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CN103890173A - 抗体和含有抗体的组合物 - Google Patents

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Abstract

对于许多由细菌等介导的疾病，细菌的增殖是引起疾病的原因之一，而有时候，细菌释放的物质也可成为疾病的起因。在后一种情况中，当疾病待被抗体治疗时，需要利用作为抗原的为疾病起因的物质制备抗体。然而难以从细菌释放的物质中获取至关重要的为疾病起因的物质。然后，用由裂解作为抗原的细菌的细胞制得的裂解液免疫鸟类物种，以产生能够结合抗原以及由抗原分泌并能够加速病症恶化的物质的（多克隆的）抗体。利用作为抗原的病毒的表面蛋白制得的抗体预期能抑制病毒的感染。

Description

抗体和含有抗体的组合物
技术领域
本发明涉及一种针对作为抗原的微生物细胞的抗体，以及含有抗体的由抗体和基质（base）组成的组合物。本发明还涉及一种针对作为抗原的病毒的表面蛋白的抗体，以及含有抗体的由抗体和基质组成的组合物。
背景技术
由于抗体选择性地结合抗原，因此抗体被应用于各个领域。例如，已知的有靶向抗原的分析和使抗原失活的疫苗的应用。此外，也已知用于过滤器中，其中，过滤器捕获通常悬浮于大气中的过敏原物质，例如微生物、真菌或花粉。
专利文件1公开了一种载有抗体的过滤器的发明，所述抗体用于捕获有害物质和有机化合物的银盐。专利文件1不仅仅公开了捕获微生物等或使微生物等失活，还公开了真菌和微生物在载体上不能重新增殖。
专利文件1：日本公开特许公报NO.2009-233557
发明内容
发明解决的问题
已知有多种获得抗体的方法。例如，如下方法是公知的：利用抗原免疫小鼠，将从小鼠获得的产生抗体的细胞与无限增殖化的细胞融合以形成杂交瘤细胞，然后培养杂交瘤细胞而获得抗体（单克隆的）。
此外，免疫卵生动物（包括鸟类）而从它们的蛋中获得抗体的方法是公知的。然而，过去只能获得仅仅针对靶抗原的抗体。
同时，对于由微生物等引起的许多疾病，虽然微生物本身的增殖是引发病症的原因，微生物释放的物质也能够成为引发病症的原因。在这些情况下，当试图利用抗体治疗疾病时，需要获得针对抗原（即引发疾病的物质）的抗体。但是，很难从微生物释放的物质中获取引发疾病的决定性物质。
另外，虽然近年来已经开发了各种各样的抗生素和灭菌剂用于皮肤疾病，许多固有的细菌被这些抗生素或灭菌剂杀灭或清除。因此，已知这会引起皮肤微生物环境的恶化，从而使皮肤疾病加剧。基于这个原因，必须仅抑制固有微生物中的病原菌。然而，具有这种选择性的材料还有待在实际应用中加以开发。
抗体是具有特异性结合抗原的特征的蛋白质。因此，设想抗体仅仅能够选择性结合身体表面或身体中存在的众多微生物中特定的病原菌，从而抑制特定病原菌的增殖或杀灭特定的病原菌。也就是说，只有不利的微生物而不是保护皮肤的固有细菌（有益细菌）受到抗体攻击，因此，预期能够缓解损伤或病症。
基于相似的理由，对于不利于人体通过皮肤或粘膜感染的病毒，预期可以通过在进入身体之前于身体表面使抗体结合这种病毒而减轻感染。
解决问题的方式
基于上述问题设计了本发明。通过发现抗体（多克隆的）不仅仅与抗原结合，还与由微生物细胞分泌用作抗原并加速病症恶化的物质结合，通过采用裂解作为抗原的微生物细胞获得的裂解液免疫鸟类而获得所述抗体，从而完成了本发明。更具体地，本发明的抗体是针对作为抗原的微生物细胞的裂解液的抗体。
此外，通过发现与病毒的表面结合的抗体可以通过采用作为抗原的病毒的表面上的蛋白质免疫鸟类而获得，从而完成了本发明。更具体地，本发明的抗体是针对作为抗原的病毒的表面蛋白的抗体。
另外，含有所述抗体和基质的含有抗体的组合物能够通过直接在皮肤上施用而获得抗体的作用。
发明的有益效果
关于本发明的抗体，可能获得了与微生物细胞和物质结合的抗体，所述物质从微生物细胞引发病症的发展，尽管只采用微生物细胞进行免疫。因此，无需采用不同的物质作为抗原来获得抗体。
此外，本发明的抗体为针对作为抗原的病毒的表面蛋白的抗体。因此，所述抗体能够与病毒的表面结合并减轻对人体的感染。
另外，还发现了通过直接施用于皮肤，使用本发明的抗体和基质的含有抗体的组合物具有缓解遗传性过敏症（atopy）或痤疮的效果。
附图说明
图1为显示本发明的抗体在抑制细菌增殖中的作用的实验结果图；
图2为显示本发明的抗体在抑制细菌增殖中的作用的照片。
具体实施方式
以下示出了本发明的具体实施例。
实施例1
细菌
应用到实施例中以证明本发明效果的两种类型的细菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，NBRC102135）（在下文中，称为S.aureus）和痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，NBRC107605）（在下文中，称为P.acnes）。
将以上描述的每种细菌的培养基悬浮液离心并沉淀。去除培养基溶液，加入磷酸盐缓冲液重悬所述细菌，并通过均质器将细菌细胞裂解。使用裂解液（匀浆）作为抗原免疫鸵鸟（ostrich）。
鸵鸟的免疫
将100μg（以蛋白质丰度计）的每种以上描述的匀浆与弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant）混合，并将混合物接种在雌鸵鸟腰椎区域的肌肉中，作为初级免疫。以后，使用上述描述的两种类型的匀浆进行每隔一周3次的给药作为初级免疫后的增强免疫。将100μg的细菌匀浆溶液与弗氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant）混合，将该混合物接种在已经免疫的雌鸵鸟腰椎区域的肌肉中。
抗体的纯化
从增强免疫后两周或更长时间的鸵鸟产的鸵鸟蛋中纯化抗体。以下示出了纯化抗体的方法。如下从蛋黄中进行抗体（IgY）的纯化。
首先，向蛋黄中加入5倍蛋黄量的TBS（20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，和0.5%NaN3）和等量的10%的葡聚糖硫酸酯/TBS，并将混合物搅拌20分钟。另外，加入与蛋黄等量的1M CaCl2/TBS，将混合物搅拌并孵育12小时。此后，将混合物在15000rpm下离心20分钟，收集上清。接下来，加入硫酸铵至终浓度为40%，并将混合物在4℃孵育12小时。之后，将混合物在15000rpm下离心20分钟，收集沉淀。最后，将沉淀重悬在与蛋黄等量的TBS中，并用TBS透析。通过这种工艺能够收集纯度为90%或以上的IgY。一个蛋黄中能够纯化2-4g的IgY。
通过ELISA测定
通过以下ELISA测定获得的抗体的抗体反应性
将100μL2μg/mL的每种细菌细胞（S.aureus或P.acnes）、S.aureus的肠毒素、S.aureus的TSST-1、凝固酶和蛋白酶加入用于ELISA的96孔微孔板的每个孔中，并在室温下孵育2小时。使用PBS洗涤3次后，在每个孔中加入100μL商购的封闭液（Block Ace:Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.），并将混合物孵育2小时。使用PBS洗涤3次后，在每个孔中加入50μL免疫前和免疫后的鸵鸟IgY抗体的系列稀释的溶液（含有2mg/mL的储液，2倍系列稀释，例如，100倍、200倍等），并在室温下孵育1小时。
使用PBS洗涤3次后，在每个孔中加入100μL过氧化物酶标记的抗鸵鸟IgY兔多克隆抗体（自产的），并孵育45分钟。使用PBS洗涤3次后，用商购的用于过氧化物酶的荧光试剂盒（luminescence kit）（SumitomoBakelite Co.,Ltd），荧光（luminescence）发射30分钟后，使用用于ELISA的酶标仪测定吸光度（450nm）。获得的结果以最大稀释比例表示，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前IgY的吸光度的2倍或以上。
表1示出了通过使用S.aureus细胞的匀浆溶液免疫获得的鸵鸟蛋黄抗体的活性（ELISA）的结果。每个数值均在最大稀释比例处，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前的从鸵鸟的蛋黄中获得的IgY的吸光度的2倍或以上。因此，数值的单位为“倍数”。例如，对于肠毒素，意味着，即使当稀释12,800倍时，与未使用匀浆溶液免疫的鸵鸟蛋黄抗体相比，吸光度值仍为2倍以上。这表明，获得了具有该程度的高滴定度的抗体。
表1
S.aureus细胞 肠毒素 TSST-1 凝固酶 蛋白酶
6,400 12,800 51,200 51,200 102,400
具有高滴定度的抗体不但能够针对微生物细胞，还能够针对使用S.aureus细胞的匀浆溶液免疫鸵鸟产生的肠毒素、特级抗原TSST-1、凝固酶和蛋白酶。肠毒素、特级抗原TSST-1、凝固酶和蛋白酶是促进来自S.aureus细胞的病变的恶化的因子，通过简单地接种微生物细胞容易获得针对它们的抗体是可能的。
表2示出了通过使用P.acnes细胞的匀浆溶液免疫鸵鸟获得的鸵鸟蛋黄抗体的ELISA的结果。和以上相似，数值在最大稀释比例处，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前IgY的吸光度的2倍或以上。因此，数值的单位为“倍数”。没有获得促进病变的因子，例如肠毒素的结果。然而，P.acne细胞显示出了高滴定度。
表2
P.acnes细胞 肠毒素 TSST-1 凝固酶 蛋白酶
12,800 — — — —
鸵鸟蛋黄抗体的细菌增殖抑制效果（通过PFU评估）
培养前，将鸵鸟蛋黄抗体与细菌溶液（S.aureus或P.acnes）混合，使浓度为1mg/mL，在琼脂培养基（0.1mL的细菌溶液培养在半径为10cm的有盖培养皿中）中培养每种混合物18小时。对细菌克隆进行计数以计算PFU（斑形成单位数）。其结果示于图1中。图1（a）为S.aureus的，图1（b）为P.acnes的。横轴表示免疫前的抗体的情况和免疫后的抗体的情况。纵轴为PFU（×105/100μL）。两种抗体均抑制为抗原的细菌的增殖。
鸵鸟蛋黄抗体的细菌增殖抑制效果（通过琼脂培养基评估）
培养前，将鸵鸟蛋黄抗体（用S.aureus免疫获得的抗体）与S.aureus的溶液混合，使浓度变为1mg/mL，在琼脂培养基（0.1mL的细菌溶液培养在半径为10cm的有盖培养皿中）中培养混合物18小时。结果示于图2的照片中，图2为免疫前（图2（a）左图）和免疫后（图2（b）右图）的混合抗体的结果。能够理解的是，通过与免疫抗体混合，细菌克隆的数量明显减少了，即，抗体抑制了细菌的增殖。
鸵鸟抗体对遗传性过敏症和痤疮的影响
将通过用S.aureus或P.acnes免疫制备的鸵鸟蛋黄抗体与凡士林（petrolatum）（基质）混合（调节抗体浓度至50μg/mL），并将混合物作为药膏涂覆在患有遗传性过敏症或痤疮的患者的感染区域。每天两次连续使用所述混合物，一周后观察感染区域的状况。在对照患者上只使用基质。结果示于表3中。在该表中，“S.aureus抗体”表示通过使用作为抗原的S.aureus细胞的匀浆溶液获得的抗体，“P.acnes抗体”表示通过使用作为抗原的P.acnes细胞的匀浆溶液获得的抗体。另外，“混合抗体”指“S.aureus抗体”和“P.acnes抗体”以50：50的比例混合，其中，混合抗体与基质混合（将全部抗体的浓度调节至50μg/mL）。
表3
抗体名称 遗传性过敏症症状的缓解 痤疮症状的缓解
S.aureus抗体 73%（49/67） 13%（5/39）
P.acnes抗体 17%（11/65） 69%（34/49）
混合抗体 81%（50/76） 59%（30/51）
仅基质 16%（12/76） —
含有抗体的药膏缓解了症状。进一步，含有两种类型的抗体混合的药膏对特应症和痤疮均有效果。括号中的数值表示在确认症状的病例数中缓解的病例数。例如，（49/67）表示，在67个病例中观察到49个缓解了症状。转化为百分数时为73%。
实施例2
由于感染后病毒进入细胞，使用抗体抑制其增殖和发展是困难的。然而，期望的是，在感染前，通过将抗体结合到病毒的表面以改变表面状况，病毒感染本身能够被抑制。具体的，病毒感染通常通过互相接触的黏膜发生。因此，期望的是，通过在这种行为前，应用针对黏膜的抗体能够显著的抑制感染。
以下为实验的总结。使用艾滋病（AIDS）病毒和乳头瘤病毒作为实例。艾滋病病毒为包裹在球形衣壳中的病毒，其表面具有gp120和gp41蛋白。另外，乳头瘤病毒为环状双链病毒，并为非衣壳类病毒。另外，部分乳头瘤病毒具有L1蛋白。
对于艾滋病病毒，使用gp120及其前体pg160作为抗体。对于乳头瘤病毒，使用L1。由于对病毒进行细胞培养不易，因此，通过杆状病毒利用基因工程生产作为重组蛋白的这些蛋白。
另外，使用产生的蛋白作为抗原免疫雌鸵鸟以获得鸵鸟产的蛋。从该蛋中纯化抗体，并通过ELISA检测其滴定度。以下提供了详细说明。
人类免疫缺陷病毒（以下称为“HIV”）抗原
使用HIV、通过杆状病毒利用基因工程产生的重组蛋白HIV gp120和HIV160的表面蛋白作为抗原，而不使用HIV本身。HIV gp120和HIV gp160为HIV需要的感染人类细胞的蛋白。因此，设想，如果产生针对这些蛋白的抗体，HIV感染便能够被抑制。使用50μg的HIV gp120和50μg的HIV gp160的混合物用于鸵鸟的免疫。
人类乳头瘤病毒（以下称为“HPV”抗原）
使用诱导宫颈癌的HPV类型6,11,16和18（抗原的总共4种类型）。使用通过杆状病毒利用基因工程产生的病毒的L1蛋白（重组蛋白）作为抗原，而不使用HPV本身。使用上述抗原的4种类型的混合物（每种40μg）用于鸵鸟的免疫。
根据常规的方法生产重组蛋白。具体的，使用病毒的cDNA，通过PCR仅扩增L1蛋白区域，并将其产物引入到杆状病毒载体中。然后将该载体引入到桑蚕细胞（Sf9）中，从培养溶液及其细胞提取物中纯化重组蛋白。
鸵鸟的免疫
使用HIV和HPV的每一种免疫独立的鸵鸟。将100μg以蛋白丰度计的以上描述的病毒抗原与弗氏完全佐剂混合，并将混合物接种在雌鸵鸟腰椎区域的肌肉中，作为初级免疫。另外，使用以上描述的两种病毒进行每隔一周3次的给药作为初级免疫后的增强免疫。将100μg的抗原与弗氏不完全佐剂混合，将该混合物接种在雌鸵鸟腰椎区域的肌肉中。
抗体的纯化
从增强免疫后两周或更长时间的鸵鸟产的鸵鸟蛋中纯化抗体。以下示出了纯化抗体的方法。
以下示出了从蛋黄中进行抗体（IgY）的纯化。首先，向蛋黄中加入5倍蛋黄量的TBS（Tris缓冲盐水：20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，和0.5%NaN3）和等量的10%的葡聚糖硫酸酯/TBS，并将混合物搅拌20分钟。另外，加入等量的1M CaCl2/TBS，将混合物搅拌并孵育12小时。此后，将混合物在15000rpm下离心20分钟，收集上清。
接下来，加入硫酸铵至终浓度变为40%，并将混合物在4℃孵育12小时。之后，将混合物在15000rpm下离心20分钟，收集沉淀。最后，将沉淀重悬在与蛋黄等量的TBS中，并用TBS透析。通过这种工艺能够收集纯度在90%或以上的IgY。一个蛋黄中能够纯化2-4g的IgY。
通过ELISA测定
通过以下ELISA测定获得的抗体的抗体反应性。将100μL2μg/mL的每种HIV gp120，HIV gp160，HPV类型6，11，16和18加入用于ELISA的96孔微孔板的每个孔中，并在室温下孵育2小时。
使用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤3次后，在每个孔中加入100μL商购的封闭液（Block Ace:Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.），并将混合物孵育2小时。使用PBS洗涤3次后，在每个孔中加入50μL免疫前和免疫后的鸵鸟IgY抗体的系列稀释的溶液（含有2mg/mL的储液，大量连续进行的（wadcontinuously performed）2倍系列稀释，例如，100倍、200倍…），并孵育1小时。
使用PBS洗涤3次后，在每个孔中加入过氧化物酶标记的抗鸵鸟IgY兔多克隆抗体（自产的），并将混合物孵育45分钟。使用PBS洗涤3次后，用商购的用于过氧化物酶的荧光试剂盒（Sumitomo Bakelite Co.,Ltd），荧光发射30分钟后，使用用于ELISA的酶标仪测定吸光度（450nm）。获得的结果以最大稀释比例表示，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前IgY的吸光度的2倍或以上。
乳液混合物
将以上描述的鸵鸟蛋黄抗体（HIV，HPV）混合为乳液（直接用于性交或也用于避孕套表面）。1mg的鸵鸟蛋黄抗体与10mL的乳液（组分：水、甘油、乙醇、聚丙烯酸钠、羟乙基纤维素、苯氧乙醇、EDTA-2Na、对羟基苯甲酸酯、聚山梨醇酯80、脂肪酸酯）混合。通过以上描述的ELISA，相似的测定混合乳液中的抗体的活性（HIV和HPV的每种抗原）。
结果
表4示出了用于HIV gp120和HIV gp160的情况的ELISA的结果。表中的数值为最大稀释比例，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前的抗体的吸光度值的2倍或以上。发现，产生了针对HIV感染中重要因子的HIVgp120和HIV gp160的具有高滴定度的抗体。另外，发现，即使当混合为乳液时，抗体的活性也没有丢失。
表4
Figure BDA0000467355150000101
表5显示了用于HPV的ELISA结果。与表4相似，表中的数值为最大稀释比例，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前的抗体的吸光度的2倍或以上。HPV类型6,11,16和18诱导人类宫颈癌。在鸵鸟中，发现，产生了针对这种病毒的L1蛋白（感染的重要蛋白）的具有高滴定度的抗体。另外，即使当混合为乳液时，也显示了针对每种HPV抗原的高反应性。
表5
Figure BDA0000467355150000111
工业应用
本发明的抗体能够应用于其他皮肤本土细菌，例如，微球菌或引起脚癣的致病微生物毛发癣菌，以抑制或治疗通过交配（接触感染）感染的病原体的感染，例如，HIV、衣原体和疱疹病毒，以及应用到用于由花粉（雪松、龙柏、豚草）引起的过敏的缓和剂或治疗剂（乳液、滴鼻剂、滴眼剂）。
另外，本发明的抗体不但能够广泛的用作针对AIDS病毒和乳头瘤病毒的感染抑制剂，还能够用作针对具有已知表面蛋白的病毒的感染抑制剂。

Claims (12)

1.一种针对抗原的抗体，所述抗原为微生物细胞的裂解液。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为从由作为抗原的微生物细胞的裂解液进行免疫的鸟类的蛋中获得的IgY。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中，所述鸟类为鸵鸟。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗体，其中，所述微生物细胞为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗体，其中，所述微生物细胞为痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）。
6.一种针对抗原的抗体，所述抗原为病毒的表面蛋白。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中，所述抗体为从由作为抗原的蛋白质进行免疫的鸟类的蛋中获得的IgY。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，所述鸟类为鸵鸟。
9.根据权利要求6-8中任意一项所述的抗体，其中，所述蛋白质包括HIV gp120。
10.根据权利要求6-8中任意一项所述的抗体，其中，所述蛋白质包括6、11、16或18型HPV中的任意一种。
11.一种含有抗体的组合物，该含有抗体的组合物含有权利要求1-10中任意一项所述的抗体和基质。
12.根据权利要求11所述的含有抗体的组合物，其中，所述基质为矿脂。
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