CN110680917A - 一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用 - Google Patents
一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用，属于抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌技术领域，包括以下方法：步骤一：免疫原制备，取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白色葡萄球菌及菌体碎片混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原；步骤二：免疫，将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡。本发明制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于面部、全身皮肤，既无全身用药的局限性和副作用又有用药起效快用药量少疗效好不破坏粘膜皮肤表面正常微生态环境。
Description
技术领域
本发明涉及抗痤疮IgY制备及其应用，特别是涉及一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用，属于抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌技术领域。
背景技术
痤疮丙酸杆菌Propionibacteriumacnes，也称痤疮杆菌、疮疱丙酸杆菌，属于细菌界、放线菌门、纲、亚纲、目、丙酸杆菌亚目、科、以及丙酸杆菌属，是一种生长相对缓慢的典型革兰氏阳性厌氧菌短杆状，细胞内寄生，属于皮肤的正常菌群，一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂腺中。痤疮丙酸杆菌的基因控制产生分解皮肤和免疫原性蛋白的酶。痤疮丙酸杆菌生活在毛孔里的脂肪酸上，当毛孔被堵塞时，它们就会疯狂生长，分解饱和脂肪酸，产生大量的游离脂肪酸，这些脂肪酸通过毛孔渗入皮肤，引起皮肤应激反应，产生粉刺、红肿等，葡萄状球菌等细菌通过流出的脓液粘在皮肤上，导致皮肤组织受损。
痤疮是由痤疮丙酸杆菌引起的毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，好发于青少年人群，临床表现以好发于面部及上胸背部的粉刺、丘疹、脓疱、结节等多形性皮损为特点。痤疮常年发生，并可反复发生，青春期后往往能自然减轻或痊愈。但患者常常留下面部结缔组织增生疙瘩和凹陷永久性损伤，严重影响容貌，导致心理创伤，临床上根据痤疮皮损性质和严重程度分为3度、4级：1级：仅有粉刺；2级：除粉刺外，还有一些炎性丘疹；3级：除粉刺外，还有较多的炎性丘疹或脓疱；4级：除有粉刺、炎性丘疹及脓疱外，还有结节、囊肿或瘢痕。痤疮的非炎症性皮损表现为开放性和闭合性粉刺。闭合性粉刺的典型皮损是约1毫米大小的肤色丘疹，无明显毛囊开口。开放性粉刺表现为圆顶状丘疹伴显著扩张的毛囊开口。粉刺进一步发展会演变成各种炎症性皮损，表现为炎性丘疹、脓疱、结节和囊肿。炎性丘疹呈红色，直径1～5毫米不等；脓疱大小一致，其中充满了白色脓液；结节直径大于5毫米，触之有硬结和疼痛感；囊肿的位置更深，充满了脓液和血液的混合物。这些皮损还可融合形成大的炎性斑块和窦道等。炎症性皮损消退后常常遗留色素沉着、持久性红斑、凹陷性或肥厚性瘢痕。
痤疮的发生主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞后痤疮丙酸杆菌感染，以及继发葡萄球菌感染和炎症反应所致。青春期人体内雄激素，特别是睾酮的水平迅速升高，促进皮脂腺发育并产生大量皮脂，同时毛囊皮脂腺导管的角化异常造成导管堵塞，皮脂排出障碍，形成角质栓即微粉刺。毛囊中多种微生物，尤其是痤疮丙酸杆菌因皮脂含有较多脂肪酸等成分致使其大量生长及繁殖。痤疮丙酸杆菌产生的脂酶分解皮脂生成游离脂肪酸，同时趋化炎症细胞和介质，最终诱导并加重炎症反应。
痤疮日常护理为每日1到2次温水洗脸，忌用油脂类、粉类化妆品和含有糖皮质激素的软膏及霜剂，忌用手挤压或搔抓皮损。痤疮治疗的常用方法为局部外用药物：维A酸类、过氧化苯甲酰、抗生素类、壬二酸、硫磺洗剂等；口服抗生素：四环素类，其次为大环内酯类，疗程6～12周。严重的痤疮则口服异维A酸，疗程以达到最小累积剂量60mg/kg为目标。抗雄激素治疗：如：口服避孕药复方醋酸环丙孕酮片，适用于女性中、重度痤疮患者，伴有雄激素水平过高表现或多囊卵巢综合征。迟发型痤疮及月经期前痤疮显著加重的女性患者也可考虑应用口服避孕药。口服糖皮质激素：主要用于暴发性或聚合性痤疮，遵循短期、小剂量、与其他方法联合应用的原则。其他治疗包括对于不能耐受或不愿接受药物治疗的患者，还可考虑物理治疗，如光动力疗法、果酸疗法、激光治疗等。痤疮的分级治疗包括：1级：采用局部治疗，首选外用维A酸类制剂。2级：联合外用维A酸类及过氧化苯甲酰或抗生素，必要时联合口服抗生素。3级：常常需要联合治疗，口服抗生素联合外用过氧化苯甲酰和/或维A酸类药物为首选。有指征的女性患者也可考虑抗雄激素治疗。4级：口服异维A酸是最有效的治疗方法，可作为一线治疗。对于炎性丘疹和脓疱较多者，也可先系统应用抗生素联合外用过氧化苯甲酰，待皮损明显改善后再改用口服异维A酸序贯治疗。痤疮的维持治疗为：待皮损明显消退以后均应继续维持治疗，首选外用维A酸类药物，维持治疗6～12个月，必要时可联合过氧化苯甲酰。
继发性葡萄球菌感染通常发生在2级以上，有炎性丘疹、脓疱，长期炎症反应出现炎性斑块和窦道、伴随结蹄组织增生出现结节、囊肿及瘢痕等。结节、囊肿及瘢痕形成则留下永久性炎症性皮损。因此继发性葡萄球菌感染是永久性皮损的主要病因，长期抗菌素使用也导致导致菌群失调和细菌耐药性。故迫切需要解决皮肤表面存在多少痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌存在的问题，且不破坏机体微生态环境的防治手段和方法。
