[go: up one dir, main page]

CN118772269A - 一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118772269A
CN118772269A CN202411146182.3A CN202411146182A CN118772269A CN 118772269 A CN118772269 A CN 118772269A CN 202411146182 A CN202411146182 A CN 202411146182A CN 118772269 A CN118772269 A CN 118772269A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
parainfluenza virus
antigen
binding fragment
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202411146182.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN118772269B (zh
Inventor
黄亚杰
刘霄卉
胡振阳
魏瑞
梅斯尧
秦萍萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Priority to CN202411146182.3A priority Critical patent/CN118772269B/zh
Publication of CN118772269A publication Critical patent/CN118772269A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN118772269B publication Critical patent/CN118772269B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗副流感病毒3型NP蛋白的抗体及其应用。本发明属于生物技术领域，所要解决的技术问题是提供一种结合副流感病毒3型NP蛋白的抗体或其抗原结合片段。本发明提供的抗体或其抗原结合片段与副流感病毒3型NP蛋白结合并表现出较多优良特性。

Description

一种抗副流感病毒3型NP蛋白的抗体及其应用
技术领域
本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，涉及一种抗副流感病毒3型NP蛋白的抗体及其应用。
背景技术
副流感病毒3型(Human ParainfluenzaVirus Type 3,HPIV-3)是一种感染呼吸道的RNA病毒，属于Paramyxoviridae科副粘病毒属。它是导致上呼吸道感染的常见病原体之一，具有较强的传染性。感染副流感病毒3型后，症状可能包括咳嗽、流鼻涕、喉咙痛、发热、打喷嚏、头痛、肌肉痛等。有些人可能会发展为肺炎或喉炎，特别是6个月龄以下的婴儿为高危人群，感染后若不及时治疗，可能会诱发严重的呼吸道疾病。
副流感病毒3型的检测方法主要包括病毒分离培养、血清学检查、病毒抗原检测、病毒核酸检测等。其中，血清学检查则通过检测急性期血清特异性IgM抗体，有助于副流感病毒的早期诊断，病毒核酸检测(如PCR-荧光探针法)因其快速、灵敏的特点，常被用于临床检测。尽管核酸检测在临床应用广泛，但对于住院患者或有严重疾病风险的患者，如果核酸检测为阴性，但怀疑患者为副流感病毒感染，仍需要更为灵敏的检测方法。
由于核酸检测存在假阴性，且耗时较长，对场地设备和技术人员要求较高，免疫学检测因其快速可满足现场检测、诊断较为准确，可辅助临床确诊。基于此，本发明发现一种抗副流感病毒3型NP蛋白的抗体，并提供检测副流感病毒或副流感病毒NP蛋白的方法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗副流感病毒3型NP蛋白的抗体，所述抗体具有较高的结合副流感3型NP蛋白的活性。
为了实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
本发明第一方面提供一种与副流感3型NP蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ IDNO:2所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明中，术语“抗体”是指表现所需生物学活性(例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导)的抗体的任何形式。因此，“抗体”以其最广泛的意义来使用，并明确包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体，单链抗体等。
在本发明中，术语“抗原结合片段”指抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗原结合片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
在本发明中，“轻链可变区(VL)”或“重链可变区(VH)”由间插三个“互补决定区(CDR)”的“框架”区组成。框架区用于调整CDR，以用于特异性结合抗原表位。CDR包含抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端，VL和VH结构域都包含以下框架(FR)区和CDR区：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。
在本发明中，“CDR”是指在抗体可变序列内的“互补决定区”。在重链和轻链的每个可变区均有三个CDR，其对于每个可变区分别被特定为“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”。“框架”(FR)或“框架序列”在本发明中是指可变区减去CDR的序列。因为CDR序列的精确定义可由不同系统确定，框架序列的意思受制于相应地不同说明。重链可变区的三个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、轻链可变区的互补性决定区域LCDR1、LCDR2、LCDR3六个CDR(也将在重链和轻链上的框架区域划分为在每个链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。在没有将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3和FR4的情况下，如由其他指出的框架区域表示在单一、自然发生地免疫球蛋白链的可变区之内组合的FR。如本发明中使用的，FR表示四个子区域之一，FR表示构成框架区域的四个子区域中的两个或更多个。
本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案：Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人,SequencesofProteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))，而Chothia指的是结构环的位置(Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883)，AbM CDR是Kabat CDR和Chothia结构环之间的折中，并且由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用，“接触性”(Contact)CDR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。根据不同的CDR确定方案，这些CDR中的序列可能不同。
