CN119350493A

CN119350493A - 识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体

Info

Publication number: CN119350493A
Application number: CN202411942180.5A
Authority: CN
Inventors: 龚文杰; 刘钟迪; 贺笋; 李俊辉; 米士江; 王遵宝; 郭艺迪; 徐龙飞; 潘晓梅
Original assignee: Tiankang Biopharmaceutical Co ltd; Jilin University
Current assignee: Tiankang Biopharmaceutical Co ltd; Jilin University
Priority date: 2024-12-27
Filing date: 2024-12-27
Publication date: 2025-01-24

Abstract

本发明公开了识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体，属于免疫球蛋白领域。具体地公开了抗瘟病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区（SEQ ID No.1）和轻链可变区（SEQ ID No.3）。本发明的单克隆抗体与BVDV1、BVDV2、CSFV、BDV、HoBiPeV、AydinPeV和OVPV反应，相比其他瘟病毒单抗更为广谱，可以识别目前已知的感染牛、羊的所有瘟病毒成员，同时也可识别瘟病毒成员CSFV，且具有良好的中和能力，可制成临床上用于瘟病毒的诊断试剂和产品。本发明的抗体可以用于瘟病毒的血清学诊断、免疫效果评价以及实验用血清制品的瘟病毒病原检测等，在临床诊断等领域具有广阔的应用前景。

Description

识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体

技术领域

本发明属于免疫球蛋白领域，具体涉及识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体。

背景技术

瘟病毒是一类严重危害家畜及野生动物的病毒。其成员病毒粒子成球形，直径约为40-60 nm，有囊膜，为单股正链RNA病毒，基因组大小为11.3-13.0 kb，包含一个大的开放阅读框和基因组两端的非编码区，编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白，其中结构蛋白E^rns（gp44/48）和E2（gp55）、非结构蛋白NS3可以刺激机体产生抗体，E2蛋白是瘟病毒的重要保护性抗原。猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E2蛋白的氨基端有4个独立的抗原结构域，依次为B、C、D、A结构域，其进一步可以分为B/C抗原区和D/A抗原区，大部分抗原表位位于这2个抗原区上。

根据国际病毒分类委员会（ICTV）的最新报告，瘟病毒包含11个已知成员（Pestivirus A -Pestivirus K），除此之外，一些与已知成员有较大遗传差异的病毒如Batpestivirus、Pangolin pestivirus、Bamboo rat pestivirus、Linda pestivirus、Ovinepestivirus（OVPV）也被发现。部分成员分布广泛，严重威胁全球养殖业，Pestivirus A（BVDV1）和Pestivirus B（BVDV2）可以感染牛、羊、猪等家畜以及鹿、和羚羊等野生动物，可以导致犊牛腹泻、粘膜脱落、流产、死胎和胎儿先天畸形；Pestivirus C（CSFV）是严重危害养猪业的病原之一，病猪主要表现为高热稽留、呼吸困难、全身广泛性出血和繁殖障碍等；PestivirusD（BDV）的主要宿主是绵羊和山羊，感染BDV后，临床表现为流产、死胎、羔羊震颤、免疫抑制和多毛。Pestivirus H（HoBiPeV）主要感染牛和其他反刍动物，又称为BVDV3。此外与BDV遗传距离较远的瘟病毒Pestivirus I（AydinPeV）和OVPV也在羊群中被检测到，这两种新的瘟病毒与CSFV毒株的亲缘关系比BDV更近。除危害动物健康外，瘟病毒及其抗体也是牛血清产品的重要污染物，对生命科学研究和疫苗生产的健康发展造成了较大的损害。

目前仅鉴定出了少数可以识别多种瘟病毒成员的单抗，单抗m912可以与BDV和部分CSFV反应，单抗15C5能与绝大多数BVDV1、BVDV2、BVDV3、BDV和Bungowannah virus反应，NS3蛋白单抗C16也是瘟病毒广谱单抗，能与CSFV、BVDV1、BVDV2、BVDV3和BDV等瘟病毒反应，但这2株广谱单抗不具有中和能力。目前鉴定的瘟病毒单抗存在识别成员种类少、无中和能力等问题，极大地限制了这些单抗的应用。因此，亟需研究和开发能够特异性结合更多瘟病毒、具有中和作用的广谱中和抗体。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体及其应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为实现上述目的，本发明首先提供了抗瘟病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID No.1的第26-33位的HCDR1、氨基酸序列为SEQ ID No.1的第51-58位的HCDR2和氨基酸序列为SEQ ID No.1的第97-108位的HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ IDNo.3的第27-37位的LCDR1、氨基酸序列为SEQ ID No.3的第55-57位的LCDR2和氨基酸序列为SEQ ID No.3的第94-102位的LCDR3。