葡萄球菌是大家族，有许多不同的种和型，它们除了有各自特异性的抗原外，还存在着不同数量的不同种和型的家族遗传的共同抗原。根据这个原理，我们采用痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌混合免疫产蛋母鸡，诱导其产生的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体不但可以与免疫的痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌产生特异性免疫反应，而且也能够与不同种属和型的具有共同抗原决定簇的痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌产生特异性免疫反应。当IgY抗体与细菌表面抗原发生免疫反应则可以阻止痤疮丙酸杆菌进入细胞及葡萄球菌粘附于炎症部位，促进吞噬细胞消灭痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌，从而减少感染达到防治疾病的效果。当IgY抗体与细菌表面抗原发生免疫反应时，其改变细菌表面结构、抑制细菌的一些功能活性、抑制细菌生长、减少和抑制细菌对细胞的黏附、促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对细菌的吞噬和清除。事实上临床上使用特异性IgY抗体防治龋齿和婴幼儿轮状病毒性腹泻预防胆囊纤维化患者绿脓杆菌感染减轻幽门螺杆菌引起的胃炎。
抗痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌复合IgY抗体与目前抗菌素作用原理不同，其与细菌表面相应抗原发生特异性结合抑制了细菌的活性、阻止细菌粘附于组织细胞、排斥了细菌在炎症部位的存在、改变了细菌表面结构和电场并促进吞噬细胞对细菌的吞噬和清除，同时又完全不会诱发耐药菌株的产生，不破坏局部和整体微生态平衡，同时也避免了抗菌素滥用和广泛的耐药菌株发生，故显示出特异性抗痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌复合IgY抗体制剂的重要性和可行性。根据上述特异性IgY抗体的作用原理，特异性抗痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌复合IgY抗体制剂能够有效地治疗所有由痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌类细菌，以及具有与这这些细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的痤疮和皮肤感染性炎症，如：痤疮及痤疮感染、皮肤破损引起的皮肤急、慢性炎症、化脓、疖肿和皮下痈肿等。
发明内容
本发明的主要目的是为了解决治疗由痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌以及具有共同抗原决定簇的细菌引起的单纯性痤疮、化脓性痤疮；由此引起的皮肤疖肿和及皮下痈肿，同时阻止面部疙瘩的形成而提供一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，包括以下方法：
步骤一：免疫原制备，取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白色葡萄球菌及菌体碎片混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原；
步骤二：免疫，将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡；
步骤三：抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备，收集免疫母鸡的鸡蛋并取蛋黄液与蒸馏水混合搅拌，并调节酸碱取上清，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物。
优选的，在步骤一中免疫原制备包括：
(1)取致病的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片碎片40～90份，金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片碎片10～60份混合成菌液；
(2)将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌免疫原；
(3)将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌免疫原；
(4)、每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中，均含有细菌20亿～40亿。
3、优选的，在步骤二中免疫包括：
(1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉30～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.7ml～1.5ml免疫原；
(2)每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.5ml皮下和肌肉50～80点注射给产蛋母鸡；
(3)使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫3～4次后，每隔四周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.5ml皮下和肌肉50～80点注射给产蛋母鸡加强免疫5次，前后共免疫9～10次。
优选的，在步骤三中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备包括：
(1)收集免疫30天免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用用自开水洗净、酒精消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液；
(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:6～9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并用1NHCl调节酸碱度至pH4.9～5.2，在温度4℃下静置10小时或过夜；
(3)将蛋黄稀释液高速离心30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩8～15倍；
(4)加入0.02％～5.0％的葡萄糖酸氯已定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并在温度4℃下静置10小时或过夜；
(5)高速离心15～30分钟，取上清，将上清经0.45μ～0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体弃脂质和脂蛋白的提取物；
(6)将除去脂质物质抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物加硫酸胺至55％～60％的饱和度，充分搅拌，室温静置3～11小时；
