人类的治疗、诊断用抗体(例如参照下述专利文献1)。但是，考虑到鸡的血液量很少，因此难以一次性地获得大量且均质的抗体。另外，虽然可以连续进行单克隆抗体的制备，但为了获得充分量的抗体量，需要繁杂的工作和培养细胞、培养液。

专利文献1：日本特开2001-238676号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明鉴于上述问题点而完成，其目的在于提供可大量、均质且简单地制备抗体(尤其是用以往的使用哺乳动物的方法难以制备的抗体)的方法。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述问题，特别聚焦大型鸟类鸵鸟而进行了深入研究，结果发现(1)在以往使用小鼠或兔子的方法中，难以制备对哺乳类之间相似性很高的蛋白质(或其一部分)为特异性的抗体，但通过免疫鸵鸟可以简单地制备这种抗体；(2)在实际中，利用使用鸵鸟制备的抗体进行蛋白质印迹(WesternBlot)分析和免疫细胞化学法时，可以特异地检测出作为癌标记物的目标蛋白质(CD166蛋白质)，可以作为诊断用抗体利用；(3)对这样使用鸵鸟制备的抗CD166抗体，确认了肿瘤增殖抑制效果，还可以作为治疗用抗体等利用，进而完成了本发明。

即，本发明提供使用鸵鸟制备的抗体及其制备方法。鸵鸟近年来在日本也开始家畜化(食用化)，饲养场的数量也有增多的倾向。饲养饲料也有市售，营养效率也极高。体重可以达到约120kg，在1只个体中几乎可以采集100只鸡份量的血液。即，使用1只鸵鸟可以均匀且大量地生产用小鼠、大鼠等哺乳类无法制备的治疗用(或者诊断用)抗体。由此，可以解决以往使用其它动物制备多克隆抗体时的批间差异问题。而且，当使用鸵鸟幼鸟时，以少量的抗原量即可建立免疫，之后经过约10个月的饲养(直至成体乌)和追加免疫即可在1只中制造大量的抗体。

即，当使用鸵鸟时，可以简单地制备用以往的方法难以制备的对蛋白质(包含其一部分)为特异性的抗体。而且，批间差异少，可以产生均匀且大量的抗体，适于商品化(治疗用、诊断用)。

这里，抗体是指特异性地识别抗原并与之结合的蛋白质，其种类(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等)不限。抗体可以是一价或多价的任一种。另外，本发明的抗体还可以利用荧光物质、放射性物质、酶及其它蛋白质(例如抗生物素蛋白)等进行标记，也可以通过使用识别本发明的抗体并与之结合的二抗，不标记本发明抗体就进行目标分子的检测。

本说明书中，“鸵鸟”是指属于鸵鸟目(Struthioniformes)的鸟类。其中优选使用属于鸵鸟科(Struthionidae)的鸵鸟(Struthio camelus)。雌雄均可。“使用鸵鸟”是指为了制备抗体，使用鸵鸟作为给予抗原的动物。作为抗原而给予的物质并无特别限定，除了蛋白质、肽(包括天然来源、合成肽、重组肽)之外还可以是多糖类等的生物体物质。抗原的制备方法、给予方法并无特别限定，优选方式在后面叙述。

在后述实施例中，为了制备抗人CD166蛋白质的抗体，将20个残基的合成肽(在哺乳类间高度保守的细胞外区域的第4号Ig环内的20个氨基酸)用作抗原，将其接种于鸵鸟的幼鸟进行免疫，从而制备抗体。所得的抗CD166鸵鸟抗体可以特异性地识别、检测作为癌标记物的人CD166蛋白质(图1、3)，可以用作癌症的诊断用抗体。而且，该抗CD166鸵鸟抗体具有抑制肿瘤增殖的抗肿瘤效果(图4)，可以用作癌症的治疗用抗体。这样，通过使用鸵鸟，可以简单地制备通过使用哺乳动物的以往方法难以制备的医疗用抗体(用于治疗或诊断的抗体)。

