TW201313248A

TW201313248A - 抗體及含抗體之組成物

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Publication number: TW201313248A
Application number: TW101129893A
Authority: TW
Inventors: Yasuhiro Tsukamoto
Original assignee: Ostrich Pharma Kk
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2013-04-01
Also published as: JP2019006817A; JP6441782B2; AU2012298125A1; JP5845265B2; TWI548420B; JPWO2013027356A1; US20190016788A1; CN103890173A; MY166794A; US9828419B2; US11041016B2; KR20160108593A; EP2746394A1; KR101911229B1; JP6830462B2; US10428138B2; US10106599B2; US20180066042A1; AU2012298125B2; US20190375827A1

Abstract

對於多數由細菌等導致之疾病而言，細菌本身之繁殖為症狀之原因之一，亦存在細菌所釋放之物質為原因之情形。此種情形時，若欲利用抗體治療疾病，則需要以原本之原因物質作為抗原而獲得抗體。但是，於細菌所釋放之物質中難以找出根本性之原因物質。藉由以粉碎菌體所獲得之粉碎液作為抗原來免疫鳥類，而獲得不僅與抗原結合，亦與抗原分泌之促進症狀惡化之物質結合的抗體(多株)。又，期待以病毒之表面蛋白質作為抗原而獲得之抗體可抑制病毒之感染。

Description

抗體及含抗體之組成物

本發明係關於一種以菌體作為抗原之抗體及包含該抗體與基材之含抗體之組成物。又，本發明係關於一種以病毒之表面蛋白質作為抗原之抗體及含有該抗體與基劑之含抗體之組成物。

由於抗體選擇性地與抗原結合，故而被應用於各種領域。例如已知有以抗原為目標之分析，或用於使抗原失活之疫苗用途。又，亦已知有應用於捕捉經常性地漂浮於空氣中之細菌、黴菌、花粉等過敏原物質之過濾器之情形。

專利文獻1中揭示有於過濾器上擔載捕捉該等有害物質之抗體與有機化合物之銀鹽的發明。該文獻中揭示了：不僅捕捉細菌等，進而使該等細菌失活，而且於該擔載體上，亦不新繁殖黴菌或細菌。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2009-233557號公報

已知有若干種獲得抗體之方法，例如已知有：利用抗原免疫小白鼠，使自該小白鼠獲得之產生抗體之細胞與不死細胞融合，成為融合瘤後，培養該融合瘤而獲得抗體(單株)之方法。

又，亦已知有利用抗原免疫以鳥類為主之卵生動物，並自其卵獲得抗體之方法。然而，先前僅可獲得針對作為目標之抗原的抗體。

另一方面，對於多數由細菌等導致之疾病而言，細菌本身之繁殖為症狀之原因之一，亦存在細菌所釋放之物質為原因之情形。此種情形時，若欲利用抗體治療疾病，則需要以原本之原因物質作為抗原來獲得抗體。但是，於細菌所釋放之物質中難以找出根本性之原因物質。

又，已知近來業界開發出各種抗生物質及消毒劑用於皮膚疾病，但由於殺死及除去多數常在菌，導致皮膚之細菌環境惡化，而使皮膚疾病惡化。因此，需要僅抑制常在菌中之病原體，但如此具有選擇性之材料尚未實用化。

一般認為，抗體係具有與抗原特異性結合之性質的蛋白質，可選擇性地與多數存在於體表或體內之微生物中之特定病原體結合，而抑制其增殖或使其死亡。即，若抗體可僅攻擊有害菌而非攻擊保護皮膚之常在菌(益生菌)，則結果可期待病變、症狀之減輕。

又，基於同樣見解，藉由使通過皮膚或黏膜而感染之對人體有害之病毒在進入體內前於體表與抗體結合，結果亦可期待感染之減輕。

本發明係鑒於上述課題而創造之發明，發現藉由以粉碎菌體之粉碎液作為抗原來免疫鳥類，獲得不僅與抗原結合，亦與作為抗原之菌體分泌之促進症狀惡化之物質結合的抗體(多株)，從而完成本發明。更具體而言，本發明之抗體係以菌體之粉碎液作為抗原之抗體。

