CN102816236A - 抗npc2蛋白的单株抗体以及利用其检测脂肪肝、癌细胞或癌组织的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗NPC2蛋白的单株抗体，其可辨识NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白；也关于检测脂肪肝、癌细胞或癌组织的方法，其通过检视细胞或组织中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量。
Description
技术领域
本发明涉及一种专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分，及应用其检测脂肪肝、癌细胞或癌组织的方法。
背景技术
尼曼匹克症C型（Niemann-Pick C disease）是一种脂质代谢异常的遗传疾病。过量脂类累积于病人的肝脏、肾脏、脾脏及骨髓等部位，甚至累积在脑部，造成这些部位的病变。临床上尼曼匹克症C型是因为NPC1或NPC2基因变异而导致的未脂化胆固醇或磷脂不正常的堆积在溶小体（lysosome）或晚期内体（late endosome）中。
依文献记载，NPC2蛋白是1个可溶性的150个胺基酸的胆固醇结合蛋白。NPC2蛋白会在溶小体中与胆固醇结合，因此调控体内胆固醇的平衡。此外，NPC2蛋白会在人类与鼠科动物的肝脏中表现且会分泌到胆汁中（Klein,Amigo et al.2006）。当NPC2基因发生突变时，会造成胆固醇不正常的堆积在细胞内（Frolov,Zielinski et al.2003）。且人类细胞内会因单寡糖链附着在NPC2蛋白序列的Asn58或双寡糖链附着在NPC2蛋白序列Asn58和Asn138上，而形成2种具N-Glycosylation sits的NPC2蛋白表现（Chikh,Vey et al.2004）。
1975年出现了一种制造“单株抗体”的方法，制造此种抗体的所有细胞均为来自同一细胞的子代，因此其分泌的抗体将完全一样。单株抗体技术可以由相当便宜的方法，大量生产某种专一性的抗体。单株抗体的技术是利用两个不同细胞，融合成一混种细胞称为“融合瘤”。形成融合瘤的这两种细胞各具有不同的特性，都不能单独作为开发之用。细胞其中之一是来自于一种称为“骨髓瘤”的癌细胞，这些癌细胞不同于正常细胞，骨髓瘤细胞可以无限制的培养下去。另一种则为一般负责制造抗体的浆细胞，浆细胞来自于被已知抗原免疫动物的脾脏，这类细胞在体外仅能培养数代。将骨髓瘤细胞与浆细胞融合成一个“融合瘤细胞”，此融合瘤细胞具有这两种细胞的基本特性，能够无止尽的培养增殖，且大量制造单一型态的抗体。
如何制造大量的NPC2单株抗体以通过NPC2蛋白的表现量变化检测前述疾病，成为亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明主要目的之一为开发一种专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分，其对于NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白有高度的辨识专一性。
为达上述目的，本发明提供一种专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分，其可辨识NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白。较佳地，前述NPC2蛋白的序列为：
MRFLAATFLLLALSTAAQAEPVQFKDCGSVDGVIKEVNVSPCPTQPCQLSKGQSYSVNVTFTSNIQSKSSKAVVHGILMGVPVPFPIPEPDGCKSGINCPIQKDKTYSYLNKLPVKSEYPSIKLVVEWQLQDDKNQSLFCWEIPVQIVSHL（SEQ ID NO:1）。
本发明的另一目的在于提供一种侦测脂肪肝的方法，以求早期诊断脂肪肝或治疗脂肪肝愈后的变化。