本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
本领域技术人员将会理解，抗体重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。
进一步，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。
进一步，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。
在本发明中，术语“同一性”是指与本发明所用氨基酸序列的序列相似性。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。因此，与本发明序列至少90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列均在本发明的保护范围内。
在本发明中，经修饰得到的抗体序列也属于本发明的保护范畴。术语“修饰”是指对氨基酸序列的任何化学修饰，例如氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加。术语“取代”是指由不同的氨基酸替换一个或多个氨基酸。“缺失”是指在氨基酸序列中一个或多个氨基酸的减少。“插入”或“添加”是指在氨基酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸的增加。需要说明的是，本发明提供的修饰抗体中，修饰优选发生在可变区以外的区域，例如发生在抗体的框架区或恒定区，且经过修饰的抗体依然保留本发明抗体或其抗原结合片段的期望的功能特性，或具有改进的与抗原结合的特性。
进一步，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体。
在本发明中，术语“单克隆抗体”，有时也称为“单抗”或Ab，其是指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。这种特性与多克隆抗体制品形成对照，多克隆抗体一般包括针对不同抗原决定簇的抗体。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，但这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
在本发明中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本发明中，术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。抗体人源化改造是增加异源抗体中人源序列比例的过程，优选地，人源化抗体中可变区域存在85％以上，优选90％，进一步优选95％，例如95％、96％、97％、98％，甚至99％以上的人源基因时为人源化抗体。可以理解的是，人源化抗体中的框架区或恒定区可以部分或全部由人类抗体基因所编码。当人源化抗体中可变区域存在85％以下的人源基因时被认为是嵌合抗体。
在本发明中，术语“鼠源抗体”通常是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明中，鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如可以包括通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。
进一步，所述抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv抗体。
在本发明中，“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
在本发明中，“Fc区”含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
在本发明中，“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
在本发明中，“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
本发明的第二方面提供了一种抗体衍生物。
进一步，所述抗体衍生物包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和抗体标志物；所述抗体标志物包括酶、荧光素、同位素、生物素、胶体金、化学发光剂等。
在本发明中，术语“抗体标记物”主要是指将特定抗体与一些化学物质或生物分子结合，使得抗体在光学、放射性或化学等方面的性质发生变化，从而方便检测、定位或纯化目标分子。
在本发明中，抗体标记物中的酶标记是指将酶与抗体结合，利用酶的催化作用来检测目标分子。常用的酶包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。HRP标记的抗体在ELISA(酶联免疫吸附测定)等实验中常用，通过与底物反应产生颜色变化来进行定量检测。
在本发明中，抗体标记物中的荧光标记是指将荧光染料与抗体结合，利用荧光信号来检测目标分子。常用的荧光染料包括荧光素、罗丹明、自发荧光蛋白等。其中，异硫氰酸荧光素(FITC)是最常用的荧光素之一，用于免疫组织化学等实验。
在本发明中，同位素标记是指将放射性同位素与抗体结合，利用放射性衰变来检测目标分子。常用的放射性同位素包括碘-125、碘-131、氘-3等。
在本发明中，生物素标记是指将生物素与抗体结合，利用生物素与亲和素或链霉亲和素的结合来检测目标分子。生物素还可以用于纯化目标分子。生物素-亲和素系统因其高亲和力和级联放大效应，在抗原分析中得到了广泛应用。
在本发明中，胶体金标记是指将胶体金颗粒与抗体结合，利用胶体金的表面等离子共振来检测目标分子。胶体金还可用于电子显微镜和光学显微镜检测。由于其高电子密度特性，胶体金标记在显微镜下可见黑褐色颗粒，检测结果直观易判读。
在本发明中，化学发光标记是指使用化学发光剂直接标记抗体，通过化学发光反应进行检测。常用的标记发光剂是鲁米诺类。
在本发明中，抗体标记物还包括磁性标记，将磁性颗粒与抗体结合，利用磁性信号来检测、分离或富集目标分子。常用的磁性颗粒包括超顺磁性铁氧体和磁性离子等。
本发明的第三方面提供了一种生物材料。
进一步，所述生物材料包括核酸分子、载体、宿主细胞。
进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA(比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA。术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分(例如病毒、核酸或蛋白质)。术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物，其已与至少约50％的当从来源细胞分离总核酸时与核酸分子一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其他材料分离。在一些实施方式中，分离的核酸分子大体上不含任何其他污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现的可干扰其在多肽产生中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其他分子。
