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KR102695056B1 - 잉어허피스 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스 바이러스 검출용 조성물 - Google Patents

잉어허피스 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스 바이러스 검출용 조성물 Download PDF

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KR102695056B1
KR102695056B1 KR1020230159254A KR20230159254A KR102695056B1 KR 102695056 B1 KR102695056 B1 KR 102695056B1 KR 1020230159254 A KR1020230159254 A KR 1020230159254A KR 20230159254 A KR20230159254 A KR 20230159254A KR 102695056 B1 KR102695056 B1 KR 102695056B1
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South Korea
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khv
herpes virus
monoclonal antibody
antibody
detecting
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정지민
권문경
김수미
황지연
김정미
이원영
강인
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대한민국
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Abstract

본 발명은 잉어허피스바이러스(KHV)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스바이러스 검출용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 KHV 항체를 포함하는 진단 키트를 사용하면, 많은 개체의 감염이 발생하기 전 신속하게 KHV를 진단할 수 있어, 양식어민의 피해를 최소화하고, 방역기관의 초기대응을 신속하게 진행할 수 있다.

Description

잉어허피스 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스 바이러스 검출용 조성물{Comosition for Detecting Koi Herpes Virus Contiaining Monoclonal Antibody Specific for Koi Herpes Virus}
본 발명은 잉어허피스 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스 바이러스 검출용 조성물에 관한 것으로 더욱 자세하게는 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 잉어허피스 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 포함하는 잉어허피스 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
잉어허피스바이러스병(KHVD, koi herpes viral disease)은 잉어과 어종에서 전염성이고 급성으로 발병하는 바이러스감염증으로 헤르페스바이러스 감염을 말한다. 일반적으로 KHV 감염은 잉어(Cyprinus carpio carpio), 비단잉어(Cyprinus carpio koi)와 ghost carp (Cyprinus carpio goi) 및 이들의 교잡종에서 발생한다고 알려져 있다.
잉어허피스바이러스는 다른 cyprinid 헤르페스바이러스의 명명법에 따라 cyprinid herpesvirus-3(CyHV-3)이라고도 불린다. KHV의 게놈 크기 295kbp 이며, 바이러스 뉴클레오캡시드는 직경이 100-110nm로 외피에 둘러싸여 있다(Ilouze et al., Ecol. Res., 26:885, 2011).
KHVD는 온도에 영향을 많이 받으며, 수온 16~25℃ 사이에서 발생한다. 모든 연령대의 물고기가 KHV에 취약한 것으로 보이지만, 2.5~6g의 물고기가 230g의 물고기보다 더 감수성이 높게 나타났다. 아가미, 신장 및 비장은 감염 과정동안 KHV가 가장 많이 존재하는 기관들이다. 이 질병이 발병하면 사망률이 눈에 띄게 증가하며, 아가미 출혈, 점액과도 후 아가미 조직 괴사, 거의 대부분의 병어에서 안구 함몰이 관찰되며, 폐사직전 병어는 무기력하며, 평형감각이 상실되며, 아가미나 피부에 퇴색된 부분이 생긴다. 특이하게 피부에 충혈이나 궤양이 형성되지는 않으며, 방향감각을 잃어 과민증상을 보이기도 한다. 또한, 병어가 무리에서 분리되고 주수구에 모여들거나 못 가장자리나 수면에서 입질을 한다. 개체별로 면밀히 관찰하면, 색깔이 창백해지거나 표피가 붉어지며 체표가 거칠어지고, 국소적이거나 전반적인 상피 소실, 피부나 아가미의 점액이 과잉되거나 부족한 증상을 나타낸다. 이 바이러스는 자외선 조사 또는 50℃ 이상에서 1분간 열처리하면 불활성화 된다.
임상적으로 감염된 어류의 KHVD 진단은 여러 가지 방법이 있으나, 가장 일반적으로 사용되는 방법은 KHV에 특정한 PCR 기반 분석법이다. KHVD은 OIE 지정 전염병 중 하나로 국내는 제3종 수산생물법정전염병으로 인간에게는 영향이 없지만, 잉어 및 비단잉어에 감염되어 피부 출혈 및 아가미 괴사 등의 증상을 보이며 폐사로 이어져 큰 피해를 야기한다고 알려져 있다.