其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、抗体可变区（Fv）、二硫键稳定的Fv（dsFv）、单链抗体（ScFv）、单域抗体（sdAb，即纳米抗体）、微型抗体（minibody）和最小识别单位（MRU）等但不限于此。

所述互补决定区（CDR）的序列可根据Kabat编号系统定义。

所述重链可变区和轻链可变区均包含框架区（framework region，FR，在可变区中CDR以外的区域）。所述框架区可来源于人或非人哺乳动物（如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、骆驼等）。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No.3所示。

进一步地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还可包括重链恒定区（CH）和轻链恒定区（CL）。所述重链恒定区可选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的重链恒定区。所述重链恒定区还可选自CH1、Fc和CH3结构域。所述轻链恒定区可选自Kappa（κ）和lambda（λ）型轻链恒定区。所述重链恒定区和轻链恒定区可来源于人或非人哺乳动物（如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、骆驼等）。

进一步地，所述重链恒定区可选自人IgG亚类如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的重链恒定区。所述重链恒定区也可选自小鼠IgG亚类如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4、IgG5和IgG6的重链恒定区。

进一步地，所述重链恒定区的核苷酸序列可如SEQ ID No.14所示。

进一步地，所述轻链恒定区的核苷酸序列可如SEQ ID No.15所示。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

A1）编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组宿主细胞。

所述生物材料均可表达本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：

B1）编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

B2）编码序列是SEQ ID No.4的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.1的重链可变区。SEQID No.4所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.3的轻链可变区。

本文所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供了本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段，或所述生物材料在下述任一项中的应用：

C1）在制备用于抑制或中和瘟病毒活性的产品中的应用；

C2）在制备用于诊断或辅助诊断瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病的产品中的应用；

C3）在制备用于筛查或辅助筛查瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病的产品中的应用；

C4）在制备用于检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的产品中的应用；

C5）在制备用于结合瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的产品中的应用。

所述抑制或中和瘟病毒活性包括通过结合瘟病毒E2蛋白，从而使瘟病毒失去结合受体的能力，继而失去感染宿主细胞的能力，从而达到抑制或中和瘟病毒活性的目的。

所述诊断或辅助诊断瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病可从受试者分离获得样品，然后利用所述单克隆抗体或其抗原结合片段检测所述样品中是否存在瘟病毒E2蛋白或瘟病毒E2蛋白的含量，根据检测结果进行瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病的诊断或辅助诊断。

所述筛查或辅助筛查瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病可从受试者分离获得样品，然后利用所述单克隆抗体或其抗原结合片段检测所述样品中是否存在瘟病毒E2蛋白或瘟病毒E2蛋白的含量，根据检测结果进行瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病的筛查。

所述检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白包括基于抗原抗体特异性反应原理的任何体内或体外的E2蛋白的检测。所述检测E2蛋白可为检测待测样品中是否含有E2蛋白和/或检测待测样品中E2蛋白的含量。

所述结合瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的产品可以是E2蛋白抑制剂，也可以是用于分离或纯化E2蛋白的产品但不限于此。例如可将本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段制备成免疫亲和层析柱，基于抗原经过层析柱时可被抗体捕获、改变pH值等环境条件使抗原从中解离的原理，筛选分离出E2蛋白。

本文所述产品可包括试剂、试剂盒、芯片、试纸、检测卡和免疫传感器。

所述受试者可为人或非人动物（如猪、牛、羊、兔、猫、马、鹿、猴、鸡、犬等）。

上述应用中，所述瘟病毒可为牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrheavirus type 1）、牛病毒性腹泻病毒2型（Bovine viral diarrhea virus type 2）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus）、边界病病毒（Border disease virus）、牛病毒性腹泻病毒3型（HoBi-like Pestivirus）、Aydin样瘟病毒（Aydin-like Pestivirus）和/或羊瘟病毒（Ovine Pestivirus）。

本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒含有本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

所述试剂盒可具有下述至少一种用途：（1）诊断或辅助诊断瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病；（2）筛查或辅助筛查瘟病毒感染或瘟病毒感染引起的疾病；（3）检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白；（4）结合瘟病毒或瘟病毒E2蛋白。

所述试剂盒的检测样本可为环境样本、血液样本（如全血、血浆、血清）、痰液样本、组织样本、细胞样本、粪便样本等但不限于此。

进一步地，所述环境样本可包括饲料厂环境样本（如料仓、输送带、工作台、地面等）、养殖环境样本（如污泥、养殖饲料、土壤、食槽、擦拭环境的抹布、拭子、养殖用水、空气等）和周边环境样本（如运输车辆、周边农田等）。