又，發現藉由以病毒之表面之蛋白質作為抗原來免疫鳥類，可獲得與病毒之表面結合之抗體，從而完成本發明。更具體而言，本發明之抗體係以病毒之表面蛋白質作為抗原之抗體。

又，使基劑含有該等抗體的本發明之含抗體之組成物可藉由直接塗敷於皮膚上而獲得抗體之效果。

本發明可獲得儘管僅免疫菌體，但亦與菌體及利用菌體而使症狀進行之物質結合的抗體。因此，無需以各種物質作為抗原而獲得抗體。

又，由於本發明之抗體係以病毒之表面之蛋白質作為抗原之抗體，因此可與病毒之表面結合而降低其對人體之感染。

又，得知使用本發明之抗體與基劑之含抗體之組成物藉由直接塗敷於皮膚上而具有減輕異位性皮炎或痤瘡之效果。

以下，例示本發明之具體之實施例。

[實施例1] <細菌>

於顯示本發明之效果之實施例中，作為對象之細菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，NBRC102135)(以下記為S.aureus)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes，NBRC107605)(以下記為P.acnes)兩種。

分別對上述細菌之培養懸浮液進行離心分離而使之沉澱。除去培養液，添加磷酸緩衝液而使細菌懸浮，利用均質機將細菌菌體粉碎。以該粉碎液(勻漿)作為抗原來免疫鴕鳥。

<對鴕鳥之免疫>

首次免疫係於弗氏完全佐劑中混合蛋白質量為100 μg之上述各勻漿，並接種至雌鴕鳥之腰部之肌肉內。其後，作為追加免疫，於首次免疫後，每隔一週將上述兩種勻漿共同追加免疫3次。再者，於該追加免疫之情形時，亦於弗氏不完全佐劑中混合100 μg之細菌勻漿液，並接種至已進行免疫之雌鴕鳥之腰部之肌肉內。

<抗體之精製>

自追加免疫2週以後產下之鴕鳥卵精製抗體。抗體之精製法如下所示。來自卵黃之抗體(IgY)之精製係藉由以下方式進行。

首先，於卵黃中添加5倍量之TBS(tris-buffered saline，三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽水)(20 mM之Tris-HCl，0.15 M之NaCl，0.5%NaN₃)與等量之10%硫酸葡聚糖/TBS，攪拌20分鐘。其後，添加與卵黃等量之1 M之CaCl₂/TBS進行攪拌，並靜置12小時。其後，以15000 rpm離心20分鐘，回收上清液。其次，以最終濃度達到40%之方式添加硫酸銨，並於4℃下靜置12小時。其後，以15000 rpm離心20分鐘，回收沉澱物。最後，將其再懸浮於與卵黃等量之TBS中，利用TBS進行透析。藉由該過程可回收純度為90%以上之IgY。自1個卵黃可精製2~4 g之IgY。

<利用ELISA法進行之測定>

藉由以下之ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，聯酶免疫測定法)，測定所得之抗體之抗原反應性。

向ELISA用96孔微量盤之各孔(well)中分別添加2 μg/mL之細菌菌體(S.aureus、P.acnes)、S.aureus之腸毒素(enterotoxins)、S.aureus之TSST-1(Toxic Shock Syndrome Toxin-1，中毒性休克症候群毒素-1)、凝固酶、及蛋白酶各100 μl，於室溫下放置2小時。其後，利用PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝溶液)清洗3次後，於各孔中添加100 μl之市售之阻斷溶液(Block Ace，大日本住友製藥)並放置2小時。其後，利用PBS清洗3次後，於各孔中添加50 μl之免疫前及免疫後之鴕鳥IgY抗體之連續稀釋液(以2 mg/mL作為原液，進行稀釋至100倍、200倍、……倍之 2倍連續稀釋)，於室溫下放置1小時。

其後，利用PBS清洗3次後，於各孔中添加100 μl之過氧化酶標記抗鴕鳥IgY．兔多株抗體(自製)，放置45分鐘。利用PBS清洗3次後，利用市售之過氧化酶用顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite)顯色30分鐘，利用ELISA用讀板儀測定吸光度(450 nm)。所得之結果以達到免疫前之IgY之吸光度值之2倍以上之最高稀釋倍率表示。

