CN117866086B - 结合人微囊蛋白-1的单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及人微囊蛋白‑1技术领域，具体涉及结合人微囊蛋白‑1的单克隆抗体及应用。实施例通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人微囊蛋白‑1的兔单克隆抗体，具有与人微囊蛋白‑1的高亲和力和特异性，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人微囊蛋白‑1的免疫印迹试剂盒和免疫组合试剂盒。该单克隆抗体还对于人微囊蛋白‑1以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。

Description

结合人微囊蛋白-1的单克隆抗体及应用

技术领域

本申请涉及人微囊蛋白-1技术领域，具体涉及结合人微囊蛋白-1的单克隆抗体及应用。

背景技术

微囊蛋白-1(Caveolin-1)是横跨膜的支架蛋白，细胞质膜微囊的主要结构部件，参与各种复杂的细胞生理过程，与多种膜结构相互联系，包括内质网和高尔基体。Caveolin-1合成后插入内质网，运输到高尔基体和细胞表面形成小凹，Caveolin-1可以从细胞质膜以相反的顺序被回收。人源Caveolin-1(Homo sapiens Caveolin-1)由178个氨基酸组成，有一个寡聚化区和一个CSD区(Caveolin脚手架区)，氨基酸60-70之间保守区域是Caveolin-1离开内质网所必需的，71-80之间的氨基酸调节Caveolin-1低聚物到高尔基体上.在丝氨酸80处磷酸化，使Caveolin-1转变为可溶分泌蛋白，通过CSD直接影响和调节信号分子活性。

Caveolin-1作为一个支架蛋白，可以增加或抑制细胞质膜微囊相关蛋白的活动，抑制细胞迁移或促进肿瘤形成，调控细胞凋亡信号途径，影响细胞周期内的生长增殖状况，在不同组织和不同情况下负性调控或正性调控血管生成并具有一定的抗炎活性。因此，Caveolin-1作为与肿瘤关系密切的窖蛋白家族成员之一被广泛关注，它的功能及其与癌症的关系是当前研究热点，虽然在不同癌症以及癌症的不同阶段，科学家对Caveolin-1所扮演的角色和发挥的功能莫衷一是，但一致认为其对癌症的恶性表型转换至关重要，是癌症治疗的靶标蛋白。

因此，开发一种人Caveolin-1的抗体，对于检测人Caveolin-1蛋白具有非常重要的意义。

发明内容

本申请实施例提供了一类高亲和性的人微囊蛋白-1的兔单克隆抗体，以在一定程度上解决上述技术问题之一。实施例通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人微囊蛋白-1的兔单克隆抗体，具有与人微囊蛋白-1的高亲和力和特异性，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人微囊蛋白-1水平的试剂盒。本申请提供的单克隆抗体对于人微囊蛋白-1以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。

为此，本申请至少公开了如下技术方案：

第一方面，实施例公开了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人微囊蛋白-1，所述单克隆抗体包含：

3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:5所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3；

和/或

3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。

第二方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人微囊蛋白-1，所述单克隆抗体包含：具有如SEQ ID NO:2所示序列的轻链可变区(VL)及具有如SEQ ID NO:7所示序列的重链可变区(VH)。

第三方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人微囊蛋白-1，所述单克隆抗体包含：具有如SEQ ID NO:1所示序列的轻链及具有如SEQ ID NO:6所示序列的重链。

第四方面，实施例公开了一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测人微囊蛋白-1，所述试剂盒包括：第一至三方面任一所述的单克隆抗体。

第五方面，实施例公开了一种免疫组化检测试剂盒，用于检测人微囊蛋白-1，所述试剂盒包括：第一至三方面任一所述的单克隆抗体。

第六方面，实施例公开了第一至三方面任一所述的单克隆抗体在制备检测人微囊蛋白-1试剂或试剂盒中的应用。

附图说明

图1为实施例提供的用SDS-PAGE胶检测Caveolin-1蛋白His标签纯化图；泳道1和泳道2分别为0.4mg/mL和0.2mg/mL的BSA；泳道3为marker；泳道4为上清液①(简称“上1”)；泳道5为纯化过程中的流穿液(简称“FT”)；泳道6为收集的Caveolin-1蛋白2倍稀释液(简称“*2”)；泳道7为收集的Caveolin-1蛋白10倍稀释液(简称“*10”)。