当然，在抗CD166鸵鸟抗体的制备中，抗原并非局限于上述合成肽，可以将人CD166蛋白质整体或其一部分特异的肽序列(优选10～20个残基左右)用作抗原。另外，当然还可以通过同样的方法制备抗CD166以外的CD抗原的抗体(抗CD抗体)。这里，CD(Cluster of differentiation，分化抗原簇)是指通过CD分类分别附上固有序号的细胞表面抗原(例如黏附分子)，上述CD166也是其中之一。通过本发明的使用鸵鸟的抗体制备法，可以大量、均质且简单地制备高灵敏度的抗人CD抗体。

如上所述，使用鸵鸟幼鸟时由于具有以少量的抗原量即可建立免疫等的优点，因此优选通过对鸵鸟的幼乌进行首次免疫，制备本发明的抗体。更具体地说，优选对出生后2个半月龄以上、不足10个月龄左右的幼乌进行首次免疫、更优选对出生后3个月龄以上、7个月龄以下左右的幼鸟进行首次免疫、进一步优选对出生后3个月龄以上、5个月龄以下左右的幼鸟进行首次免疫。13另外，列举使用鸵鸟制备抗体时的优点、优选方式等的话，如下所述。

(1)鸵鸟从孵化时(体重约0.8kg)开始迅速生长、在6个月龄时达到60kg、在10个月(成体鸟)时达到120kg。即，当在幼乌时开始免疫，则少量抗原即可，通过数次的追加免疫可以获得大量的抗体。

(2)下面说明抗体制备的一例：使用合成肽为抗原，进行免疫的抗原量为每次100μg、在3个月龄时进行首次免疫，之后每隔1个月实施每次为相同抗原量的免疫，直至成为成体鸟(在后述实施例中，以隔周共进行3次免疫。)。首次免疫为混合100μg抗原液(0.5mL)和完全佐剂0.5mL，接种于鸵鸟胸部的肌肉内。从第2次开始，混合100μg的抗原液(0.5mL)和不完全佐剂0.5mL，接种于鸵鸟颈部肌肉内。在距离最终免疫2～5天后进行采血，从所得鸵鸟的抗血清中使用蛋白G柱纯化抗体。

(3)用于测定抗体效价的血液到4个月龄为止优选采集于羽翼下的静脉，之后适宜从颈部静脉采集(这是由于从5个月龄开始比较凶狠)。

(4)由于2个月龄及其以前的鸵鸟幼乌对应激敏感，因此优选从3个月龄起开始免疫。

(5)通过上述(2)的方法免疫鸵鸟时，在3次免疫时(5个月龄)已经确认了抗体效价的上升，在第5次(7个月龄)达到最高值。在此阶段可以大量采集血液获得抗体，但由于随着饲养期间的进一步延长和追加免疫，抗体效价的最高值可以维持到成体鸟(体重120kg)，因此成长阶段可以回收更多的抗体。

(6)由于只要不杀死免疫过的鸵鸟，则可以半永久性地回收抗体，因此可以持续地提供抗体。

(7)由于鸟类的抗体会向卵转移，因此在免疫过的鸵鸟的卵中含有高精度的抗体。即，如下所述，当利用卵时，可以持续、简单、大量地获得抗体。

(8)在免疫鸵鸟而获得的抗体IgG的纯化中，由于与蛋白A的结合很弱，因此优选使用蛋白G。

接着，说明使用鸵鸟制备抗体时的优点、优选方式和利用例。

本发明通过使用鸵鸟，与使用鸡(家鸡)等的情况相比，可以大量、均质且简单地制备高灵敏度抗体。例如，使用鸵鸟制备抗人CD146的抗体和抗人CD166的抗体，就各个抗原检测灵敏度，与使用鸡制备的抗体进行比较的结果，鸵鸟抗体的检测灵敏度显著高，与鸡抗体相比具有显著的优越性(图8、9)。