所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、免疫沉淀检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒但不限于此。

进一步地，所述试剂盒还可包括免疫检测所需试剂，如标记抗体或抗原、磁微粒、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液等但不限于此。

本发明还提供了抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述抗体部分和偶联部分可直接连接，或通过接头（如腙键、二硫键、硫醚键、肽键）共价连接。

进一步地，所述偶联部分可为可检测的标记。

进一步地，所述可检测的标记包括酶（如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶等）、化学发光试剂（如吖啶酯类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物等）、荧光染料（如AMCA、FITC、CFSE、GFP、DAPI、7-AAD、Hoechst 33342、Pacific Blue、PE、PE-TR、PE-Cy7、PE-Cy5、PI、PerCP-Cy5.5、APC、APC-CY7、APC-H7、V500、Alexa 700、BV605、BV480、BV785、BV510、BV711、BV421等）、近红外染料（如菁类染料、BODIPY类、罗丹明类、方酸类、卟啉类染料等）、放射性核素（如125I、18F、11C、99mTc、123I等）、生物素、磁共振成像的纳米粒子、磁共振成像的量子点、磁性物质（如磁珠、含钆复合物的纳米颗粒、超顺磁性氧化铁纳米颗粒）和胶体金等但不限于此。

本发明还提供了检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的方法，所述方法包括使用本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、所述试剂盒或所述抗体偶联物检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白。

所述检测可包括检测样品中是否存在E2蛋白，或样品中E2蛋白的表达水平或含量。

进一步地，所述检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的方法包括使本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段、所述抗体偶联物或所述试剂盒与待测样品接触，通过抗原抗体反应来检测待测样品中是否存在瘟病毒E2蛋白。

进一步地，所述检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的方法包括先将本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段用可检测的标记进行标记；再使其与待测样品接触，通过对可检测的标记的检测来检测待测样品中是否存在E2蛋白，或待测样品中E2蛋白的含量。

所述检测E2蛋白的方法可以是免疫学检测，例如沉淀反应、凝集试验、免疫印迹法（Western Blot）、酶免疫测定法（例如ELISA）、双抗夹心ELISA法、荧光连接免疫吸附测定法（FLISA）、酶免疫测定法（EIA）、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫测定法（RIA）、胶体金免疫技术（GIC）、胶体金免疫层析技术（GICA）、免疫组织化学法（IHC）、补体结合反应法、多元免疫分析法和荧光免疫层析技术。

所述检测E2蛋白的方法可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的。

所述非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的可以是检测环境样本中是否存在瘟病毒污染。

进一步地，所述检测E2蛋白的方法可为ELISA检测方法。

进一步地，所述方法包括将本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段包被固相载体得到包被抗体的固相载体的步骤。所述包被是指通过物理吸附作用被结合在固相载体上。

进一步地，所述固相载体可为酶标板、膜载体、微球、生物芯片或磁珠但不限于此。

所述固相载体的材料可为聚苯乙烯、纤维素、交联右旋糖苷、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶但不限于此。

所述膜载体可为硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜但不限于此。

本发明还提供了本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括在宿主细胞中表达本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并回收或分离所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述制备方法可包括如下步骤：构建含有编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子（如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的DNA分子）的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重组宿主细胞；培养所述重组细胞，从培养的重组宿主细胞培养物中回收或分离所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述回收或分离可通过沉淀法（如盐析法、有机溶剂沉淀法、辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、等电点沉淀法）或层析技术（如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析）从培养物（包括培养容器内的所有物质）中分离。

进一步地，所述表达载体可选自原核表达载体（包括大肠杆菌（如BL21系列表达细胞、M15表达细胞、Top10表达细胞和Origamai系列表达细胞）表达载体但不限于此）和真核表达载体（包括酵母（如X33细胞、GS115细胞和SMD1168细胞）表达载体、昆虫细胞（如Sf21细胞、Sf-9细胞和Hi-5细胞）表达载体、哺乳动物细胞（如HET293细胞和CHO细胞）表达载体但不限于此）。

所述导入的方法可包括以下任一种：（1）通过化学转化法（如Ca离子诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法等）或物理转化法（如电穿孔转化法）将目的基因或含有目的基因的重组载体导入宿主菌。（2）通过噬菌体转导的方法将目的基因转导进入宿主菌。（3）通过物理或化学方法将目的基因直接转入植物受体细胞，如化学刺激法、电击法、脂质体介导法、显微注射法、基因枪法、激光微束法、花粉管通道法、超声波法、气枪法和涡流法等。（4）以载体为媒介将目的基因转入植物受体细胞，如农杆菌Ti质粒载体（包括Ti质粒衍生的载体如共整合载体系统和双元载体系统）介导法。（5）通过磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物法（如DEAE-葡聚糖转染法）、阳离子脂质体法、电穿孔法（即电转染法）、显微注射、基因枪法或病毒介导法（如腺病毒感染法、慢病毒感染法）等将目的基因导入离体动物细胞（转染）。