图2为实施例构建的含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体结构示意图，图中，pBR322 origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearlypromotor为在真核生物中的启动子，SV40 PAterminator是加尾信号，Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列。

图3为实施例构建的含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体结构示意图，图中，pBR322 origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearlypromotor为在真核生物中的启动子，SV40 PAterminator是加尾信号，Light chain constant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。

图4为实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫印迹试剂盒对细胞样本HeLa中Caveolin-1的检测结果。

图5为实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫印迹试剂盒对鼠肺组织和兔肺组织中Caveolin-1的检测结果；“Mouse lung”为来自于6-8周c57bl/6小鼠的高表达Caveolin-1的鼠肺细胞样本；“Rat lung”为来自于SD大鼠的高表达Caveolin-1的鼠肺细胞样本。

图6为本申请实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫组化试剂盒检测人肺样本中Caveolin-1的染色定位图。

图7为本申请实施例提供的兔单克隆抗体构建的免疫组化试剂盒检人结肠样本中Caveolin-1的染色定位图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

术语解释

在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与人微囊蛋白-1特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。

在本申请中，术语“兔抗体”、“抗人微囊蛋白-1兔单克隆抗体”、“人微囊蛋白-1的兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，人微囊蛋白-1的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中，抗人微囊蛋白-1的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在一个实施例中，抗人微囊蛋白-1的兔单克隆抗体可以为CDR区来源于兔源免疫球蛋白序列、而FR来自其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗人微囊蛋白-1的兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。

在本申请中，术语“抗体”是指，由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Lightchain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链的V区和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。一般地，VH包括3个互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，VL包括3个互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。VH和VL的3个互补决定区单独或共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。通过骨架区的替换或改变，在保证抗体识别及结合抗原的部位不变的情况下，可以具有相同特异性的多个抗体。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。

在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

抗体

本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体特异性结合人微囊蛋白-1。

在一些实施例中，所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。VL CDR1如SEQ ID NO:5所示，VL CDR2如SEQ ID NO:6所示，VL CDR3如SEQ ID NO:7所示。

在一些实施例中，所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的重链可变区(HL)的互补决定区(CDRs)：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VL CDR1如SEQ ID NO:8所示，VL CDR2如SEQ ID NO:9所示，VL CDR3如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施例中，所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及3个Kabat编号系统定义的重链可变区(HL)的互补决定区(CDRs)：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VL CDR1如SEQ ID NO:5所示，VLCDR2如SEQ ID NO:6所示，VL CDR3如SEQ ID NO:7所示。VL CDR1如SEQ ID NO:8所示，VLCDR2如SEQ ID NO:9所示，VL CDR3如SEQ ID NO:10所示。

在某些实施方式中，该抗人微囊蛋白-1的抗体可以具有Y型分子结构。在一个实施例中，抗人微囊蛋白-1的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL均可用于识别和结合人微囊蛋白-1。

在一些实施例中，位于VL和VH区域中的CDR，相互之间可被FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架，以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人微囊蛋白-1)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。

抗体制备

本申请实施例提供的单克隆抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、单个B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。

在一些实施方式中，该单克隆抗体的制备过程包括：通过重组表达的人微囊蛋白-1作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选得到抗原特异性B淋巴细胞；经抗体功能验证后筛选出能分泌特异性抗体的阳性B淋巴细胞；通过扩增以获得阳性B淋巴细胞的抗体重链及轻链基因，然后进行重组表达，以获得抗人MSH2的兔单克隆抗体。

在一些实施例中，人微囊蛋白-1的制备方法包括：

(1)表达质粒构建

使用包含人Caveolin-1CDS序列的质粒(Thermo Fisher Scientific cDNA/ORFLibrary-Plate Map(s))为模板，采用Caveolin-1-Primer-F(SEQ ID NO.11所示)和Caveolin-1-Primer-F(SEQ ID NO.12所示)的引物进行PCR扩增，以用于表达得到人Caveolin-1蛋白N端的第1位至第80位氨基酸组成的重组人Caveolin-1(SEQ ID NO.13所示)。

其中，PCR反应体系：1μL模板，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，25μL2×Gloria Hi-Fi PCR Master Mix with GC Buffer(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，22μLN.F H₂O。PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行30次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。将扩增的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式装载在表达载体上，所使用的原核表达载体为pGEX-4T-AB1(商业化改造载体)，经测序(金开瑞生物科技有限公司)验证之后保存质粒，即得用于表达人Caveolin-1的表达质粒。

(2)蛋白的重组表达

将用于表达人Caveolin-1的表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta菌株，并在LB琼脂平板(含有75μg/mL氨苄青霉素)上于37℃温育过夜，以获得几个单菌落转化子。

将单菌落转化子接种于2mL LB培养液(75μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃、220rpm培养至菌液OD600nm为0.4～0.6即可。接下来，将每种菌株的2mL培养物转接至400mL LB表达培养基中，于37℃、220rpm再次培养至菌液OD600nm达到约0.45～0.55时，加入0.8mM IPTG，37℃继续诱导3～4h，4000rpm离心10min，取沉淀即为菌体。

(3)重组蛋白的纯化

用30mL的破菌液(50mM Tris-300mM NaCl)重悬菌体，冰盒固定。选择变幅杆，放入破菌舱内，功率350W，破菌时间3s，间隔时间3s，倒计5min，之后置于冰水混合物中冷却5min，再重复上述步骤破菌5min。破菌完成后9000rpm离心10min得到上清液①和沉淀。

使用Ni亲和层析树脂通过亲和层析从上清液①中提取重组Caveolin-1。纯化结果如图1所示，得到了纯度为80％的重组Caveolin-1，包含Caveolin-1蛋白片段、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签。

在一些实施例中，人微囊蛋白-1的单克隆抗体的制备方法包括：

(1)动物免疫

以上述实施例制得的重组人Caveolin-1蛋白为免疫原，每只新西兰大白兔免疫200μg免疫原进行免疫。首次免疫前，将免疫原与等量的完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后，采集兔血清样本，用ELISA方法测定其针对人Caveolin-1蛋白的滴度，取血清按1:243000稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，3天后取脾脏。

(2)分离脾细胞

于无菌环境下，将上述得到的兔脾脏用基础培养基清洗，剪除多余的结缔组织、脂肪剪除，与细胞筛网中研磨。收集研磨液(即为膜内细胞)，室温以400g离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，吹散1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解。室温以400g离心5min，去上清，加入40mL常温基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬。再次室温以400g离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

(3)B淋巴细胞分选和培养

B淋巴细胞分选与培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。

(4)编码兔单克隆抗体基因的克隆

培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序。

其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL、10mM正向引物，1μL、10mM反向引物，12.5μL2×Gloria HiFi(武汉爱博泰克生物科技有限公司提供)，6.5μLN.F H₂O。PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存

其中，轻链可变区引物对为：VL-Primer-F：SEQ ID NO:14；VL-Primer-R：SEQ IDNO:15。

重链可变区引物对为：VH-Primer-F：SEQ ID NO:16；VH-Primer-R：SEQ ID NO:17。

(5)重链和轻链表达载体的构建

将上述步骤中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图2和图3。其中，挑选的轻链的编码基因如SEQ ID NO.18所示，挑选的轻链可变区的编码基因如SEQ ID NO.19所示。挑选的重链的编码基因如SEQ ID NO.20所示，挑选的重链可变区的编码基因如SEQ ID NO.21所示。

(6)单克隆抗体制备和纯化

将含兔单克隆抗体重链恒定区(图2)和轻链恒定区(图3)的哺乳动物细胞(如CHO)表达载体分别用NheI、XbaI和XbaI、BamHI限制性内切酶常规线性化处理。

将上述步骤中扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链可变区基因和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染72～96小时，所得转化子继续培养，收集培养液，使用protein A亲和凝胶树脂离心从离心的上清液中纯化收获识别人Caveolin-1的兔单克隆抗体，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，对纯化的人Caveolin-1蛋白的兔单克隆抗体进行氨基酸测序，于-20℃低温保存备用。