另外，如上述(7)所述，通过对雌鸵鸟免疫抗原，由其产下的鸵鸟卵的卵黄纯化抗体(IgY)，可以持续且简单、大量地获得抗体。例如，将1型胶原作为抗原每周免疫鸵鸟的产卵雌乌时，在首次免疫后第4周确认产下的卵黄中产生了其抗体(图5、6)。同样，当对鸵鸟的产卵雌鸟每周免疫IBV(鸡传染性支气管炎病毒)的灭活疫苗时，在首次免疫后第6周确认产下的卵黄中产生了其抗体(图7)。

另外，使用IgY纯化法时，从首次免疫后第6周的一个鸵鸟卵的卵黄中纯化出2～4g抗体(IgY)。由于从1只雌鸵鸟在4月～9月的产卵期中可获得约100个卵，因此最多可以获得约400g的抗体(IgY)。这表明，在制备病毒感染的诊断检查用抗体时，通过调整免疫时期，可以在6个月内从1只鸵鸟制备可应用到约400～4000万份样品量的诊断检查试剂盒中的大量抗体。

鸵鸟卵黄的IgY纯化法与通常的鸡卵黄的纯化法(例如J.Immunol.Methods 46：63-68，1981.；Agric.B1ol.Chem.54：2531-2535，1990.；Immunological Investigations 19：253-258，1990.)基本相同地进行，还可以使用市售的由鸡卵黄的抗体(IgY)纯化用试剂盒。另外，由于鸵鸟卵黄的脂质很多，因此优选将相对于卵黄量的所有的溶液(葡聚糖硫酸酯/TBS等)量增加到鸡卵黄情况的1.5倍左右进行纯化。

本发明的抗体用途并无特别限定，除了之前所述的医疗用抗体之外，还可以在目前各种领域中利用的各种抗体中使用本发明的抗体。特别是由于本发明的抗体可以使用鸵鸟大量地生产，因此通过在癌检测试剂盒或病毒感染检查试剂盒等中所用的检查用抗体的制备中应用本发明，可以在在健康诊断或感染、食物中毒的检查等必须检查多个样品的情况中，短期间内简单地由1只鸵鸟制备检查所必需的大量检查试剂盒。

例如，由于上述IBV(鸡传染性支气管炎病毒)为与SARS病毒近缘的冠状病毒，因此也可以使用鸵鸟大量制备抗SARS病毒的抗体，另外，还可以大量制备禽流感等病原性病毒检测用抗体。而且，还可以大量制备BSE(疯牛病)等朊病毒病或其它疾病的检查用抗体。本发明的抗体还可以作为工业用抗体应用，即在空调过滤器、口罩、水管的过滤器等各种工业制品中可以作为用于除去病原体、变应原及其它抗原物质的抗体来应用。

这样，本发明不仅作为病毒检测用、疾病检查用抗体来应用，还可以通过用于空调过滤器、口罩等中，作为除去病毒用的工业用抗体来应用。当然，还可以作为病毒以外的病原体(传染病或食物中毒菌等)或食品中的变应原(荞麦或卵清白蛋白等)、饮用水中的病原体等的检测、除去用抗体来应用。

本发明的抗体既可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。对于一般的抗体制备方法，例如在Harlow等人的“Antibodies：A laboratory manual”(Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1988))、岩崎等的《単クロ一ン抗体ハィブリド一マとELISA，講談社(1991)》等中有记载，以下简单地说明各抗体的制备方法。

(1)多克隆抗体的制备

多克隆抗体可以通过将成为抗原的物质单独或与载体、稀释剂一起给予到鸵鸟的能够产生抗体的部位、例如上述的胸部肌肉内、颈部肌肉内等而制备。给予时，为了提高抗体的产生能力，可以给予完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。抗原的给予可以仅进行1次，但通常为每2～6周给予1次，共计给予2～10次左右。

血清中的对抗原的抗体效价的测定是用液相法(例如使标记的抗原与抗血清反应后，测定结合于抗体上的标识剂的活性的方法)、或者固相法(例如在96孔板的各孔内壁面上固定抗原，在其中添加将血清适当稀释的溶液，使抗体结合于抗原，然后洗涤孔中的溶液以除去多余的抗体，测定结合于孔内壁面的抗体量的方法)进行的。