세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE) 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code)의 기준에 따른 일반적인 종래 PCR(conventional PCR)법을 수행하여 PCR 증폭산물을 전기영동으로 확인한 다음, 증폭산물을 클로닝하고 다시 정제된 플라스미드 DNA의 염기서열을 확인하여 진단하고 있다. OIE 기준에 따라서 PCR 증폭산물의 전기영동 확인 시 객관적인 분석이 불가능하거나(gray zone), 희미한 PCR 증폭산물을 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후 시퀀싱을 통하여 상기 증폭산물의 염기서열을 재확인하는 등의 검증 단계를 거친다. 이러한 검증 단계는 비특이적 산물(non-specific PCR band)의 서열을 확인하여 검증하는 방식으로 분석 절차가 많고 많은 시간을 소모하는 등의 문제점을 가지고 있다. 특히, 종래 PCR법에 의해 증폭산물이 양성으로 확인되면(시퀀싱 판정 이전), 수산생물전염병의 감염이 우려되는 경우에 해당되어 방역조치를 취하게 됨에 따라, 이후 시퀀싱에 따라 위양성으로 판정되는 경우 검사기관의 신뢰성 하락 및 어업인의 피해발생 사례도 있으므로, 신속, 정확하게 법정 전염병을 진단하는 방법의 개선이 절실하다. 이처럼 결과분석에 장시간 소요되는 PCR 방법의 문제점을 개선하고 현장에서 신속예찰이 가능한 진단키트의 도입이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 현장에서 전문가 또는 전문장비의 도움없이 KHV를 신속하게 진단하는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, KHV에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 이를 함유하는 KHV 진단 키트를 제작하고, 상기 키트를 이용하여, 많은 개체의 감염이 발생하기 전 신속하게 KHV를 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 잉어허피스 바이러스(KHV)의 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 잉어허피스 바이러스(KHV)의 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잉어허피스 바이러스(KHV: Infectious myonecrosis virus) 항원 포획을 위한 1차 항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 2차 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물에 있어서,
상기 잉어허피스 바이러스 항원 포획을 위한 1차 항체는 기탁번호 KCTC15651BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 잉어허피스 바이러스에 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6C7인 것을 특징으로 하는, 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 검출용 조성물을 포함하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6C7를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC15651BP)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 하이브리도마 세포주(KCTC15651BP)에 의해 생산되고 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 6C7를 제공한다.
본 발명은 또한, 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6G8을 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC15648BP)를 제공한다.
본 발명에 따른 KHV 항체를 포함하는 진단 키트를 사용하면, 많은 개체의 감염이 발생하기 전 신속하게 KHV를 진단할 수 있어, 양식어민의 피해를 최소화하고, 방역기관의 초기대응을 신속하게 진행할 수 있다.
도 1은 재조합 항원 단백질 정제 결과를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다(레인 1: ORF68 레인 2: ORF72).
도 2는 KHV 바이러스 2종을 슈크로오스 구배(sucrose gradient)법으로 초원심분리에 의해 분리하는 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 분리된 KHV Tp4 바이러스를 SDS-PAGE(A)와 웨스턴 블럿(B)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 항원 단백질 2종을 투여한 마우스의 항체 역가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 선정된 단클론 항체 10종의 KHV 배양액에 대한 반응성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 선정된 단클론 항체 중 6종의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 잉어과 어종에서 급성 전염증을 유발하는 잉어허피스 바이러스(KHV)를 효과적으로 진단할 수 있는 키트를 제작하기 위하여, 2종 유전자(ORF68 및ORF72)가 코딩하는 단백질, 6종의 KHV 펩타이드 및 2종의 바이러스(KHV TP4 및 KHV F03/16)을 KHV 항원으로 사용하여, 면역화시킨 마우스 비장세포와 마우스 골수종 유래 세포를 피더세포 존재하에서 융합시켜, KHV 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작하고, 상기 하이브리도마 세포 중 KHV에 반응성 있는 클론 40종을 1차 선별하였다. 이후 Isotype 및 민감도 테스트를 통해 10종의 단클론 항체 2차 선별하고, 이들 항체 중 페어링 테스트를 통하여 캡처 항체 6C7과 CGC 2차 항체 6G8을 선별하였다. 상기 항체에 대한 하이브로도마 세포를 마우스에 주사하여 KHV 단클론 항체를 제작하였다. 상기 제작된 KHV 단클론항체를 이용하여 측방유동면역분석법(LFIA: Leteral Flow Immuno Assay)을 이용한 신속진단키트를 제작하였으며, 상기 제작한 진단 키트는 KHV를 높은 정확도로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 잉어허피스 바이러스(KHV: Infectious myonecrosis virus) 항원 포획을 위한 1차 항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 2차 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물에 있어서,
상기 잉어허피스 바이러스 항원 포획을 위한 1차 항체는 기탁번호 KCTC15651BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 잉어허피스 바이러스에 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6C7인 것을 특징으로 하는, 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 2차 항체는 기탁번호 KCTC15648BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 잉어허피스 바이러스에 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6G8인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 검출표지는 비오틴(biotin), HRP(horseradish peroxidase), 염기성탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocya nate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6C7를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC15651BP)에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 하이브리도마 세포주(KCTC15651BP)에 의해 생산되고 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 6C7에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6G8을 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC15648BP)에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 하이브리도마 세포주(KCTC15648BP)에 의해 생산되고 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 6G8에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물을 포함하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출표지와 상기 검출표지의 활성 측정용 시약은 반응에 의해 발색, 형광, 발광 특성 중 어느 하나를 나타내어 이를 측정하기 위함으로 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 검출표지와 각 검출표지에 따른 활성 측정용 시약을 사용할 수 있다.