为达上述目的，本发明提供一种侦测脂肪肝的方法，其通过专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分检视细胞或组织中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量；较佳地，前述细胞系为肝细胞；较佳地，前述组织包含：血液、肝组织或其组合；较佳地，前述检视方法包含：西方点墨法、免疫沉淀法或免疫组织染色法。
本发明的另一个目的在于，提供一种侦测各种癌细胞或癌组织的方法，以达到早期侦测癌症的效果。
为达上述目的，本发明提供一种侦测癌细胞或癌组织的方法，其通过专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分检视前述癌细胞或癌组织中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量。较佳地，前述癌细胞或癌组织的癌包含：肝癌、肾癌、乳癌、大肠癌、肺癌、摄护腺癌、食道癌、直肠癌、胰癌、胃癌或子宫颈癌。较佳地，前述检视方法包含：西方点墨法、免疫沉淀法或免疫组织染色法。
本发明的另一个目的在于，提供一种简便的制造抗NPC2蛋白的单株抗体的方法，以大量制造。
为达上述目的，本发明提供一种制造抗NPC2蛋白的单株抗体的方法，其通过细胞融合法（hybridoma technique）所产生。较佳地，前述细胞融合法所使用的细胞包含NS1细胞和NS0细胞（此两种为老鼠的骨髓瘤细胞）。
综上所述，本发明提供专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分，除可辨识NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白外，也可通过侦测细胞或组织中NPC2蛋白的变化，诊断脂肪肝或癌细胞的发展，有效地达到早期诊断或愈后追踪的效果。
附图说明
图1A含有GST-NPC2表现蛋白的GEX4T-1-NPC2载体。
图1B含有His-NPC2表现蛋白的pET28a-NPC2载体。
图2为各种单株抗体对于His-NPC2和GST-NPC2的辨识效果。
图3为各种单株抗体对于小鼠附睾NPC2蛋白的辨识效果。
图4A为抗NPC2蛋白的单株抗体的有效辨识部位（pNPC2-HA全长）。
图4B为抗NPC2蛋白的单株抗体的有效辨识部位（1-80胺基酸序列）。
图4C为抗NPC2蛋白的单株抗体的有效辨识部位（41-105胺基酸序列）。
图4D为抗NPC2蛋白的单株抗体的有效辨识部位（81-151胺基酸序列）。
图5为NPC2单株抗体（3-6B）抗原决定区的侦测。
图6为单株抗体3-6B对其中NPC2蛋白的辨识效果。
图7为以苏木紫伊红染色检测MCD喂食的小鼠的肝组织结果。
图8检测MCD喂食的小鼠的血清ALT值结果。
图9为MCD喂食的小鼠的肝组织醣基化NPC2蛋白的表现量。
图10为以抗NPC2的单株抗体检测MCD喂食的小鼠的肝组织免疫染色结果。
图11为以抗NPC2的单株抗体检测MCD喂食的小鼠的血清NPC2蛋白的表现量。
图12为脂肪肝及肝癌病人的肝组织NPC2蛋白表现量的比较。
图13为乳癌病人的NPC2蛋白表现量的比较。
图14为大肠癌病人的NPC2蛋白表现量的比较。
图15为肺癌病人的NPC2蛋白表现量的比较。
图16为摄护腺癌病人的NPC2蛋白表现量的比较。
图17为肾癌病人的NPC2蛋白表现量的比较。
图18为肝癌病人的NPC2蛋白表现量的比较。
具体实施方式
本发明所开发的专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分，可通过西方点墨法、免疫沉淀法、免疫组织染色等方式，来检测检体或生物体、病患之脂肪肝或各种癌的发展。本发明的专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分对于NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白有高度的辨识专一性。其中，前述NPC2蛋白之序列为：