进一步，所述载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。
在本发明中，载体指一种人工构建体，其能够在宿主细胞中递送并优选表达一种或多种目的基因或序列。本发明的载体不限定，可以是表达载体、病毒载体等。在某些实施方案中，载体包含编码本发明抗体或其前体的目标基因、启动子、终止子，或可选地进一步包含标记基因。载体可使用已知的载体或自行构建的载体。已知载体包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、AAV病毒载体等。
进一步，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的核酸分子或载体。
本发明中，“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他表示微生物或作为单细胞实体培养的更高级别真核细胞系可以互换使用，其能够用作，或已经用作重组载体或其他转染的DNA的接受者，并且包括已转染的原始细胞的原始子代。所述载体用于表达本发明所述的针对副流感3型Np蛋白的抗体或本发明描述的抗体或其功能片段。在本发明中有用的宿主细胞包括但不限于真核宿主细胞。优选的真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。优选地，哺乳动物宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚胎肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞或MDCK细胞。优选的真菌宿主细胞包括曲霉菌属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、子囊菌酵母属(Yarrowia)和假丝酵母属(Candida)。在本发明的具体实施方式中，宿主细胞是HEK293细胞。
本发明的第四方面提供了一种制备本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法。
进一步，所述方法包括在适于表达抗体的情况下，培养本发明第三方面所述的宿主细胞，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞或培养基中回收所述抗体或其抗原结合片段。
本发明第五方面提供了一种检测副流感病毒或检测副流感病毒NP蛋白的方法。
进一步，所述方法包括将待测样本与本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触，观察待测样本与抗体或其抗原结合片段的免疫反应，以确定样本中副流感病毒NP蛋白的表达水平或副流感病毒感染情况。
在本发明中，术语“样本”以其最广泛的意义使用。在某种情况下，样本包括细胞(例如细菌、酵母和真菌)、有机体、从任何来源获得的试样或培养物，以及生物和环境样品。其中，生物样品可从动物(包括人)获得并且指在其中发现的生物材料或组合物，包括但不限于骨髓、组织间液、尿液、脑脊液、核酸、DNA、血液、血清、血小板、血浆、组织以及其纯化或过滤形式；环境样品包括但不限于水样品、食物样品、空气样品、微生物样品、动物细胞样品、地表物质、土壤样品、晶体样品和工业样品。
本发明的第六方面提供了一种应用。
进一步，所述应用包括以下任一种：
1)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的抗体衍生物、本发明第三方面所述的生物材料在制备检测副流感病毒或副流感病毒NP蛋白产品中的应用；
2)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的抗体衍生物、本发明第三方面所述的生物材料在制备诊断副流感病毒感染的产品中的应用；
3)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的抗体衍生物、本发明第三方面所述的生物材料在制备副流感病毒感染相关疾病的产品中的应用。
进一步，所述副流感病毒包括副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型。
进一步，所述副流感病毒选自副流感病毒3型。
进一步，所述副流感病毒感染相关疾病包括发热、流涕、咽炎、喉炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸衰竭、支气管哮喘。
当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以产品形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的受试者样本的副流感病毒或副流感病毒Np蛋白，以降低测定的复杂性和成本。可使用本发明所述的能够检测样本副流感病毒Np蛋白的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中抗体至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒包括胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒或微流体芯片。需要指明的是本发明所述的检测方法和试剂盒不仅应用于对患者(人、动物)的样品进行检测，也包括对环境中的环境样品包括但不限于水样品、食物样品、空气样品、微生物样品、动物细胞样品、地表物质、土壤样品、晶体样品和工业样品等多种样品的非诊断目的的检测。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种抗副流感病毒3型NP蛋白的抗体，该抗体具有高纯度、高表达量的特点，与副流感病毒3型NP蛋白具有较好的结合活性，能作为筛查副流感病毒的有效检测手段，对感染副流感病毒NP蛋白具有较高的检测准确率。
附图说明
图1是检测副流感3型NP蛋白抗体5B9的电泳图；
图2是检测副流感3型NP蛋白抗体5B9的HPLC图；
图3是ELISA检测副流感3型NP蛋白抗体5B9的结合活性图。
具体实施方式
在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本发明所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
除非另外定义，否则本发明所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本发明所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本发明所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入本发明中。
在本发明中，术语“EC50”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。
在本发明中，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。
在本发明中，术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的内在结合能力。分子X对其结合配偶体Y的亲和力可以由平衡解离常数(KD)表示，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。结合亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。