本文所述抗瘟病毒单克隆抗体可以是鼠源单克隆抗体，也可以是人源化单克隆抗体（包括嵌合抗体、CDR移植抗体和SDR移植抗体）以及全人单克隆抗体。

本文所述抗瘟病毒单克隆抗体可结合多种瘟病毒（如牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV1）、牛病毒性腹泻病毒2型（BVDV2）、猪瘟病毒（CSFV）、边界病病毒（BDV）、牛病毒性腹泻病毒3型（HoBiPeV）、Aydin样瘟病毒（AydinPeV）和/或羊瘟病毒（OVPV））的E2蛋白，具有中和瘟病毒的作用，又称为识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体。

本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及抗体的分离纯化方法。

本发明通过杂交瘤技术筛选、鉴定得到了抗瘟病毒广谱中和单克隆抗体（识别7种瘟病毒的广谱中和单克隆抗体），该抗体可以在原核细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产，可制成临床上用于瘟病毒的诊断试剂和产品。本发明的抗体与BVDV1、BVDV2、CSFV、BDV、HoBiPeV、AydinPeV和OVPV反应，相比其他瘟病毒单抗更为广谱，可以识别目前已知的感染牛、羊的所有瘟病毒成员，且具有良好的中和能力。本发明提供的单克隆抗体以及基于抗体研制的诊断试剂和产品可以用于瘟病毒的血清学诊断、免疫效果评价以及实验用牛血清制品的瘟病毒病原检测等，在临床诊断等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为单抗TCH052与不同基因型毒株间接免疫荧光实验结果。

图2为单抗TCH052与不同基因型毒株Western blot实验结果。

图3为单抗TCH052与不同种瘟病毒Western blot实验结果。

图4为SDS-PAGE鉴定单抗TCH052的纯化效果实验结果。

图5为单抗TCH052中和能力鉴定结果。

图6为单抗TCH052纯化效果验证结果。

图7为Western blot验证单抗TCH052表达活性结果。

图8为单抗TCH052的功能验证结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的本实验室分离并保存的各基因型的CSFV流行毒株（SM、CN021、CN069、GD53、CN049、CN057、CN063、CN068、CN002、HuB2）、猪瘟兔化弱毒疫苗C株（HCLV）记载于如下文献中：Shijiang Mi,Lihua Wang,Hongwei Li, et al. Characterization ofmonoclonal antibodies that specifically differentiate field isolates fromvaccine strains of classical swine fever virus. Frontiers in Immunology,2022,13,930631. BVDV1型毒株（BVDV-1）和BVDV2型毒株（BVDV-2）为扬州大学兽医学院朱国强老师惠赠，记载于如下文献中：蒋颖,林燕清,陶洁,等.抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报, 2012, 34(12):4. 公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人（吉林大学）获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的基因2.1b亚型流行毒株JL23记载于如下文献中：Gong W , Li J, Wang Z ,et al.Virulence evaluation of classical swine fever virussubgenotype 2.1 and 2.2 isolates circulating in China[J].VeterinaryMicrobiology, 2019, 232:114-120. 公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人（吉林大学）获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的昆虫杆状病毒表达载体pFastBac 1记载于如下文献中：米士江.猪瘟病毒流行毒株与疫苗株鉴别单抗和广谱性单抗的鉴定及其抗原表位解析[D].吉林大学,2022。

下述实施例中的蛋白标签抗体anti-His Tag mAb购自索莱宝公司，货号K200060M。

下述实施例中的半固体培养基购自博奥龙公司，货号BTYA0607。

下述实施例中的HAT添加剂购自Thermo Fishe公司，货号21060017。

下述实施例中CSFV-LPC E2蛋白的编码基因的核苷酸序列为GenBank AccessionNo. AY526732（Update Date 26-JUL-2016）的第1171-2259位。

本文中的英文缩略词及对应的英文全称和中文注释如表1所示。

实施例1、瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

免疫抗原为猪瘟病毒（CSFV）疫苗株LPC的E2蛋白，命名为CSFV-LPC E2蛋白。本实施例采用昆虫杆状病毒表达系统来制备CSFV-LPC的E2蛋白，步骤如下：将CSFV-LPC的E2蛋白编码基因（GenBank登录号：AY526732所示序列的第1171-2259位）在3'端添加His标签（His标签的核苷酸序列为5’-CATCATCACCATCACCAT-3’，SEQ ID No.5）后克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac 1中，得到重组表达载体，将该重组表达载体转化至DH10Bac感受态细胞中获得含目的基因片段的重组杆粒，将杆粒转染至Sf9细胞中进行蛋白表达，利用固定金属离子亲和色谱法方法收集CSFV-LPC E2蛋白，纯化后获得免疫抗原（CSFV-LPC E2纯化蛋白）。

（1）小鼠免疫

取SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，将CSFV-LPC E2纯化蛋白加入等体积201佐剂（Seppic公司）进行乳化，皮下多点注射免疫小鼠，每只小鼠免疫50 μg乳化蛋白，每两周免疫一次，共免疫3次，三免后一周腹腔注射100 μg未加佐剂的CSFV-LPC E2纯化蛋白进行冲击免疫，继续饲养3天。

（2）细胞融合

冲击免疫3天后，将小鼠脱臼处死后取出脾脏，在尼龙筛中轻轻碾碎，用无菌PBS冲洗后收集冲洗液，使用红细胞裂解液去除红细胞后计数脾细胞，将SP2/0细胞与脾细胞1:5混合后1200 r/min离心3 min弃上清，沉淀使用10 mL电融合液（BTX）洗涤2遍后，加入9 mL电融合液重悬，将细胞转移至电融合仪中进行融合，融合参数设定为800 V、40 μs、1次。将融合后细胞使用含5% FBS Advanced RPMI-1640完全培养基（购自Thermo Fisher公司，货号12633012）活化10 h后，转移至半固体培养基（购自博奥龙公司，货号BTYA0607）中培养10天。

（3）杂交瘤细胞筛选

挑取步骤（2）中半固体培养基中的单克隆细胞团至含HAT（购自Thermo Fisher公司，货号21060017）的Advanced RPMI 1640培养基，培养3天后使用间接免疫荧光试验筛选抗体阳性细胞孔，经亚克隆后确定一株能分泌特异性结合E2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为TCH052。杂交瘤细胞株TCH052分泌的单克隆抗体称为单抗TCH052。

（4）抗体类型鉴定

使用间接ELISA方法对单抗Ig类别和轻链型别进行鉴定，实验所用的针对不同类型抗体的二抗均来自小鼠单抗Ig类亚类鉴定用酶标二抗试剂盒（购自博奥龙公司，货号BF16002X），结果显示，单抗TCH052的类型为IgG1、κ轻链。

（5）单抗与病毒反应类型的鉴定

将单抗TCH052与本实验室分离并保存的各基因型的CSFV流行毒株（SM、CN021、CN069、GD53、CN049、CN057、CN063、CN068、CN002、HuB2），以及猪瘟兔化弱毒疫苗C株（HCLV），扬州大学兽医学院朱国强老师惠赠的1株BVDV1型毒株（BVDV-1）和1株BVDV2型毒株（BVDV-2）进行间接免疫荧光实验（indirect immunofluorescence assay，IFA），步骤如下：

①细胞接毒：同时按100 TCID₅₀/孔接种CSFV细胞毒，将细胞加入96孔板中，于37℃、5% CO₂温箱培养72 h。

②细胞固定：弃去细胞培养上清，在96孔板中每孔加入200 μL PBS清洗3遍，加入-20℃保存的80%冷丙酮（50 μL/孔），在-20℃冰箱中固定1 h。

③一抗孵育：弃去冷丙酮固定液，每孔加入200 μL的PBS清洗3遍，每孔加入100 μL杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1 h。

④二抗孵育：弃去一抗孵育液，每孔加入200 μL PBS清洗3遍，将Alexa Fluor 488荧光二抗使用PBS进行1:500稀释，同时加入0.01%伊文思蓝和5% FBS，充分混匀后每孔100μL加入细胞板中，37℃孵育1 h。

⑤荧光观察：弃去二抗孵育液，每孔加入200 μL的PBS清洗3遍，于荧光显微镜下观察血清抗体与感染细胞的反应情况。

结果如图1显示，单抗与所有毒株均反应呈现较明显荧光。

通过昆虫杆状病毒表达系统表达不同基因型CSFV和BVDV的E2蛋白，包括下述17种CSFV毒株的E2蛋白：HCLV、SM、Brescia (1.2)、CSF0650 (1.3)、CSF1056 (1.4)、CN021(2.1a)、CN069 (2.1b)、GD53 (2.1c)、CN049 (2.1g)、CN057 (2.1h)、CN063 (2.1i)、CN068(2.1j)、CN002 (2.2)、HuB2 (2.3)、CSF0410 (3.1)、JJ9811 (3.2)、94.4/IL/94/TWN(3.4)；两种BVDV的E2蛋白：BVDV1和BVDV2。上述毒株的E2蛋白的制备方法参考实施例1中CSFV-LPCE2蛋白的制备方法。其中，克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac 1中的各个E2蛋白的编码基因如下：

HCLV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. Z46258.1（Update Date 25-NOV-2005）的第2345-3433位。

SM E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. AY775178.2（Update Date 27-NOV-2007）的第2345-3433位。

Brescia (1.2) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.AY578687.1（Update Date 31-MAR-2005）的第2333-3421位。

CSF0650 (1.3) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.JX028200.1（Update Date 19-AUG-2012）的第2147-3235位。

CSF1056 (1.4) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.JX028202.1（Update Date 19-AUG-2012）的第2147-3235位。

CN021 (2.1a) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

CN069 (2.1b) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

GD53 (2.1c) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.KP343640.1（Update Date 01-MAY-2016）的第2344-3432位。

CN049 (2.1g) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.KU504339.1（Update Date 28-JUN-2016）的第2347-3435位。

CN057 (2.1h) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

CN063 (2.1i) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.KY132096.1（Update Date 01-FEB-2017）的第2345-3433位。

CN068 (2.1j) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

CN002 (2.2) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

HuB2 (2.3) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

CSF0410 (3.1) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.JQ411575.1（Update Date 09-MAR-2016）的第2146-3234位。

JJ9811 (3.2) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No.KF669877.1（Update Date 20-DEC-2012）的第2346-3434位。

94.4/IL/94/TWN(3.4) E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank AccessionNo. AY646427.1（Update Date 29-OCT-2007）的第2344-3432位。

BVDV1 E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

BVDV2 E2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

将单抗TCH052与通过昆虫杆状病毒表达系统表达的不同基因型CSFV和BVDV E2蛋白（即上述19种毒株和CSFV-LPC的E2蛋白）进行Western blot实验，以CSFV抗体蛋白标签抗体anti-His Tag mAb作为对照，步骤如下：

①蛋白处理：将E2蛋白按比例加入4×loading buffer，煮沸处理10 min。

②蛋白电泳：将处理好的蛋白（每泳道10 μL）上样至密度为10%的SDS-PAGE凝胶中，进行蛋白电泳，程序为55 V-50 min，110 V-80 min。

③转膜：使用半干转膜法将电泳结束的蛋白转至NC膜，程序为23 V-25 min。

④封闭：每100 mL PBS中加入5 g脱脂奶粉，充分震荡混匀作为封闭液。在自封袋中加入5 mL封闭液，置于摇床上常温封闭NC膜1 h。

⑤孵育一抗：使用封闭液1:100稀释杂交瘤细胞培养上清，Anti-His Tag抗体1:3000稀释作为阳性对照，置于摇床上4℃过夜孵育。

⑥孵育二抗：PBS洗膜3遍，加入PBS 1:5000稀释的Alexa Fluor 680标记的荧光二抗，置于摇床上常温避光孵育1 h。

⑦扫描NC膜：PBS洗膜3遍，置于双色红外激光成像系统中进行扫描，并保存图片。

结果如图2所示，单抗TCH052与所有毒株E2蛋白均反应。

通过昆虫杆状病毒表达系统表达下述瘟病毒的E2蛋白：BDV、PAPeV、PPeV、GPeV、HoBiPeV、AydinPeV、RPeV、APPV和OVPV。上述瘟病毒的E2蛋白的制备方法参考实施例1中CSFV-LPC E2蛋白的制备方法。其中，克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac 1中的各个E2蛋白的编码基因如下：

BDV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_003679（Update Date 13-AUG-2018）的第2347-3435位。

PAPeV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_024018（Update Date 04-JUN-2019）的第2335-3417位。

PPeV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_023176（Update Date 13-AUG-2018）的第2386-3486位。

GPeV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_003678（Update Date 13-AUG-2018）的第2351-3442位。

HoBiPeV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_012812.1（Update Date 13-AUG-2018）的第2361-3449位。

AydinPeV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_018713（Update Date 13-AUG-2018）的第2352-3440位。

RPeV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. KJ950914（Update Date 02-JUL-2018）的第2809-3915位。

APPV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. NC_038964（Update Date 24-AUG-2018）的第2122-2949位。

OVPV E2蛋白的编码基因的核苷酸序列：GenBank Accession No. MG770617（Update Date 26-AUG-2021）的第2323-3411位。

将单抗TCH052与12种瘟病毒成员（CSFV-LPC、BVDV1、BVDV2、BDV、PAPeV、PPeV、GPeV、HoBiPeV、AydinPeV、RPeV、APPV和OVPV）的E2蛋白进行Western blot实验，以蛋白标签抗体anti-His Tag mAb作为对照。以杂交瘤细胞培养上清作为一抗，Alexa Fluor 680标记的荧光抗体作为二抗，进行Western blot实验。

结果如图3所示，单抗TCH052能与7个瘟病毒种的E2蛋白反应，包括流行范围广、致病性强的BVDV1、BVDV2、CSFV、BDV、HoBiPeV、AydinPeV和OVPV，这些瘟病毒主要来自猪、牛和羊等家畜。

（6）单抗的腹水制备及纯化

6-8周龄雌性Balb/C小鼠腹腔注射300 μL小鼠腹水专用佐剂，12天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞TCH052，待小鼠腹围明显膨大，使用注射器抽取腹水，12000 r/min离心10min取上清保存。使用Protein A/G预装色谱柱纯化腹水中抗体，使用SDS-PAGE实验验证抗体纯化效果，结果如图4所示，大于180 kDa处有明显且单一的条带，表明实验获得了较高纯度的单抗。

（7）单抗的中和能力鉴定

利用间接免疫荧光实验对单抗TCH052中和CSFV疫苗株LPC株、基因2.1b亚型流行毒株JL23、BVDV1和BVDV2毒株的能力进行了鉴定，鉴定方法如下：分别利用MEM和DMEM将不同基因型的CSFV毒株和BVDV毒株稀释至2000 TCID₅₀/mL，吸取50 μL病毒稀释液加入至96孔板中。将纯化后的抗体TCH052使用MEM或DMEM进行2倍梯度稀释，每个浓度梯度吸取50 μL加入到相应的病毒液中，37℃孵育1 h。向病毒/抗体中和液中分别加入100 μL 1:4传代的PK-15细胞或MDBK细胞，37℃、5% CO₂培养3天，利用IFA鉴定瘟病毒广谱单抗是否能中和CSFV和BVDV。

结果如图5所示，当加入较高浓度纯化的单抗时，感染CSFV或BVDV毒株的细胞均无明显绿色荧光，随着抗体稀释倍数不断增加，感染不同毒株细胞均出现绿色荧光，表明单抗TCH052具有良好的中和能力。

（8）单抗序列的确定

委托南京德泰生物工程有限公司测序纯化的单克隆抗体，在Sanger测序获得核酸序列的基础上，利用三联密码子编码一个氨基酸的规则，获得对应氨基酸序列。最终确定单抗TCH052重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；单抗TCH052轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。其中：

单抗TCH052重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26-33位所示；

单抗TCH052重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51-58位所示；

单抗TCH052重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第97-108位所示；

单抗TCH052轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第27-32位所示；

单抗TCH052轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第50-52位所示；

单抗TCH052轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第94-102位所示。

实施例2、基因工程制备抗体及功能验证

1、基因工程方法制备抗体

1）重组表达质粒的构建

为了表达单抗TCH052，分别制备重链表达载体和轻链表达载体：单抗TCH052重链基因的核苷酸序列是将重链可变区编码基因的核苷酸序列（SEQ ID No.2）与mouse-IgG2a模版序列（重链恒定区序列，SEQ ID No.14）直接连接而得。单抗TCH052轻链基因的核苷酸序列是将轻链可变区编码基因的核苷酸序列（SEQ ID No.4）与mouse-kappa模版序列（轻链恒定区序列，SEQ ID No.15）直接连接而得。

将单抗TCH052重链基因和轻链基因分别克隆到载体pcDNA3.4中，得到重链表达载体和轻链表达载体，重组载体由南京德泰生物工程有限公司合成。

2）抗体的表达：

a）将新鲜消化的293T细胞接种到175cm²培养瓶中，加入35 mL含8%FBS的DMEM培养基（购自康宁公司，货号10-013-CVRC）培养细胞密度至90%。

b）将200 μg含轻链和重链的质粒（各100 μg）和200 μL QuickShuttle-293细胞专用转染试剂（博奥龙，KX0110044）分别稀释到1 mL生理盐水中。

c）合并上述步骤b）中的两溶液并混匀，得到复合物。

d）将上述复合物直接加入到步骤a）中的细胞培养基中，用加样器吸打混匀。

e）将细胞板移至37ºC/5% CO₂孵箱中进行培养，培养3天后收取培养上清验证。

3）抗体表达的验证：

取细胞表达上清，按比例加入不含DTT的非还原性Buffer（泳道1）和含DTT的还原性Buffer上样进行Western blot实验，结果如图6所示，泳道1在大于180 kDa处有明显单一条带，抗体经还原性Buffer处理后如泳道2所示，在约25 kDa和50 kDa处有轻链和重链两条明显条带，表明抗体得到良好纯化。将表达上清与CSFV-LPC和BVDV1的E2蛋白进行Westernblot实验，结果如图7所示，单抗TCH052与所有毒株E2蛋白均反应，说明表达的抗体具有活性，上述实验表明，抗体已成功表达。