本发明的多克隆抗体的分离纯化根据免疫球蛋白的分离纯化法(例如盐析法、醇沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、利用离子交换剂(例如DEAE)的吸附脱附法、超离心法、凝胶过滤法、通过结合抗原的固相或蛋白G等活性吸附剂仅采集抗体并解离结合之后获得抗体的特异纯化法等)进行。

(2)单克隆抗体的制备

在制备单克隆抗体时，从免疫过抗原的鸵鸟中选择确认了抗体效价的个体，在最终免疫的2～5天后采集脾脏或淋巴节，将其中所包含的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，从而可以制备本发明的单克隆抗体产生杂交瘤。

融合操作可以根据已知方法实施，例如Kayler和Milstein的方法(Nature，256卷，495页，1975年)。作为融合促进剂，可以举出聚乙二醇(PEG)或仙台病毒等，优选使用PEG等。作为骨髓瘤细胞可以举出例如NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，优选使用P3U1等。所使用的抗体产生细胞(脾脏细胞等)数与骨髓瘤细胞数的优选比例通常为1∶1～20∶1左右，通过以10～80％左右的浓度添加PEG(优选PEG1000～PEG6000)、通常在20～40℃、优选30～37℃下孵育1～10分钟可以高效地实施细胞融合。

在抗体产生杂交瘤的筛选中可以使用各种方法，可以列举出例如在直接或与载体一起吸附有抗原或其部分肽的固相(例如微孔板)中添加杂交瘤培养上清，接着加入用荧光物质或酶等标记过的抗鸵鸟免疫球蛋白抗体或蛋白G，检测结合于固相的本发明的单克隆抗体的方法；在吸附有抗鸵鸟免疫球蛋白抗体或蛋白G的固相中添加杂交瘤培养上清，加入用荧光物质或酶等标记的抗原，检测结合于固相的单克隆抗体的方法等。

本发明的单克隆抗体的筛选、培养通常在添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)、含有10～20％胎牛血清的动物细胞用培养基(例如RPMI1640)中进行。杂交瘤培养上清的抗体效价可以与上述抗血清中抗体的抗体效价的测定同样地测定。单克隆抗体的分离纯化与上述多克隆抗体的分离纯化同样地进行。

如上所述，通过在动物的体内或体外培养杂交瘤细胞并从其体液或培养物中采集抗体，可以制备本发明的抗体。

当然，并非局限于上述示例的方法，可以应用以往公知的各种方法制备本发明多克隆抗体和单克隆抗体。另外，本发明还可以使用以后新开发的方法。

附图说明

图1为表示分别用人CD166肽免疫小鼠、兔子、鸵鸟后，通过使用这些动物的抗血清进行的Western Blot分析检测人CD166蛋白质的结果的图。

图2为表示使用SDS-PAGE确认纯化的鸵鸟IgG的结果的图。

图3为表示通过使用抗CD166鸵鸟抗体进行的免疫细胞化学法在人肺癌细胞(A549)中检测人CD166蛋白质的结果的图。

图4为表示向移植有人肺癌细胞的裸鼠给予抗CD166鸵鸟抗体所产生的肿瘤增殖抑制效果的图表。“*”表示与给予PBS具有显著性差异。^*P＜0.01(Student-t)

图5为表示对鸵鸟的产卵雌鸟免疫1型胶原，利用琼脂凝胶内沉降方法随时间调查其血清和卵黄中的抗体产生情况的结果的图。图中，A为抗原(1型胶原)、1为免疫前的鸵鸟血清、2为免疫第1周的鸵鸟血清、3为免疫第2周的鸵鸟血清、4为免疫第3周的鸵鸟血清、5为免疫第4周的鸵鸟卵黄提取液、6为PBS。抗原抗体反应所产生的白色沉降线表示抗体的产生。

图6为表示对鸵鸟的产卵雌鸟免疫1型胶原，利用琼脂凝胶内沉降方法随时间调查其卵黄中的抗体产生情况的结果的图。图中，A为抗原(1型胶原)、1为免疫前的鸵鸟卵黄提取液、2为免疫第1周的鸵鸟卵黄提取液、3为免疫第2周的鸵鸟卵黄提取液、4为免疫第3周的鸵鸟卵黄提取液、5为免疫第4周的鸵乌卵黄提取液、6为PBS。抗原抗体反应所产生的白色沉降线表示抗体的产生。