본 발명의 KHV 진단 시약은 상기 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 단클론항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약 외에 일반적인 면역측정법에 사용되는 시약이 추가로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로는, 항체 고정용액, 항원 고정용액, 블로킹 용액, 가검시료 희석제, 혈청 반응 및 항체의 비특이 반응을 제거하기 위한 세척액, 테스트의 유효성을 검증하기 위한 양성 및 음성 대조시약, 상기 검출표지의 활성 측정을 위한 반응을 정지시키기 위한 정지액 등이 포함될 수 있다. 또한, 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 고체상 지지체, 즉, 플레이트, 마이크로플레이트 웰, 플라스틱 시험관, 유리 비드, 플라스틱 비드 등도 포함될 수 있다.
본 발명의 KHV 진단 키트는 상기 본 발명의 KHV 진단 시약을 포함하여 이루어지는 키트일 수 있다.
본 발명의 KHV 진단 또는 KHV 바이러스 중화항체 검출방법은 효소면역분석법(Enzyme immunoassay, EIA) 또는 방사선면역분석법(Radio immunoassay, RIA)을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 효소면역항체 분석법을 사용한다. 그러나, 상기 검출방법에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 KHV 바이러스 중화항체 검출용 단클론항체, 진단용 항원 포획용 단클론항체와 진단용 KHV 바이러스 항원의 복합체 및 피검체로부터 채취한 가검시료를 반응시켜 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 방법이라면 어느 방법도 사용가능하다.
상기 가검시료는 피검체로부터 채취한 생물학적인 시료를 의미한다. 세포간 체액이나 혈청을 사용하는 것이 바람직하고, KHV 바이러스의 항원 또는 상기 KHV 바이러스에 대한 자가 항체가 정제되도록 처리한 시료를 채취하여 사용한다.
보다 구체적인 본 발명의 KHV 진단 방법은 고체상 지지체에 항원 포획을 위한 단클론항체를 고정하는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계; 상기 고체상 지지체에 KHV 바이러스 진단용 항원을 반응시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계; 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 상기 KHV 바이러스 진단용 항원과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론항체는 하이브리도마 세포주 KHV 6C7에 의해 생산되고, KHV에 면역반응성을 나타내는 단클론항체를 사용한다.
본 발명의 검출용 키트는 바람직하게는 항원-항체 반응을 이용한 측방유동면역분석법(LFIA: Leteral Flow Immuno Assay)을 이용한 신속진단키트일 수 있다.
측방유동면역분석법(LFIA: Leteral Flow Immuno Assay)은 지지대인 백킹카드(backing card)위에 샘플패드(sample pad), 접합패드(conjugate pad), 멤브레인(membrane) 및 흡수패드(absorbent pad)가 부착된 형태로 구성되어 있다.
측방유동면역분석법의 원리는 멤브레인과 접합패드에 목표물질인 항원(KHV)에 대한 특이항체가 고정화 및 분주되어 있으며, 샘플패드로 주입된 시료내 항원(KHV)이 모세관현상을 통한 측방유동 과정에서 접합패드의 “항체-나노금입자 접합체“와 1차 결합하여 ”항원-항체 접합체“를 형성한 다음 멤브레인의 T-line(test line)에서 고정된 항체와 2차 결합하면서 “항체-항원-항체 접합체“를 형성한다. 항원(KHV)의 농도가 높을수록 T-line에 결합하는 ”항체-항원-항체 접합체”의 수가 증가하고, 항체 접합체의 나노금입자의 수가 증가하면서 분홍색 또는 보라색의 육안으로 판별 가능하게 된다. 판정 방법은 테스트 결과 C-line(Control line)만 발색한 경우 음성으로 판정하며, C-line과 T-line 모두 발색한 경우 양성으로 판정한다.
KHV 신속진단키트의 장점은 기존의 높은 비용과 고가의 장비를 활용한 real-time PCR기법보다 저렴한 비용과 5~10분내의 짧은 결과 판독시간이 소요되며, 비숙련자가 실험하여도 숙련자가 실험한 기법과 동일한 검사결과를 활용할 수 있어 현장적용에 있어 여러면에서 장점을 갖는다.
본 발명의 진단키트는 현장 사용의 편의성을 위하여 키트 패키지 타입으로 구성될 수 있으며, 구성 물품으로는 KHV 신속진단키트, 완충용액, 간이 분쇄기, 간이 스포이트를 포함할 수 있다.
본 발명은 수산생물질병의 상시 예찰 및 법정전염병 모니터링을 위한 진단시스템 개발을 통하여 수산양식 산업의 피해를 최소화하고 바이오 신소재를 활용한 대응체계 마련에 방향을 제시하는 등 효과적인 수산방역체계 강화에 기여할 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: KHV 바이러스에 대한 재조합 항원 제작
재조합 항원단백질 선정
KHV 관련논문(J Gen virol. 91:452-462, 2010; J Fish Dis., 00:1-9, 2020)을 참조하여 ORF자리 156개 중에서 ORF68와 ORF72, 총 2종 염기서열을 선정하였으며, KHV 비리온에서 많이 존재하는 단백질 3종에 대한 펩타이드 6종을 선정하였다.