MRFLAATFLLLALSTAAQAEPVQFKDCGSVDGVIKEVNVSPCPTQPCQLSKGQSYSVNVTFTSNIQSKSSKAVVHGILMGVPVPFPIPEPDGCKSGINCPIQKDKTYSYLNKLPVKSEYPSIKLVVEWQLQDDKNQSLFCWEIPVQIVSHL（SEQ ID NO:1）。
本发明之侦测脂肪肝的方法，通过专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分检视细胞或组织中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量；所检视的组织可为各种组织，包含，但不限于血液、肝组织，而前述细胞也可为各种细胞，包含，但不限于肝细胞。
本发明的侦测癌细胞或癌组织的方法，通过专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分检视前述癌细胞或癌组织中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量。前述癌细胞或癌组织可为各种癌，包含，但不限于：肝癌、肾癌、乳癌、大肠癌、肺癌、摄护腺癌、食道癌、直肠癌、胰癌、胃癌或子宫颈癌。
本发明所使用的检视方法可为各种习知惯用的方法，包含，但不限于：西方点墨法、免疫沉淀法或免疫组织染色法。
本发明的另一个目的在于提供一种简便的制造抗NPC2蛋白的单株抗体的方法，以大量制造。
综上所述，本发明提供专一性结合NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的单株抗体或其抗原结合性部分，除可辨识NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白外，也可通过侦测细胞或组织中NPC2蛋白的变化，诊断脂肪肝或癌细胞的发展，有效地达到早期诊断或愈后追踪的效果。
实施例一、制备抗NPC2蛋白的单株抗体
将纯化的GST-NPC2和His-NPC2蛋白与Freund’s完全佐剂和不完全佐剂混合分别用以作为初次免疫反应和追加注射，所产生的混合物作为抗原，其如图1A和图1B所示，其为所构筑的分别含有GST-NPC2和His-NPC2表现蛋白的pGEX4T-1-NPC2和pET28a-NPC2载体。使用His-NPC2RP作为筛选GST-NPC2RP所产生的抗体的抗原，并使用GST-NPC2RP作为筛选His-NPC2RP所产生的抗体的抗原。本实施例所制备的抗NPC2蛋白单株抗体是使用细胞融合法。
将融合细胞培养于96-well的培养盘，使用HAT培养基培养，收集悬浮液，使用重组蛋白GST-NPC2和His-NPC2进行酵素免疫分析试验（enzyme immunoassay,EIA）筛选。培养出的细胞接种至BALB/c鼠腹腔（此鼠已先注射了0.5毫升之Freund’s不完全佐剂），接着收集鼠的腹水，再以protein-A抗体纯化套组搭配Centricon Plus-80管柱收集并纯化抗体。
所收集到的单株抗体如表一所示：
表一本发明各种NPC2蛋白的单株抗体
实施例二、确认实施例一的各种抗NPC2蛋白的单株抗体的辨识效果取鼠的附睾细胞（已知会表现NPC2蛋白的细胞），利用西方点墨法检测实施例一所制得的各种单株抗体对于His-NPC2和GST-NPC2的辨识效果，结果如图2所示。
图中，由左至右分别为14-8D、5-5B、阴性对照组、5-4B、4-12C、3-6B、阳性对照组、2-7B、1-5B和1-2G的结果，图中，GST-NPC2和His-NPC2之分子量分别于43和17处。结果显示，本发明各种单株抗体对于醣基化NPC2和His-NPC2都有良好的辨识效果。
此外，取鼠的附睾细胞（已知会表现NPC2蛋白的细胞），利用西方点墨法检测实施例一所制得的各种单株抗体对于NPC2蛋白的辨识效果，结果如图3所示。图中，由左至右分别为14-8D、5-5B、5-4B、4-12C、阳性对照组、3-6B、2-7B、1-5B、1-2G和阴性对照组的结果。结果显示，本发明各种单株抗体对于NPC2都有良好的辨识效果。
实施例三、利用抗NPC2蛋白的单株抗体的有效辨识部位