图7为表示对鸵鸟的产卵雌乌免疫IBV(鸡传染性支气管炎病毒)的灭活疫苗，利用琼脂凝胶内沉降方法随时间调查其血清和卵黄中的抗体产生情况的结果的图。图中，A为抗原(IBV)、1为PBS、2为免疫前的鸵鸟血清、3为免疫第4周的鸵鸟血清、4为免疫第6周的鸵鸟血清、5为免疫第6周的鸵鸟卵黄提取液、6为免疫前的鸵鸟卵黄提取液。抗原抗体反应所产生的白色沉降线表示抗体的产生。

图8为使用鸵鸟和鸡分别制备抗CD146抗体并比较两者的检测强度的图，(a)为表示两抗体的免疫印迹结果的图表、(b)为表示两抗体的相对强度的图表。“*”表示与鸡相比具有显著性差异。^*P＜0.01(Student-t)

图9为使用鸵鸟和鸡分别制备抗CD166抗体并比较两者的检测强度的图，(a)为表示两抗体的免疫印迹结果的图表、(b)为表示两抗体的相对强度的图表。“*”表示与鸡相比具有显著性差异。^*P＜0.01(Student-t)

具体实施方式

实施例

以下参照附图说明本发明的实施例，但本发明并非局限于下述实施例。

[实施例1]

为了制备抗人CD166蛋白质的抗体，其中，人CD166蛋白质被期待作为肺癌、黑色素瘤、前列腺癌等的癌标记物，将人、小鼠、兔子的种间一致的合成肽(哺乳类间高度保守的细胞外区域的第4号Ig环内的20个氨基酸)免疫小鼠(BALBc)、兔子(日本大耳白兔)、鸵鸟(3个月幼鸟)(隔周共3次)，采血。

首次免疫是混合100μg的抗原液(0.5mL)和0.5mL完全佐剂并接种于鸵鸟胸部的肌肉内、兔子背部皮内。对于小鼠则将0.4mL上述混合液接种于背部皮内。从第2次开始，混合100μg的抗原液(0.5mL)和0.5mL不完全佐剂，接种于鸵鸟颈部肌肉内、兔子背部皮内。对于小鼠，将0.4mL上述混合液接种于背部皮内。当使用这些动物的抗血清(从最终免疫起2周后)进行人肺癌的细胞膜部分的Western Blot时，仅在鸵鸟中产生识别人CD166蛋白质的抗体(图1)。

用于上述Western Blot中的标记二抗如下制备。首先，使用蛋白G由非免疫鸵鸟的血液纯化免疫球蛋白G(IgG)，通过SDS-PAGE进行确认(图2)。将其免疫兔子。更详细地说，将1次量200μg的鸵鸟IgG隔周4次免疫日本大耳白兔，在最后一次起的第2周回收全血，制备抗鸵鸟IgG兔多克隆抗体(血清)。根据使用蛋白A的常规方法进行纯化。对所得纯化抗体进行FITC标记和HRP标记后用作二抗。

由鸵鸟的上述抗血清如下纯化抗体。首先，将鸵鸟的抗血清上到蛋白G柱中。用PBS洗涤后，利用柠檬酸缓冲液和甘油缓冲液的混合液(pH9.0)进行洗脱后，用2M tris/HCl中和。将如此纯化的抗体作为抗CD166鸵鸟抗体在以下实验中使用。

[实施例2]

将实施例1所得抗CD166鸵鸟抗体作为一抗，对培养人肺癌细胞(A549)实施免疫荧光抗体法，结果在肺癌细胞的细胞膜上反应强烈(图3)。在实验中，首先在盖玻片上培养A549细胞1天，利用Zamboni液固定。接着，用PBS将实施例1获得的抗CD166鸵鸟抗体(1mg/mL)稀释1000倍作为一抗，在上述细胞上于37℃下反应1小时。之后，用PBS将实施例1中制备的FITC标记抗鸵鸟IgG兔多克隆抗体(1mg/mL)稀释1000倍，作为二抗，在上述细胞上于37℃下反应1小时，通过荧光显微镜观察。