선정된 재조합 항원 2종 염기서열에 대하여 코돈 최적화를 진행 후 유전자 합성을 진행하였고, 상기 선정된 펩타이드 6종에 대한 유전자 합성을 진행하였다.
(가) ORF68 (서열번호 1)
Gene size : 1548 bp
GGATCCGATCAGTTCAAGCAGACCACGGCCGAGCTGGCCGGCATCAAGGCCGACGCTCAGAGCGTCGCCGACGCCATCAAGGCGGCGAACGACGAGCACCAGAAGACCAAGGATGCCCTGGCCCACACGCAGAGCGCCTACGACCTGACCATGGAGCAGGTCAACGAGTACCAGGCCAAGCTCCAGGCCAGCGAGGCCGCGCTCAAGGAGGCGCACGACACGGCCAAGGCCAACATGACCGTCAAGGCCCAGTCGCGCATCTCCGAGCTCGAGGCCGAGGCCGTGCTGGGCCGCGACACCATGAAGGTCAAGGACGCCGAGGTGCGGGACCTCAAGACCAAGCTGGCCAGCGCCAAGAACGAGACGGCCGCAGCGCTCAGCCGCCTCGCGGACAAGGAAGACGAGATCGAGACGCTGGCCAAGACGCTCGCCGACGCCGTCGAGAGCGCCAAGCAGCAGAACGAGACCATCGGCCGCAACGCCGCAGAGTCCATCAAGGACCTGGCGCTCAGGCTCAAGCGCCAGGAGGAGCTCGCCAAGGACGCCGAGGCCAACCTCGCGAACGTGACCCGGGACCTCGAGCGGCGCATGAAGGAGCAGGCCGAGGAGTACAACAACAACGAGCTCAACTACGCCGCCGCCCTCACCGCCTTGCAGCAGTCGTCCAAGGAACTGGAGCAACAGCTGGCCGACGCGCGACGCCAGCTCGCCCAGGCCCAGGCCCAGGCCCAGGCCCAGGCCGCTCAACCTCAACCCCAGCCACCCGCTCAACCCCAGGCGGCCGCTCAGCCACCCGCTCAACCCCAGGCCGCTCAGGCACCCGCTCAACCCCAGCCACCCGCTCAAGCTCAACCCCAGGCCGAGCAGCCACCCGCCGCTCAACCCCAAGCGCAGGCGGCGGCGGTCATCGCGCAAGGCGTCACTGAGGCCGCCTCCGTCGCGGACGATGGCGAGACGCCCATGGAGGAGATTGAGCCGCCCGAGTACGAGCCTCCGGCCGGCGGCGTCGAGTACGAGCCCGACATGGAGATCGAGATGCCGCCCGCCGCCTTCGACCCCGAAGAGTACCGCAAGTCCCAGGAGCGCAAGAAGCTCGAGGAGAGCGCCCGCGCCAACCCCAACCTCGTGCGCAAGCCGACTCCCAAGGTCAACATGTTCGACTTTATGCAGTCCATCAAGAAGCCGGTGCCCGAGACGGTGGAGGCCCTCAAGGCCCGGGTGAAGGAGCTGGAGATGATGCTGAAACTGGTGTACGATGAGCTCACGCGGGTCAACGCCGAGCGCTACCAGGAGGCGGCCACCCGCTGCATGGCGGCCGAGAACTTCAAGCGCCAGATCAAGGACCTGCGCTCCAAGAACGTCGCGCTCAGGGACAAGCTCGAGGAGGCCCGGCTCCGCTTCGAGCTGGACAAGCTCACCTACGAGAACGACTACGCCAAGCAGATGTACAAGTTCCAGGAGAACATCAAGGTCGAGTACAAGGGCAGCGTCGACATGGTGGACCAGCTGAAGCGCGAGAACTCCAGGCTCGAGTCGCAGTGAGAATTC
(나) ORF72 (서열번호 2)
Gene size : 1122 bp
GGATCCATGTATGGCCTGAACAGCGCGAGCGGCTTTCTGGATACCGAATGGGTGGAAAAACAAGGCATGGTGACCCCGCCGGAAGAAGTGGCGAAAATGCTGAACCCGCATCTGGCGACCATGGGCAAACCGGTGGATGTGACGAGCCTGATGCTGCCGAACGGCATTTTTGTGCCGTATACCCCGACCGGCCCGGAACCGAACATTGCGATTGGCGGCGGCTATTTTTATCGCCCGAGCTATCATGGCTATGGCAGCGTGGCGGAAGATAGCGATGATCTGCAGAAACTGCATAAAAACGTGCTGTGCCGCAACGAAGGTCAGTGGACCCGCACCGCGCTGATTGGCGTGCCGACCACCGGCAACTTTCCGGTGGATCTGTTTGATTATAAAAATCAGAAATATCAGATTGTGAACACCGGCCCGGATGCGCTGCATAGCGGCGATGCGTTTATGGTGGAACCGCCGAGCGTGGAAGCGAGCAAAGCGCAGATTGATAGCTTTAAACGTATTCGCGCGCAAGGCTCTTTTCGTCAGCCGACCCTGTTAGGCGGCCTGAGCGCGACCAACCGCGTGCCGAGCGAACTGACCCATCGCATGAAACATATTATGGCGCGCGATATTGGCCTGTGCATGGATATTACCACCCCGGGGCAAGGCGGCGTACAAGCGGGCCTGGCGCGACTTTATCAAGCGCCGACCGAACTGGGCCAAGCGGTGAAAAACAGCGTGATGGCGACCACCCTGGATTGCATGAACAGCCTGGATGTGATTTTTAGCATGATGCGCCGCATTGCGGCGCTGCCGCGCGGCGTGCTGGAAACCCTGGCGGAATTTCATAACTTTAAACATGGCGGCCCGAACGCGACCATGCCTGATCCGGCGATTCTGATTGAAATTTGGCGCACCCCGGCGGTGGCGGATCTGTTTATGGAAAGCATGGATATGGGCTTTCAGAGCATTGATCGCCTGCGCCATTGCACCTATGGCACCGTGATTAAAAGCACCGAAGCGAACCCGACGAGCACCCGCGGCGAAATTATTTATAACGCGTATAGCGGTCAGTATGATACCGGCGATACCTTTGAAGGCGCGGTGCTGAGCTTTAACGGCTATCTCGAG
KHV 펩타이드 6종의 정보
Lane Sample Name Sequence
1 ORF57 p57-1 SCDCLCCRRQG(서열번호 3)
2 p57-2 FDDCACDVHVLRHV(서열번호 4)
3 ORF92 p92-1 RYAVVPLGVLGQGVYFPASFIRNV(서열번호 5)
4 p92-2 MDSVTLPAVVVSGGAVVPFILFDGQPICRD(서열번호 6)
5 ORF136 p136-2 SKLLLVTWVAFA(서열번호 7)
6 p136-3 EDDVVHF(서열번호 8)
상기 합성된 2종의 항원에 대한 유전자를 플라스미드 pET28a(Novagen)에 삽입하고, 대장균 BL21 plyss 또는 대장균 BL21 Rosetta1에 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드는 형질전환된 대장균을 배양하여, 전기영동을 통해 형질전환 결과를 확인하였다.
MNV 합성 Gene 2종 정보 및 Vector, Enzyme, 숙주세포(E.coli) 정보
The Genome of Koi Herpesvirus(KHV)(GenBank YP 001096103/MN695411)
Name Target Vector Enzyme E.coli Gene Size
ORF68 1045-2577bp pET28a BamHI/EcoRI BL21 Rosetta1 1548bp
ORF72 full sequence pET28a BamHI/EcoRI BL21 Rosetta1 1122bp
재조합 항원 단백질 유전자가 형질전환된 발현 균주 BL21 plyss 또는 BL21 Rosetta1를 LB-kanamycin 배지 1L에 접종 후 37℃에서 O.D값이 0.5-0.6이 될 때 까지 배양 후, 1mM IPTG를 이용하여 재조합 항원 단백질의 발현을 유도한 후, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 균주를 수득한 후, 용해 버퍼(6M Urea, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 1mM 2-mercapoethanol)에 현탁하여 초음파 파쇄를 실시하고, 17,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 미리 결합버퍼로 평형화시켜 놓은 Ni-NTA His-Tag Affinity ㅋ크클크로마토그래피 칼럼에 적용하여 결합시킨 후 세척버퍼로 세척하고, 용출버퍼를 이용하여 재조합 항원 단백질을 용출시켰다. 그 다음 20mM Sodium Carbonate 버퍼에서 하룻밤 투석한 후 농축시켰다.
정제한 각 재조합 항원 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 순도와 분자량을 확인하였다(도 1 및 표 3).
Lane Name Target Size Sol. / InSol. Ag. Yield (E.Coli 1L)
1 KHV　ORF68 60kDa Soluble 0.73 mg
2 KHV　ORF72 45kDa Insoluble 28.15mg
정제 KHV 바이러스 확보
배양 후 정제한 2종의 KHV Tp4(국립수산물품질관리원) 및 KHV F03/16(국립수산물품질관리원)바이러스 배양액 2종을 초원심분리기를 사용하여 sucrose gradient법으로 바이러스를 분리하였다. 분리된 KHV Tp4 바이러스를 SDS-PAGE(도 3A)와 웨스턴 블럿(도 3B)으로 확인하였다.
실시예 2: 항-KHV 단클론 항체 제작
실시예 1에서 제작한 재조합 항원 2종, 펩타이드 항원 6종을 8주령 Balb/c mouse에 표 4와 같은 스케줄 및 용량으로 투여하여 면역을 진행하였다.
마우스 면역 방법 및 스케쥴
Balb/cA 마우스(8 주령, 암컷) 면역 방법
면역회차
Immunization 		투여일
Days 		항원 혼합물 투여방법
1st 0 주 50ug Ag. With Freund’s Complete Adjuvant 복강내 주사
(I.P.)