在本发明中，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 5B9抗体的筛选
1、重组副流感3型NP蛋白的合成
合成副流感3型NP蛋白序列，构建至pet28a载体；抽提转化用质粒；转化大肠杆菌BL21(DE3)，发酵培养；离心收获菌体，破碎离心，缓冲液重悬蛋白沉淀，Ni柱纯化，经过浓缩置换缓冲液，得到副流感3型NP蛋白。重组副流感3型NP蛋白序列来源NCBI，序列如表1所示。
表1重组副流感3型NP蛋白的序列
2、免疫
免疫小鼠，第一次用福氏完全佐剂，每只100ug，腹腔注射，总剂量0.5ml/只，间隔3周进行第二次免疫；第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为50ug/0.5ml/只，间隔2周进行第三次免疫；第三次注射后10天准备细胞融合；
SP2/0融合，取饲养细胞，可按105/孔使用，于融合前一天铺板105个/100μl/孔；取小鼠免疫脾细胞与准备好的骨髓瘤细胞用融合剂PEG进行融合，铺入已经加入饲养细胞的96细胞培养板，100μl/孔。
3、筛选和亚克隆
通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，铺重组副流感3型NP蛋白过夜；洗板，加脱脂奶粉封闭，37℃，1h；洗板，加入100ul 96孔培养液上清，37℃，孵育1h；洗板，加入HRP标记羊抗鼠二抗，37℃，孵育30min；洗板，加入显色液，显色10min，加入终止液，读取OD450的数值；筛选高表达量细胞株进行亚克隆。
4、序列调取
收集细胞，抽提RNA，反转录，设计引物，PCR，转化，挑克隆，送测序。
5、结果
筛选出抗副流感3型NP蛋白抗体5B9，其序列如下所示：
VH(重链可变区)，序列号SEQ ID NO:2
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGGTYYPDSVRGRFTISRDSVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAREGEIYYDYDVKDYYAMDYWGQGTSVTVSS
其中，HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分别为GFTFSSYA、ISSGGGT和AREGEIYYDYDVKDYYAMDY，序列号分别为SEQ ID NO:4、5、6。
VL(轻链可变区)，序列号SEQ ID NO:3
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQLSRELPYTFGGGTKLEIK
其中，LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分别为KSVSTSGYSY、LAS、QLSRELPYT，序列号分别为SEQ ID NO:7、8、9。
实施例25B9抗体的功能性研究
1、抗体的表达
经HEK293瞬转，PEI转染，获得的5B9抗体表达量是225mg/L。
2、抗体的理化性质检测
2.1凝胶电泳检测5B9抗体的纯度
结果如图1所示，从左至右条带分别是marker、还原条带；5B9抗体的检测纯度大于95％。
2.2HPLC检测5B9抗体的纯度
结果如图2所示，5B9抗体的检测纯度大于95％。
3、抗体的结合活性检测
包被NP蛋白，加抗体，加二抗，显色，读数，数据分析。
结合活性结果如图3所示，5B9抗体可以与副流感病毒3型NP蛋白特异性结合，EC50为5.65ng/ml。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种与副流感3型NP蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列；
所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体；
所述抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv抗体。
4.一种抗体衍生物，其特征在于，所述抗体衍生物包含权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段和抗体标记物；所述抗体标记物包括酶、荧光素、同位素、生物素、胶体金、化学发光剂等。
5.一种生物材料，其特征在于，其包括：
1)核酸分子，其编码权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
2)载体，其包含1)所述的核酸分子；
3)宿主细胞，其包含1)所述的核酸分子或2)所述的载体。
6.一种制备权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括在适于表达抗体的情况下，培养权利要求5所述的宿主细胞，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞或培养基中回收所述抗体或其抗原结合片段。
7.一种检测副流感病毒或检测副流感病毒NP蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括将待测样本与权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，观察待测样本与抗体或其抗原结合片段的免疫反应，以确定样本中副流感病毒NP蛋白的表达水平或副流感病毒感染情况。
8.一种应用，其特征在于，所述应用包括以下任一种：
1)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的抗体衍生物、权利要求5所述的生物材料在制备检测副流感病毒或副流感病毒NP蛋白产品中的应用；
2)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的抗体衍生物、权利要求5所述的生物材料在制备诊断副流感病毒感染的产品中的应用；
3)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的抗体衍生物、权利要求5所述的生物材料在制备副流感病毒感染相关疾病的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述副流感病毒包括副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型；
优选地，所述副流感病毒选自副流感病毒3型。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述副流感病毒感染相关疾病包括发热、流涕、咽炎、喉炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸衰竭、支气管哮喘。
CN202411146182.3A 2024-08-20 2024-08-20 一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用 Active CN118772269B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411146182.3A CN118772269B (zh) 2024-08-20 2024-08-20 一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411146182.3A CN118772269B (zh) 2024-08-20 2024-08-20 一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN118772269A true CN118772269A (zh) 2024-10-15