[实施例3]

将10⁶个培养人肺癌细胞(A549)分别移植于5只裸鼠皮下，从第5天开始每周腹腔内给予实施例1获得的抗CD166鸵鸟抗体(120μg)，在移植第3周测定肿瘤体积。对照小鼠仅给予PBS。结果表明在抗CD166鸵鸟抗体给予组中显著地抑制了肿瘤的增殖(图4)。

[实施例4]

为了调查卵黄的抗体的产生，对2岁零6个月龄的鸵鸟的产卵雌乌每周免疫大鼠的1型胶原，利用琼脂凝胶内沉淀反应确认从首次免疫起第1周～3周的血清和第4周的卵黄提取液中的抗体的产生。实验方法如下所示。

抗原量和免疫法：将4mg/0.5mL的抗原液与0.5mL完全佐剂混合，接种于鸵鸟的背部皮内。之后的追加免疫为将4mg/0.5mL的抗原液与0.5mL不完全佐剂混合，接种于鸵鸟的背部皮内。

血清的纯化：使用通过从颈静脉采血、静置1小时后通过离心分离(15000rpm)分离的血清。

卵黄提取法：从鸵鸟卵中仅取出卵黄(250～350mL)并搅拌。仅使用10mL，剩余保存于冰箱。

混合10mL卵黄液和75mL的TBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、0.5％NaN₃)，加入5mL 10％葡聚糖硫酸酯/TBS搅拌30分钟。加入10mL 1M CaCl/TBS并搅拌后，静置2小时以上。在10000rpm下离心30分钟，回收上清。在上清中加入硫酸铵至最终浓度为40％，静置12小时以上。在10000rpm下离心分离，回收沉淀。将该沉淀再次悬浮于10mL TBS中，使用TBS透析。

琼脂凝胶内沉降反应：将琼脂混合于0.8％NaCl液中至最终浓度达到1％，通过加热使琼脂完全溶解。装载在玻璃载片上后冷却，使其形成中央具有1个孔穴和周围具有6个孔穴的结构。在中央滴加30微升抗原液(2mg/ml)，在周围的孔穴中分别滴加30微升PBS、血清、卵黄提取液，静置12小时后观察有无沉降线。

结果示于图5中。图中的记号、数字如下所述。

A：抗原(1型胶原)

1：免疫前的鸵鸟血清

2：免疫第1周的鸵鸟血清

3：免疫第2周的鸵鸟血清

4：免疫第3周的鸵鸟血清

5：免疫第4周的鸵鸟卵黄提取液

6：PBS

同样，对鸵鸟的产卵雌鸟每周免疫大鼠的1型胶原，利用琼脂凝胶内沉淀反应确认从首次免疫起第1周～第4周的卵黄提取液中抗体的产生。结果示于图6中。图中的记号、数字如下所述。

A：抗原(1型胶原)

1：免疫前的鸵鸟卵黄提取液

2：免疫第1周的鸵鸟卵黄提取液

3：免疫第2周的鸵鸟卵黄提取液

4：免疫第3周的鸵鸟卵黄提取液

5：免疫第4周的鸵鸟卵黄提取液

6：PBS

在图5、6中，抗原抗体反应所产生的白色沉降线表示抗体的产生(图7也相同)。如这些图所示，从免疫第2周开始血液中产生抗体、从免疫第4周开始卵黄中产生抗体，确认鸵鸟卵黄中的抗体的产生。

另外，同样对鸵鸟的产卵雌鸟每周免疫IBV(鸡传染性支气管炎病毒)的灭活疫苗，利用琼脂凝胶内沉淀反应随时间调查其血清和卵黄中的抗体产生情况。结果示于图7中。图中的记号、数字如下所述。

A：抗原(IBV)