2nd 2 주 50ug Ag. With Freund’s Complete Adjuvant 복강내 주사
(I.P.)
3rd 4 주 50ug Ag. With Freund’s Incomplete Adjuvant 복강내 투여
(I.P.)
4th 5 주 50ug Ag. With Freund’s Incomplete Adjuvant 복강내 주사
(I.P.)
1차 부스팅
1st Boosting		 6 주 50ug Ag. With PBS 정맥주사
(I.V.)
2차 부스팅
2nd Boosting		 7 주 50ug Ag. With PBS 정맥주사
(I.V.)
면역화 후 4일 뒤에 꼬리 미정맥에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 효소면역측정법 (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)으로 항체가를 결정하였다. 측정된 흡광도 수치가 음성대조군의 마우스(항원을 주입하지 않은 쥐의 혈청)과 비교하였다. 그 결과를 표 5, 도 4에 나타내었다. 펩타이드 면역된 마우스 혈청엔 KHV 바이러스에 대한 역가가 6종 펩타이드 모두에서 검출되지 않아 결과에서 제외하였다.
양호한 결과가 얻어진 경우 면역화가 성공한 것으로 보고 세포 간 융합 준비를 하였다.
마우스 항체 역가 결과 요약표
Antigen Mice No. Anti-Antigen Titer Anti-KHV Virus Titer
KHV ORF68 #1 High Low
#2 High Low
#3 High Low
KHV ORF72 #1 High Low
#2 High Low
#3 High Low
KHV Tp4 #1 none Low
#2 none Low
#3 none Low
KHV F03/16 #1 none Low
#2 none Low
#3 none Low
*High: Serum 희석배수 1:12800에서 O.D값 1.0 이상 (충분한 항체역가)
*Low: Serum 희석배수 1:12800에서 O.D값 1.0 이하
피더세포(feeder cell) 준비
골수종세포 (myeloma)와 비장 세포의 융합 18시간 이전에, 12주령 이상의 마우스(Balb/c 암컷)의 복부 피부를 벗겨 낸 후 복근 속 복강 내로 8㎖의 4℃, 11.3% sucrose (Sigma) 용액을 주입한 후 복강을 마사지하여, 복강 내 대식세포들의 유리를 촉진한 후, 이를 회수하여 1300 rpm으로 원심분리하여, 펠렛을 PBS 혹은 RPMI-1640(Sigma) 배지를 이용한 세척한 후, 1X HAT (hypoxanthine aminopterine tymidine, Sigma), 20 % FBS (fetal bovine serum, Sigma), RPMI-1640에 현탁시키고, 세포배양용 96 well plate (Nunc)에 분주한 후 37℃ CO2 incubator (Binder)에서 배양하였다.
피더 세포를 미리 준비하는 것은 융합과정 중 여러 단계를 거치면서 손상을 입은 융합세포들이 피더세포들이 분비하는 다양한 사이토카인에 의한 치유를 촉진하고, 지나친 세포희석으로 인한 성장 저해를 억제하기 위해서이다.
비장세포와 골수종세포의 융합 (Cell fusion)
세포융합 방법은 PEG(polyethylene glycol, Sigma)를 fusogen으로 이용하여Khler와 Milstein 방법에 따라 수행하였다. 세포융합 2주 전에 계대한 골수종세포 (myeloma, Sp2/0-Ag14, HGPRT-, 한국세포주은행)와 항체가(antibody titer)가 높게 나타난 마우스의 비장세포(splenocyte)를 미리 준비한 후 이들을 혼합하여 FBS가 첨가되지 않은 세포배양용 배지로 세척한 후, 37℃의 1㎖의 PEG를 이용하여 1분간에 걸쳐 서서히 저어주면서 융합시켰다. 융합 후 수분에 걸쳐 천천히 1X HAT 배지 (20% FBS, RPMI-1640)를 첨가해 주면서 융합과정을 마쳤다. 이러한 전과정은 37℃ 항온수조(water bath)를 이용하여 시행하였다.
전날 준비한 피더세포가 깔린 96 well plate에 well 당 1개의 colony가 생길 정도의 농도로 세포를 HAT가 첨가된 배지로 희석하여 분주하고, 분주된 96well plate들은 37℃ CO2 배양기에서 7일간 배양하며 스크리닝 단계에 접어들 때까지 배양기를 열지 않고 배양하였다.