将pNPC2-HA（包含pNPC2-HA全长、N-端（1-80胺基酸序列）、41-105胺基酸序列、C-端（81-151胺基酸序列））转殖至293T细胞中，24小时后，取前述细胞做为西方点墨法用检体，使用实施例一所制备之各种单株抗体，定位各种单株抗体的有效辨识部位。观察全长的pNPC2-HA全长、N-端（1-80胺基酸序列）、41-105胺基酸序列、C-端（81-151胺基酸序列）的辨识能力，结果分别如图4A～图4D所示。
图中箭号所指为本发明单株抗体应辨识到的部位，而编号1至9分别代表单株抗体1-2G、1-5B、2-7B、3-6B、阳性对照组、4-12C、5-4B、5-5B和14-8D的侦测结果。结果显示，所有单株抗体都可辨识全长和N-端（1-80胺基酸序列）的pNPC2-HA，相对此，41-105胺基酸序列、C-端（81-151胺基酸序列）并非本发明各种抗NPC2的单株抗体所辨识的部位。
综上所述，本发明的各种抗NPC2的单株抗体可辨识NPC2蛋白的1-40胺基酸序列，其胺基酸序列为：
MRFLAATFLLLALSTAAQAEPVQFKDCGSVDGVIKEVNVS（SEQ IDNO:2）。
实施例四、NPC2单株抗体（3-6B）抗原决定区的侦测
利用Peptide Screening的方法去寻找Niemann-Pick type C2（NPC2）单株抗体（3-6B）的抗原决定区。针对NPC2（1-40个胺基酸序列）合成4段长度为10个胺基酸的胜肽（Peptide），并涵盖NPC2蛋白N端1-40个胺基酸序列。接着利用酵素免疫分析法（EIA）来寻找可能的抗原区域。
将合成完成的peptide以10ug/ml的浓度（in 68mM NaHCO3+32mMNaCO3,PH9.6）coat在EIA 96well plate；以2%BSA in PBST block，使用一级抗体3-6B，于37℃作用1小时，之后以PBST（PBS+0.05%TWEEN20）wash 4次，加入Anti-mouse IgG HRP（1:3000）二级抗体于37℃作用1小时，以PBST（PBS+0.05%TWEEN 20）wash 4次后，加入OPD避光呈色，最后加入3N HCl中止反应，使用ELx808酵素免疫分析仪，于波长490nm侦测吸光值。
实验结果看到NPC2单株抗体（3-6B）在peptide NPC2-3140的OD490分别为1.716、1.607,而其他片段则低于0.1（表二）。将量测的OD490取平均值后以柱状图呈现（图5）。
因此，NPC2单株抗体（3-6B）抗原决定区为NPC2的N端31-40胺基酸，其胺基酸序列为：DGVIKEVNVS（SEQ ID NO:3）
表二NPC2单株抗体与胜肽的免疫酵素反应
实施例五、观测单株抗体3-6B的辨识敏感度
为观察单株抗体3-6B对于NPC2蛋白的辨识敏感度与特异度，利用已知会表现NPC2蛋白的Sk-hep1细胞，再将shNPC2转殖至Sk-hep1细胞中，使之不表现NPC2蛋白，取转殖载体（无携带shNPC2基因，做为对照组）和shNPC2各一组，分别进行西方点墨法，观测单株抗体3-6B对其中NPC2蛋白的辨识效果，结果如图6所示，并有α-蛋白质微管（α-tubulin）的测定做为定量的对照组。
结果显示，3-6B可侦测到转殖载体的细胞中之NPC2，而转殖了shNPC2的细胞因不会表现NPC2蛋白，而3-6B不会侦测结果不会显示条带（band）。
综上所述，3-6B单株抗体对于NPC2蛋白有高度的辨识敏感度。
实施例六、以抗NPC2之单株抗体检测MCD喂食的小鼠的肝组织和血清
已有报导指出，喂食不足量之甲硫氨酸和胆碱（methionine and chlionedeficient,MCD）的小鼠中，会产生脂肪肝（hepatic steatosis）和脂肪性肝炎（steatohepatitis），其类似于人类的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis），因此使用这种处理的小鼠做为本发明抗NPC2的单株抗体的检测对象。
将雄鼠及母鼠以MCD喂食1、2和5周后，取其肝组织，以H&E染色法观察之，其结果如图7所示。
图中，上排为雄鼠，下排为雌鼠，而自左至右分别为未喂食、喂食MCD2周后、喂食MCD5周后的肝组织。喂食MCD2周后，可观察到有脂肪化的现象，而5周后，有发炎浸润（inflammatory infiltration），如箭号所示。
