JP2001238676A - ニワトリ型モノクローナル抗体 - Google Patents
ニワトリ型モノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、遺伝子組換え法による多量生産に
適したニワトリ型モノクローナル抗体の製造方法を提供
するものである。また、本発明は、そのための新規なプ
ラスミドベクター及びそのための新規なプライマーを提
供するものである。さらに本発明は、新規なニワトリ型
モノクローナル抗体を提供するものである。 【解決手段】 本発明は、遺伝子組換え法によりニワト
リ型モノクローナル抗体を製造する方法において、ニワ
トリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が導入
されている発現ベクターに、ニワトリ型モノクローナル
抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子を導入した発現ベク
ターを用いることを特徴とするニワトリ型モノクローナ
ル抗体の新規な製造方法、及びその方法で製造されるニ
ワトリ型モノクローナル抗体に関する。さらに、本発明
は、遺伝子組換え法によりニワトリ型モノクローナル抗
体を製造する際に使用される新規な発現ベクターｐＣＰ
ＤＳ、新規なプライマーＣＬＦ１、及びそれを使用して
遺伝子を増幅させる方法に関する。
適したニワトリ型モノクローナル抗体の製造方法を提供
するものである。また、本発明は、そのための新規なプ
ラスミドベクター及びそのための新規なプライマーを提
供するものである。さらに本発明は、新規なニワトリ型
モノクローナル抗体を提供するものである。 【解決手段】 本発明は、遺伝子組換え法によりニワト
リ型モノクローナル抗体を製造する方法において、ニワ
トリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が導入
されている発現ベクターに、ニワトリ型モノクローナル
抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子を導入した発現ベク
ターを用いることを特徴とするニワトリ型モノクローナ
ル抗体の新規な製造方法、及びその方法で製造されるニ
ワトリ型モノクローナル抗体に関する。さらに、本発明
は、遺伝子組換え法によりニワトリ型モノクローナル抗
体を製造する際に使用される新規な発現ベクターｐＣＰ
ＤＳ、新規なプライマーＣＬＦ１、及びそれを使用して
遺伝子を増幅させる方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え法に
より組換えニワトリ型モノクローナル抗体を製造する方
法、それに用いる発現ベクター、その方法により製造さ
れる組換えニワトリ型モノクローナル抗体、組換えニワ
トリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝
子を増幅させるためのプライマー、及び当該プライマー
を用いた遺伝子の増幅方法に関する。また、本発明は組
換えニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコード
する遺伝子を増幅させるためのプライマーとして使用さ
れる新規なオリゴヌクレオチドに関する。
より組換えニワトリ型モノクローナル抗体を製造する方
法、それに用いる発現ベクター、その方法により製造さ
れる組換えニワトリ型モノクローナル抗体、組換えニワ
トリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝
子を増幅させるためのプライマー、及び当該プライマー
を用いた遺伝子の増幅方法に関する。また、本発明は組
換えニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコード
する遺伝子を増幅させるためのプライマーとして使用さ
れる新規なオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】モノクローナル抗体は、抗原の特定部分
だけを認識する単一抗体であり、この技術は遺伝子組み
替えと並んでバイオテクノロジー分野での基幹技術であ
り、これを利用した診断薬、治療薬は急速に普及発展し
ている。モノクローナル抗体については、マウス、ラッ
ト型など広く活用されているが、ニワトリ型について
は、発明者がすでに提案した例がある程度である。この
ニワトリ型の大きな利点は、マウス等の哺乳動物では作
成困難な抗体が作成可能であるということである。
だけを認識する単一抗体であり、この技術は遺伝子組み
替えと並んでバイオテクノロジー分野での基幹技術であ
り、これを利用した診断薬、治療薬は急速に普及発展し
ている。モノクローナル抗体については、マウス、ラッ
ト型など広く活用されているが、ニワトリ型について
は、発明者がすでに提案した例がある程度である。この
ニワトリ型の大きな利点は、マウス等の哺乳動物では作
成困難な抗体が作成可能であるということである。
【０００３】ニワトリは系統発生学的に哺乳動物より下
等であるが、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力を
持つ動物であることから、これまでに有用なニワトリ抗
体が数多く作成されてきた。一方、ヒトをはじめとする
哺乳動物間で高度保存された生体成分を認識できる抗体
が哺乳動物を用いて作成できない場合、ニワトリ抗体と
して作成可能であることも経験されてきた。そのため、
ニワトリ抗体を大量調整するひとつの手段として、産卵
鶏を特定の抗原で免役し、その後、卵に移行した抗体を
生成して卵黄抗体（ポリクローナル抗体）として利用す
る方法が開発されているが、この方法によりモノクロー
ナル抗体を製造することはできない。
等であるが、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力を
持つ動物であることから、これまでに有用なニワトリ抗
体が数多く作成されてきた。一方、ヒトをはじめとする
哺乳動物間で高度保存された生体成分を認識できる抗体
が哺乳動物を用いて作成できない場合、ニワトリ抗体と
して作成可能であることも経験されてきた。そのため、
ニワトリ抗体を大量調整するひとつの手段として、産卵
鶏を特定の抗原で免役し、その後、卵に移行した抗体を
生成して卵黄抗体（ポリクローナル抗体）として利用す
る方法が開発されているが、この方法によりモノクロー
ナル抗体を製造することはできない。
【０００４】マウスモノクローナル抗体は、極めて広範
な基礎・応用領域に活用されているが、マウス型、ラッ
ト型以外のモノクローナル抗体については、応用にまで
至っている成功例は少ない。マウス型、ラット型以外の
モノクローナル抗体での応用の一例としては、本発明者
らが開発した細胞融合法によるニワトリ型モノクローナ
ル抗体がすでに報告されている。上述したとおり、ニワ
トリの大きな利点は、マウスあるいはラットを用いて作
成困難な抗体がニワトリ抗体として得られやすいことで
あり、モノクローナル抗体としても作成可能なことであ
る。本発明者らによる細胞融合技術を用いたニワトリ型
モノクローナル抗体の成功例としては、Ｎ−グリコリル
ノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を認識するニワトリ型モノ
クローナル抗体や哺乳動物に高度保存されたプリオンタ
ンパク（ＰｒＰ）を認識するニワトリ型モノクローナル
抗体などである。ＮｅｕＧｃは、ヒトのがんマーカーと
なる抗原で、ヒトを除くほとんどの哺乳動物に存在して
いるため、マウス、ラットやウサギなど一般に広く免疫
動物として用いる動物では抗体を作ることができない。
また、ＰｒＰは、その異常型が狂牛病やヒトＣＪＤの病
原体となることで知られているが、ＰｒＰは哺乳動物間
でアミノ酸配列の相同性は９０％以上である。一方、哺
乳動物とニワトリの間ではその相同性がわずか３０％台
であるため、これまでに作成された哺乳動物ＰｒＰを認
識するマウスモノクローナル抗体作成の成功例はわずか
である。本発明者らは、すでにＮｅｕＧｃや哺乳動物Ｐ
ｒＰを認識できるニワトリ型ｍＡｂの作成に成功し、そ
れらをヒトがんの診断や狂牛病・ヒトＣＪＤの研究に活
用することができていた。
な基礎・応用領域に活用されているが、マウス型、ラッ
ト型以外のモノクローナル抗体については、応用にまで
至っている成功例は少ない。マウス型、ラット型以外の
モノクローナル抗体での応用の一例としては、本発明者
らが開発した細胞融合法によるニワトリ型モノクローナ
ル抗体がすでに報告されている。上述したとおり、ニワ
トリの大きな利点は、マウスあるいはラットを用いて作
成困難な抗体がニワトリ抗体として得られやすいことで
あり、モノクローナル抗体としても作成可能なことであ
る。本発明者らによる細胞融合技術を用いたニワトリ型
モノクローナル抗体の成功例としては、Ｎ−グリコリル
ノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を認識するニワトリ型モノ
クローナル抗体や哺乳動物に高度保存されたプリオンタ
ンパク（ＰｒＰ）を認識するニワトリ型モノクローナル
抗体などである。ＮｅｕＧｃは、ヒトのがんマーカーと
なる抗原で、ヒトを除くほとんどの哺乳動物に存在して
いるため、マウス、ラットやウサギなど一般に広く免疫
動物として用いる動物では抗体を作ることができない。
また、ＰｒＰは、その異常型が狂牛病やヒトＣＪＤの病
原体となることで知られているが、ＰｒＰは哺乳動物間
でアミノ酸配列の相同性は９０％以上である。一方、哺
乳動物とニワトリの間ではその相同性がわずか３０％台
であるため、これまでに作成された哺乳動物ＰｒＰを認
識するマウスモノクローナル抗体作成の成功例はわずか
である。本発明者らは、すでにＮｅｕＧｃや哺乳動物Ｐ
ｒＰを認識できるニワトリ型ｍＡｂの作成に成功し、そ
れらをヒトがんの診断や狂牛病・ヒトＣＪＤの研究に活
用することができていた。
【０００５】しかしながら、本発明者らが先に開発した
ニワトリ型モノクローナル抗体の最大の欠点は、その抗
体を産生するハイブリドーマ（融合細胞）の抗体産生能
力が低いことであった。このように、ニワトリ型モノク
ローナル抗体は、他の哺乳動物では作成が困難であるモ
ノクローナル抗体を作成することができるが、その抗体
産生細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生能力がマウスや
ラットより低いことが大きな欠点であり、実用化にあた
っての大きな障害となっていた。
ニワトリ型モノクローナル抗体の最大の欠点は、その抗
体を産生するハイブリドーマ（融合細胞）の抗体産生能
力が低いことであった。このように、ニワトリ型モノク
ローナル抗体は、他の哺乳動物では作成が困難であるモ
ノクローナル抗体を作成することができるが、その抗体
産生細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生能力がマウスや
ラットより低いことが大きな欠点であり、実用化にあた
っての大きな障害となっていた。
【０００６】一方、近年になり、遺伝子工学技術を活用
して組み換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ表
面に発現させる技術が開発された。このファージディス
プレイ抗体技術は１９９１年に英国ＭＲＣ研究所のＷｉ
ｎｔｅｒらによって開発されたシステムで（Winter,
G., et al., Nature, 349, 293-299 (1991)）、非免疫
ヒト末梢血リンパ球から抗体遺伝子を単離し、人工的に
ＶＨ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃ
Ｆｖ（single chain Fragment of variable region）抗
体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を
得た（Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol., 222, 581
-597 (1991)）。この技術は、免疫を回避でき、さらに
細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価
された。現在では高度免疫したマウス脾細胞を利用して
実用的抗体が数多く作製され、抗ＰｒＰ抗体も同様に作
製されている（Williamson, R. A., et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., 99, 7279-7282 (1996)）。
して組み換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ表
面に発現させる技術が開発された。このファージディス
プレイ抗体技術は１９９１年に英国ＭＲＣ研究所のＷｉ
ｎｔｅｒらによって開発されたシステムで（Winter,
G., et al., Nature, 349, 293-299 (1991)）、非免疫
ヒト末梢血リンパ球から抗体遺伝子を単離し、人工的に
ＶＨ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃ
Ｆｖ（single chain Fragment of variable region）抗
体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を
得た（Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol., 222, 581
-597 (1991)）。この技術は、免疫を回避でき、さらに
細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価
された。現在では高度免疫したマウス脾細胞を利用して
実用的抗体が数多く作製され、抗ＰｒＰ抗体も同様に作
製されている（Williamson, R. A., et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., 99, 7279-7282 (1996)）。
【０００７】また、ニワトリを利用した例としては、以
下に示す国内外の２つのグループからの報告が挙げられ
る。Daviesらは、非免疫状態のファブリキウス嚢由来抗
体遺伝子と、発現ベクターｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧ １か
ら３種の特異抗体を樹立し、哺乳動物以外でも同様にこ
の技術の適応が可能であり、しかも免疫を回避して作出
できることを証明した（Davis, E. D., et al., J. Imm
unol. Methods, 186,125-135 (1995)）。しかしなが
ら、作出された抗体の反応性は極めて低く、また発現ベ
クターの構造からファージディスプレイ抗体しかできな
いという欠点があった。一方、山中らは、マウスアルブ
ミン免疫脾細胞由来の抗体Ｖ領域遺伝子と、独自に開発
した発現ベクターｐＰＤＳを利用して十分な反応性を示
す特異的ファージディスプレイ抗体の構築を報告し、実
用化抗体の作製には、免疫脾細胞由来抗体遺伝子ライブ
ラリーの利用を強調した（Yamanaka, H. I., et al.,
J. Immunol., 157, 1156-1162 (1996)）。ここで使用し
たｐＰＤＳは、マウス抗体発現用ベクターとして開発さ
れたもの（Yamanaka, H. I., et al., J. Biochem.,11
7, 1218-1227 81995)）で、STRATA GENE社から市販され
ているクローニング用ファージミドベクターのｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔIIをベースとしている。
下に示す国内外の２つのグループからの報告が挙げられ
る。Daviesらは、非免疫状態のファブリキウス嚢由来抗
体遺伝子と、発現ベクターｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧ １か
ら３種の特異抗体を樹立し、哺乳動物以外でも同様にこ
の技術の適応が可能であり、しかも免疫を回避して作出
できることを証明した（Davis, E. D., et al., J. Imm
unol. Methods, 186,125-135 (1995)）。しかしなが
ら、作出された抗体の反応性は極めて低く、また発現ベ
クターの構造からファージディスプレイ抗体しかできな
いという欠点があった。一方、山中らは、マウスアルブ
ミン免疫脾細胞由来の抗体Ｖ領域遺伝子と、独自に開発
した発現ベクターｐＰＤＳを利用して十分な反応性を示
す特異的ファージディスプレイ抗体の構築を報告し、実
用化抗体の作製には、免疫脾細胞由来抗体遺伝子ライブ
ラリーの利用を強調した（Yamanaka, H. I., et al.,
J. Immunol., 157, 1156-1162 (1996)）。ここで使用し
たｐＰＤＳは、マウス抗体発現用ベクターとして開発さ
れたもの（Yamanaka, H. I., et al., J. Biochem.,11
7, 1218-1227 81995)）で、STRATA GENE社から市販され
ているクローニング用ファージミドベクターのｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔIIをベースとしている。
【０００８】図１に発現ベクターｐＰＤＳの構成を示
す。ｐＰＤＳは、そのラクトースオペロン（Ｌａｃ）プ
ロモーターを利用し組み込んだｓｃＦｖ抗体ｃＤＮＡの
発現を誘導するようになっている。プロモーターの下流
には、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）およびＭ１３ ｇ
ｅｎｅIIIのリーダー配列（ｇ３ｌ）を人工的に繋ぎ込
み、ＥａｇＩとＢｓｓＨIIとからなるクローニングサイ
トで組み込まれた抗体遺伝子が大腸菌のペリプラズムを
経て再構成ファージ体として発現できるよう設計されて
いる。更にその下流にはＦａｂ抗体の発現に備えてマウ
スＣκ鎖遺伝子を繋ぎ、ｃｐ３の構造部位へとつながり
終止コドンとなっている。このＣκ鎖は、融合タンパク
の発現がうまく行われているかどうかを検証する上でも
非常に有効なタグとなる。また、このｐＰＤＳベクター
は、可溶型ｓｃＦｖもしくはＦａｂ抗体の発現にも対応
できるように、Ｃκ鎖とｇｅｎｅIIIの間にはＴＡＧ
（アンバー配列）ストップコドンを挿入しており、通常
はｓｕｐＥの大腸菌株を用いることによりファージディ
スプレイ抗体として発現されるが、ノンサプレッサー株
で培養すれば、培地中に可溶型抗体が分泌されるように
なる。
す。ｐＰＤＳは、そのラクトースオペロン（Ｌａｃ）プ
ロモーターを利用し組み込んだｓｃＦｖ抗体ｃＤＮＡの
発現を誘導するようになっている。プロモーターの下流
には、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）およびＭ１３ ｇ
ｅｎｅIIIのリーダー配列（ｇ３ｌ）を人工的に繋ぎ込
み、ＥａｇＩとＢｓｓＨIIとからなるクローニングサイ
トで組み込まれた抗体遺伝子が大腸菌のペリプラズムを
経て再構成ファージ体として発現できるよう設計されて
いる。更にその下流にはＦａｂ抗体の発現に備えてマウ
スＣκ鎖遺伝子を繋ぎ、ｃｐ３の構造部位へとつながり
終止コドンとなっている。このＣκ鎖は、融合タンパク
の発現がうまく行われているかどうかを検証する上でも
非常に有効なタグとなる。また、このｐＰＤＳベクター
は、可溶型ｓｃＦｖもしくはＦａｂ抗体の発現にも対応
できるように、Ｃκ鎖とｇｅｎｅIIIの間にはＴＡＧ
（アンバー配列）ストップコドンを挿入しており、通常
はｓｕｐＥの大腸菌株を用いることによりファージディ
スプレイ抗体として発現されるが、ノンサプレッサー株
で培養すれば、培地中に可溶型抗体が分泌されるように
なる。
【０００９】このような発現ベクターであるため、可溶
型抗体においてはニワトリ抗体遺伝子由来であっても、
検出にはマウスＣκ鎖に対する抗体を用いなければなら
ず、サンドイッチＥＬＩＳＡ等におけるマウス抗体併用
の場合、ニワトリ抗体の正確な測定が不可能であった。
本発明者らは、山中博士よりｐＰＤＳの恵与を受け、抗
体産生ニワトリハイブリドーマからファージディスプレ
イ抗体の作出に活用しようとしていることからも、この
問題は解決すべき事項であった。
型抗体においてはニワトリ抗体遺伝子由来であっても、
検出にはマウスＣκ鎖に対する抗体を用いなければなら
ず、サンドイッチＥＬＩＳＡ等におけるマウス抗体併用
の場合、ニワトリ抗体の正確な測定が不可能であった。
本発明者らは、山中博士よりｐＰＤＳの恵与を受け、抗
体産生ニワトリハイブリドーマからファージディスプレ
イ抗体の作出に活用しようとしていることからも、この
問題は解決すべき事項であった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子組換
え法による多量生産に適したニワトリ型モノクローナル
抗体の製造方法を提供するものである。また、本発明
は、そのための新規なプラスミドベクター及びそのため
の新規なプライマーを提供するものである。さらに本発
明は、新規なニワトリ型モノクローナル抗体を提供する
ものである。
え法による多量生産に適したニワトリ型モノクローナル
抗体の製造方法を提供するものである。また、本発明
は、そのための新規なプラスミドベクター及びそのため
の新規なプライマーを提供するものである。さらに本発
明は、新規なニワトリ型モノクローナル抗体を提供する
ものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子組換え
法によりニワトリ型モノクローナル抗体を製造する方法
において、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードす
る遺伝子が導入されている発現ベクターに、ニワトリ型
モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子を導
入した発現ベクターを用いることを特徴とするニワトリ
型モノクローナル抗体の新規な製造方法、及びその方法
で製造されるニワトリ型モノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、前記方法で使用される新規な発現ベク
ターに関する。さらに、本発明は、ニワトリ型モノクロ
ーナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増
幅させるためのプライマーのひととつが、制限酵素Ｂｓ
ｓＨIIで切断できる塩基配列を有することを特徴とする
ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする
遺伝子増幅用のプライマー、及び当該プライマーを使用
してニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖ
をコードする遺伝子を増幅させる方法に関する。また、
本発明は、ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓ
ｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマ
ーとして有用な新規なオリゴヌクレオチドに関する。
法によりニワトリ型モノクローナル抗体を製造する方法
において、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードす
る遺伝子が導入されている発現ベクターに、ニワトリ型
モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子を導
入した発現ベクターを用いることを特徴とするニワトリ
型モノクローナル抗体の新規な製造方法、及びその方法
で製造されるニワトリ型モノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、前記方法で使用される新規な発現ベク
ターに関する。さらに、本発明は、ニワトリ型モノクロ
ーナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増
幅させるためのプライマーのひととつが、制限酵素Ｂｓ
ｓＨIIで切断できる塩基配列を有することを特徴とする
ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする
遺伝子増幅用のプライマー、及び当該プライマーを使用
してニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖ
をコードする遺伝子を増幅させる方法に関する。また、
本発明は、ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓ
ｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマ
ーとして有用な新規なオリゴヌクレオチドに関する。
【００１２】本発明者らは、プリオン病の病態解析やプ
リオン変換機構解明へのツールとなりうるニワトリ型抗
プリオンタンパク（ＰｒＰ）パネルモノクローナル抗体
の作製とその安定的な利用を目的として、まず細胞融合
法によって得られた哺乳動物プリオンタンパク（Ｐｒ
Ｐ）２５−２９残基（ＲＰＫＰＧ）を認識する有効性の
示されたＰｒＰ特異的ニワトリ型モノクローナル抗体Ｈ
ＵＣ２−１３を供試材料に、ｐＰＤＳ発現ベクターを用
いたファージディスプレイ抗体技術によるリコンビナン
ト化と大量調製の確立を行った。
リオン変換機構解明へのツールとなりうるニワトリ型抗
プリオンタンパク（ＰｒＰ）パネルモノクローナル抗体
の作製とその安定的な利用を目的として、まず細胞融合
法によって得られた哺乳動物プリオンタンパク（Ｐｒ
Ｐ）２５−２９残基（ＲＰＫＰＧ）を認識する有効性の
示されたＰｒＰ特異的ニワトリ型モノクローナル抗体Ｈ
ＵＣ２−１３を供試材料に、ｐＰＤＳ発現ベクターを用
いたファージディスプレイ抗体技術によるリコンビナン
ト化と大量調製の確立を行った。
【００１３】本発明者らは、まず哺乳動物プリオンタン
パク（ＰｒＰ）２３−２３１残基を認識するニワトリモ
ノクローナル抗体を次のようにして調製した。リコンビ
ナントヒトプリオンタンパク（ＰｒＰ）２３−２３１
（約１００μｇ）を４週齢の近交系ニワトリ白色レグホ
ン種Ｈ−Ｂ１５ニワトリの腹腔内に免疫し、その脾臓を
摘出し免疫脾細胞を調製した。これをＴＫ欠損・ウアバ
イン耐性のニワトリＢ細胞株であるＭｕＨ１とＰＥＧ法
により融合して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマあるい
は免疫ニワトリの脾臓リンパ球から調整した抗体遺伝子
（ＶＨおよびＶＬ領域）をフレキシブルリンカーを介し
て１本鎖にしたｓｃＦｖ（single chain fragment of V
region）を作成した。このｓｃＦｖを発現させるプラ
スミドベクターとしては、すでに山中（現ロート製薬）
が構築したｐＰＤＳ（図１参照）があるが、ｐＰＤＳを
用いると、ｓｃＦｖのＮ末端側にマウス免疫グロブリン
Ｌ鎖のＣ領域（Ｃκ）が発現し、Ｖ領域がニワトリでＣ
領域がマウスの組み換え抗体となってしまう。
パク（ＰｒＰ）２３−２３１残基を認識するニワトリモ
ノクローナル抗体を次のようにして調製した。リコンビ
ナントヒトプリオンタンパク（ＰｒＰ）２３−２３１
（約１００μｇ）を４週齢の近交系ニワトリ白色レグホ
ン種Ｈ−Ｂ１５ニワトリの腹腔内に免疫し、その脾臓を
摘出し免疫脾細胞を調製した。これをＴＫ欠損・ウアバ
イン耐性のニワトリＢ細胞株であるＭｕＨ１とＰＥＧ法
により融合して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマあるい
は免疫ニワトリの脾臓リンパ球から調整した抗体遺伝子
（ＶＨおよびＶＬ領域）をフレキシブルリンカーを介し
て１本鎖にしたｓｃＦｖ（single chain fragment of V
region）を作成した。このｓｃＦｖを発現させるプラ
スミドベクターとしては、すでに山中（現ロート製薬）
が構築したｐＰＤＳ（図１参照）があるが、ｐＰＤＳを
用いると、ｓｃＦｖのＮ末端側にマウス免疫グロブリン
Ｌ鎖のＣ領域（Ｃκ）が発現し、Ｖ領域がニワトリでＣ
領域がマウスの組み換え抗体となってしまう。
【００１４】抗体の特異性（反応性）はＶ領域が規定す
ることから、反応性には問題ないが、ＨＵＣ２−１３の
ようなバックグラウンド染色のない検出はｐＰＤＳベク
ターを使用した場合には得られなかった。リコンビナン
ト抗体作出に使用した発現ベクターｐＰＤＳは，山中ら
によりマウス抗体発現用ベクターとして設計・構築され
たものであり、発現するｓｃＦｖ抗体は，変異頻度の極
めて高い抗体Ｖ領域で構成されており、安定的に検出す
ることが困難であることから、検出用タグとしてマウス
Ｃκ鎖が導入されている。したがって、ｐＰＤＳベクタ
ーを使用して作出したリコンビナント抗体は、抗原認識
部位がニワトリ抗体由来でありながら検出には抗マウス
κ鎖抗体を用いなければならず、その結果として、バッ
クグラウンド染色が生じてきた。リコンビナント抗体に
おいて、マウスＣκ鎖を検出用タグとする限り、（１）
高感度検出や定量実験に汎用されるサンドイッチＥＬＩ
ＳＡを実施した場合、キャプチャー抗体にマウス抗体を
用いたとすると、その抗体をバックグラウンドとして検
出してしまうこと、（２）モデル動物としてマウスを使
用した免疫組織化学染色の場合、そのマウスの持つ免疫
グロブリンを非特異的に検出してしまう、といった問題
点が生じる。
ることから、反応性には問題ないが、ＨＵＣ２−１３の
ようなバックグラウンド染色のない検出はｐＰＤＳベク
ターを使用した場合には得られなかった。リコンビナン
ト抗体作出に使用した発現ベクターｐＰＤＳは，山中ら
によりマウス抗体発現用ベクターとして設計・構築され
たものであり、発現するｓｃＦｖ抗体は，変異頻度の極
めて高い抗体Ｖ領域で構成されており、安定的に検出す
ることが困難であることから、検出用タグとしてマウス
Ｃκ鎖が導入されている。したがって、ｐＰＤＳベクタ
ーを使用して作出したリコンビナント抗体は、抗原認識
部位がニワトリ抗体由来でありながら検出には抗マウス
κ鎖抗体を用いなければならず、その結果として、バッ
クグラウンド染色が生じてきた。リコンビナント抗体に
おいて、マウスＣκ鎖を検出用タグとする限り、（１）
高感度検出や定量実験に汎用されるサンドイッチＥＬＩ
ＳＡを実施した場合、キャプチャー抗体にマウス抗体を
用いたとすると、その抗体をバックグラウンドとして検
出してしまうこと、（２）モデル動物としてマウスを使
用した免疫組織化学染色の場合、そのマウスの持つ免疫
グロブリンを非特異的に検出してしまう、といった問題
点が生じる。
【００１５】そこで、本発明者らは、上述の問題点を解
消するとともに、プリオン病解析さらにはより広範な研
究にニワトリ型抗体が活用されることを目的として、抗
ニワトリＩｇ抗体で検出できるよう、ｐＰＤＳ内のマウ
スＣκ鎖をニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）に置換した
新規な発現ベクターの構築を試みた。さらに精製を簡便
化する目的から、精製用タグ（ＦＬＡＧ）を導入した純
ニワトリ型リコンビナント抗体発現用ベクターの構築を
おこなった。図２にニワトリリコンビナント抗体発現用
ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
消するとともに、プリオン病解析さらにはより広範な研
究にニワトリ型抗体が活用されることを目的として、抗
ニワトリＩｇ抗体で検出できるよう、ｐＰＤＳ内のマウ
スＣκ鎖をニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）に置換した
新規な発現ベクターの構築を試みた。さらに精製を簡便
化する目的から、精製用タグ（ＦＬＡＧ）を導入した純
ニワトリ型リコンビナント抗体発現用ベクターの構築を
おこなった。図２にニワトリリコンビナント抗体発現用
ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
【００１６】まず、ニワトリＣλ鎖遺伝子をクローニン
グした。正常ニワトリ脾細胞から合成したｃＤＮＡをも
とにＰＣＲでニワトリＣλ鎖を増幅させたところ、Ｃλ
鎖遺伝子と思われる約３４０ｂｐのバンドを得た（図３
のＡ参照）。図３はこれらの結果を示す図面に代わる写
真である。図３中の「Ｍ１」はｐＵＣ１１８ Ｈｉｎｆ
Ｉで消化を、「Ｍ２」はφｘ１７４ ＨａｅIIIで消化
を示す。このバンドを制限酵素処理後ライゲーション
し、形質転換を行った。翌日ランダムに６クローンをア
ルカリＳＤＳ法でプラスミド調製を行い、インサートの
有無を確認したところ、全てにインサートが確認され
た。６クローンのうちの１クローン（クローン＃１）に
ついて塩基配列決定を行ったところ、１１４残基のアミ
ノ酸をコードする既報のＣλ鎖と完全一致した（図４参
照）。そこで、このクローンをベクター再構築用コンス
トラクト調製のためのテンプレートとした。
グした。正常ニワトリ脾細胞から合成したｃＤＮＡをも
とにＰＣＲでニワトリＣλ鎖を増幅させたところ、Ｃλ
鎖遺伝子と思われる約３４０ｂｐのバンドを得た（図３
のＡ参照）。図３はこれらの結果を示す図面に代わる写
真である。図３中の「Ｍ１」はｐＵＣ１１８ Ｈｉｎｆ
Ｉで消化を、「Ｍ２」はφｘ１７４ ＨａｅIIIで消化
を示す。このバンドを制限酵素処理後ライゲーション
し、形質転換を行った。翌日ランダムに６クローンをア
ルカリＳＤＳ法でプラスミド調製を行い、インサートの
有無を確認したところ、全てにインサートが確認され
た。６クローンのうちの１クローン（クローン＃１）に
ついて塩基配列決定を行ったところ、１１４残基のアミ
ノ酸をコードする既報のＣλ鎖と完全一致した（図４参
照）。そこで、このクローンをベクター再構築用コンス
トラクト調製のためのテンプレートとした。
【００１７】塩基配列を決定したクローニング済のニワ
トリＣλ鎖遺伝子をもとに、再構築コンストラクトに使
用するニワトリＣλ鎖遺伝子をＰＣＲ法を用いて調製し
た。その結果、副生成物も多々みられたが、約３６０ｂ
ｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと
思われるバンドが検出された（図３のＢ参照）。このバ
ンドを精製し、ｇｅｎｅIII遺伝子とのオーバーラップ
ＰＣＲ用テンプレートとした。
トリＣλ鎖遺伝子をもとに、再構築コンストラクトに使
用するニワトリＣλ鎖遺伝子をＰＣＲ法を用いて調製し
た。その結果、副生成物も多々みられたが、約３６０ｂ
ｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと
思われるバンドが検出された（図３のＢ参照）。このバ
ンドを精製し、ｇｅｎｅIII遺伝子とのオーバーラップ
ＰＣＲ用テンプレートとした。
【００１８】一方、ｐＰＤＳからのｇｅｎｅIII遺伝子
の増幅は、ＰＣＲ法を用いて行った。その結果、約６０
０ｂｐの位置にｇｅｎｅIII遺伝子と思われるバンドが
検出された（図３のＣ参照）。このバンドを精製し、Ｆ
ＬＡＧ配列の付加したニワトリＣλ遺伝子とのオーバー
ラップＰＣＲ用テンプレートとした。
の増幅は、ＰＣＲ法を用いて行った。その結果、約６０
０ｂｐの位置にｇｅｎｅIII遺伝子と思われるバンドが
検出された（図３のＣ参照）。このバンドを精製し、Ｆ
ＬＡＧ配列の付加したニワトリＣλ遺伝子とのオーバー
ラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【００１９】ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子のオ
ーバーラップＰＣＲは、ニワトリＣλ鎖遺伝子３’側そ
してｇｅｎｅIII遺伝子の５’側に付加されたＦＬＡＧ
配列を介して行った。その結果、約９５０ｂｐの位置に
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子が連結したと思わ
れるバンドが検出された（図３のＤ参照）。このバンド
を精製し制限酵素処理を行い、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで
処理されたｐＰＤＳにライゲーション、大腸菌へ形質転
換した。
ーバーラップＰＣＲは、ニワトリＣλ鎖遺伝子３’側そ
してｇｅｎｅIII遺伝子の５’側に付加されたＦＬＡＧ
配列を介して行った。その結果、約９５０ｂｐの位置に
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子が連結したと思わ
れるバンドが検出された（図３のＤ参照）。このバンド
を精製し制限酵素処理を行い、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで
処理されたｐＰＤＳにライゲーション、大腸菌へ形質転
換した。
【００２０】大腸菌への形質転換後、１５クローンをニ
ワトリＣλ鎖遺伝子の増幅でインサートチェックした。
その結果、１２クローンで約３６０ｂｐの位置にニワト
リＣλ鎖の増幅が確認できた（図５参照）。図５はこの
結果を示す図面に代わる写真である。図５の「Ｍ」はｐ
ＵＣ１１８ ＨｉｎｆＩで消化を示す。これらのクロー
ンはそれぞれｐＣＰＤＳ１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２と命名した。これら１２クロ
ーンはｓｃＦｖ遺伝子を含まない状態でファージ体の調
製を行い、発現タンパクの検討を行った。この１２クロ
ーン由来のファージ体は、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）な
らびに抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体
とし、ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体を検出用抗体
とするサンドイッチＥＬＩＳＡでニワトリＣλ鎖および
ファージ体の発現確認をした。なお、陽性対照としてｐ
ＰＤＳから発現させたファージ体を用いた。その結果、
ｐＣＰＤＳ８と１０を除いた残り１０クローンで抗ニワ
トリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合、
ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）平均０．６の反応性であっ
た（図６）。図６はこの結果を示すものであり、黒塗り
はキャプチャー抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を
使用した場合を示し、白抜きはキャプチャー抗体として
抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示す。こ
れらのクローンは、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプ
チャー抗体とした場合には、平均０．１７と低値であ
り、さらにｐＰＤＳでの反応性に比べ明らかに低いこと
から構成されたベクターは再構築用コンストラクトを正
確に発現する再構築ベクターであることがわかった。
ワトリＣλ鎖遺伝子の増幅でインサートチェックした。
その結果、１２クローンで約３６０ｂｐの位置にニワト
リＣλ鎖の増幅が確認できた（図５参照）。図５はこの
結果を示す図面に代わる写真である。図５の「Ｍ」はｐ
ＵＣ１１８ ＨｉｎｆＩで消化を示す。これらのクロー
ンはそれぞれｐＣＰＤＳ１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２と命名した。これら１２クロ
ーンはｓｃＦｖ遺伝子を含まない状態でファージ体の調
製を行い、発現タンパクの検討を行った。この１２クロ
ーン由来のファージ体は、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）な
らびに抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体
とし、ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体を検出用抗体
とするサンドイッチＥＬＩＳＡでニワトリＣλ鎖および
ファージ体の発現確認をした。なお、陽性対照としてｐ
ＰＤＳから発現させたファージ体を用いた。その結果、
ｐＣＰＤＳ８と１０を除いた残り１０クローンで抗ニワ
トリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合、
ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）平均０．６の反応性であっ
た（図６）。図６はこの結果を示すものであり、黒塗り
はキャプチャー抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を
使用した場合を示し、白抜きはキャプチャー抗体として
抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示す。こ
れらのクローンは、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプ
チャー抗体とした場合には、平均０．１７と低値であ
り、さらにｐＰＤＳでの反応性に比べ明らかに低いこと
から構成されたベクターは再構築用コンストラクトを正
確に発現する再構築ベクターであることがわかった。
【００２１】得られた発現ベクターｐＣＰＤＳの構成を
図７に示す。上述した実験で、正確なニワトリＣλ鎖お
よび再構成ファージの発現が確認された再構築ベクター
ｐＣＰＤＳ７を用い、図８〜図１３に示すニワトリ抗体
をコードする遺伝子ＨＵＣ２−１３のファージディスプ
レイ抗体および可溶型抗体を調製した。調製したリコン
ビナント抗体は、ＨＵＣ２−１３とあわせてＨ２５ペプ
チドに対する反応性の確認を試みた。その結果、一次抗
体を希釈なしで用いた場合、全ての抗体でＥＬＩＳＡ値
（ＯＤ４９２）が１．５を越えた。希釈した場合、ＨＵ
Ｃ２−１３および菌体破壊から調製した可溶型抗体では
２５倍希釈までほとんどＥＬＩＳＡ力価の低下はみられ
なかった。一方、ファージディスプレイ抗体および培養
上清からの可溶型抗体では低下傾向にあり、１２５倍希
釈では陽性ＥＬＩＳＡ力価が得られなかった。菌体破壊
から調製した可溶型抗体は、１２５倍希釈からＨＵＣ２
−１３のＥＬＩＳＡ力価を上回っていた（図１４参
照）。
図７に示す。上述した実験で、正確なニワトリＣλ鎖お
よび再構成ファージの発現が確認された再構築ベクター
ｐＣＰＤＳ７を用い、図８〜図１３に示すニワトリ抗体
をコードする遺伝子ＨＵＣ２−１３のファージディスプ
レイ抗体および可溶型抗体を調製した。調製したリコン
ビナント抗体は、ＨＵＣ２−１３とあわせてＨ２５ペプ
チドに対する反応性の確認を試みた。その結果、一次抗
体を希釈なしで用いた場合、全ての抗体でＥＬＩＳＡ値
（ＯＤ４９２）が１．５を越えた。希釈した場合、ＨＵ
Ｃ２−１３および菌体破壊から調製した可溶型抗体では
２５倍希釈までほとんどＥＬＩＳＡ力価の低下はみられ
なかった。一方、ファージディスプレイ抗体および培養
上清からの可溶型抗体では低下傾向にあり、１２５倍希
釈では陽性ＥＬＩＳＡ力価が得られなかった。菌体破壊
から調製した可溶型抗体は、１２５倍希釈からＨＵＣ２
−１３のＥＬＩＳＡ力価を上回っていた（図１４参
照）。
【００２２】図１４はこの結果を示したグラフである。
図１４中の黒四角印はニワトリ型ファージディスプレイ
抗体を示し、灰色菱形印はニワトリ型可溶型抗体（培養
上清）を示し、灰色丸形印はニワトリ型可溶型抗体（菌
体破壊）を示し、灰色三角形印はＨＵＣ２−１３（ネイ
ティブ抗体）を示す。
図１４中の黒四角印はニワトリ型ファージディスプレイ
抗体を示し、灰色菱形印はニワトリ型可溶型抗体（培養
上清）を示し、灰色丸形印はニワトリ型可溶型抗体（菌
体破壊）を示し、灰色三角形印はＨＵＣ２−１３（ネイ
ティブ抗体）を示す。
【００２３】以上の実験から、純粋なニワトリリコンビ
ナント抗体作製のためのベクターの再構築ができりこと
がわかった。このベクターから得られた純粋なニワトリ
リコンビナント抗体は、マウス抗体によるノイズが少な
く、検出のＳ／Ｎ比を高くすることができる。本発明の
ベクターの構築に当たって、（１）機能的なＳｃＦｖ抗
体が発現できる、（２）将来的にＦａｂ抗体も作製でき
るようなベクターにする、（３）簡便に精製できる、の
３点に留意した。この３点を考慮し、マウスＣκ鎖の代
わりにニワトリＣλ鎖を、精製用タグとしてＦＬＡＧ配
列と呼ばれる人工配列を選択した。
ナント抗体作製のためのベクターの再構築ができりこと
がわかった。このベクターから得られた純粋なニワトリ
リコンビナント抗体は、マウス抗体によるノイズが少な
く、検出のＳ／Ｎ比を高くすることができる。本発明の
ベクターの構築に当たって、（１）機能的なＳｃＦｖ抗
体が発現できる、（２）将来的にＦａｂ抗体も作製でき
るようなベクターにする、（３）簡便に精製できる、の
３点に留意した。この３点を考慮し、マウスＣκ鎖の代
わりにニワトリＣλ鎖を、精製用タグとしてＦＬＡＧ配
列と呼ばれる人工配列を選択した。
【００２４】また、再構築ベクターの作製にはｐＰＤＳ
ベクターをベースとし、適当な制限酵素部位を利用して
コンストラクトの入れ替えという形でできるようにし
た。ｐＰＤＳは、ｓｃＦｖ抗体クローニングサイト以降
ｇｅｎｅIII終止コドンの直後のＥｃｏＲＩまで、位置
的にも適当な制限酵素部位がないためＥａｇＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ間、もしくはＢｓｓＨII−ＥｃｏＲＩ間でコンスト
ラクトを置換せざるを得なかった。ニワトリＣλ鎖とＳ
ｃＦｖ抗体遺伝子の連結部位は、自然なＶＬ−Ｃλアミ
ノ酸配列に近似するよう注意しながら、高切断効率であ
り、かつベクターやＳｃＦｖ抗体遺伝子を切断しない制
限酵素とその設置部位を選定した。この切断位置を検討
するために、Ｖλ領域とＣλ領域の結合をまとめた。こ
れを表１として示す。
ベクターをベースとし、適当な制限酵素部位を利用して
コンストラクトの入れ替えという形でできるようにし
た。ｐＰＤＳは、ｓｃＦｖ抗体クローニングサイト以降
ｇｅｎｅIII終止コドンの直後のＥｃｏＲＩまで、位置
的にも適当な制限酵素部位がないためＥａｇＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ間、もしくはＢｓｓＨII−ＥｃｏＲＩ間でコンスト
ラクトを置換せざるを得なかった。ニワトリＣλ鎖とＳ
ｃＦｖ抗体遺伝子の連結部位は、自然なＶＬ−Ｃλアミ
ノ酸配列に近似するよう注意しながら、高切断効率であ
り、かつベクターやＳｃＦｖ抗体遺伝子を切断しない制
限酵素とその設置部位を選定した。この切断位置を検討
するために、Ｖλ領域とＣλ領域の結合をまとめた。こ
れを表１として示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１の＊は置換可能なアミノ酸であり、イ
タリックは置換に問題があるアミノ酸を示す。１）で示
されるアミノ酸配列に対応する塩基配列はｐＰＤＳ用の