1：PBS

2：免疫前的鸵鸟血清

3：免疫第4周的鸵鸟血清

4：免疫第6周的鸵鸟血清

5：免疫第6周的鸵鸟卵黄提取液

6：免疫前的鸵鸟卵黄提取液

如图7所示，在从首次免疫起第4周、第6周的血清和第6周的卵黄提取液中产生抗体，确认鸵鸟卵黄中产生抗体。

[实施例5]

为了比较鸵鸟抗体和鸡抗体的检测强度，使用鸵鸟和鸡分别制备抗CD146抗体，比较两者的检测强度。

在实验中，用人CD146蛋白质对雌鸡和雌鸵鸟隔周进行免疫，由第6周采集的血清纯化抗体，分别将等量(0.1mg)抗体进行HRP标记。将10ng CD146蛋白质进行SDS-PAGE后使用PVDF膜转印，并使其与上述各个抗体反应。洗涤后，使用ECL发光，用伦琴膜(roentgen film)感光。

结果示于图8中。图中(a)表示使用来自2只鸡、2只鸵鸟的抗体的免疫印迹结果，可知鸵鸟抗体的检测强度更强。(b)表示3只鸡、3只鸵鸟相对强度的平均值，相对强度是利用显像密度测定法测量伦琴膜上的条带浓度并以无带区域的强度为1时计算的相对强度。由该图表可知，鸵鸟抗体的相对灵敏度显著地高。

同样，使用鸵鸟和鸡分别制备抗CD166抗体，比较两者的检测强度。

在实验中，用人CD166蛋白质隔周对母鸡和雌鸵鸟进行免疫，由第6周采集的血清纯化抗体，分别将等量(0.1mg)抗体进行HRP标记。将20ng CD166蛋白质进行SDS-PAGE后使用PVDF膜转印，与上述各个抗体反应。洗涤后，使用ECL发光，用伦琴膜感光。

结果示于图9。图中(a)表示使用来自2只鸡、2只鸵鸟的抗体的免疫印迹结果，可知鸵鸟抗体的检测强度更强。(b)表示3只鸡、3只鸵鸟的相对强度的平均值，相对强度是利用显像密度测定法测量伦琴膜上的条带浓度，以无带区域的强度为1时计算的相对强度。由该图表可知，鸵鸟抗体的相对强度显著地高。

这样，通过本实施例确认与鸡抗体相比，鸵鸟抗体的检测灵敏度更高，相对于鸡抗体，鸵鸟抗体具有显著的优越性。

产业实用性

如上所述，本发明涉及使用鸵鸟制备的抗体及其制造方法，如上所述，可以在人的治疗或诊断中使用的医疗用抗体的大量生产、及其它可以利用抗体的各种领域中利用。

Claims

1.抗体，其为使用鸵鸟制备的抗体。

2.医疗用抗体，其为使用鸵鸟制备的用于治疗或诊断的医疗用抗体。

3.根据权利要求2所述的医疗用抗体，其为癌症的治疗用或诊断用的抗体。

4.根据权利要求3所述的医疗用抗体，其为将CD166蛋白质(包括其一部分)作为抗原而制备的抗体。

5.根据权利要求1所述的抗体，其为抗CD抗体。

6.根据权利要求1所述的抗体，其为将病毒蛋白作为抗原而制备的抗体。

7.根据权利要求1所述的抗体，其为病毒感染的检查用抗体。

8.根据权利要求1所述的抗体，其为用于除去病原体、变应原及其它抗原而使用的工业用抗体。

9.根据权利要求1～8任一项所述的抗体，其通过对鸵鸟的幼鸟实施首次免疫而制备。

10.根据权利要求1～8任一项所述的抗体，其通过对雌鸵鸟实施免疫、由其产下的卵的卵黄制备。

11.抗体的制备方法，其特征在于，将蛋白质或其肽片断等作为抗原免疫鸵鸟，制备多克隆抗体或单克隆抗体。

12.根据权利要求11所述的抗体的制备方法，其对鸵鸟的幼鸟实施首次免疫。

13.根据权利要求11所述的抗体的制备方法，其特征在于，对雌鸵鸟实施免疫，由其产下的卵的卵黄制备抗体。