接着，观察前述处理的小鼠的ALT值（Alanine aminotransferase）的变化，其结果如图8所示，纵轴单位为U/L（U=unit，L=liter）。由图可知，无论在雄鼠或雌鼠，随MCD喂食时间越久，其血清中的ALT值越高。
接着，观察前述处理之雄鼠和雌鼠的肝细胞萃取物，以稀释1/2000倍的3-6B单株抗体，利用西方点墨法观察其中醣基化NPC2蛋白的表现量，其结果如图9所示。由图可知，随MCD喂食时间越久，其肝细胞中的醣基化NPC蛋白含量越高。
此外，取未处理和MCD喂食5周的小鼠的肝组织，以稀释1/200倍的3-6B单株抗体，进行免疫组织染色，其结果如图10所示。图中可观察到因MCD喂食引起的脂肪肝组织中，有空洞增大的组织，其NPC2表现增加。
另一方面，取未经处理和前述处理5周的雄鼠和雌鼠的血清，以稀释1/2000倍的3-6B单株抗体，利用西方点墨法观察其中NPC2蛋白的表现量，其结果如图11所示。由图可知，随MCD喂食时间越久，其血清中的NPC蛋白含量越高。
实施例七、人类脂肪肝和肝癌组织的NPC2蛋白的免疫组织染色取46位患有脂肪肝和50位患有肝癌的人类肝组织进行NPC2蛋白的免疫组织染色，结果分别如图12上排及下排所示。
上排自左至右分别为放大200倍、放大400倍的正常和脂肪肝组织的免疫组织染色图。其中，箭号所示为NPC2蛋白染色处。
下排为肝癌前期的免疫组织染色图，自左至右分别为放大200倍的肿瘤及肿瘤邻近组织、放大400倍之肿瘤邻近组织和放大400倍的肿瘤。其中，箭号所示为NPC2蛋白染色处。
统计前述所有病患之免疫组织染色结果，如下表所示：
表三、人类脂肪肝和肝癌组织之NPC2蛋白免疫组织染色结果
注：S为脂肪组织，S为脂肪周围组织，T为癌症组织，TA为癌症周围组织结果显示，在所有脂肪肝病患的组织染色结果中，与正常的检体比较，有41位（73%）的NPC2蛋白表现量增加，10位（18%）的NPC2蛋白表现量无显著变化，而有5位（9%）的NPC2蛋白表现量减少。统计50位肝癌病患的肿瘤（tumor tissue,T）和肿瘤邻近组织（tumor-adjacent tissue,TA）的NPC2蛋白表现量，结果显示，有36位（72%）的病患中，肿瘤组织的NPC2蛋白的表现量比肿瘤邻近组织表现量低。
综上所述，由NPC2蛋白的表现量可以看出脂肪肝和肝癌的发展情况。这对慢性肝病来说，提供了良好的检测依据。因此，本发明所开发的抗NPC2单株抗体可做为检测肝病用。
实施例八、人类各种癌组织之NPC2蛋白的免疫组织染色
为求理解人类各种癌组织中，NPC2蛋白的表现量，取23位乳癌病患、38位大肠癌病患、44位肺癌病患之癌组织与其所对应之正常组织；及60位摄护腺癌病患的癌组织与9位正常人的摄护腺组织，进行NPC2蛋白表现量的比较，其结果分别如图13～图16所示，并分别统计如表四～表七所示。
表四、乳癌病患及正常人类的乳房组织的NPC2蛋白表现量比较
| N=23 | 肿瘤>正常 | 肿瘤=正常 | 肿瘤<正常 | P value |
| N（%） | 18（78%） | 4（17%） | 1（4%） | <0.01 |
表五、大肠癌病患及正常人类的大肠组织的NPC2蛋白表现量比较
| N=38 | 肿瘤>正常 | 肿瘤=正常 | 肿瘤<正常 | P value |
| N（%） | 18（47%） | 14（37%） | 6（16%） | 0.0045 |
表六、肺癌病患及正常人类之肺组织的NPC2蛋白表现量比较
| N=44 | 肿瘤>正常 | 肿瘤=正常 | 肿瘤<正常 | P value |
| N（%） | 36（82%） | 5（11%） | 9（20%） | <0.01 |
表七、摄护腺癌病患及正常人类的摄护腺组织的NPC2蛋白表现量比较
以上结果显示，相较于正常组织而言，NPC2蛋白在乳癌、大肠癌、肺癌和摄护腺癌组织中，表现量均增加。
另一方面，取33位肾癌病患和50位肝癌病患的癌组织，与其所对应的正常组织进行NPC2蛋白表现量的比较，其结果分别如图17～图18所示，并分别统计如表八至表九所示。
表八、肾癌病患及正常人类的肾组织的NPC2蛋白表现量比较