세포 융합 시 사용된 비장세포와 Sp2/0의 세포 수
Antigen Mice No. Splenocyte Sp2/0 cell
ORF68 #1 1.0 x10^8 cell 2.55 x10^7 cell
#2 0.67 x10^8 cell 2.45 x10^7 cell
#3 1.5 x10^8 cell 2.4 x10^7 cell
KHV TP4 #1 0.65 x10^8 cell 1.2 x10^7 cell
#2 1.3 x10^8 cell 2.0 x10^7 cell
#3 0.8 x10^8 cell 1.7 x10^7 cell
비장세포와 골수종세포의 융합 (Cell fusion)
세포융합 방법은 PEG(polyethylene glycol, Sigma)를 fusogen으로 이용하여Khler와 Milstein 방법에 따라 수행하였다. 세포융합 2주 전에 계대한 골수종세포 (myeloma, Sp2/0-Ag14, HGPRT-, 한국세포주은행)와 항체가(antibody titer)가 높게 나타난 마우스의 비장세포 (splenocyte)를 미리 준비한 후 이들을 혼합하여 FBS가 첨가되지 않은 세포배양용 배지로 세척한 후, 37℃의 1㎖의 PEG를 이용하여 1분간에 걸쳐 서서히 저어주면서 융합시켰다. 융합 후 수분에 걸쳐 천천히 1X HAT 배지 (20% FBS, RPMI-1640)를 첨가해 주면서 융합과정을 마쳤다. 이러한 전과정은 37℃ 항온수조(water bath)를 이용하여 시행하였다.
전날 준비한 피더세포가 깔린 96 well plate에 well 당 1개의 colony가 생길 정도의 농도로 세포를 HAT가 첨가된 배지로 희석하여 분주하고, 분주된 96well plate들은 37℃ CO2 배양기에서 7일간 배양하며 스크리닝 단계에 접어들 때까지 배양기를 열지 않고 배양하였다.
특이성 검사 대상 well의 선별
충분히 성장한 하이브리도마 세포의 배양 상층액을 사용하여 KHV TP4 바이러스 배양액에 반응성이 있는 64개 클론을 대상으로 스크리닝 ELISA를 실시하고, CCB 세포에 반응성이 없으면서, KHV TP4에 반응성 있는 클론 40종을 1차 선별하였다(표 7).
이후, 선정된 40개 클론에 대하여, Isotype 테스트를 통해 IgM, IgA 클론들을 제외하고, KHV TP4에 대하여 반응성이 낮은 클론들을 제외하여 최종 10종의 단클론 항체를 선정하였다.
확보한 항-KHV 단클론항체의 특이성 검사
효소면역측정법(ELISA)을 이용하여, 선별된 10개 클론에 대한 항원 특이성을 확인하였다.
KHV 항원 용액을 10㎍/㎖의 농도로 100㎕씩 96 well plate에 분주하고 37℃, 60분간 반응시켰다. 희석액으로는 0.05M sodium bicarbonate 용액을 사용하였으며, 반응액을 제거하고 세척액 (인산염완충액, 0.05% Tween 20) well당 200㎕ 씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 세척 후 각 well에 차단액(blocking solution, 1% BSA가 함유된 인산염 완충액)을 200㎕ 첨가하고 37℃, 30분간 반응시켰다. 차단액 반응액을 제거하고 상기 세척액을 well당 200㎕씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 단클론항체 (MAb)용액을 well당 100㎕씩 분주하고 음성대조군용 well에 희석액을 100㎕ 분주한 다음 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응액을 제거하고 상기 세척액을 well당 200㎕씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복함. 항-마우스 IgG에 HRP (Horse reddish peroxidase)가 융합된 시약을 well당 100㎕씩 분주하고 37℃에서 60분간 반응시킴. 반응액을 제거하고 상기 세척액을 well당 200㎕씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다.
효소 기질 용액 (o-phenylenediamine 0.4㎎/㎖ in phosphate citrate buffer pH 5.0))을 100㎕씩 분주하고 암실의 상온에서 30분간 반응시킨 후, 492 nm (yellow)에서 흡광도값을 확인하여 음성대조군의 흡광도의 3배 이상 되는 흡광도 값을 양성 반응의 최소치로 기준하여 음성, 양성으로 판정하였다.
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, KHV mAb는 자가 항원에 특이적인 반응을 확인할 수 있었으며, 다른 항원에 대한 비특이반응은 확인되지 않았으며, ELISA를 실시하여, 이소타입을 확인하였으며, 10종 클론 모두 IgG로 확인되었다.
No. Target Clone No. ELISA Isotype
Antigen 반응성 KHV 반응성
1 ORF68 #4C5 O O IgG2a
2 KHV TP4 #3E8 O O IgG1
3 #4F5 O O IgG1
4 #6C7 O O IgG1
5 #6F11 O O IgG1
6 #6G8 O O IgG1
7 #4E9-1 O O IgG1
8 #4E9-2 O O IgG1
9 #4E9-3 O O IgG1
10 #4E9-4 O O IgG1
실시예 3: 단클론 항체 기반 KHV 진단 키트 제작
5종 항체의 페어링 테스트(pairing test)
CGC(Colloidal gold conjugate) 용액 100ul당 10종의 KHV 단클론 항체를 각각 적정량으로 혼합하여 골드 패드를 제작하고, LFIA(lateral Flow Immuno Assay) 스트립 페어 테스트를 진행하였다.
그 결과, 표 9에 나타난 바와 같이, KHV에 민감도가 높고, 버퍼에 대한 비특이 반응이 낮은 페어로 캡처는 #4F5와 #6C7 단클론 항체를 선정하였고, CGC는 #6F11과 #6G8 단클론을 선정하였다.
진단키트 최적화 조건 선정
가) 항체-콜로이달 골드 입자 접합체 제조
CGC 원료로 선정된 단클론 항체 #6F11과 #6G8을 이용하여 40nm Colloidal Gold Conjugate(CGC) 제작 조건 테스트 진행하였으며, #6F11의 40nm SC CGC 제작을 위한 조건은 pH 6.0, 항체농도 8㎍/ml 이며, #6G8의 40nm SC CGC 제작을 위한 조건은 pH 7.0, 항체농도 14㎍/ml로 선정하였다(표 10 및 표 11).
나) 항체-콜로이달 골드 접합체 최적 함량 결정
단클론 항체 #6G8, #6F11 40nm CGC를 사용하여 컨쥬게이트 패드에 분주하는 CGC의 농도를 O.D 기준으로 2.0, 4.0, 6.0 OD 을 각각 분주하여 테스트 한 결과 #6G8 4.0 O.D로 선정하였다(표 12).
다) Capture 항체 분주 함량 결정
니트로셀룰로오즈 막의 테스트 라인에 고정하는 항체 #6C7의 농도를 1.0, 1.5, 2.0 mg/ml을 각각 분주한 다음 스트립을 제작하여 KHV TP4+F03 바이러스 배양액과 CCB 세포 배양액, 버퍼테스트 결과 분주농도가 높아질수록 민감도 유지되는 반면, 위양성은 증가하여 T-line 항체 분주 농도는 1.0 mg/ml으로 선정하였다(표 13).
라) 샘플패드 종류 및 첨가제 테스트
샘플패드 2종 Cytosep 1662와 Fusion 5에 버퍼 및 첨가제 함량에 따른 테스트를 실시한 결과 Cytosep 1662 / 200mM Tris-Hcl (pH 8.0) / 1% Tween 20 / 0.2% casein / 0.1% NaN3로 선정하였다(표 14).
마) 비특이 반응 제거를 위한 capture 첨가제 테스트
버퍼 및 음성검체 비특이 반응 제거를 위해 캡쳐 항체 분주 시 0.5% 카제인, 0.5% BSA, 0.5% protein saver를 첨가한 결과 민감도 유지되면서 비특이 반응 제거되는 0.5% BSA 조건을 선정하였다.
바) 타사키트 비교 테스트
최종 선정된 항체 쌍 #6C7(캡처) #6G8(CGC) 조건으로 키트를 제작(SFI032301)하고, 타사키트와 비교실험을 진행하였다.
바) 타사키트 비교 테스트
최종 선정된 항체 쌍 #6C7(캡처) #6G8(CGC) 조건으로 키트를 제작(SFI032301)하고, 타사키트와 비교실험을 진행하였다.
국립수산물품질관리원에서 정제한 KHV TP4 sucrose gradient fraction 3과 fraction 7을 1/100 희석배수부터 1/3200 희석배수까지 1/2 serial dilution 한 후 KHV 타사키트와 비교 테스트 실시하였다.
그 결과, 표 16에 나타난 바와 같이, 타사키트는 1/800 희석배수까지 T-line band를 육안으로 확인할 수 있는 반면, 자사 키트(SFI032301)는 1/3200 희석배수까지 육안으로 확인 가능하여 타사키트 대비 높은 민감도를 보였다. 또한, 같은 희석배수의 검체를 사용 시 타사키트에 비해 시 T-line의 강도가 높아 육안으로 판별이 용이하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15651BP 20231019 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15648BP 20231019
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Claims (10)

  1. 잉어허피스 바이러스(KHV: Koi Herpes Virus) 항원 포획을 위한 1차 항체, 검출표지, 상기 검출표지가 결합되는 2차 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물에 있어서,
    상기잉어허피스 바이러스 항원 포획을 위한 1차 항체는 기탁번호 KCTC15651BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 잉어허피스 바이러스 TP4에 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6C7인 것을 특징으로 하는, 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2차 항체는 기탁번호 KCTC15648BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 잉어허피스 바이러스 TP4에 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6G8인 것을 특징으로 하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 검출표지는 비오틴(biotin), HRP(horseradish peroxidase), 염기성탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocya nate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 조성물.

  4. 제1항의 검출용 조성물을 포함하는 잉어허피스 바이러스(KHV) 검출용 키트.
  5. 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6C7를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC15651BP).
  6. 제5항의 하이브리도마 세포주(KCTC15651BP)에 의해 생산되고 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 6C7.
  7. 제6항에 있어서, KHV TP4에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내 것을 특징으로 하는 단클론 항체 6C7.
  8. 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론항체 6G8을 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC15648BP).
  9. 제8항의 하이브리도마 세포주(KCTC15648BP)에 의해 생산되고 잉어허피스 바이러스(KHV)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 6G8.
  10. 제9항에 있어서, KHV TP4에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내 것을 특징으로 하는 단클론 항체 6G8.
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Patent Citations (1)

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