结果可知，所得兔单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，轻链互补决定区VL CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链互补决定区VL CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链互补决定区VL CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其重链互补决定区VH CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，重链互补决定区VH CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链互补决定区VH CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。并且该兔单克隆抗体，轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。

在一些检测例中，采用高表达Caveolin-1的Hela细胞(中国科学院细胞库细胞株)对上述实施例制得的人Caveolin-1蛋白的兔单克隆抗体的特异性进行了检测。取高表达Caveolin-1的Hela细胞(中国科学院细胞库细胞株)，用免疫印迹的方法检测单克隆抗体的识别特异性，进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入实施例提供的Caveolin-1兔单克隆抗体(1:10000稀释)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗(购自JacksonImmunoResearch，货号111-035-045)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL显色液，显影，曝光时长90s。结果见图4，Caveolin-1全长为178aa，理论分子量为22kd，筛选得到的人Caveolin-1蛋白的兔单克隆抗体特异性较好，检测到特异性目的条带。

在一些检测例中，采用高表达Caveolin-1的鼠肺细胞样本(6-8周c57bl/6小鼠和SD大鼠)，用免疫印迹的方法检测单克隆抗体的识别特异性，进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入实施例提供的Caveolin-1兔单克隆抗体(1:10000稀释)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗(购自JacksonImmunoResearch，货号111-035-045)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL显色液，显影，曝光时长10s。结果见图5，Caveolin-1全长为178aa，理论分子量为20kd，筛选得到的人Caveolin-1蛋白的兔单克隆抗体特异性较好，检测到特异性目的条带(两个条带分别为Caveolin-1两个剪切体，经过磷酸化和脂质化的翻译后修饰大小为24kD和21kD)。

一些检测例中，将制得人Caveolin-1蛋白的兔单克隆抗体作为一抗，采用免疫组化染色方法定性检测在人肺样本和人结肠样本中Caveolin-1。具体过程包括：

(1)芯片选择：

免疫组化芯片，货号TMA000-42，百奥斯公司。

(2)IHC染色及分析

烤片：分别将石蜡切片(人肺样本和人结肠样本)按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入至常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min。

抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)高压热修复。

内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。

封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。

一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用PBS缓冲液稀释(抗体稀释比为1:150)的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次(一抗稀释比：1:150)。

二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REAL EnVisionDetection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP；Dako)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次

显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min；

复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min；

返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；

脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥；

封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出切片扫描。

需要说明的是，免疫组化染色结果分为:阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。使用上述实施例制得的抗人Caveolin-1兔单克隆抗体作为一抗，进行免疫组化染色，结果如图6、图7所示。染色清晰且无非特异性染色，背景干净。结合免疫印迹的结果，说明抗人Caveolin-1兔单克隆抗体特异的识别人Caveolin-1蛋白，无非特异性染色，有效避免假阳性结果。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人微囊蛋白-1，所述单克隆抗体包含：

三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区（VL）的互补决定区（CDRs）：如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3；以及

三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区（VH）的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。

2.一种单克隆抗体，特异性结合人微囊蛋白-1，所述单克隆抗体包含：

如SEQ ID NO:3所示序列的轻链可变区（VL）；及

如SEQ ID NO:4所示序列的重链可变区（VH）。

3.一种单克隆抗体，特异性结合人微囊蛋白-1，所述单克隆抗体包含：

如SEQ ID NO:1所示序列的轻链；及

如SEQ ID NO:2所示序列的重链。

4.一种核酸分子，其携带有编码权利要求1~3任一所述的单克隆抗体的基因。

5.一种宿主细胞，其携带有如权利要求4所述的核酸分子，并能够进行自主表达如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体。

6.一种试剂盒，用于检测人微囊蛋白-1，所述试剂盒包括：如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒选自免疫组织化学试剂盒、免疫印迹试剂盒、免疫沉淀试剂盒。

8.如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体在制备检测人微囊蛋白-1试剂或试剂盒中的应用。