表1表示用S.aureus菌體之勻漿液進行免疫而獲得之鴕鳥卵黃抗體之反應性(ELISA)的結果。由於各數值係達到自免疫前之鴕鳥之卵黃所獲得之IgY之吸光度值之2倍以上的最高稀釋倍率，因此單位為「倍」。例如，對於腸毒素而言，係指與未以勻漿液免疫之情形時之鴕鳥卵黃抗體相比，即便稀釋12,800倍，亦存在2倍以上之吸光度值。此表示獲得效價如此高之抗體。

藉由用S.aureus菌體之勻漿液來免疫鴕鳥，而產生不僅對菌體，對腸毒素、超級抗原TSST-1、凝固酶、蛋白酶之效價亦較高之抗體。腸毒素、超級抗原TSST-1、凝固酶、蛋白酶係使由S.aureus菌體導致之病變惡化進行的因素，可僅藉由接種菌體而簡單地獲得針對該等之抗體。

表2表示關於藉由用P.acnes菌體之勻漿液來免疫鴕鳥而獲得之鴕鳥卵黃抗體之ELISA的結果。由於數值與上述相同，係達到免疫前之IgY之吸光度值之2倍以上的最高稀釋倍率，故而單位為「倍」。雖然未獲得對腸毒素等使病變進行之因素之結果，但對P.acnes菌體顯示高效價。

<鴕鳥卵黃抗體之細菌增殖抑制效果(藉由PFU進行之評價)>

以達到1 mg/mL之方式於培養前之細菌液(S.aureus、P.acnes)中混合鴕鳥卵黃抗體，分別利用洋菜培養基(於半徑10 cm之培養皿中培養細菌液0.1 ml)培養18小時。對細菌之菌落進行計數，算出PFU(plaque-forming units，溶菌斑形成單位)。將其結果示於圖1。圖1(a)為S.aureus之情形，圖1(b)為P.acnes之情形。橫軸表示免疫前抗體之情形與免疫後抗體之情形。縱軸為PFU(×10⁵/100 μL)。任一抗體均抑制作為抗原之細菌之增殖。

<鴕鳥卵黃抗體之細菌增殖抑制效果(利用洋菜培養基進行之評價)>

以達到1 mg/mL之方式於培養前之S.aureus液中混合鴕鳥卵黃抗體(利用S.aureus進行免疫而獲得之抗體)，利用洋菜培養基(於半徑10 cm之培養皿中培養細菌液0.1 ml)培養 18小時。結果如圖2之照片所示。為混合免疫前抗體(圖2(a)左照片)及免疫後(圖2(b)右照片)之抗體之結果。得知藉由免疫抗體之混合，細菌之菌落(白點)數明顯減少。即，利用抗體使細菌之增殖受到抑制。

<鴕鳥抗體對異位性皮炎及痤瘡之效果>

於凡士林(基劑)中混合(以抗體濃度達到50 μg/mL之方式進行調整)藉由S.aureus、P.acnes之免疫而製作之鴕鳥卵黃抗體，製成軟膏，並塗佈於異位性皮炎及痤瘡患者之患部。一天兩次連續使用，觀察第一週之患部之狀態。比較對象僅使用基劑。將結果示於表3。此處，「S.aureus抗體」表示以S.aureus菌體之勻漿液作為抗原而獲得之抗體，「P.acnes抗體」表示以P.acnes菌體之勻漿液作為抗原而獲得之抗體。「混合抗體」係將以50：50混合「S.aureus抗體」與「P.acnes抗體」成者混合(以全部抗體濃度達到50 μg/mL之方式進行調整)至基劑中者。

添加有抗體之軟膏使症狀減輕。又，混合兩種抗體之軟膏對異位性皮炎與痤瘡均有效果。再者，括號內之數字表示於症例數中確認症狀減輕之症例數。例如，(49/67)表示於67 症例中，有49例確認症狀減輕。若將其換算為百分數，則為73%。

[實施例2]

病毒感染後會進入細胞內，因此利用抗體難以抑制其增殖或發病。但是，藉由於感染前使抗體結合於病毒表面而改變表面狀態，可期待抑制病毒之感染本身。尤其是，病毒藉由黏膜彼此接觸之行為而進行感染之情形居多。因此，期待實施該等行為時，藉由於事前將抗體塗佈於黏膜上，可大幅度抑制感染。