CN118772269B CN118772269B (zh) 2025-04-01

Family

ID=92989438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411146182.3A Active CN118772269B (zh) 2024-08-20 2024-08-20 一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118772269B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114957481A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 华夏英泰（北京）生物技术有限公司 针对cd19和cd22的双靶点star
CN116789811A (zh) * 2023-06-15 2023-09-22 郑州伊美诺生物技术有限公司 抗i型人副流感病毒的单克隆抗体及其制备方法和应用
US20230406925A1 (en) * 2022-04-22 2023-12-21 Phylaxis Bioscience, Llc Siglec-8 binding proteins and uses thereof
CN117448279A (zh) * 2023-09-27 2024-01-26 清华大学深圳国际研究生院 分泌抗人副流感病毒3型n蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒
WO2024148337A1 (en) * 2023-01-05 2024-07-11 Angeles Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene transduction and to control the activity of synthetic and immune receptors

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114957481A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 华夏英泰（北京）生物技术有限公司 针对cd19和cd22的双靶点star
US20230406925A1 (en) * 2022-04-22 2023-12-21 Phylaxis Bioscience, Llc Siglec-8 binding proteins and uses thereof
WO2024148337A1 (en) * 2023-01-05 2024-07-11 Angeles Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene transduction and to control the activity of synthetic and immune receptors
CN116789811A (zh) * 2023-06-15 2023-09-22 郑州伊美诺生物技术有限公司 抗i型人副流感病毒的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN117448279A (zh) * 2023-09-27 2024-01-26 清华大学深圳国际研究生院 分泌抗人副流感病毒3型n蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈金龙;黄兴军;郝胜楠;张德普;王金良;沈志强;: "山羊副流感病毒3型NP蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立", 中国兽医学报, no. 08, 15 August 2020 (2020-08-15) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN118772269B (zh) 2025-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112250763B (zh) 靶向SARS-CoV-2冠状病毒的抗体及其诊断和检测用途
WO2022007304A1 (zh) 能够特异性识别RBD蛋白的IgA抗体以及试剂盒
JP5941615B2 (ja) ヒトｃｘｃｌ１タンパク質の免疫学的測定方法
CN112010981B (zh) 一种小鼠抗人IgG单克隆抗体
CN115028713A (zh) 一种抗冠状病毒n蛋白的抗体及其应用
CN109336973B (zh) 抗转铁蛋白抗体及其用途
CN116143931B (zh) 一种抗人IgM抗体及其制备方法和用途
CN115286715B (zh) 一种抗cd3的纳米抗体或其抗原结合部分及其制备方法
WO2023241416A1 (zh) 抗p24抗体、检测p24的试剂和试剂盒
CN118772269B (zh) 一种抗副流感病毒3型np蛋白的抗体及其应用
WO2023088444A1 (zh) 一种抗hiv-1 p24的抗体及其制备方法和用途
JP5770092B2 (ja) ヒトｈｉｇ１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体
CN119143871B (zh) 用于人偏肺病毒检测的单克隆抗体、检测试剂及其应用
CN118930643B (zh) 副流感3型np蛋白抗体6d3
CN116496394B (zh) 抗s100蛋白的抗体、检测s100蛋白的试剂和试剂盒
CN118725120B (zh) 一种抗人l1cam蛋白的抗体及其应用
US20190375834A1 (en) Disulfide-type hmgb1-specific antibody, method for measuring disulfide-type hmgb1 and kit for said measurement, and measurement method capable of quantitating all of hmgb1 molecules including reduced hmgb1, disulfide-type hmgb1 and thrombin-cleavable hmgb1 and kit for said measurement
CN118440198B (zh) 抗人cd69蛋白的兔单克隆抗体及其应用
CN115825415B (zh) 阻断剂和体外免疫诊断产品、应用
CN114213542B (zh) Cps-i抗体及其用途
CN115677851B (zh) 一种免疫阻断抗体或其抗原结合片段及其应用
JP7366411B2 (ja) ヒトαディフェンシンＨＤ５を検出する方法及びキット、並びにこれらにおいて用いられる抗体
JP5448424B2 (ja) ヒトＩｇＧのＦｃを含有するタンパク質の測定試薬
JPWO2009022632A1 (ja) 新規肝癌マーカー
CN119684465A (zh) 人免疫球蛋白G2亚型（IgG2）兔单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant