CN117624370B - 人amacr的单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及人AMACR技术领域，具体涉及人AMACR的单克隆抗体及应用。实施例通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人AMACR的兔单克隆抗体，具有与人AMACR的高亲和力和特异性，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人AMACR的免疫印迹试剂盒和免疫组化试剂盒。该单克隆抗体还对于人AMACR以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。

Description

人AMACR的单克隆抗体及应用

技术领域

本申请涉及人AMACR技术领域，具体涉及人AMACR的单克隆抗体及应用。

背景技术

α-甲基酰辅酶α消旋酶(AMACR)催化(2R)-甲基酰辅酶α和(2S)-甲基酰辅酶α脂肪酸的β-氧化和胆汁酸的合成所需。脂肪酸的代谢在肿瘤组织中被激活，这与AMACR产量的增加有关。含脂肪酸食物(如动物脂肪、肉类和牛奶)消费量的增加会增加患前列腺癌和肠癌的风险。相反，对AMACR产生的抑制阻止了恶性细胞的生长。AMACR在1994年被鉴定为参与脂质代谢的酶，它在前列腺癌中过度表达，而在良性前列腺组织中不表达。因此，AMACR已被广泛用作前列腺癌的诊断标记。

目前，对AMACR抑制剂的研究主要集中在具有底物特异性的物质。一些作者提出了使用识别AMACR的细胞毒性T淋巴细胞进行前列腺癌免疫治疗的结果。至少就我们所知，抗AMACR抗体用于治疗的可能性还没有被研究过。这可能与蛋白质的细胞内定位及其抗体的不可及性有关。另一方面，最近的研究揭示了在癌症患者的生物体液中存在AMACR，这表明了获得和表征抗AMACR抗体的明显需求。

发明内容

本申请实施例提供了一类高亲和力的人AMACR的兔单克隆抗体，以在一定程度上解决上述技术问题之一。实施例通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人AMACR的兔单克隆抗体，具有与人AMACR的高亲和力和特异性，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人AMACR水平的试剂盒。本申请提供的单克隆抗体对于人AMACR以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。

为此，本申请至少公开了如下技术方案：

第一方面，实施例公开了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人AMACR，所述单克隆抗体包含：

3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR3；

和/或

3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。

第二方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人AMACR，所述单克隆抗体包含具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)及具有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链可变区(VH)。

第三方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人AMACR，所述单克隆抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链及具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链。

第四方面，实施例公开了一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测人AMACR，所述试剂盒包括：第一至三方面任一所述的单克隆抗体。

第五方面，实施例公开了一种免疫组化检测试剂盒，用于检测人AMACR，所述试剂盒包括：第一至三方面任一所述的单克隆抗体。

第六方面，实施例公开了第一至三方面任一所述的单克隆抗体在制备检测人AMACR试剂或试剂盒中的应用。

附图说明

图1为实施例提供的用SDS-PAGE胶检测AMACR蛋白His标签纯化图；泳道1为0.4mg/mL的BSA；泳道2为0.2mg/mL的BSA；泳道3为marker；泳道4为包涵体；泳道5为流穿液；泳道6为收集的300mM咪唑洗脱AMACR蛋白的2倍稀释液；泳道7为收集的300mM咪唑洗脱AMACR蛋白的10倍稀释液。

图2为本申请实施例构建的含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体结构示意图，图中，pBR322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列。

图3为本申请实施例构建的含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体结构示意图，图中，pBR322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Light chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列。

图4为本申请实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫印迹试剂盒对鼠肝细胞样本和鼠肾细胞样本中AMACR的检测结果。

图5为本申请实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫印迹试剂盒对人肾组织石蜡切片样本中AMACR的检测结果。

图6为本申请实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫组化试剂盒检测人良性前列腺增生组织石蜡切片样本(阴性对照)中AMACR的染色定位图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

术语解释

在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与人AMACR特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。

在本申请中，术语“兔抗体”、“抗人AMACR兔单克隆抗体”、“人AMACR的兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，人AMACR的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中，抗人AMACR的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在一个实施例中，抗人AMACR的兔单克隆抗体可以为CDR区来源于兔源免疫球蛋白序列、而FR来自其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗人AMACR的兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。

在本申请中，术语“抗体”是指，由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Lightchain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链的V区和轻链的V区分别称为VL和VH。VL和VH中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。一般地，VH包括3个互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，VL包括3个互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。VL和VH的3个互补决定区单独或共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。通过骨架区的替换或改变，在保证抗体识别及结合抗原的部位不变的情况下，可以具有相同特异性的多个抗体。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。

在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

抗体

本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体特异性结合人AMACR。

在一些实施例中，所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。VLCDR1如SEQ ID NO:3所示，VL CDR2如SEQ ID NO:4所示，VL CDR3如SEQ ID NO:5所示。

在一些实施例中，所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的重链可变区(HL)的互补决定区(CDRs)：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VLCDR1如SEQ ID NO:8所示，VL CDR2如SEQ ID NO:9所示，VL CDR3如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施例中，所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及3个Kabat编号系统定义的重链可变区(HL)的互补决定区(CDRs)：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VLCDR1如SEQ ID NO:4所示，VLCDR2如SEQ ID NO:5所示，VL CDR3如SEQ ID NO:6所示。VLCDR1如SEQ ID NO:8所示，VLCDR2如SEQ ID NO:9所示，VL CDR3如SEQ ID NO:10所示。

在某些实施方式中，该抗人AMACR的抗体可以具有Y型分子结构。在一个实施例中，抗人AMACR的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL均可用于识别和结合人AMACR。在一个实施例中，所述抗人AMACR的抗体轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。

在一些实施例中，位于VL和VH区域中的CDR，相互之间可被FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架，以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人AMACR)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。CDR可以被移植到来自其他物种的另一种抗体的FR之间，同时保留其与人AMACR结合的能力，形成一种融合抗体。在一个实施例中，将Y型兔单克隆抗体的CDR移植到人抗体的FR之间，形成一个抗人AMACR的人源化抗体。在一些实施例中，该抗体包含来源于人免疫球蛋白的FR区，所述FR区任选地包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个从人源残基至相应的兔源残基的回复突变。

在一些实施例中，位于VH和VL区域中的CDR，相互之间可被FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架，以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人AMACR)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。

抗体制备

本申请实施例提供的单克隆抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、单个B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。

在一些实施方式中，该单克隆抗体的制备过程包括：通过重组表达的人AMACR作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选得到抗原特异性B淋巴细胞；经抗体功能验证后筛选出能分泌特异性抗体的阳性B淋巴细胞；通过扩增以获得阳性B淋巴细胞的抗体重链及轻链基因，然后进行重组表达，以获得抗人AMACR的兔单克隆抗体。

在一些实施例中，人AMACR的制备方法包括：

(1)表达质粒构建

使用包含人AMACR序列的质粒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)为模板，采用AMACR-F：(SEQ ID NO.11)和AMACR-R(SEQ ID NO.12)的引物进行PCR扩增，以扩增得到人AMACR蛋白N端的第1位至第138位氨基酸的编码目的序列。

其中，PCR反应体系包含：1μL模板，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，25μL2×Gloria Hi-Fi PCRMaster Mix with GC Buffer(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，22μLN.F H₂O。PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行30次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。将扩增的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式装载在表达载体上，所使用的原核表达载体为pGEX-4T-1，经测序(金开瑞生物科技有限公司)验证之后保存质粒，即得用于表达人AMACR的表达质粒。

(2)蛋白的重组表达

将用于表达人AMACR的表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta菌株，并在LB琼脂平板(含有75μg/mL氨苄青霉素)上于37℃温育过夜，以获得几个单菌落转化子。

将单菌落转化子接种于2mL LB培养液(75μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃、220rpm培养至菌液OD600nm为0.4～0.6即可。接下来，将每种菌株的2mL培养物转接至400mLLB表达培养基中，于37℃、220rpm再次培养至菌液OD600nm达到约0.45～0.55时，加入0.8mM IPTG，37℃继续诱导3～4h，4000rpm离心10min，取沉淀即为菌体。

(3)重组蛋白的纯化

第一次破碎：用30mL的破菌液(含有50mM Tris和300mMNaCl，pH为8.0)重悬菌体，冰盒固定。选择变幅杆，放入破菌舱内，功率350W，破菌时间3s，间隔时间3s，倒计5min，之后置于冰水混合物中冷却5min，再重复上述步骤破菌5min。破菌完成后9000rpm离心10min得到上清液①和沉淀。

第二次破碎：量取30mL破菌液(含2M尿素的PBS缓冲液)倒入沉淀中，吹匀沉淀，转移至50mL的圆底离心管中，功率350W，破菌时间3s，间隔时间3s，破碎0～5min(破碎时间按沉淀量及质地来决定，菌液置于冰块中)，9000rpm离心10min得到上清液②和包涵体，将得到的上清液①和上清液②用Loading Buffer分别做2倍稀释，包涵体做2倍稀释、10倍稀释；将得到2倍稀释上清液①(简称“上1”)、2倍稀释上清液②(简称“上2”)、2倍稀释包涵体(简称“*2”)、10倍稀释包涵体(简称“*10”)样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳。

使用GST亲和层析树脂(汇研)通过亲和层析从上清液①中提取重组AMACR。纯化结果如图1所示，包涵体经His纯化得到浓度为1mg/ml纯度为85％的重组AMACR。

在一些实施例中，人AMACR的单克隆抗体的制备方法包括：

(1)动物免疫

以上述实施例制得的重组人AMACR蛋白为免疫原，每只新西兰大白兔免疫300μg免疫原进行免疫。首次免疫前，将免疫原与等量的完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔2周取150μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后，采集兔血清样本，用ELISA方法测定其针对人AMACR蛋白的滴度，取血清滴度高的兔子，用300μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

(2)分离脾细胞

于无菌环境下，将上述得到的兔脾脏用基础培养基清洗，剪除多余的结缔组织、脂肪剪除，与细胞筛网中研磨。收集研磨液(即为膜内细胞)，室温以400g离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，吹散1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解。室温以400g离心5min，去上清，加入40mL常温基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬。再次室温以400g离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温含血清的完全培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

(3)B淋巴细胞分选和培养

B淋巴细胞筛选方法参见“可溶性B淋巴细胞刺激因子原核表达及其单克隆抗体制备[J]生物学杂志，2021年第3期，ISSN：2095-1736”。

(4)编码兔单克隆抗体基因的克隆

培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序。

其中，PCR反应体系如下：将天然配对的兔单克隆抗体的轻、重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来。其中PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL正向引物(Primer-F，10mM)，1μL反向引物(Primer-R，10mM)，12.5μL2×Gloria HiFi(ABclonal)，6.5μLN.F H2O。

其中，用于扩增轻链可变区的引物对包括VL-Primer-F(SEQ ID NO.13)和VL-Primer-R(SEQ ID NO.14)。用于扩增重链可变区的引物对包括VH-Primer-F(SEQ IDNO.15)和VH-Primer-R(SEQ ID NO.16)。(5)重链和轻链表达载体的构建

将上述步骤中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图2和图3。其中，挑选的轻链的编码基因如SEQ ID NO.17所示，挑选的轻链可变区的编码基因如SEQ ID NO.18所示。挑选的重链的编码基因如SEQ ID NO.19所示，挑选的重链可变区的编码基因如SEQ ID NO.20所示。

(6)单克隆抗体制备和纯化

为了获得多株识别人AMACR的兔单克隆抗体，本发明将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上(见图2，图3)，将质粒转染293F细胞；转染72-96小时获得培养上清中含有重组的识别人AMACR的兔单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人AMACR的兔单克隆抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。

结果可知，所得兔单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链互补决定区VL CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链互补决定区VL CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，轻链互补决定区VL CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其重链互补决定区VH CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，重链互补决定区VH CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链互补决定区VH CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。并且该兔单克隆抗体，轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。

在一些检测例中，对上述实施例制得的识别人AMACR的兔单克隆抗体的特异性进行鉴定。用免疫印迹的方法检测单克隆抗体的识别特异性，进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到NC膜上。将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入抗体AMACR兔单克隆抗体(1:1000稀释)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗(Jackson ImmunoResearch)，室温孵育1h。再次TBST洗膜，加入ECL显色液显影，并分析显影结论确定AMACR兔单克隆抗体特异性(如图4)。

一些检测例中，将制得人AMACR蛋白的兔单克隆抗体作为一抗，采用免疫组化染色方法定性检测在人肾组织石蜡切片和人良性前列腺增生组织石蜡切片样本中AMACR。具体过程包括：

(1)切片选择：

人良性前列腺增生石蜡切片样本(阴性对照)和人肾脏石蜡切片样本(组织样本来源于芯片，芯片采购于百奥斯公司)。

(2)IHC染色及分析

烤片：分别将石蜡切片人良性前列腺增生石蜡切片样本(阴性对照)和人肾脏石蜡切片样本按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min。

抗原修复：pH6.0、0.01M柠檬酸钠修复液高压热修复。

内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。

封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。

一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用PBS缓冲液稀释(抗体稀释比为1:50)的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次(一抗稀释比：1:50)。

二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REAL EnVisionDetection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP；Dako)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。

显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min。

复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min。

返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min。

脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥；

封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出切片扫描。

需要说明的是，免疫组化染色结果分为:阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。使用上述实施例制得的抗人AMACR兔单克隆抗体作为一抗，进行免疫组化染色，结果如图5、图6所示。染色清晰且无非特异性染色，背景干净。结合免疫印迹的结果，说明抗人AMACR兔单克隆抗体特异的识别人AMACR蛋白，无非特异性染色，有效避免假阳性结果。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人AMACR，所述单克隆抗体包含：

3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区（VL）的互补决定区（CDRs）：如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR3；以及

3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区（VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。

2.一种单克隆抗体，特异性结合人AMACR，所述单克隆抗体包含：

如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链可变区（VL）；及

如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链可变区（VH）。

3.一种单克隆抗体，特异性结合人AMACR，所述单克隆抗体包含：

如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链；及

如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链。

4.一种核酸分子，其携带有编码权利要求1~3任一所述的单克隆抗体的基因。

5.一种宿主细胞，其携带有如权利要求4所述的核酸分子，并能够进行自主表达如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体。

6.一种试剂盒，其特征在于，用于检测人AMACR，所述试剂盒包括：如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒选自免疫组织化学试剂盒、免疫印迹试剂盒、免疫沉淀试剂盒。

8.如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体在制备检测人AMACR试剂或试剂盒中的应用。