實驗之概略如下所述。使用愛滋病毒與乳突病毒作為實施例。愛滋病毒為由球狀之套膜包覆之病毒，其表面存在有作為蛋白質之gp120與gp41。又，乳突病毒為環狀構造之雙鏈病毒，為非套膜型病毒。並且其一部分具有L1蛋白質。

對於愛滋病毒，使用gp120及作為其前驅物之gp160作為抗體。對於乳突病毒，使用L1。由於病毒之細胞培養並不容易，因此該等蛋白質係以基因工程方式利用桿狀病毒製作重組蛋白質。

接著，以所製作之蛋白質作為抗原來免疫雌鴕鳥，獲得該鴕鳥產下之卵。自該卵精製抗體，藉由ELISA研究其效價。以下進行詳細說明。

<人類免疫缺乏病毒(Human immunodeficiency virus，以下稱作「HIV」)抗原>

使用HIV之表面蛋白質、即以基因工程之方式藉由桿狀病毒而製作之重組蛋白質HIVgp120與HIVgp160作為抗原，而非使用HIV本身。一般認為，HIVgp120與HIVgp160係HIV感染人類細胞所必需之蛋白質，若製作針對該等之抗體，則可抑制HIV之感染。對1隻鴕鳥之免疫係使用將50 μg之HIVgp120、50 μg之HIVgp160混合而成者。

<人類乳突病毒(Human papillomavirus，以下稱作「HPV」)抗原>

使用誘發子宮頸癌之HPV第6型、第11型、第16型、第18型(合計4種抗原)。使用以基因工程之方式利用桿狀病毒製作之病毒之L1蛋白質(重組蛋白質)作為抗原，而非使用HPV本身。對1隻鴕鳥之免疫係使用將上述4種抗原(各40 μg)混合而成者。

重組蛋白質係根據常法製作。具體而言，使用病毒之cDNA(complementary deoxyribonucleic acid，互補去氧核糖核酸)，藉由PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)僅擴增L1蛋白質區域，將其組入桿狀病毒載體中。將該載體導入蠶之細胞(Sf9)，自其培養液及細胞萃取液精製重組蛋白質。

<對鴕鳥之免疫>

用HIV與HPV分別免疫各別之鴕鳥。首次免疫係將蛋白質量為100 μg之上述病毒抗原混合至弗氏完全佐劑中，並接種至雌鴕鳥之腰部之肌肉內。又，作為追加免疫，於首次免疫後，每隔一週，將上述兩型共同追加免疫3次。於弗氏不完全佐劑中混合100 μg之抗原，接種至雌鴕鳥之腰部之肌肉內。

<抗體之精製>

自追加免疫2週以後所產下之鴕鳥卵精製抗體。抗體之精製法如下所示。

自卵黃之抗體(IgY)之精製係藉由以下方式進行。首先，於卵黃中添加5倍量之TBS(三羥甲基胺基甲烷緩衝生理鹽水(Tris-Buffered Saline)：20 mM之Tris-HCl、0.15 M之NaCl、0.5%NaN₃)與等量之10%硫酸葡聚糖/TBS，攪拌20分鐘。接著，添加與卵黃等量之1 M之CaCl₂/TBS進行攪拌，並靜置12小時。其後，以15000 rpm離心20分鐘，回收上清液。

其次，以最終濃度達到40%之方式添加硫酸銨，於4℃下靜置12小時。其後，以15000 rpm離心20分鐘，回收沉澱物。最後，將其再懸浮於與卵黃等量之TBS中，藉由TBS進行透析。藉由該過程可回收純度為90%以上之IgY。自1個卵黃可精製2~4 g之IgY。

<利用ELISA法進行之測定>

藉由以下之ELISA，測定所得之抗體之抗原反應性。向ELISA用96孔微量盤之各孔中分別添加2 μg/mL之 HIVgp120、HIVgp160、HPV第6型、第11型、第16型、第18型各100 μl，於室溫下放置2小時。