4）抗体的纯化：

a）缓冲液配制：向无菌的ddH₂O中加入Na₂HPO₄·12H₂O，使其最终浓度为0.2 M，充分震荡混匀。

b）预洗脱液配制：在缓冲液中加入0.1 M柠檬酸，使柠檬酸体积占比为20%。

c）洗脱液配制：在缓冲液中加入0.1 M柠檬酸，使柠檬酸体积占比为60%。

d）样品处理：取步骤3）验证的细胞表达上清30 mL，按体积比1:1加入步骤a）配制的缓冲液，使用孔径为0.22 μm过滤后准备上柱。

e）平衡柱体：使用恒流泵将10 mL缓冲液以1 mL/min的流速缓慢通过Protein A/G4FF预装色谱柱（生工，C600983）。

f）上样：使用恒流泵将步骤d）溶液以1 mL/min的流速缓慢通过Protein A/G柱。

g）洗涤：使用恒流泵将10 mL洗涤缓冲液以1 mL/min的流速缓慢通过Protein A/G柱。

h）预洗脱：使用恒流泵将10 mL预洗脱液以1 mL/min的流速缓慢通过Protein A/G柱。

i）洗脱：使用恒流泵将15 mL洗脱液以1 mL/min的流速缓慢通过Protein A/G柱，洗脱产物分装至1.5 mL离心管中。

2、偶联抗体的制备

使用HRP偶联试剂盒（生工，D601047）将HRP偶联至单抗TCH052，制备HRP-TCH052偶联抗体，具体操作步骤如下：

（1）将500 μL HRP溶液与200 μL HRP活化缓冲液混合均匀，置于摇床上缓慢震荡，室温反应30 min。

（2）加入200 μL HRP偶联缓冲液，室温静置30 min。

（3）加入1 mL纯化的单抗TCH052，并转移至透析袋中，于2 L透析液中室温透析2h。

（4）向透析产物中加入100 μL还原剂，室温静置2 h，每间隔30 min搅拌一次，分装并保存偶联产物。

3、单抗TCH052的功能验证

将上步制备的标记单抗HRP-TCH052与单抗TCH052可以识别的7种瘟病毒成员（BVDV1、BVDV2、CSFV-LPC、BDV、HoBiPeV、AydinPeV和OVPV）的E2蛋白进行Western blot实验，以蛋白标签抗体anti-His Tag mAb一抗及山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)预吸附二抗（购于abcam公司，货号ab97040）作为对照。将标记单抗HRP-TCH052使用PBS进行1：1000稀释，进行Western blot实验。利用Omni-ECL™超灵敏化学发光检测试剂盒（购自雅酶公司，货号SQ201）进行显色，结果如图8所示，标记单抗HRP-TCH052能与7个瘟病毒种的E2蛋白均反应。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.抗瘟病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID No.1的第26-33位的HCDR1、氨基酸序列为SEQ ID No.1的第51-58位的HCDR2和氨基酸序列为SEQ ID No.1的第97-108位的HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID No.3的第27-37位的LCDR1、氨基酸序列为SEQ ID No.3的第55-57位的LCDR2和氨基酸序列为SEQ ID No.3的第94-102位的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

A1）编码权利要求1或2所述单克隆抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组宿主细胞。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：

B1）编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

B2）编码序列是SEQ ID No.4的DNA分子。

5.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或权利要求3或4所述的生物材料在下述任一项中的应用：

C1）在制备用于抑制或中和瘟病毒活性的产品中的应用；

C4）在制备用于检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的产品中的应用；

C5）在制备用于结合瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述瘟病毒为牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrhea virus type 1）、牛病毒性腹泻病毒2型（Bovine viraldiarrhea virus type 2）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus）、边界病病毒（Border disease virus）、牛病毒性腹泻病毒3型（HoBi-like Pestivirus）、Aydin样瘟病毒（Aydin-like Pestivirus）和/或羊瘟病毒（Ovine Pestivirus）。

7.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

8.抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其特征在于，所述抗体部分包含权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

9.检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的试剂盒或权利要求8所述的抗体偶联物检测瘟病毒或瘟病毒E2蛋白。

10.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在宿主细胞中表达权利要求1或2所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并回收或分离所述单克隆抗体或其抗原结合片段。