プライマー配列であり、２）で示されるアミノ酸配列に
対応する塩基配列は本発明のニワトリ型抗体発現ベクタ
ー用のプライマー配列であることを示す。この結果、ふ
たたびＢｓｓＨIIとなったが、ＢｓｓＨII−ＥｃｏＲＩ
間でコンストラクトの置換を行うと、空ベクター発現時
にフレームシフトが生じ正確にタンパク発現されないこ
とから、ベクターの有効性を確認できないことが明らか
となった。そこで、新たなＥａｇＩ−ＢｓｓＨII間のス
ペーサーをつけ加えたＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ間コンスト
ラクトを導入することにした。
タリックは置換に問題があるアミノ酸を示す。１）で示
されるアミノ酸配列に対応する塩基配列はｐＰＤＳ用の
プライマー配列であり、２）で示されるアミノ酸配列に
対応する塩基配列は本発明のニワトリ型抗体発現ベクタ
ー用のプライマー配列であることを示す。この結果、ふ
たたびＢｓｓＨIIとなったが、ＢｓｓＨII−ＥｃｏＲＩ
間でコンストラクトの置換を行うと、空ベクター発現時
にフレームシフトが生じ正確にタンパク発現されないこ
とから、ベクターの有効性を確認できないことが明らか
となった。そこで、新たなＥａｇＩ−ＢｓｓＨII間のス
ペーサーをつけ加えたＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ間コンスト
ラクトを導入することにした。
【００２７】ニワトリＣλ鎖はニワトリ脾細胞から、ｇ
ｅｎｅIIIはｐＰＤＳから遺伝子を準備した。一方、Ｆ
ＬＡＧ−アンバー配列はプライマーの一部に導入し、Ｃ
λ鎖増幅時に連結させることとしたが、煩雑な脾臓細胞
由来ｃＤＮＡ群からＣλ鎖増幅時にこの５４塩基もある
プライマーを用いるのは危険であると判断し、いったん
クローニングしたＣλ鎖をテンプレートとしてＦＬＡＧ
−アンバー連結ＰＣＲを行うことにした。ＥａｇＩ−Ｂ
ｓｓＨIIのｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイト−ニ
ワトリＣλ鎖−ＦＬＡＧ−アンバー配列（ＴＡＧ）−ｇ
ｅｎｅIIIまでの再構築用コンストラクトは全てＫＯＤ
ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法で作製した。Ｅ
ａｇＩとＥｃｏＲＩで処理したｐＰＤＳにライゲーショ
ンし、最終的に１０クローンのニワトリＣλ鎖、再構成
ファージ体を発現するベクターが得られた（図６参
照）。
ｅｎｅIIIはｐＰＤＳから遺伝子を準備した。一方、Ｆ
ＬＡＧ−アンバー配列はプライマーの一部に導入し、Ｃ
λ鎖増幅時に連結させることとしたが、煩雑な脾臓細胞
由来ｃＤＮＡ群からＣλ鎖増幅時にこの５４塩基もある
プライマーを用いるのは危険であると判断し、いったん
クローニングしたＣλ鎖をテンプレートとしてＦＬＡＧ
−アンバー連結ＰＣＲを行うことにした。ＥａｇＩ−Ｂ
ｓｓＨIIのｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイト−ニ
ワトリＣλ鎖−ＦＬＡＧ−アンバー配列（ＴＡＧ）−ｇ
ｅｎｅIIIまでの再構築用コンストラクトは全てＫＯＤ
ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法で作製した。Ｅ
ａｇＩとＥｃｏＲＩで処理したｐＰＤＳにライゲーショ
ンし、最終的に１０クローンのニワトリＣλ鎖、再構成
ファージ体を発現するベクターが得られた（図６参
照）。
【００２８】以上の実験に基づく本発明の純粋なニワト
リリコンビナント抗体作製のための概要を図１５に示
す。これを順に説明する。 （１）抗体Ｖ領域遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）の調製 抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡを元に、
下記の表２に示す合成プライマーセット（ＶＨ増幅用プ
ライマーセット、ＶＬ増幅用プライマーセット）を用い
て増幅する。 （２）ｓｃＦｖの構築 （１）の実験で得たＶＨおよびＶＬの増幅産物を精製し
た後、ＶＨおよびＶＬを、リンカ（scFv linker）（−
（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−）を用いて連
結する（アッセンブリー反応）。 （３）ｓｃＦｖの再増幅と制限酵素処理 ｓｃＦｖの再増幅のための下記表２に示すプライマー・
セット（ＣＨＢとＣＬＦ１）を用いて、（２）で構築し
たｓｃＦｖの再増幅を行い、ｓｃＦｖを精製した後、プ
ラスミドベクターｐＣＰＤＳに挿入するため、制限酵素
（ＥａｇIとＢｓｓＨII）を用いてｓｃＦｖ挿入遺伝子
断片（インサート）を調製する。
リリコンビナント抗体作製のための概要を図１５に示
す。これを順に説明する。 （１）抗体Ｖ領域遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）の調製 抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡを元に、
下記の表２に示す合成プライマーセット（ＶＨ増幅用プ
ライマーセット、ＶＬ増幅用プライマーセット）を用い
て増幅する。 （２）ｓｃＦｖの構築 （１）の実験で得たＶＨおよびＶＬの増幅産物を精製し
た後、ＶＨおよびＶＬを、リンカ（scFv linker）（−
（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−）を用いて連
結する（アッセンブリー反応）。 （３）ｓｃＦｖの再増幅と制限酵素処理 ｓｃＦｖの再増幅のための下記表２に示すプライマー・
セット（ＣＨＢとＣＬＦ１）を用いて、（２）で構築し
たｓｃＦｖの再増幅を行い、ｓｃＦｖを精製した後、プ
ラスミドベクターｐＣＰＤＳに挿入するため、制限酵素
（ＥａｇIとＢｓｓＨII）を用いてｓｃＦｖ挿入遺伝子
断片（インサート）を調製する。
【００２９】（４）インサート（ｓｃＦｖ）のｐＣＰＤ
Ｓへの挿入（ライゲーション） ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調
整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（TAKARA））を
用いてライゲーションを行う。 （５）大腸菌の形質転換 インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用い
て、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を形質転
換する。 （６）インサートを発現する形質転換大腸菌の選抜 増殖させた大腸菌のコロニーから複数の大腸菌コロニー
を任意に取り、プライマー・セットを用いてｓｃＦｖの
増幅を行い、インサートを発現する形質転換大腸菌を選
抜する。 （７）ファージ発現抗体の作成 選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファー
ジ発現抗体を作成する。 （８）特異的ファージ抗体の選抜のためのバニシング 抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファ
ージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗
体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体
を選抜する。 （９）可溶化抗体の作成 特異的ファージ抗体をノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡ
あるいはＨＢ２１５１）に感染させる。感染２４時間後
に、大腸菌培養上清および培養菌体を回収し、上清およ
び菌体破壊抽出物を可溶化抗体とする。 （１０）可溶化抗体の生成 抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲルを用いて可溶化抗体
をアフィニティ精製する。
Ｓへの挿入（ライゲーション） ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調
整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（TAKARA））を
用いてライゲーションを行う。 （５）大腸菌の形質転換 インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用い
て、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を形質転
換する。 （６）インサートを発現する形質転換大腸菌の選抜 増殖させた大腸菌のコロニーから複数の大腸菌コロニー
を任意に取り、プライマー・セットを用いてｓｃＦｖの
増幅を行い、インサートを発現する形質転換大腸菌を選
抜する。 （７）ファージ発現抗体の作成 選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファー
ジ発現抗体を作成する。 （８）特異的ファージ抗体の選抜のためのバニシング 抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファ
ージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗
体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体
を選抜する。 （９）可溶化抗体の作成 特異的ファージ抗体をノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡ
あるいはＨＢ２１５１）に感染させる。感染２４時間後
に、大腸菌培養上清および培養菌体を回収し、上清およ
び菌体破壊抽出物を可溶化抗体とする。 （１０）可溶化抗体の生成 抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲルを用いて可溶化抗体
をアフィニティ精製する。
【００３０】このようにして、本発明の発現ベクターｐ
ＣＰＤＳを用いることにより純粋なニワトリリコンビナ
ント抗体を製造することができる。この本発明のニワト
リ型抗体を作成するためのｓｃＦｖの製造についてさら
に詳細に説明する。哺乳動物と鳥類では、抗体遺伝子の
多様性獲得メカニズムが異なっており、哺乳動物抗体遺
伝子では多数のＶ遺伝子のうちの１つが再構築するが、
鳥類抗体遺伝子では、機能する抗体遺伝子はただ１つで
あり、この機能的抗体遺伝子内に偽Ｖ遺伝子がランダム
に挿入される。図１６は哺乳動物（図１６上段）と鳥類
（図１６下段）における抗体Ｈ鎖を模式的に示したもの
である。哺乳動物抗体遺伝子では多数のＶ遺伝子のうち
の１つが再構築するために、５’側の塩基配列も変動
し、抗体の種類によってプライマーを用意しなければな
らないのであるが、鳥類抗体遺伝子では、機能する抗体
遺伝子はただ１つであり、この機能的抗体遺伝子内に抗
体の種類に応じた偽Ｖ遺伝子がランダムに挿入されるた
めに、どの種類の抗体であったも５’側の塩基配列も基
本的に変動しない。
ＣＰＤＳを用いることにより純粋なニワトリリコンビナ
ント抗体を製造することができる。この本発明のニワト
リ型抗体を作成するためのｓｃＦｖの製造についてさら
に詳細に説明する。哺乳動物と鳥類では、抗体遺伝子の
多様性獲得メカニズムが異なっており、哺乳動物抗体遺
伝子では多数のＶ遺伝子のうちの１つが再構築するが、
鳥類抗体遺伝子では、機能する抗体遺伝子はただ１つで
あり、この機能的抗体遺伝子内に偽Ｖ遺伝子がランダム
に挿入される。図１６は哺乳動物（図１６上段）と鳥類
（図１６下段）における抗体Ｈ鎖を模式的に示したもの
である。哺乳動物抗体遺伝子では多数のＶ遺伝子のうち
の１つが再構築するために、５’側の塩基配列も変動
し、抗体の種類によってプライマーを用意しなければな
らないのであるが、鳥類抗体遺伝子では、機能する抗体
遺伝子はただ１つであり、この機能的抗体遺伝子内に抗
体の種類に応じた偽Ｖ遺伝子がランダムに挿入されるた
めに、どの種類の抗体であったも５’側の塩基配列も基
本的に変動しない。
【００３１】したがって、抗体遺伝子を抗体産生細胞か
らＰＣＲで増幅しようとする場合、哺乳動物Ｖ遺伝子
は、多数のＶ遺伝子のどれが用いられているかわからな
いので、抗体の種類に応じて５’側（Ｖ遺伝子側）に多
数のプライマーを合成し、準備しなければならない。一
方、鳥類Ｖ遺伝子は、ベースとなる機能的Ｖ遺伝子が１
つであるので、あらかじめその塩基配列がわかっている
ので、５’側１つ、３’側１つの１ペアのプライマー
で、全ての抗体産生細胞に対応できる点も、鳥類の抗体
を用いる際の大きな特徴である。本発明が開示する鳥類
用のプライマーを次の表２に示す。
らＰＣＲで増幅しようとする場合、哺乳動物Ｖ遺伝子
は、多数のＶ遺伝子のどれが用いられているかわからな
いので、抗体の種類に応じて５’側（Ｖ遺伝子側）に多
数のプライマーを合成し、準備しなければならない。一
方、鳥類Ｖ遺伝子は、ベースとなる機能的Ｖ遺伝子が１
つであるので、あらかじめその塩基配列がわかっている
ので、５’側１つ、３’側１つの１ペアのプライマー
で、全ての抗体産生細胞に対応できる点も、鳥類の抗体
を用いる際の大きな特徴である。本発明が開示する鳥類
用のプライマーを次の表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】表２に示されるプライマーセットを使用す
ることにより、基本的にはどのような抗体であっても、
鳥類、好ましくはニワトリの抗体遺伝子を増幅させるこ
とが可能となる。この中で、ＣＬＦ１として示されるプ
ライマーは、新規な塩基配列を有するものであり、その
途中に制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できるサイト（ｇｃｇ
ｃｇｃ）を有していることを大きな特徴とするものであ
る。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。図１７
は、このプライマーＣＬＦ１の使用状況を模式的に示し
たものであり、図１７の上段の左側がＶＬ領域であり、
そのすぐ右側がＣλ領域である。前記してきたように、
発現ベクターｐＣＰＤＳにおいてはＶＬ領域とＣλ領域
が制限酵素ＢｓｓＨIIで結合されるために、ＶＬ領域の
３’末端とＣλ領域の５’末端の結合の様子を示してい
る。図１７の丸２で示した塩基配列の四角枠で囲った部
分が制限酵素ＢｓｓＨIIで切断可能な位置である。そし
て、前述してきたように鳥類ではＶＬ領域の末端の塩基
配列は抗体の種類により変動しなのであるから、このプ
ライマーＣＬＦ１を用いることによりＶＬ領域及びＶＨ
−リンカー−ＶＬからなるｓｃＦｖをも増幅可能とな
る。
ることにより、基本的にはどのような抗体であっても、
鳥類、好ましくはニワトリの抗体遺伝子を増幅させるこ
とが可能となる。この中で、ＣＬＦ１として示されるプ
ライマーは、新規な塩基配列を有するものであり、その
途中に制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できるサイト（ｇｃｇ
ｃｇｃ）を有していることを大きな特徴とするものであ
る。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。図１７
は、このプライマーＣＬＦ１の使用状況を模式的に示し
たものであり、図１７の上段の左側がＶＬ領域であり、
そのすぐ右側がＣλ領域である。前記してきたように、
発現ベクターｐＣＰＤＳにおいてはＶＬ領域とＣλ領域
が制限酵素ＢｓｓＨIIで結合されるために、ＶＬ領域の
３’末端とＣλ領域の５’末端の結合の様子を示してい
る。図１７の丸２で示した塩基配列の四角枠で囲った部
分が制限酵素ＢｓｓＨIIで切断可能な位置である。そし
て、前述してきたように鳥類ではＶＬ領域の末端の塩基
配列は抗体の種類により変動しなのであるから、このプ
ライマーＣＬＦ１を用いることによりＶＬ領域及びＶＨ
−リンカー−ＶＬからなるｓｃＦｖをも増幅可能とな
る。
【００３４】以上のように、本発明は純粋なニワトリリ
コンビナント抗体を製造するための新規なプライマーセ
ット、新規な発現ベクターｐＣＰＤＳ、及びそれを用い
て製造される純粋なニワトリリコンビナント抗体を提供
するものである。
コンビナント抗体を製造するための新規なプライマーセ
ット、新規な発現ベクターｐＣＰＤＳ、及びそれを用い
て製造される純粋なニワトリリコンビナント抗体を提供
するものである。
【００３５】
【実施例】以下に実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
【００３６】実施例１ ニワトリリコンビナント抗体発
現用ベクターの設計 ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターの設計は、
ｐＰＤＳベクターをベースに行った。ｐＰＤＳにすでに
挿入されているマウスＣκ鎖遺伝子をニワトリＣλ鎖遺
伝子に置換し、その際ＶＬとＣλ連結の配列がgermline
のアミノ酸配列に近似し、使用遺伝子が切断されないよ
うなクローニング用制限酵素部位を選択した（表１参
照）。また、インサートのない状態（Ｍｏｃｋ）でもニ
ワトリＣλ鎖の発現でベクター検定できるようＥａｇＩ
以降のスペーサー配列も新たに設計し直した。ニワトリ
Ｃλ鎖の下流には精製用タグであるＦＬＡＧ配列（ＤＹ
ＫＤＤＤＤＫ）、さらにＦＬＡＧ配列とｇｅｎｅIIIの
間には可溶型抗体として発現できるようＴＡＧ（ａｍｂ
ｅｒ）ストップコドンを挿入した。ＥａｇＩ部位からｇ
ｅｎｅIIIまで作製したコンストラクトは、ＥａｇＩと
ＥｃｏＲＩ処理したｐＰＤＳにライゲーションし、ニワ
トリリコンビナント抗体発現用ベクターとした（図２参
照）。
現用ベクターの設計 ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターの設計は、
ｐＰＤＳベクターをベースに行った。ｐＰＤＳにすでに
挿入されているマウスＣκ鎖遺伝子をニワトリＣλ鎖遺
伝子に置換し、その際ＶＬとＣλ連結の配列がgermline
のアミノ酸配列に近似し、使用遺伝子が切断されないよ
うなクローニング用制限酵素部位を選択した（表１参
照）。また、インサートのない状態（Ｍｏｃｋ）でもニ
ワトリＣλ鎖の発現でベクター検定できるようＥａｇＩ
以降のスペーサー配列も新たに設計し直した。ニワトリ
Ｃλ鎖の下流には精製用タグであるＦＬＡＧ配列（ＤＹ
ＫＤＤＤＤＫ）、さらにＦＬＡＧ配列とｇｅｎｅIIIの
間には可溶型抗体として発現できるようＴＡＧ（ａｍｂ
ｅｒ）ストップコドンを挿入した。ＥａｇＩ部位からｇ
ｅｎｅIIIまで作製したコンストラクトは、ＥａｇＩと
ＥｃｏＲＩ処理したｐＰＤＳにライゲーションし、ニワ
トリリコンビナント抗体発現用ベクターとした（図２参
照）。
【００３７】実施例２ ニワトリＣλ鎖遺伝子の単離 （１） ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマ
ーの設計と合成 ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマーは、既
報のＣλ鎖塩基配列をもとにOLIGO 4.05 Primer Analys
is Software（National Bioscinece）を用いて設計し、
北海道システムサイエンスに委託して合成した。 （２） ニワトリCλ鎖遺伝子の増幅とクローニング ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅は、正常ニワトリ脾細胞か
ら後記する方法に準じＲＴ−ＰＣＲ法で行った。ＰＣＲ
反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム
抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ ２０μｌに再溶解
した。その溶液に１６Ｕ／μｌのＢａｍＨＩと２０Ｕ／
μｌのＨｉｎｄIIIをそれぞれ１μｌずつ添加し、３７
℃ ２時間の制限酵素処理し、エタノール沈殿濃縮をし
た。濃縮後のサンプルは、ＤＷ １０μｌに再溶解し、
１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、UltraCle
anで精製し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。濃度測定
後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）とモル比が
ベクター：インサート＝１：３になるように混合し、TA
KARA Ligation Kit ver.1で１６℃ ３時間ライゲーシ
ョンした。ライゲーション終了後、その反応液５μｌを
コンピテントセルに形質転換し、４０μｌをアンピシリ
ン含有２×ＹＴプレートにプレーティングした。翌日、
得られたコロニーを単離しアンピシリン含有２×ＹＴ培
地で少量培養し、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを調
製後、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで制限酵素処理し、イ
ンサート有無の確認をした。定法にしたがって、その塩
基配列を決定した（図４参照）。
ーの設計と合成 ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマーは、既
報のＣλ鎖塩基配列をもとにOLIGO 4.05 Primer Analys
is Software（National Bioscinece）を用いて設計し、
北海道システムサイエンスに委託して合成した。 （２） ニワトリCλ鎖遺伝子の増幅とクローニング ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅は、正常ニワトリ脾細胞か
ら後記する方法に準じＲＴ−ＰＣＲ法で行った。ＰＣＲ
反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム
抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ ２０μｌに再溶解
した。その溶液に１６Ｕ／μｌのＢａｍＨＩと２０Ｕ／
μｌのＨｉｎｄIIIをそれぞれ１μｌずつ添加し、３７
℃ ２時間の制限酵素処理し、エタノール沈殿濃縮をし
た。濃縮後のサンプルは、ＤＷ １０μｌに再溶解し、
１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、UltraCle
anで精製し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。濃度測定
後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）とモル比が
ベクター：インサート＝１：３になるように混合し、TA
KARA Ligation Kit ver.1で１６℃ ３時間ライゲーシ
ョンした。ライゲーション終了後、その反応液５μｌを
コンピテントセルに形質転換し、４０μｌをアンピシリ
ン含有２×ＹＴプレートにプレーティングした。翌日、
得られたコロニーを単離しアンピシリン含有２×ＹＴ培
地で少量培養し、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを調
製後、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで制限酵素処理し、イ
ンサート有無の確認をした。定法にしたがって、その塩
基配列を決定した（図４参照）。
【００３８】実施例３ 連結反応用ニワトリＣλ鎖遺伝
子の調製 （１） ニワトリＣλ鎖遺伝子増幅用プライマーの設計
と合成 再構築ベクターのコンストラクトとなるニワトリＣλ鎖
遺伝子の増幅用プライマーは、ｓｃＦｖ抗体遺伝子クロ
ーニングサイトになるようＥａｇＩ、ＢｓｓＨIIを組み
込み、さらに空ベクターでも発現できるようフレームシ
フトに留意したセンスプライマーと、ＦＬＡＧ−アンバ
ー−ｇｅｎｅIII−５’末端配列を付加してｐＰＤＳか
ら単離したｇｅｎｅIIIと連結できるようにしたアンチ
センスプライマーを設計し、その合成した。 （２） ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅 塩基配列決定後、データバンクと照会し完全一致したク
ローンは、塩化セシウム法で大量調製した。調製したサ
ンプルをテンプレートとし、オーバーラップＰＣＲ用ニ
ワトリＣλ鎖遺伝子を調製した。ＰＣＲ反応液は、フェ
ノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノー
ル沈殿濃縮し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。この反応
液を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、Ｕｌｔｒａ
Ｃｌｅａｎで精製、ＤＷ １０μｌに再溶解し、ＶＣＳ
−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIとのオーバーラップＰＣＲ用
サンプルとした。
子の調製 （１） ニワトリＣλ鎖遺伝子増幅用プライマーの設計
と合成 再構築ベクターのコンストラクトとなるニワトリＣλ鎖
遺伝子の増幅用プライマーは、ｓｃＦｖ抗体遺伝子クロ
ーニングサイトになるようＥａｇＩ、ＢｓｓＨIIを組み
込み、さらに空ベクターでも発現できるようフレームシ
フトに留意したセンスプライマーと、ＦＬＡＧ−アンバ
ー−ｇｅｎｅIII−５’末端配列を付加してｐＰＤＳか
ら単離したｇｅｎｅIIIと連結できるようにしたアンチ
センスプライマーを設計し、その合成した。 （２） ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅 塩基配列決定後、データバンクと照会し完全一致したク
ローンは、塩化セシウム法で大量調製した。調製したサ
ンプルをテンプレートとし、オーバーラップＰＣＲ用ニ
ワトリＣλ鎖遺伝子を調製した。ＰＣＲ反応液は、フェ
ノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノー
ル沈殿濃縮し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。この反応
液を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、Ｕｌｔｒａ
Ｃｌｅａｎで精製、ＤＷ １０μｌに再溶解し、ＶＣＳ
−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIとのオーバーラップＰＣＲ用
サンプルとした。
【００３９】実施例４ 連結反応用ＶＣＳ−Ｍ１３由来
ｇｅｎｅIIIの調製 （１） ｇｅｎｅIII増幅用プライマーの設計と合成 ｐＰＤＳからのｇｅｎｅIII増幅には、ニワトリＣλ鎖
とＦＬＡＧ−アンバー配列を介して連結できるようなセ
ンスプライマーとｇｅｎｅIIIの終止コドン直後にＥｃ
ｏＲＩを導入したアンチセンスプライマーを設計し、合
成した。 （２） ｇｅｎｅIIIの増幅 ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIの調製は、ｐＰＤＳベ
クターからＰＣＲ法で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノ
ール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール
沈殿濃縮し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。この反応液
を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣ
ｌｅａｎで精製、ＤＷ １０μｌに再溶解し、ニワトリ
Ｃλ鎖とのオーバーラップＰＣＲ用サンプルとした。
ｇｅｎｅIIIの調製 （１） ｇｅｎｅIII増幅用プライマーの設計と合成 ｐＰＤＳからのｇｅｎｅIII増幅には、ニワトリＣλ鎖
とＦＬＡＧ−アンバー配列を介して連結できるようなセ
ンスプライマーとｇｅｎｅIIIの終止コドン直後にＥｃ
ｏＲＩを導入したアンチセンスプライマーを設計し、合
成した。 （２） ｇｅｎｅIIIの増幅 ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIの調製は、ｐＰＤＳベ
クターからＰＣＲ法で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノ
ール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール
沈殿濃縮し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。この反応液
を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣ
ｌｅａｎで精製、ＤＷ １０μｌに再溶解し、ニワトリ
Ｃλ鎖とのオーバーラップＰＣＲ用サンプルとした。
【００４０】実施例５ ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII
との連結反応 ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIIIとの連結は、モル比１：
１で混合したテンプレートをもとにアッセンブリー反
応、再増幅反応で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノール
抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿
濃縮し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。この反応液を
１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣｌ
ｅａｎで精製、ＤＷ １０μｌに再溶解した。
との連結反応 ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIIIとの連結は、モル比１：
１で混合したテンプレートをもとにアッセンブリー反
応、再増幅反応で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノール
抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿
濃縮し、ＤＷ １０μｌに再溶解した。この反応液を
１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣｌ
ｅａｎで精製、ＤＷ １０μｌに再溶解した。
【００４１】実施例６ ｐＰＤＳベクターからのマウス
Ｃκ鎖、ｇｅｎｅIIIの除去とニワトリＣλ鎖−ｇｅｎ
ｅ３の挿入 ｐＰＤＳベクターにニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅIIIを挿
入するため、１０Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０Ｕ／μｌの
ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、さらに、分子内ライゲー
ションを防ぐためＢＡＰ処理を行った。ＢＡＰ処理後の
反応液は、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動
し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製後、ＤＷ１０μｌに再
溶解し、再構築用サンプルとした。また、ニワトリＣλ
鎖−ｇｅｎｅIIIも同様に制限酵素処理、精製して１０
μｌの再構築用サンプルを準備した。調製した再構築用
サンプルは濃度測定後、ベクター：インサートのモル比
が１：３になるように混合し、TAKARA Ligation Kit ve
r.1で１６℃ ３時間ライゲーションし、その反応液５
μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転換した。形質
転換した大腸菌はアンピシリン含有２×ＹＴプレートに
４０μｌプレーティングし、終夜３７℃で培養した。挿
入遺伝子は，コロニーをテンプレートにニワトリＣλ鎖
のＰＣＲ法による増幅で確認した。
Ｃκ鎖、ｇｅｎｅIIIの除去とニワトリＣλ鎖−ｇｅｎ
ｅ３の挿入 ｐＰＤＳベクターにニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅIIIを挿
入するため、１０Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０Ｕ／μｌの
ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、さらに、分子内ライゲー
ションを防ぐためＢＡＰ処理を行った。ＢＡＰ処理後の
反応液は、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動
し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製後、ＤＷ１０μｌに再
溶解し、再構築用サンプルとした。また、ニワトリＣλ
鎖−ｇｅｎｅIIIも同様に制限酵素処理、精製して１０
μｌの再構築用サンプルを準備した。調製した再構築用
サンプルは濃度測定後、ベクター：インサートのモル比
が１：３になるように混合し、TAKARA Ligation Kit ve
r.1で１６℃ ３時間ライゲーションし、その反応液５
μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転換した。形質
転換した大腸菌はアンピシリン含有２×ＹＴプレートに
４０μｌプレーティングし、終夜３７℃で培養した。挿
入遺伝子は，コロニーをテンプレートにニワトリＣλ鎖
のＰＣＲ法による増幅で確認した。
【００４２】実施例７ 再構成ファージ体発現の確認 再構成ファージ体発現の確認は，サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法で行った．抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Kirk
egaard and Perry Laboratories）と抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）抗体（Kirkegaard and Perry Laboratorie
s）を０．５μｇ／ｗｅｌｌで４℃ 終夜固相化し、ブ
ロッキングの後、挿入遺伝子の確認できたコロニーをも
とにｓｃＦｖ抗体発現なしの再構成ファージ体を５０μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃ １時間反応させた。反応
後、３，５００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗Ｍ１３抗体を
３７℃ １時間反応させｏ−フェニレンジアミンを基質
として発色させた。１０分間の反応後、４９２ｎｍの吸
収をマイクロプレートリーダＭＰＲ−Ａ４ｉで測定し
た。
Ａ法で行った．抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Kirk
egaard and Perry Laboratories）と抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）抗体（Kirkegaard and Perry Laboratorie
s）を０．５μｇ／ｗｅｌｌで４℃ 終夜固相化し、ブ
ロッキングの後、挿入遺伝子の確認できたコロニーをも
とにｓｃＦｖ抗体発現なしの再構成ファージ体を５０μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃ １時間反応させた。反応
後、３，５００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗Ｍ１３抗体を
３７℃ １時間反応させｏ−フェニレンジアミンを基質
として発色させた。１０分間の反応後、４９２ｎｍの吸
収をマイクロプレートリーダＭＰＲ−Ａ４ｉで測定し
た。
【００４３】実施例８ ＨＵＣ２−１３の作成 （１） 供試細胞株 チミジンキナーゼ欠損、ウアバイン耐性のニワトリＢ細
胞株ＭｕＨ１を親株として、細胞融合で作成された哺乳
動物プオリンタンパクＰｒＰの２５−２９残基を認識す
る抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体ＨＵＣ２−１３
産生ハイブリドーマを使用した。なお、細胞は１０％Ｆ
ＢＳ（Fetal bovine serum）（SIGMA）含有ＩＭＤＭ（I
scove's modified Dullbecco's medium）（GIBCO BRL）
を用い、３８．５℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で
培養維持した。その培養上清は、抗ＰｒＰニワトリモノ
クローナル抗体ＨＵＣ２−１３として利用した。 （２） 抗体Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅 （２−１） ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成 供試細胞のＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（Nippon Gen
e）を用い、添付のプロトコールに従い単離した。単離
したＲＮＡは、ジエチルピロカーボネート処理蒸留水
（diethylpyrocarbonate-distilled water、DEPC-DW）
２０μｌに再溶解した。１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮ
Ａの合成は、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー法を用いて行
った。１〜５μｇの全ＲＮＡ溶液に５００μｇ／ｍｌ
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ１５プライマー（Boehringer Mammhei
m）を１．０μｌ加え、蒸留水（Ｄ．Ｗ）で１２μｌに
調製した。この混合液を７０℃で１０分間インキュベー
トし、氷冷後、５×逆転写バッファー（GIBCO BRL）を
４．０μｌ、０．１Ｍジチオスレイトール（dithiothre
itol、ＤＴＴ）（GIBCO BRL）を２．０μｌ、５ｍＭ
ｄＮＴＰｓ（GIBCO BRL）を２．０μｌ加え、４２℃で
２分間インキュベートした。その後、２００Ｕ／μｌ逆
転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII ＲＴ）（GIBCO
BRL）を１．０μｌ加え、４２℃で５０分間、続いて７
０℃で１５分間インキュベートした。合成したｃＤＮＡ
は−２０℃で保存した。 （２−２） ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子ならびにリンカー遺
伝子の増幅と精製 ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によるＶＨ、
ＶＬ抗体遺伝子の増幅には、（２−１）で合成したｃＤ
ＮＡを、リンカー遺伝子の増幅にはリンカー供給用に構
築されたプラスミドｐＬＩＮＫをテンプレートとし、そ
れぞれ１ペアのセンスプライマーおよびリバースプライ
マー、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO）、Ｃｌｏ
ｎｅｄ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）
を用いた。また、陽性対照として、Yamanakaらが作製し
た抗マウスアルブミンモノクローナル抗体３Ｃ８（ニワ
トリリコンビナント抗体）を供試した。ＶＨ、ＶＬ抗体
遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノール抽出、フェノー
ル・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン
２μｌを加えたエタノール沈殿によって濃縮した後、
１．５％アガロースゲル（和光純薬）を用いて電気泳動
した。得られたバンドは、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ（MO
BIO laboratories、 Inc.）で添付プロトコールに従い
精製し、ＤＷ ２０μｌで溶出させた。リンカー遺伝子
のＰＣＲ反応溶液は、ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子の精製と同
様に行った。ただし、電気泳動には３．０％アガロース
ゲルを用いた。
胞株ＭｕＨ１を親株として、細胞融合で作成された哺乳
動物プオリンタンパクＰｒＰの２５−２９残基を認識す
る抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体ＨＵＣ２−１３
産生ハイブリドーマを使用した。なお、細胞は１０％Ｆ
ＢＳ（Fetal bovine serum）（SIGMA）含有ＩＭＤＭ（I
scove's modified Dullbecco's medium）（GIBCO BRL）
を用い、３８．５℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で
培養維持した。その培養上清は、抗ＰｒＰニワトリモノ
クローナル抗体ＨＵＣ２−１３として利用した。 （２） 抗体Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅 （２−１） ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成 供試細胞のＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（Nippon Gen
e）を用い、添付のプロトコールに従い単離した。単離
したＲＮＡは、ジエチルピロカーボネート処理蒸留水
（diethylpyrocarbonate-distilled water、DEPC-DW）
２０μｌに再溶解した。１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮ
Ａの合成は、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー法を用いて行
った。１〜５μｇの全ＲＮＡ溶液に５００μｇ／ｍｌ
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ１５プライマー（Boehringer Mammhei
m）を１．０μｌ加え、蒸留水（Ｄ．Ｗ）で１２μｌに
調製した。この混合液を７０℃で１０分間インキュベー
トし、氷冷後、５×逆転写バッファー（GIBCO BRL）を
４．０μｌ、０．１Ｍジチオスレイトール（dithiothre
itol、ＤＴＴ）（GIBCO BRL）を２．０μｌ、５ｍＭ
ｄＮＴＰｓ（GIBCO BRL）を２．０μｌ加え、４２℃で
２分間インキュベートした。その後、２００Ｕ／μｌ逆
転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII ＲＴ）（GIBCO
BRL）を１．０μｌ加え、４２℃で５０分間、続いて７
０℃で１５分間インキュベートした。合成したｃＤＮＡ
は−２０℃で保存した。 （２−２） ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子ならびにリンカー遺
伝子の増幅と精製 ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によるＶＨ、
ＶＬ抗体遺伝子の増幅には、（２−１）で合成したｃＤ
ＮＡを、リンカー遺伝子の増幅にはリンカー供給用に構
築されたプラスミドｐＬＩＮＫをテンプレートとし、そ
れぞれ１ペアのセンスプライマーおよびリバースプライ
マー、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO）、Ｃｌｏ
ｎｅｄ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）
を用いた。また、陽性対照として、Yamanakaらが作製し
た抗マウスアルブミンモノクローナル抗体３Ｃ８（ニワ
トリリコンビナント抗体）を供試した。ＶＨ、ＶＬ抗体
遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノール抽出、フェノー
ル・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン
２μｌを加えたエタノール沈殿によって濃縮した後、
１．５％アガロースゲル（和光純薬）を用いて電気泳動
した。得られたバンドは、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ（MO
BIO laboratories、 Inc.）で添付プロトコールに従い
精製し、ＤＷ ２０μｌで溶出させた。リンカー遺伝子
のＰＣＲ反応溶液は、ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子の精製と同
様に行った。ただし、電気泳動には３．０％アガロース
ゲルを用いた。
【００４４】（２−３） ｓｃＦｖ抗体遺伝子の増幅と
精製 ｓｃＦｖ抗体遺伝子合成増幅のためのアッセンブリー反
応ならびに再増幅反応は、精製したＶＨ、ＶＬ、および
リンカーをそれぞれモル比１：１：１で混合して行っ
た。ｓｃＦｖ抗体遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノー
ル抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍ
ｌ グリコーゲン ２μｌ加えたエタノール沈殿によっ
て濃縮した後、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳
動した。得られたバンドは、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎで
添付プロトコールに従い精製し、ＤＷ ２０μｌで溶出
させた。 （３） 発現ベクター（ｐＰＤＳ）の調製 ロート製薬（株）山中八郎博士より分与を受けたファー
ジディスプレイ用発現ベクター（ｐＰＤＳ）（図１）
を、Escherichia coli XL1-Blueへ塩化ルビジウム法に
よる形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
２×ＹＴプレートにプレーティング後、３７℃の終夜培
養をした。得られたコロニーは選択採取し、５０μｇ／
ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地で大量振盪培養し
た。培養した大腸菌からのベクター精製は、塩化セシウ
ム密度勾配平衡遠心法により行った。 （４） 制限酵素処理とＢＡＰ処理 精製したｓｃＦｖ遺伝子断片２μｇとベクターｐＰＤＳ
１０μｇは、ＤＮＡ１．０μｇに対して４．０ＵのＥａ
ｇＩ（New England BioLabs, Inc.）を添加し、３７℃
で終夜処理した。ＥａｇＩ処理後、同様の比率で反応液
にＢｓｓＨII（New England BioLabs, Inc.）を添加
し、５０℃で４時間処理した。ＢｓｓＨII処理後，６８
℃、２０分間の酵素失活処理をし、反応液をＤＷで３０
０μｌにメスアップした上でフェノール抽出、フェノー
ル・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン
２μｌを加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ ３０μｌに
再溶解した。ベクターは、分子内ライゲーションを防ぐ
ため大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（Bacterial
alkaline phosphatase、ＢＡＰ）（TOYOBO）を用いて脱
リン酸化処理した。ベクター３０μｌに５×ＢＡＰバッ
ファー１０μｌ、アルカリフォスファターゼ（０．４Ｕ
／μｌ）３μｌ、ＤＷ ７μｌを加え、３７℃ ３時間
の処理を行った。処理後の反応液は、ＤＷで３００μｌ
にメスアップした上でフェノール抽出、フェノール・ク
ロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン ２μ
ｌ加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ ３０μｌに再溶解
した。
精製 ｓｃＦｖ抗体遺伝子合成増幅のためのアッセンブリー反
応ならびに再増幅反応は、精製したＶＨ、ＶＬ、および
リンカーをそれぞれモル比１：１：１で混合して行っ
た。ｓｃＦｖ抗体遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノー
ル抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍ
ｌ グリコーゲン ２μｌ加えたエタノール沈殿によっ
て濃縮した後、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳
動した。得られたバンドは、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎで
添付プロトコールに従い精製し、ＤＷ ２０μｌで溶出
させた。 （３） 発現ベクター（ｐＰＤＳ）の調製 ロート製薬（株）山中八郎博士より分与を受けたファー
ジディスプレイ用発現ベクター（ｐＰＤＳ）（図１）
を、Escherichia coli XL1-Blueへ塩化ルビジウム法に
よる形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
２×ＹＴプレートにプレーティング後、３７℃の終夜培
養をした。得られたコロニーは選択採取し、５０μｇ／
ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地で大量振盪培養し
た。培養した大腸菌からのベクター精製は、塩化セシウ
ム密度勾配平衡遠心法により行った。 （４） 制限酵素処理とＢＡＰ処理 精製したｓｃＦｖ遺伝子断片２μｇとベクターｐＰＤＳ
１０μｇは、ＤＮＡ１．０μｇに対して４．０ＵのＥａ
ｇＩ（New England BioLabs, Inc.）を添加し、３７℃
で終夜処理した。ＥａｇＩ処理後、同様の比率で反応液
にＢｓｓＨII（New England BioLabs, Inc.）を添加
し、５０℃で４時間処理した。ＢｓｓＨII処理後，６８
℃、２０分間の酵素失活処理をし、反応液をＤＷで３０
０μｌにメスアップした上でフェノール抽出、フェノー
ル・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン
２μｌを加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ ３０μｌに
再溶解した。ベクターは、分子内ライゲーションを防ぐ
ため大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（Bacterial
alkaline phosphatase、ＢＡＰ）（TOYOBO）を用いて脱
リン酸化処理した。ベクター３０μｌに５×ＢＡＰバッ
ファー１０μｌ、アルカリフォスファターゼ（０．４Ｕ
／μｌ）３μｌ、ＤＷ ７μｌを加え、３７℃ ３時間
の処理を行った。処理後の反応液は、ＤＷで３００μｌ
にメスアップした上でフェノール抽出、フェノール・ク
ロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン ２μ
ｌ加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ ３０μｌに再溶解
した。
【００４５】（５） ベクターへのライゲーション 精製したｓｃＦｖ遺伝子断片とベクターｐＰＤＳのモル
比が３：１になるように調製し、ＤＮＡ ligation kit
ver.1（TAKARA）を用いてライゲーション反応を行っ
た。なお、その方法は添付プロトコールに従った。 （６） 形質転換（塩化ルビジウム法） 形質転換は、−８５℃で保存したEscherichia coli XL1
-Blueコンピテントセル溶液１００μｌを氷中で融解
し、これにライゲーション溶液を１０μｌ加え、氷中３
０分間静置した。次に４２℃、２分間熱処理し、すばや
く氷中に移して２分間静置した。ＳＯＣ培地を１．０ｍ
ｌ加え３７℃で１時間振盪培養し、１０μｌを１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレートにプレー
ティング、３７℃で終夜培養した。 （７） 挿入ＤＮＡ断片の確認 挿入ＤＮＡであるｓｃＦｖ遺伝子の確認は、ｐＰＤＳベ
クター由来の配列であり挿入部位を完全に増幅できるよ
うに設計したＬａｃ Ｚ上流配列のＭ１３−Ｒ、および
マウスＣκ鎖内配列のＳＬＰ−１の１ペアプライマーを
用い、コロニーをテンプレートとしたＰＣＲ法で行っ
た。 （８） ファージディスプレイ抗体の調製 形質転換後、挿入ＤＮＡ断片の確認されたコロニーは、
５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＣ培地 ２ｍｌで
３０℃、ゆっくりとした終夜振盪培養をした。翌日、培
養液 ０．８ｍｌに、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含
有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 ０．２ｍｌ、および２Ｍ
グルコース ３７μｌを添加した。５０ｍｌチューブで
３７℃、３時間振盪培養した後、５×１０９ｐｆｕのヘ
ルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）を加え穏やかに振盪
しながら３０分間培養しファージを感染させた。さらに
３０分間強めに振盪培養した後、室温で８００×ｇ １
０分間の遠心を行い上清を捨てた。沈殿物は、１ｍｌの
１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマ
イシン含有Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地で再懸濁した
後、同培地９ｍｌを加えて激しく振盪しながら終夜培養
した。翌日冷却後、８００×ｇ １０分間の遠心で菌体
を除き、０．４５μｍポアフィルター（関東化学）で上
清を濾過し、その濾液をファージディスプレイ抗体浮遊
液とした。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存し
た。得られたコロニーから１０コロニーをランダムに単
離し、ＰＣＲでインサート（ｓｃＦｖ遺伝子断片）の有
無を確認した。その結果、１０クローン中４クローン
（クローン＃：１，３，５，および６）でインサートが
確認され、これをもとにファージディスプレイ抗体を調
製し、これら４種のファージディスプレイ抗体をそれぞ
れＨＵＣ２ｐ１，ＨＵＣ２ｐ３，ＨＵＣ２ｐ５およびＨ
ＵＣ２ｐ６と命名した。 （９） 可溶型抗体の調製 可溶型抗体は、アンバー配列ノンサプレッサー株である
Escherichia coli XL1-Blue SOLR株（ＳＯＬＲ株）にフ
ァージディスプレイ抗体を感染させることにより作成し
た。ＳＯＬＲ株は２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＳＯ
Ｃ培地２ｍｌで終夜培養し、その培養液２００μｌにフ
ァージディスプレイ抗体５μｌを加えて３７℃で１時間
感染させた。この培養液を２×ＹＴ培地で希釈し、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴプレートにプレ
ーティングし、３７℃で終夜培養した。得られたコロニ
ーをテンプレートとしたＰＣＲでｓｃＦｖ抗体遺伝子断
片が確認されたものを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地２ｍｌで培養した。その培
養液５００μｌにＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地４．５ｍ
ｌを加え、さらにアンピシリン、カナマイシンをそれぞ
れ終濃度１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌとなるよう
に加え３７℃、２時間振盪培養した。その後、終濃度が
１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに４時間振盪
培養した。培養液は氷冷後、室温で８００×ｇ １０分
間遠心し、その上清を回収した。上清はさらに０．４５
μｍポアフィルターで濾過滅菌し、その濾液を可溶型抗
体液（培養上清）、また、沈殿物は培養液同容量のＰＢ
Ｓ ５ｍｌで撹拌後、Ｈａｎｄｙ Ｓｏｎｉｃ ｍｏｄ
ｅｌ ＵＲ−２０Ｐ（トミー精工）で超音波処理しその
濾液を可溶型抗体液（菌体破壊抽出物）として調製し
た。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存した。
比が３：１になるように調製し、ＤＮＡ ligation kit
ver.1（TAKARA）を用いてライゲーション反応を行っ
た。なお、その方法は添付プロトコールに従った。 （６） 形質転換（塩化ルビジウム法） 形質転換は、−８５℃で保存したEscherichia coli XL1
-Blueコンピテントセル溶液１００μｌを氷中で融解
し、これにライゲーション溶液を１０μｌ加え、氷中３
０分間静置した。次に４２℃、２分間熱処理し、すばや
く氷中に移して２分間静置した。ＳＯＣ培地を１．０ｍ
ｌ加え３７℃で１時間振盪培養し、１０μｌを１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレートにプレー
ティング、３７℃で終夜培養した。 （７） 挿入ＤＮＡ断片の確認 挿入ＤＮＡであるｓｃＦｖ遺伝子の確認は、ｐＰＤＳベ
クター由来の配列であり挿入部位を完全に増幅できるよ
うに設計したＬａｃ Ｚ上流配列のＭ１３−Ｒ、および
マウスＣκ鎖内配列のＳＬＰ−１の１ペアプライマーを
用い、コロニーをテンプレートとしたＰＣＲ法で行っ
た。 （８） ファージディスプレイ抗体の調製 形質転換後、挿入ＤＮＡ断片の確認されたコロニーは、
５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＣ培地 ２ｍｌで
３０℃、ゆっくりとした終夜振盪培養をした。翌日、培
養液 ０．８ｍｌに、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含
有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 ０．２ｍｌ、および２Ｍ
グルコース ３７μｌを添加した。５０ｍｌチューブで
３７℃、３時間振盪培養した後、５×１０９ｐｆｕのヘ
ルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）を加え穏やかに振盪
しながら３０分間培養しファージを感染させた。さらに
３０分間強めに振盪培養した後、室温で８００×ｇ １
０分間の遠心を行い上清を捨てた。沈殿物は、１ｍｌの
１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマ
イシン含有Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地で再懸濁した
後、同培地９ｍｌを加えて激しく振盪しながら終夜培養
した。翌日冷却後、８００×ｇ １０分間の遠心で菌体
を除き、０．４５μｍポアフィルター（関東化学）で上
清を濾過し、その濾液をファージディスプレイ抗体浮遊
液とした。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存し
た。得られたコロニーから１０コロニーをランダムに単
離し、ＰＣＲでインサート（ｓｃＦｖ遺伝子断片）の有
無を確認した。その結果、１０クローン中４クローン
（クローン＃：１，３，５，および６）でインサートが
確認され、これをもとにファージディスプレイ抗体を調
製し、これら４種のファージディスプレイ抗体をそれぞ
れＨＵＣ２ｐ１，ＨＵＣ２ｐ３，ＨＵＣ２ｐ５およびＨ
ＵＣ２ｐ６と命名した。 （９） 可溶型抗体の調製 可溶型抗体は、アンバー配列ノンサプレッサー株である
Escherichia coli XL1-Blue SOLR株（ＳＯＬＲ株）にフ
ァージディスプレイ抗体を感染させることにより作成し
た。ＳＯＬＲ株は２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＳＯ
Ｃ培地２ｍｌで終夜培養し、その培養液２００μｌにフ
ァージディスプレイ抗体５μｌを加えて３７℃で１時間
感染させた。この培養液を２×ＹＴ培地で希釈し、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴプレートにプレ
ーティングし、３７℃で終夜培養した。得られたコロニ
ーをテンプレートとしたＰＣＲでｓｃＦｖ抗体遺伝子断
片が確認されたものを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地２ｍｌで培養した。その培
養液５００μｌにＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地４．５ｍ
ｌを加え、さらにアンピシリン、カナマイシンをそれぞ
れ終濃度１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌとなるよう
に加え３７℃、２時間振盪培養した。その後、終濃度が
１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに４時間振盪
培養した。培養液は氷冷後、室温で８００×ｇ １０分
間遠心し、その上清を回収した。上清はさらに０．４５
μｍポアフィルターで濾過滅菌し、その濾液を可溶型抗
体液（培養上清）、また、沈殿物は培養液同容量のＰＢ
Ｓ ５ｍｌで撹拌後、Ｈａｎｄｙ Ｓｏｎｉｃ ｍｏｄ
ｅｌ ＵＲ−２０Ｐ（トミー精工）で超音波処理しその
濾液を可溶型抗体液（菌体破壊抽出物）として調製し
た。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存した。
【００４６】実施例９ ＨＵＣ２−１３ ＳｃＦｖ抗体
の再構築ベクターを用いた発現 実施例８の（８）で構築したＨＵＣ２ｐ３からＳｃＦｖ
抗体遺伝子を再構築ベクター用に設計したプライマーを
用い、増幅させた。反応液は、フェノール抽出、フェノ
ール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿濃縮し、Ｄ
Ｗ ２０μｌに再溶解した。塩化セシウム法を用いた大
量調製後の再構築ベクターならびにＨＵＣ２ｐ３由来Ｓ
ｃＦｖ抗体遺伝子は、１０Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０Ｕ
／μｌのＢｓｓＨIIで制限酵素処理した。さらに、ベク
ターは分子内ライゲーションを防ぐためＢＡＰ処理を行
った。処理後の反応液は、１．０％アガロースゲルを用
いて電気泳動し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製後、ＤＷ
１０μｌに再溶解し、再構築用サンプルとした。調製
した再構築用サンプルは濃度測定後、ベクター：インサ
ートのモル比が１：３になるように混合し、TAKARA Lig
ation Kit ver.1で１６℃ ３時間ライゲーションし、
その反応液５μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転
換した。形質転換した大腸菌はアンピシリン含有２×Ｙ
Ｔプレートに４０μｌプレーティングし、終夜３７℃で
培養した。インサートのチェックは、ｓｃＦｖ抗体遺伝
子増幅用のプライマーを用い、コロニーをテンプレート
とするＰＣＲで行った。インサートの確認できたコロニ
ーは、実施例８に記載した方法に準じてファージディス
プレイ抗体を調製した．
の再構築ベクターを用いた発現 実施例８の（８）で構築したＨＵＣ２ｐ３からＳｃＦｖ
抗体遺伝子を再構築ベクター用に設計したプライマーを
用い、増幅させた。反応液は、フェノール抽出、フェノ
ール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿濃縮し、Ｄ
Ｗ ２０μｌに再溶解した。塩化セシウム法を用いた大
量調製後の再構築ベクターならびにＨＵＣ２ｐ３由来Ｓ
ｃＦｖ抗体遺伝子は、１０Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０Ｕ
／μｌのＢｓｓＨIIで制限酵素処理した。さらに、ベク
ターは分子内ライゲーションを防ぐためＢＡＰ処理を行
った。処理後の反応液は、１．０％アガロースゲルを用
いて電気泳動し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製後、ＤＷ
１０μｌに再溶解し、再構築用サンプルとした。調製
した再構築用サンプルは濃度測定後、ベクター：インサ
ートのモル比が１：３になるように混合し、TAKARA Lig
ation Kit ver.1で１６℃ ３時間ライゲーションし、
その反応液５μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転
換した。形質転換した大腸菌はアンピシリン含有２×Ｙ
Ｔプレートに４０μｌプレーティングし、終夜３７℃で
培養した。インサートのチェックは、ｓｃＦｖ抗体遺伝
子増幅用のプライマーを用い、コロニーをテンプレート
とするＰＣＲで行った。インサートの確認できたコロニ
ーは、実施例８に記載した方法に準じてファージディス
プレイ抗体を調製した．
【００４７】実施例１０ 可溶型抗体の調製 可溶型抗体の調製は、実施例８に記載した方法に準じて
行った。
行った。
【００４８】実施例１１ ＥＬＩＳＡ 調製したニワトリ型ファージディスプレイ抗体ならびに
可溶型抗体の反応性は、Ｈ２５ペプチドを抗原としてＥ
ＬＩＳＡで解析した。一次抗体のリコンビナント抗体な
らびにネイティブ抗体は１５，６２５倍までの５倍段階
希釈液を用いた。二次抗体に２，０００倍希釈したＨＲ
ＰＯ標識抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Kirkegaard and
Perry Laboratories）を用いたＥＬＩＳＡで解析し
た。即ち、５μｇ／ｍｌ濃度のＨ２５ペプチドを９６ウ
ェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ（０．２５μｇ／ｗ
ｅｌｌ）ずつ添加し、４℃、終夜固相化しこれを抗原プ
レートとした。抗原プレートはＢｌｏｃｋＡｃｅ（雪印
乳業）をＰＢＳで２５％に希釈したものを４００μｌ／
ｗｅｌｌ加え３７℃ １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗浄した。一次
抗体反応は、リコンビナント抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌ
加え、３７℃、２時間静置して行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ ２０（０．０５％）で５回洗浄後、二次抗体反応
として１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅで３，０００倍希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（Amersham Pharmac
ia biotech）を加え、３７℃ １時間静置した。ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で８回洗浄後、ｏ−
フェニレンジアミン（ペルオキシダーゼ標識二次抗体使
用時）（SIGMA）もしくはｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート（アルカリフォスファターゼ標識二次抗体使用
時）（Kirkegaard and Perry Laboratories）を用いて
２０分間の発色を行い、４９２もしくは４０５ｎｍの吸
収をマイクロプレートリーダ ＭＰＲ−Ａ４ｉ（ＴＯＳ
ＯＨ）で測定した。
可溶型抗体の反応性は、Ｈ２５ペプチドを抗原としてＥ
ＬＩＳＡで解析した。一次抗体のリコンビナント抗体な
らびにネイティブ抗体は１５，６２５倍までの５倍段階
希釈液を用いた。二次抗体に２，０００倍希釈したＨＲ
ＰＯ標識抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Kirkegaard and
Perry Laboratories）を用いたＥＬＩＳＡで解析し
た。即ち、５μｇ／ｍｌ濃度のＨ２５ペプチドを９６ウ
ェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ（０．２５μｇ／ｗ
ｅｌｌ）ずつ添加し、４℃、終夜固相化しこれを抗原プ
レートとした。抗原プレートはＢｌｏｃｋＡｃｅ（雪印
乳業）をＰＢＳで２５％に希釈したものを４００μｌ／
ｗｅｌｌ加え３７℃ １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗浄した。一次
抗体反応は、リコンビナント抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌ
加え、３７℃、２時間静置して行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ ２０（０．０５％）で５回洗浄後、二次抗体反応
として１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅで３，０００倍希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（Amersham Pharmac
ia biotech）を加え、３７℃ １時間静置した。ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で８回洗浄後、ｏ−
フェニレンジアミン（ペルオキシダーゼ標識二次抗体使
用時）（SIGMA）もしくはｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート（アルカリフォスファターゼ標識二次抗体使用
時）（Kirkegaard and Perry Laboratories）を用いて
２０分間の発色を行い、４９２もしくは４０５ｎｍの吸
収をマイクロプレートリーダ ＭＰＲ−Ａ４ｉ（ＴＯＳ
ＯＨ）で測定した。
【００４９】実施例１２ 抗体Ｖ領域遺伝子（ＶＨおよ
びＶＬ）の調整 抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡを元に、
表２に示す合成プライマーセット（ＶＨ増幅用プライマ
ーセット、ＶＬ増幅用プライマーセット）を用いて、Ｖ
Ｈ及びＶＬ領域を増幅する。 （ＶＨ増幅条件） １０ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ １ ５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３μｌ ２．０ｍＭ ｄＮＴＰＳ ４μｌ プライマーＣＨＢ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）＊ ５μｌ プライマーＣＨＳＦ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）＊ ５μｌ ｃＤＮＡ １μｌ ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ ＤＷ ２６．５μｌ ＊ＶＬ増幅条件はプライマーＣＬＳＢとＣＬＦ１を用いる。 以上のＰＣＲ混合物を作り、サーマルサイクラーにセッ
トして、以下のＰＣＲサイクル条件でＶＨとＶＬの増幅
を行う。 （ＰＣＲサイクル条件） ・９８℃１０秒ｘ１回 ・（９８℃１５秒、６０℃７秒、７４℃２０秒）ｘ３０
回 ・７４℃３０秒 ・４℃
びＶＬ）の調整 抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡを元に、
表２に示す合成プライマーセット（ＶＨ増幅用プライマ
ーセット、ＶＬ増幅用プライマーセット）を用いて、Ｖ
Ｈ及びＶＬ領域を増幅する。 （ＶＨ増幅条件） １０ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ １ ５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３μｌ ２．０ｍＭ ｄＮＴＰＳ ４μｌ プライマーＣＨＢ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）＊ ５μｌ プライマーＣＨＳＦ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）＊ ５μｌ ｃＤＮＡ １μｌ ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ ＤＷ ２６．５μｌ ＊ＶＬ増幅条件はプライマーＣＬＳＢとＣＬＦ１を用いる。 以上のＰＣＲ混合物を作り、サーマルサイクラーにセッ
トして、以下のＰＣＲサイクル条件でＶＨとＶＬの増幅
を行う。 （ＰＣＲサイクル条件） ・９８℃１０秒ｘ１回 ・（９８℃１５秒、６０℃７秒、７４℃２０秒）ｘ３０
回 ・７４℃３０秒 ・４℃
【００５０】実施例１３ ｓｃＦｖの構築 実施例１２で得たＶＨおよびＶＬの増幅産物を精製した
後、ＶＨおよびＶＬを、リンカ（ｓｃＦｖ ｌｉｎｋｅ
ｒ）を用いて連結する（アッセンブリー反応）。 （連結条件） １０ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ １ ２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２．１μｌ ２．０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １０μｌ ＶＨ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ＶＬ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ｓｃＦｖ ｌｉｎｋｅｒ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ＫＤＯ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３μｌ ＤＷ ７．１μｌ 以上のＰＣＲ 混合物を作り、サーマルサイクラーにセ
ットして、以下のＰＣＲサイクル条件でＶＨとＶＬの連
結を行う。 ・９８℃１０秒ｘ１回 ・（９８℃１５秒、６５℃３０秒）ｘ７回 ・７４℃３０秒ｘ１回 ・４℃
後、ＶＨおよびＶＬを、リンカ（ｓｃＦｖ ｌｉｎｋｅ
ｒ）を用いて連結する（アッセンブリー反応）。 （連結条件） １０ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ １ ２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２．１μｌ ２．０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １０μｌ ＶＨ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ＶＬ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ｓｃＦｖ ｌｉｎｋｅｒ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ ＫＤＯ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３μｌ ＤＷ ７．１μｌ 以上のＰＣＲ 混合物を作り、サーマルサイクラーにセ
ットして、以下のＰＣＲサイクル条件でＶＨとＶＬの連
結を行う。 ・９８℃１０秒ｘ１回 ・（９８℃１５秒、６５℃３０秒）ｘ７回 ・７４℃３０秒ｘ１回 ・４℃
【００５１】実施例１４ ｓｃＦｖの再増幅と制限酵素
処理 ｓｃＦｖの再増幅のための表２に示すプライマー・セッ
ト（ＣＨＢとＣＬＦ１）を用いて、実施例１３で構築し
たｓｃＦｖの再増幅を行い、ｓｃＦｖを精製した後、プ
ラスミドベクターｐＣＰＤＳに挿入するため、制限酵素
（ＥａｇIとＢｓｓＨII）を用いてｓｃＦｖ挿入遺伝子
断片（インサート）を調製する。 （再増幅反応） １０ｘＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ １ ２．５μｌ ２．０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ ｓｃＦｖプライマーＣＨＢ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ） ３μｌ ｓｃＦｖプライマーＣＬＦ１（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ） ３μｌ ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３μｌ ＤＷ １２．２μｌ （ＰＣＲ温度条件） ・９８℃１０秒ｘ１回 ・（９８℃１５秒、６５℃７秒、７４℃２０秒）ｘ３０回 ・７４℃３０秒ｘ１回 ・４℃ （制限酵素処理） ・ｓｃＦｖの制限酵素処理 ｓｃＦｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ２０μｌ １０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３ ５μｌ ＤＷで ４８μｌ ＥａｇI（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ） ３７℃で一晩処理 ・ｐＣＰＤＳ ｖｅｃｔｏｒの制限酵素処理 ｐＣＭＤＳ ｖｅｃｔｏｒ（５μｇ） ｘμｌ １０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３ ９μｌ ＤＷで ８８μｌ ＥａｇI（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ） ３７℃で一晩処理 ・電気泳動でベクターの消化が完全に行われたことを確
認した後、２μｌのＢｓｓII（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）
を加え、５０℃３〜４時間消化する。 ・６８℃２０分間処理し、酵素を失活させる。 ・ｓｃＦｖの精製 ・ｐＣＰＤＳはセルフライゲーションを防ぐためにＢＡ
Ｐ処理し、精製する。
処理 ｓｃＦｖの再増幅のための表２に示すプライマー・セッ
ト（ＣＨＢとＣＬＦ１）を用いて、実施例１３で構築し
たｓｃＦｖの再増幅を行い、ｓｃＦｖを精製した後、プ
ラスミドベクターｐＣＰＤＳに挿入するため、制限酵素
（ＥａｇIとＢｓｓＨII）を用いてｓｃＦｖ挿入遺伝子
断片（インサート）を調製する。 （再増幅反応） １０ｘＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ １ ２．５μｌ ２．０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ ｓｃＦｖプライマーＣＨＢ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ） ３μｌ ｓｃＦｖプライマーＣＬＦ１（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ） ３μｌ ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３μｌ ＤＷ １２．２μｌ （ＰＣＲ温度条件） ・９８℃１０秒ｘ１回 ・（９８℃１５秒、６５℃７秒、７４℃２０秒）ｘ３０回 ・７４℃３０秒ｘ１回 ・４℃ （制限酵素処理） ・ｓｃＦｖの制限酵素処理 ｓｃＦｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ２０μｌ １０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３ ５μｌ ＤＷで ４８μｌ ＥａｇI（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ） ３７℃で一晩処理 ・ｐＣＰＤＳ ｖｅｃｔｏｒの制限酵素処理 ｐＣＭＤＳ ｖｅｃｔｏｒ（５μｇ） ｘμｌ １０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３ ９μｌ ＤＷで ８８μｌ ＥａｇI（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ） ３７℃で一晩処理 ・電気泳動でベクターの消化が完全に行われたことを確
認した後、２μｌのＢｓｓII（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）
を加え、５０℃３〜４時間消化する。 ・６８℃２０分間処理し、酵素を失活させる。 ・ｓｃＦｖの精製 ・ｐＣＰＤＳはセルフライゲーションを防ぐためにＢＡ
Ｐ処理し、精製する。
【００５２】実施例１５ インサート（ｓｃＦｖ）のｐ
ＣＰＤＳへの挿入（ライゲーション） ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調
整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（ＴＡＫＡＲ
Ａ））を用いてライゲーションを行う。 ベクター Ｘμｌ インサート Ｙμｌ ５ ｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ ＤＷで ５μｌ Ａ ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌ Ｂ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ １６℃で４〜終夜処理。
ＣＰＤＳへの挿入（ライゲーション） ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調
整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（ＴＡＫＡＲ
Ａ））を用いてライゲーションを行う。 ベクター Ｘμｌ インサート Ｙμｌ ５ ｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ ＤＷで ５μｌ Ａ ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌ Ｂ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ １６℃で４〜終夜処理。
【００５３】実施例１６ 大腸菌の形質転換 インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用い
て、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を、実施
例８に記載の方法に準じて順形質転換する。インサート
を発現する形質転換大腸菌を、増殖させた大腸菌のコロ
ニーから複数の大腸菌コロニーを任意に取り、プライマ
ー・セットを用いてｓｃＦｖの増幅を行い、インサート
を発現する形質転換大腸菌を選抜する。
て、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を、実施
例８に記載の方法に準じて順形質転換する。インサート
を発現する形質転換大腸菌を、増殖させた大腸菌のコロ
ニーから複数の大腸菌コロニーを任意に取り、プライマ
ー・セットを用いてｓｃＦｖの増幅を行い、インサート
を発現する形質転換大腸菌を選抜する。
【００５４】実施例１７ ファージ発現抗体の作成 選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、実施例
８に記載の方法に準じてファージ発現抗体を作成する。
８に記載の方法に準じてファージ発現抗体を作成する。
【００５５】実施例１８ 特異的ファージ抗体の選抜の
ためのバニシング 抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファ
ージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗
体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体
を選抜する。パニングは、抗原抗体反応を利用した高親
和性抗体選抜法である。例えば、次のようにして行う。
５μｇ／ｍｌ濃度のマルトース結合タンパク融合リコン
ビナントヒトＰｒＰ２３−２３１（ＭＢＰ−ＨｕＰｒ
Ｐ）を９６ウェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ（０．
２５μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、４℃、終夜固相化しこ
れを抗原コートプレートとした。抗原コートプレート１
６ウェルに２５％ＢｌｏｃｋＡｃｅ ４００μｌ／ｗｅ
ｌｌ加え３７℃ １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗浄した。洗浄後、
ファージディスプレイ抗体浮遊液 １．６ｍｌ、Ｂｌｏ
ｃｋＡｃｅ ７０４μｌ、５Ｍ ＮａＣｌ９６μｌで混
合したものを１５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃ ２
時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）
で１５回洗浄した。洗浄後のウェルには、溶出液５０μ
ｌ／ｗｅｌｌを添加し、１５分間 室温の反応後、２Ｍ
トリス３μｌ／ｗｅｌｌで中和した。中和後、反応液を
回収しＯＤ６００＝０．５〜１．０に培養したＸＬ１−
Ｂｌｕｅ ２ｍｌに３７℃ １時間感染させた。感染後
の溶液の一部は力価測定のために、１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレートにプレーティング
し、溶出ファージ力価を測定した。さらにＰＣＲによる
インサートチェック後、そのインサート率を溶出ファー
ジ力価に積し陽性溶出ファージ力価を求めた。残りの感
染溶液には５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｓｕｐｅｒ
Ｂｒｏｔｈ培地 ４００μｌと２Ｍ グルコース３７μ
ｌ加え、３７℃ ２時間の培養後、５×１０９ｐｆｕの
ヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）を１時間感染させ
た。感染後、８００×ｇ １０分間遠心して上清を除
き、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカ
ナマイシン、２５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有Ｓｕ
ｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 １０ｍｌで終夜培養した。翌日
冷却後、８００×ｇ １０分間の遠心で菌体を除き、
０．４５μｍポアフィルターで上清を濾過し、その濾液
を一次パニング済ファージディスプレイ抗体浮遊液と
し、次回のパニングサンプルとした。
ためのバニシング 抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファ
ージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗
体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体
を選抜する。パニングは、抗原抗体反応を利用した高親
和性抗体選抜法である。例えば、次のようにして行う。
５μｇ／ｍｌ濃度のマルトース結合タンパク融合リコン
ビナントヒトＰｒＰ２３−２３１（ＭＢＰ−ＨｕＰｒ
Ｐ）を９６ウェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ（０．
２５μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、４℃、終夜固相化しこ
れを抗原コートプレートとした。抗原コートプレート１
６ウェルに２５％ＢｌｏｃｋＡｃｅ ４００μｌ／ｗｅ
ｌｌ加え３７℃ １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗浄した。洗浄後、
ファージディスプレイ抗体浮遊液 １．６ｍｌ、Ｂｌｏ
ｃｋＡｃｅ ７０４μｌ、５Ｍ ＮａＣｌ９６μｌで混
合したものを１５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃ ２
時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）
で１５回洗浄した。洗浄後のウェルには、溶出液５０μ
ｌ／ｗｅｌｌを添加し、１５分間 室温の反応後、２Ｍ
トリス３μｌ／ｗｅｌｌで中和した。中和後、反応液を
回収しＯＤ６００＝０．５〜１．０に培養したＸＬ１−
Ｂｌｕｅ ２ｍｌに３７℃ １時間感染させた。感染後
の溶液の一部は力価測定のために、１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレートにプレーティング
し、溶出ファージ力価を測定した。さらにＰＣＲによる
インサートチェック後、そのインサート率を溶出ファー
ジ力価に積し陽性溶出ファージ力価を求めた。残りの感
染溶液には５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｓｕｐｅｒ
Ｂｒｏｔｈ培地 ４００μｌと２Ｍ グルコース３７μ
ｌ加え、３７℃ ２時間の培養後、５×１０９ｐｆｕの
ヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）を１時間感染させ
た。感染後、８００×ｇ １０分間遠心して上清を除
き、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカ
ナマイシン、２５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有Ｓｕ
ｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 １０ｍｌで終夜培養した。翌日
冷却後、８００×ｇ １０分間の遠心で菌体を除き、
０．４５μｍポアフィルターで上清を濾過し、その濾液
を一次パニング済ファージディスプレイ抗体浮遊液と
し、次回のパニングサンプルとした。
【００５６】実施例１９ 可溶化抗体の作成 実施例８に記載の方法に準じて、特異的ファージ抗体を
ノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡあるいはＨＢ２１５
１）に感染させる。感染２４時間後に、大腸菌培養上清
および培養菌体を回収し、上清および菌体破壊抽出物を
可溶化抗体とする。抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲル
を用いて可溶化抗体をアフィニティ精製する。
ノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡあるいはＨＢ２１５
１）に感染させる。感染２４時間後に、大腸菌培養上清
および培養菌体を回収し、上清および菌体破壊抽出物を
可溶化抗体とする。抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲル
を用いて可溶化抗体をアフィニティ精製する。
【００５７】
【発明の効果】本発明は、純水な鳥類型リコンビナント
抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を提供
する。ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では
作成できないモノクローナル抗体を作成することがで
き、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリ
ルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパ
クなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生態系高分
子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの
展開が期待される。したがって、がん、プリオン病など
の種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。ところ
が、ニワトリ型の大きな欠点は、一般にモノクローナル
抗体を産生させる融合細胞の手法では、実際に実用する
ための必要量ができないことである。本発明は、実質上
純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組み替え法で、初めて
多量に作ることに成功した。即ち、本発明は、新規なプ
ラスミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノ
クローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能に
したものであり、抗体、その製法、ベクター、プライマ
ー・セット等を提供するものである。また、鳥類の抗体
遺伝子は、３’末端及び５’末端の塩基配列が比較的固
定化されており、本発明が提供するプライマーを用いて
抗体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能
であり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗
体を遺伝子組換え手段により簡便に作成できる方法を提
供するものである。
抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を提供
する。ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では
作成できないモノクローナル抗体を作成することがで
き、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリ
ルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパ
クなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生態系高分
子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの
展開が期待される。したがって、がん、プリオン病など
の種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。ところ
が、ニワトリ型の大きな欠点は、一般にモノクローナル
抗体を産生させる融合細胞の手法では、実際に実用する
ための必要量ができないことである。本発明は、実質上
純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組み替え法で、初めて
多量に作ることに成功した。即ち、本発明は、新規なプ
ラスミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノ
クローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能に
したものであり、抗体、その製法、ベクター、プライマ
ー・セット等を提供するものである。また、鳥類の抗体
遺伝子は、３’末端及び５’末端の塩基配列が比較的固
定化されており、本発明が提供するプライマーを用いて
抗体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能
であり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗
体を遺伝子組換え手段により簡便に作成できる方法を提
供するものである。
【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉Japan Science And Technology Corporation 〈120〉Chicken Monoclonal Antibody 〈130〉PA902457 〈160〉1 〈210〉1 〈211〉28 〈212〉DNA 〈213〉Artificial 〈400〉1 3'-TTGGGACTGG CAGGATCCGC GCGGGTTC-5' 28
【図１】図１は、公知の発現ベクターｐＰＤＳの構成を
示すものである。
示すものである。
【図２】図２は、本発明のニワトリリコンビナント抗体
発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
【図３】図３は、ニワトリＣλ鎖遺伝子と思われる約３
４０ｂｐのバンド（図３のＡ）、約３６０ｂｐの位置に
ニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと思われるバ
ンド（図３のＢ）、約６００ｂｐの位置のｇｅｎｅIII
遺伝子と思われるバンド（図３のＣ）、約９５０ｂｐの
位置のニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子が連結した
と思われるバンド（図３のＤ）が検出されたことを示
す、図面に代わる写真である。図３中の「Ｍ１」はｐＵ
Ｃ１１８ ＨｉｎｆＩで消化を、「Ｍ２」はφｘ１７４
ＨａｅIIIで消化を示す。
４０ｂｐのバンド（図３のＡ）、約３６０ｂｐの位置に
ニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと思われるバ
ンド（図３のＢ）、約６００ｂｐの位置のｇｅｎｅIII
遺伝子と思われるバンド（図３のＣ）、約９５０ｂｐの
位置のニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子が連結した
と思われるバンド（図３のＤ）が検出されたことを示
す、図面に代わる写真である。図３中の「Ｍ１」はｐＵ
Ｃ１１８ ＨｉｎｆＩで消化を、「Ｍ２」はφｘ１７４
ＨａｅIIIで消化を示す。
【図４】図４は、１１４残基のアミノ酸をコードするニ
ワトリＣλ鎖遺伝子の塩基配列と、本発明の方法で得ら
れたＣλ鎖の塩基配列を比較したものである。
ワトリＣλ鎖遺伝子の塩基配列と、本発明の方法で得ら
れたＣλ鎖の塩基配列を比較したものである。
【図５】図５は、インサートして得られた１２クローン
で約３６０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖の増幅が確認で
きたことを示す、図面に代わる写真である。図５の
「Ｍ」はｐＵＣ１１８ ＨｉｎｆＩで消化を示す。
で約３６０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖の増幅が確認で
きたことを示す、図面に代わる写真である。図５の
「Ｍ」はｐＵＣ１１８ ＨｉｎｆＩで消化を示す。
【図６】図６は、本発明の方法で得られた１２クローン
のリコンビナント抗体について、抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合、及び抗マウスＩ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合のＥＬＩ
ＳＡ値（ＯＤ４９２）を示すものである。黒塗りはキャ
プチャー抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用し
た場合を示し、白抜きはキャプチャー抗体として抗ニワ
トリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示す。
のリコンビナント抗体について、抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合、及び抗マウスＩ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合のＥＬＩ
ＳＡ値（ＯＤ４９２）を示すものである。黒塗りはキャ
プチャー抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用し
た場合を示し、白抜きはキャプチャー抗体として抗ニワ
トリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示す。
【図７】図７は、本発明の発現ベクターｐＣＰＤＳの構
成を示す。
成を示す。
【図８】図８は、ニワトリ抗体のＶ領域重鎖の塩基配列
を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。
図８のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を
示す。
を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。
図８のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を
示す。
【図９】図９は、ニワトリ抗体のＶ領域重鎖の塩基配列
を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。
図９のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を
示す。
を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。
図９のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を
示す。
【図１０】図１０は、ニワトリ抗体のＶ領域重鎖の塩基
配列、及びＶ領域軽鎖のアミノ酸配列を、ＨＵＣ２−１
３と共に比較して示したものである。図１０のＮはＤセ
グメントの塩基配列を示し、：は欠失を示す。
配列、及びＶ領域軽鎖のアミノ酸配列を、ＨＵＣ２−１
３と共に比較して示したものである。図１０のＮはＤセ
グメントの塩基配列を示し、：は欠失を示す。
【図１１】図１１は、ニワトリ抗体のＶ領域軽鎖の塩基
配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものであ
る。図１１の：は欠失を示す。
配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものであ
る。図１１の：は欠失を示す。
【図１２】図１２は、ニワトリ抗体のＶ領域軽鎖の塩基
配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものであ
る。図１２の：は欠失を示す。
配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものであ
る。図１２の：は欠失を示す。
【図１３】図１３は、ＨＵＣ２−１３Ｌ鎖における多様
性獲得機構をＨＵＣ２ＶＬと共に比較して示したもので
ある。図１３の？は突然変異を示し、：は欠失を示し、
ＰＶは偽遺伝子を示す。
性獲得機構をＨＵＣ２ＶＬと共に比較して示したもので
ある。図１３の？は突然変異を示し、：は欠失を示し、
ＰＶは偽遺伝子を示す。
【図１４】図１４は、本発明の方法により調製されたリ
コンビナント抗体のＨ２５ペプチドに対する反応性の確
認を試みたＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）の結果を示すも
のである。図１４中の黒四角印はニワトリ型ファージデ
ィスプレイ抗体を示し、灰色菱形印はニワトリ型可溶型
抗体（培養上清）を示し、灰色丸形印はニワトリ型可溶
型抗体（菌体破壊）を示し、灰色三角形印はＨＵＣ２−
１３（ネイティブ抗体）を示す。
コンビナント抗体のＨ２５ペプチドに対する反応性の確
認を試みたＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）の結果を示すも
のである。図１４中の黒四角印はニワトリ型ファージデ
ィスプレイ抗体を示し、灰色菱形印はニワトリ型可溶型
抗体（培養上清）を示し、灰色丸形印はニワトリ型可溶
型抗体（菌体破壊）を示し、灰色三角形印はＨＵＣ２−
１３（ネイティブ抗体）を示す。
【図１５】図１５は、本発明の純粋なニワトリリコンビ
ナント抗体作製のための概要を示したものである。
ナント抗体作製のための概要を示したものである。
【図１６】図１６は、哺乳動物（図１６上段）と鳥類
（図１６下段）における抗体Ｈ鎖遺伝子の構成を模式的
に示したものである。
（図１６下段）における抗体Ｈ鎖遺伝子の構成を模式的
に示したものである。
【図１７】図１７は、本発明のプライマーＣＬＦ１の使
用状況を模式的に示したものであり、図１７の上段の左
側がＶＬ領域であり、そのすぐ右側がＣλ領域である。
用状況を模式的に示したものであり、図１７の上段の左
側がＶＬ領域であり、そのすぐ右側がＣλ領域である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年３月３日（２０００．３．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】モノクローナル抗体は、抗原の特定部分
だけを認識する単一抗体であり、この技術は遺伝子組換
えと並んでバイオテクノロジー分野での基幹技術であ
り、これを利用した診断薬、治療薬は急速に普及発展し
ている。モノクローナル抗体については、マウス、ラッ
ト型など広く活用されているが、ニワトリ型について
は、発明者がすでに提案した例がある程度である。この
ニワトリ型の大きな利点は、マウス等の哺乳動物では作
成困難な抗体が作成可能であるということである。
だけを認識する単一抗体であり、この技術は遺伝子組換
えと並んでバイオテクノロジー分野での基幹技術であ
り、これを利用した診断薬、治療薬は急速に普及発展し
ている。モノクローナル抗体については、マウス、ラッ
ト型など広く活用されているが、ニワトリ型について
は、発明者がすでに提案した例がある程度である。この
ニワトリ型の大きな利点は、マウス等の哺乳動物では作
成困難な抗体が作成可能であるということである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】 ニワトリは系統発生学的に哺乳動物より
下等であるが、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力
を持つ動物であることから、これまでに有用なニワトリ
抗体が数多く作成されてきた。一方、ヒトをはじめとす
る哺乳動物間で高度保存された生体成分を認識できる抗
体が哺乳動物を用いて作成できない場合、ニワトリ抗体
として作成可能であることも経験されてきた。そのた
め、ニワトリ抗体を大量調整するひとつの手段として、
産卵鶏を特定の抗原で免疫し、その後、卵に移行した抗
体を生成して卵黄抗体（ポリクローナル抗体）として利
用する方法が開発されているが、この方法によりモノク
ローナル抗体を製造することはできない。
下等であるが、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力
を持つ動物であることから、これまでに有用なニワトリ
抗体が数多く作成されてきた。一方、ヒトをはじめとす
る哺乳動物間で高度保存された生体成分を認識できる抗
体が哺乳動物を用いて作成できない場合、ニワトリ抗体
として作成可能であることも経験されてきた。そのた
め、ニワトリ抗体を大量調整するひとつの手段として、
産卵鶏を特定の抗原で免疫し、その後、卵に移行した抗
体を生成して卵黄抗体（ポリクローナル抗体）として利
用する方法が開発されているが、この方法によりモノク
ローナル抗体を製造することはできない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】 一方、近年になり、遺伝子工学技術を
活用して組換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ
表面に発現させる技術が開発された。このファージディ
スプレイ抗体技術は１９９１年に英国ＭＲＣ研究所のＷ
ｉｎｔｅｒらによって開発されたシステムで（Winter,
G., et al., Nature, 349, 293-299(1991)）、非免疫ヒ
ト末梢血リンパ球から抗体遺伝子を単離し、人工的にＶ
Ｈ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃＦ
ｖ（single chain Fragment of variable region）抗体
をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得
た（Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol., 222, 581-
597 (1991)）。この技術は、免疫を回避でき、さらに細
胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価さ
れた。現在では高度免疫したマウス脾細胞を利用して実
用的抗体が数多く作製され、抗ＰｒＰ抗体も同様に作製
されている（Williamson, R. A., etal., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 99, 7279-7282 (1996)）。
活用して組換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ
表面に発現させる技術が開発された。このファージディ
スプレイ抗体技術は１９９１年に英国ＭＲＣ研究所のＷ
ｉｎｔｅｒらによって開発されたシステムで（Winter,
G., et al., Nature, 349, 293-299(1991)）、非免疫ヒ
ト末梢血リンパ球から抗体遺伝子を単離し、人工的にＶ
Ｈ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃＦ
ｖ（single chain Fragment of variable region）抗体
をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得
た（Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol., 222, 581-
597 (1991)）。この技術は、免疫を回避でき、さらに細
胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価さ
れた。現在では高度免疫したマウス脾細胞を利用して実
用的抗体が数多く作製され、抗ＰｒＰ抗体も同様に作製
されている（Williamson, R. A., etal., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 99, 7279-7282 (1996)）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】 本発明者らは、まず哺乳動物プリオンタ
ンパク（ＰｒＰ）２３−２３１残基を認識するニワトリ
モノクローナル抗体を次のようにして調製した。リコン
ビナントヒトプリオンタンパク（ＰｒＰ）２３−２３１
（約１００μｇ）を４週齢の近交系ニワトリ白色レグホ
ン種Ｈ−Ｂ１５ニワトリの腹腔内に免疫し、その脾臓を
摘出し免疫脾細胞を調製した。これをＴＫ欠損・ウアバ
イン耐性のニワトリＢ細胞株であるＭｕＨ１とＰＥＧ法
により融合して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマあるい
は免疫ニワトリの脾臓リンパ球から調整した抗体遺伝子
（ＶＨおよびＶＬ領域）をフレキシブルリンカーを介し
て１本鎖にしたｓｃＦｖ（single chain fragment of V
region）を作成した。このｓｃＦｖを発現させるプラ
スミドベクターとしては、すでに山中（現ロート製薬）
が構築したｐＰＤＳ（図１参照）があるが、ｐＰＤＳを
用いると、ｓｃＦｖのＮ末端側にマウス免疫グロブリン
Ｌ鎖のＣ領域（Ｃκ）が発現し、Ｖ領域がニワトリでＣ
領域がマウスの組換え抗体となってしまう。
ンパク（ＰｒＰ）２３−２３１残基を認識するニワトリ
モノクローナル抗体を次のようにして調製した。リコン
ビナントヒトプリオンタンパク（ＰｒＰ）２３−２３１
（約１００μｇ）を４週齢の近交系ニワトリ白色レグホ
ン種Ｈ−Ｂ１５ニワトリの腹腔内に免疫し、その脾臓を
摘出し免疫脾細胞を調製した。これをＴＫ欠損・ウアバ
イン耐性のニワトリＢ細胞株であるＭｕＨ１とＰＥＧ法
により融合して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマあるい
は免疫ニワトリの脾臓リンパ球から調整した抗体遺伝子
（ＶＨおよびＶＬ領域）をフレキシブルリンカーを介し
て１本鎖にしたｓｃＦｖ（single chain fragment of V
region）を作成した。このｓｃＦｖを発現させるプラ
スミドベクターとしては、すでに山中（現ロート製薬）
が構築したｐＰＤＳ（図１参照）があるが、ｐＰＤＳを
用いると、ｓｃＦｖのＮ末端側にマウス免疫グロブリン
Ｌ鎖のＣ領域（Ｃκ）が発現し、Ｖ領域がニワトリでＣ
領域がマウスの組換え抗体となってしまう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】 以上の実験から、純粋なニワトリリコン
ビナント抗体作製のためのベクターの再構築ができたこ
とがわかった。このベクターから得られた純粋なニワト
リリコンビナント抗体は、マウス抗体によるノイズが少
なく、検出のＳ／Ｎ比を高くすることができる。本発明
のベクターの構築に当たって、（１）機能的なＳｃＦｖ
抗体が発現できる、（２）将来的にＦａｂ抗体も作製で
きるようなベクターにする、（３）簡便に精製できる、
の３点に留意した。この３点を考慮し、マウスＣκ鎖の
代わりにニワトリＣλ鎖を、精製用タグとしてＦＬＡＧ
配列と呼ばれる人工配列を選択した。
ビナント抗体作製のためのベクターの再構築ができたこ
とがわかった。このベクターから得られた純粋なニワト
リリコンビナント抗体は、マウス抗体によるノイズが少
なく、検出のＳ／Ｎ比を高くすることができる。本発明
のベクターの構築に当たって、（１）機能的なＳｃＦｖ
抗体が発現できる、（２）将来的にＦａｂ抗体も作製で
きるようなベクターにする、（３）簡便に精製できる、
の３点に留意した。この３点を考慮し、マウスＣκ鎖の
代わりにニワトリＣλ鎖を、精製用タグとしてＦＬＡＧ
配列と呼ばれる人工配列を選択した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】 （４）インサート（ｓｃＦｖ）のｐＣＰ
ＤＳへの挿入（ライゲーション） ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調
整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（TAKARA））を
用いてライゲーションを行う。 （５）大腸菌の形質転換 インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用い
て、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を形質転
換する。 （６）インサートを発現する形質転換大腸菌の選抜 増殖させた大腸菌のコロニーから複数の大腸菌コロニー
を任意に取り、プライマー・セットを用いてｓｃＦｖの
増幅を行い、インサートを発現する形質転換大腸菌を選
抜する。 （７）ファージ発現抗体の作成 選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファー
ジ発現抗体を作成する。 （８）特異的ファージ抗体の選抜のためのパニング 抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファ
ージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗
体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体
を選抜する。 （９）可溶化抗体の作成 特異的ファージ抗体をノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡ
あるいはＨＢ２１５１）に感染させる。感染２４時間後
に、大腸菌培養上清および培養菌体を回収し、上清およ
び菌体破壊抽出物を可溶化抗体とする。 （１０）可溶化抗体の生成 抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲルを用いて可溶化抗体
をアフィニティ精製する。
ＤＳへの挿入（ライゲーション） ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調
整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（TAKARA））を
用いてライゲーションを行う。 （５）大腸菌の形質転換 インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用い
て、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を形質転
換する。 （６）インサートを発現する形質転換大腸菌の選抜 増殖させた大腸菌のコロニーから複数の大腸菌コロニー
を任意に取り、プライマー・セットを用いてｓｃＦｖの
増幅を行い、インサートを発現する形質転換大腸菌を選
抜する。 （７）ファージ発現抗体の作成 選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファー
ジ発現抗体を作成する。 （８）特異的ファージ抗体の選抜のためのパニング 抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファ
ージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗
体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体
を選抜する。 （９）可溶化抗体の作成 特異的ファージ抗体をノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡ
あるいはＨＢ２１５１）に感染させる。感染２４時間後
に、大腸菌培養上清および培養菌体を回収し、上清およ
び菌体破壊抽出物を可溶化抗体とする。 （１０）可溶化抗体の生成 抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲルを用いて可溶化抗体
をアフィニティ精製する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５５】 実施例１８ 特異的ファージ抗体の選抜
のためのパニング抗原（プリオンタンパク）を固相化し
たプレートにファージ発現抗体を反応させた後、反応し
たファージ発現抗体のみを回収し、大腸菌に感染して特
異的ファージ抗体を選抜する。パニングは、抗原抗体反
応を利用した高親和性抗体選抜法である。例えば、次の
ようにして行う。５μｇ／ｍｌ濃度のマルトース結合タ
ンパク融合リコンビナントヒトＰｒＰ２３−２３１（Ｍ
ＢＰ−ＨｕＰｒＰ）を９６ウェルプレートに５０μｌ／
ｗｅｌｌ（０．２５μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、４℃、
終夜固相化しこれを抗原コートプレートとした。抗原コ
ートプレート１６ウェルに２５％ＢｌｏｃｋＡｃｅ ４
００μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃ １時間ブロッキング
し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗
浄した。洗浄後、ファージディスプレイ抗体浮遊液
１．６ｍｌ、ＢｌｏｃｋＡｃｅ ７０４μｌ、５Ｍ Ｎ
ａＣｌ９６μｌで混合したものを１５０μｌ／ｗｅｌｌ
添加し、３７℃ ２時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
２０（０．０５％）で１５回洗浄した。洗浄後のウェル
には、溶出液５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、１５分間
室温の反応後、２Ｍトリス３μｌ／ｗｅｌｌで中和し
た。中和後、反応液を回収しＯＤ６００＝０．５〜１．
０に培養したＸＬ１−Ｂｌｕｅ ２ｍｌに３７℃ １時
間感染させた。感染後の溶液の一部は力価測定のため
に、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレ
ートにプレーティングし、溶出ファージ力価を測定し
た。さらにＰＣＲによるインサートチェック後、そのイ
ンサート率を溶出ファージ力価に積し陽性溶出ファージ
力価を求めた。残りの感染溶液には５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 ４００μｌと
２Ｍ グルコース３７μｌ加え、３７℃ ２時間の培養
後、５×１０９ｐｆｕのヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ
１３）を１時間感染させた。感染後、８００×ｇ １０
分間遠心して上清を除き、１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌテト
ラサイクリン含有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 １０ｍｌ
で終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ １０分間の
遠心で菌体を除き、０．４５μｍポアフィルターで上清
を濾過し、その濾液を一次パニング済ファージディスプ
レイ抗体浮遊液とし、次回のパニングサンプルとした。
のためのパニング抗原（プリオンタンパク）を固相化し
たプレートにファージ発現抗体を反応させた後、反応し
たファージ発現抗体のみを回収し、大腸菌に感染して特
異的ファージ抗体を選抜する。パニングは、抗原抗体反
応を利用した高親和性抗体選抜法である。例えば、次の
ようにして行う。５μｇ／ｍｌ濃度のマルトース結合タ
ンパク融合リコンビナントヒトＰｒＰ２３−２３１（Ｍ
ＢＰ−ＨｕＰｒＰ）を９６ウェルプレートに５０μｌ／
ｗｅｌｌ（０．２５μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、４℃、
終夜固相化しこれを抗原コートプレートとした。抗原コ
ートプレート１６ウェルに２５％ＢｌｏｃｋＡｃｅ ４
００μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃ １時間ブロッキング
し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗
浄した。洗浄後、ファージディスプレイ抗体浮遊液
１．６ｍｌ、ＢｌｏｃｋＡｃｅ ７０４μｌ、５Ｍ Ｎ
ａＣｌ９６μｌで混合したものを１５０μｌ／ｗｅｌｌ
添加し、３７℃ ２時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
２０（０．０５％）で１５回洗浄した。洗浄後のウェル
には、溶出液５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、１５分間
室温の反応後、２Ｍトリス３μｌ／ｗｅｌｌで中和し
た。中和後、反応液を回収しＯＤ６００＝０．５〜１．
０に培養したＸＬ１−Ｂｌｕｅ ２ｍｌに３７℃ １時
間感染させた。感染後の溶液の一部は力価測定のため
に、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレ
ートにプレーティングし、溶出ファージ力価を測定し
た。さらにＰＣＲによるインサートチェック後、そのイ
ンサート率を溶出ファージ力価に積し陽性溶出ファージ
力価を求めた。残りの感染溶液には５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 ４００μｌと
２Ｍ グルコース３７μｌ加え、３７℃ ２時間の培養
後、５×１０９ｐｆｕのヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ
１３）を１時間感染させた。感染後、８００×ｇ １０
分間遠心して上清を除き、１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌテト
ラサイクリン含有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地 １０ｍｌ
で終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ １０分間の
遠心で菌体を除き、０．４５μｍポアフィルターで上清
を濾過し、その濾液を一次パニング済ファージディスプ
レイ抗体浮遊液とし、次回のパニングサンプルとした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】
【発明の効果】本発明は、純粋な鳥類型リコンビナント
抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を提供
する。ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では
作成できないモノクローナル抗体を作成することがで
き、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリ
ルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパ
クなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生体系高分
子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの
展開が期待される。したがって、がん、プリオン病など
の種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。ところ
が、ニワトリ型の大きな欠点は、一般にモノクローナル
抗体を産生させる融合細胞の手法では、実際に実用する
ための必要量ができないことである。本発明は、実質上
純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組換え法で、初めて多
量に作ることに成功した。即ち、本発明は、新規なプラ
スミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノク
ローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能にし
たものであり、抗体、その製法、ベクター、プライマー
・セット等を提供するものである。また、鳥類の抗体遺
伝子は、３’末端及び５’末端の塩基配列が比較的固定
化されており、本発明が提供するプライマーを用いて抗
体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能で
あり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗体
を遺伝子組換え手段により簡便に作成できる方法を提供
するものである。
抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を提供
する。ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では
作成できないモノクローナル抗体を作成することがで
き、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリ
ルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパ
クなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生体系高分
子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの
展開が期待される。したがって、がん、プリオン病など
の種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。ところ
が、ニワトリ型の大きな欠点は、一般にモノクローナル
抗体を産生させる融合細胞の手法では、実際に実用する
ための必要量ができないことである。本発明は、実質上
純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組換え法で、初めて多
量に作ることに成功した。即ち、本発明は、新規なプラ
スミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノク
ローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能にし
たものであり、抗体、その製法、ベクター、プライマー
・セット等を提供するものである。また、鳥類の抗体遺
伝子は、３’末端及び５’末端の塩基配列が比較的固定
化されており、本発明が提供するプライマーを用いて抗
体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能で
あり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗体
を遺伝子組換え手段により簡便に作成できる方法を提供
するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA41 BA53 CA04 CA20 DA06 EA03 EA04 GA03 GA11 HA08 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ08 QQ46 QQ96 QR31 QR62 QS25 4B064 AG27 CA02 CA12 CA19 CC24 DA01 DA13 DA14 4B065 AA26X AA90X AA98X AB04 AC14 BA02 CA25 CA44 CA46 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 DA86 EA21 EA28 FA72 GA26
Claims (27)
- 【請求項１】 遺伝子組換え法によりニワトリ型モノク
ローナル抗体を製造する方法において、ニワトリＣλ鎖
（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が導入されている
発現ベクターに、ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃ
Ｆｖをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを用い
ることを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体の製
造方法。 - 【請求項２】 ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコー
ドする遺伝子が導入されている発現ベクターが、精製用
タグを有する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦ
ｖをコードする遺伝子が導入される位置での制限酵素
が、ＥａｇＩ−ＢｓｓＨIIである請求項１又は２に記載
の方法。 - 【請求項４】 ファージディスプレー法により発現させ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 可溶型抗体として発現できるためのタグ
（アンバー）が、ファージの蛋白質をコードする遺伝子
の上流に導入されている発現ベクターを用いる請求項４
に記載の方法。 - 【請求項６】 ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコー
ドする遺伝子が導入されている発現ベクターが、ｐＣＰ
ＤＳである請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 遺伝子組換え法によりニワトリ型モノク
ローナル抗体を製造するための発現ベクターであって、
ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が
導入されていることを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項８】 ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコー
ドする遺伝子が導入されている発現ベクターが、精製用
タグを有する請求項７に記載の発現ベクター。 - 【請求項９】 ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦ
ｖをコードする遺伝子が導入される位置での制限酵素
が、ＥａｇＩ−ＢｓｓＨIIである請求項７又は８に記載
の発現ベクター。 - 【請求項１０】 発現ベクターが、ニワトリｐＰＤＳで
ある請求項７〜９のいずれかに記載の発現ベクター。 - 【請求項１１】 ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃ
Ｆｖをコードする遺伝子が制限酵素ＥａｇＩ−ＢｓｓＨ
IIの位置に導入されている請求項７〜１０のいずれかに
記載の発現ベクター。 - 【請求項１２】 ファージディスプレー法によりニワト
リ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖが発現し得る請求項
１１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１３】 可溶型抗体として発現できるためのタ
グ（アンバー）が、ファージの蛋白質をコードする遺伝
子の上流に導入されている請求項１２に記載の発現ベク
ター。 - 【請求項１４】 請求項１〜６のいずれかに記載の方法
により製造されるニワトリ型組換え抗体。 - 【請求項１５】 ヒトプリオンタンパク（ＰｒＰ）に対
するモノクローナル抗体である請求項１４に記載の抗
体。 - 【請求項１６】 可溶化抗体である請求項１４又は１５
に記載の抗体。 - 【請求項１７】 ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ
又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプ
ライマーのひととつが、制限酵素ＢｓｓＨIIで切断でき
る塩基配列を有することを特徴とするニワトリ型モノク
ローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子増幅用のプ
ライマー。 - 【請求項１８】 塩基数が１５〜３０である請求項１７
に記載のプライマー。 - 【請求項１９】 塩基配列が、 ３’−ｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃ
ｇｇｇｔｔｃ−５’ 又はその相補鎖である請求項１７又は１８に記載のプラ
イマー。 - 【請求項２０】 他方のプライマーの塩基配列が、 ５’−ｃｔｇａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｔｇａｃｇｔｔ−
３’ 又はその相補鎖である請求項１７〜１９のいずれかに記
載のプライマー。 - 【請求項２１】 他方のプライマーの塩基配列が、 ５’−ｔｃｔｇａｃｇｔｃｇｃｇｃｔｇａｃｔｃａｇｃ
ｃ−３’ 又はその相補鎖である請求項１７〜１９のいずれかに記
載のプライマー - 【請求項２２】 請求項１７〜２１のいずれかに記載の
プライマーを用いて、ニワトリ型モノクローナル抗体の
可変領域をコードする遺伝子を増幅させる方法。 - 【請求項２３】 可変領域がＶＬ領域である請求項２２
に記載の方法。 - 【請求項２４】 プライマーが請求項２１に記載のプラ
イマーである請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 可変領域がｓｃＦｖである請求項２２
に記載の方法。 - 【請求項２６】 プライマーが請求項２０に記載のプラ
イマーである請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 塩基配列が、 ３’−ｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃ
ｇｇｇｔｔｃ−５’ 又はその相補鎖であるオリゴヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000054875A JP2001238676A (ja) | 2000-02-29 | 2000-02-29 | ニワトリ型モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000054875A JP2001238676A (ja) | 2000-02-29 | 2000-02-29 | ニワトリ型モノクローナル抗体 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005291975A Division JP3908257B2 (ja) | 2005-10-05 | 2005-10-05 | ニワトリ型モノクローナル抗体用のオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001238676A true JP2001238676A (ja) | 2001-09-04 |
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ID=18576074
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|---|---|---|---|
| JP2000054875A Pending JP2001238676A (ja) | 2000-02-29 | 2000-02-29 | ニワトリ型モノクローナル抗体 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001238676A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005278633A (ja) * | 2004-03-04 | 2005-10-13 | Hiroshima Univ | ニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法、および当該生産方法によって生産されるニワトリ型モノクローナル抗体 |
| WO2007026689A1 (ja) * | 2005-08-29 | 2007-03-08 | Japan Science And Technology Agency | ダチョウを用いた抗体、及びその作製方法 |
| CN105559202A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-05-11 | 陕西瑞凯生物科技有限公司 | 一种基于卵黄抗体的防霾口罩及其制备方法 |
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2000
- 2000-02-29 JP JP2000054875A patent/JP2001238676A/ja active Pending
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