其後，以PBS(磷酸鹽緩衝液：Phosphate buffered saline)清洗3次後，於各孔中添加100 μl之市售之阻斷溶液(Block Ace，大日本住友製藥)，放置2小時。其後，利用PBS清洗3次後，於各孔中添加50 μl之免疫前及免疫後之鴕鳥IgY抗體之連續稀釋液(以2 mg/mL作為原液，持續進行稀釋至100倍、200倍、……之2倍連續稀釋)，於室溫下放置1小時。

其後，利用PBS清洗3次後，於各孔中添加100 μl之過氧化酶標記抗鴕鳥IgY．兔多株抗體(自製)，放置45分鐘。利用PBS清洗3次後，藉由市售之過氧化酶用顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite)顯色30分鐘，利用ELISA用讀板儀測定吸光度(450 nm)。所獲得之結果以達到免疫前之IgY之吸光度值之2倍以上的最高稀釋倍率表示。

<向乳液中之混合>

將上述鴕鳥卵黃抗體(HIV、HPV)混合至乳液(於性交時直接使用，亦用於保險套之表面)中。將鴕鳥卵黃抗體1 mg與10 mL之乳液(成分：水、甘油、乙醇、聚丙烯酸鈉、羥乙基纖維素、苯氧基乙醇、EDTA-2Na、對羥基苯甲酸酯、聚山梨糖醇酯80、山梨糖醇酐脂肪酸酯)混合。藉由與上述相同之ELISA測定該混合液中之抗體活性(HIV、HPV各抗原)。

<結果>

表4表示HIVgp120與HIVgp160之情形時之ELISA之結果。表中之數值係達到免疫前抗體之吸光度值之2倍以上的最高稀釋倍率。判明產生針對對於HIV感染而言重要之HIVgp120與HIVgp160的高效價之抗體。又，判明即便混合至乳液中亦完全不失去抗體活性。

表5表示HPV之情形時之ELISA之結果。與表4同樣地，表中之數值係達到免疫前抗體之吸光度值之2倍以上的最高稀釋倍率。HPV第6型、第11型、第16型、第18型會誘發人類之子宮頸癌。判明鴕鳥產生針對該等病毒之L1蛋白質(對於感染而言重要之蛋白質)的高效價之抗體。又，即便混合至乳液中亦對各HPV抗原顯示高反應性。

(產業上之可利用性)

本發明之抗體可應用於作為其他皮膚常在菌之微球菌或足癬之致病菌即髮癬菌，亦可應用於交尾感染(接觸感染)之病原體、例如HIV、披衣菌、疱疹病毒等之感染抑制或治療，進而亦可應用於由花粉(柳杉、扁柏、豬草)引起之過敏之緩解劑、治療劑(軟膏或滴鼻、滴眼劑)。

又，不僅可用作針對愛滋病毒或乳突病毒之感染抑制劑，亦可廣泛用作針對表面蛋白質已知之病毒之感染抑制劑。

圖1(a)及(b)係表示顯示本發明之抗體抑制細菌之增殖之效果之實驗結果的圖表。

圖2(a)及(b)係表示本發明之抗體抑制細菌之增殖之效果的照片。

Claims

一種抗體，其以菌體之粉碎液作為抗原。
如申請專利範圍第1項之抗體，其中，上述抗體係自以上述菌體之粉碎液作為抗原而免疫之鳥類之卵所獲得之IgY。
如申請專利範圍第2項之抗體，其中，上述鳥類為鴕鳥。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其中，上述菌體為金黃色葡萄球菌(Stapylococcus aureus)。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其中，上述菌體為痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)。
一種抗體，其以病毒之表面蛋白質作為抗原。
如申請專利範圍第6項之抗體，其中，上述抗體係自以上述蛋白質作為抗原而免疫之鳥類之卵所獲得之IgY。
如申請專利範圍第7項之抗體，其中，上述鳥類為鴕鳥。
如申請專利範圍第6至8項中任一項之抗體，其中，上述蛋白質含有HIVgp120。
如申請專利範圍第6至8項中任一項之抗體，其中，上述蛋白質含有HPV之第6型、第11型、第16型、第18型中之任一者。
一種含抗體之組成物，其含有申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體與基劑。
如申請專利範圍第11項之含抗體之組成物，其中，上述基劑為凡士林。