| N=33 | 肿瘤>正常 | 肿瘤=正常 | 肿瘤<正常 | P value |
| N（%） | 2（6%） | 0 | 31（94%） | <0.001 |
表九、肝癌病患及正常人类之肝组织的NPC2蛋白表现量比较
| N=50 | 肿瘤>正常 | 肿瘤=正常 | 肿瘤<正常 | P value |
| N（%） | 2（4%） | 12（24%） | 36（72%） | 0.02 |
以上结果显示，相较于正常组织而言，NPC2蛋白在肾癌和肝癌组织中，表现量均减少。
另外，与正常组织相比较，NPC2蛋白在直肠癌、胰脏癌、食道癌、胃癌、卵巢癌和子宫颈癌组织中，表现量无差异。
综上所述，由NPC2蛋白表现量的改变，可以看出各种癌症的发展情况，可做为一指标。因此，本发明所开发的抗NPC2单株抗体可做为检测各种癌症用。
以上所述只是通过较佳实施例详细说明本发明，但不应该以此限定本发明专利实施的范围，所属领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围下，相对所述实施例进行的等同变化和改进，都应该属于本发明所保护的技术范围。
Claims (12)
1.一种专一性结合NPC2蛋白质的单株抗体，其特征在于，该单株抗体系专一性辨识NPC2蛋白质序列N端1-40胺基酸（SEQ NO.2）。
2.根据权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，NPC2蛋白更包含醣基化NPC2蛋白质。
3.根据权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该单株抗体专一性辨识NPC2蛋白质序列N端1-40胺基酸中的N端31-40胺基酸（SEQNO.3）。
4.一种检测一个体具脂肪肝的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：
（A）提供一个体的生物样本；以及
（B）根据权利要求1所述的单株抗体检测该生物样本中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量，该表现量相较于正常生物样本表现量高时，表示该个体罹患脂肪肝。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，前述细胞为肝细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，前述生物样本包含：血液、肝组织或其组合。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，前述检视方法包含：西方点墨法、免疫沉淀法或免疫组织染色法。
8.一种侦测一个体具癌症的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：
（A）提供一个体的生物样本；以及
（B）根据权利要求1所述的单株抗体检测该生物样本中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量，该表现量相较于正常生物样本表现量高时，表示该个体罹患癌症。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，前述癌症包含：乳癌、大肠癌、肺癌或摄护腺癌。
10.一种侦测一个体具癌症的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：
（A）提供一个体的生物样本；以及
（B）根据权利要求1所述的单株抗体检测该生物样本中NPC2蛋白或醣基化NPC2蛋白的表现量，该表现量相较于正常生物样本表现量低时，表示该个体罹患癌症。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，前述癌症包含：肝癌或肾癌。
12.根据权利要求8或10所述的方法，其特征在于，前述侦测方法包含：西方点墨法、免疫沉淀法或免疫组织染色法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121212 |