(7)高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％～40％的饱和度，充分搅拌，室温静置3～11小时；
(8)高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品。
优选的，免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的家庭土鸡、白毛乌骨鸡、海兰褐鸡、莱杭鸡、罗曼鸡和明星鸡。
优选的，第一次免疫后第28天收集免疫母鸡的鸡蛋，第一次免疫后第28天至第320天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体。
优选的，提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的纯度采用还原性SDS-PAGE测定。
优选的，在步骤一中菌体碎片采用石炭酸灭活处理，同时用超声波粉碎机将细菌菌体碎片超声粉碎。
一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用，加入药学上可接受的附加剂制成含有抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的喷雾剂、气雾剂、搽洗液、软膏和胶布。
优选的，制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于皮肤，用于防治不同临床和病理表现痤疮，以及继发性痤疮感染性炎症。
本发明的有益技术效果：按照本发明的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用，制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于面部、全身皮肤，既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏面部及全身皮肤正常菌群的微生态环境、不导致局部菌群失调等效果，也无毒副作用，更无抗菌素局部使用易产生耐药性等问题；IgY抗体不激活补体系统，不与类风湿因子产生非特异性结合，不固定金黄色葡萄球菌A蛋白，不与蛋白G，以及人类细胞Fc受体结合，因而不易发生变态反应。抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗体提取物不产生急性毒性反应和慢性毒性反应，属于实际无毒级；抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物三致试验阴性，属于无致畸、致癌、致突变的制品，同时也无眼结膜、粘膜、皮肤刺激性。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本实施例提供的抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用，包括以下方法：
步骤一：免疫原制备，取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白色葡萄球菌及菌体碎片混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原；
步骤二：免疫，将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡；
步骤三：抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备，收集免疫母鸡的鸡蛋并取蛋黄液与蒸馏水混合搅拌，并调节酸碱取上清，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物。
在步骤一中免疫原制备包括：(1)取致病的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片碎片40～90份，金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片碎片10～60份混合成菌液；(2)将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌免疫原；(3)将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌免疫原；(4)每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中，均含有细菌20亿～40亿。
在步骤二中免疫包括：(1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉30～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.7ml～1.5ml免疫原；(2)每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.5ml皮下和肌肉50～80点注射给产蛋母鸡；(3)使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫3～4次后，每隔四周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.5ml皮下和肌肉50～80点注射给产蛋母鸡加强免疫5次，前后共免疫9～10次。
在步骤三中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备包括：(1)收集免疫30天免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用用自开水洗净、酒精消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液；(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:6～9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并用1NHCl调节酸碱度至pH4.9～5.2，在温度4℃下静置10小时或过夜；(3)将蛋黄稀释液高速离心30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩8～15倍；(4)加入0.02％～5.0％的葡萄糖酸氯已定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并在温度4℃下静置10小时或过夜；(5)高速离心15～30分钟，取上清，将上清经0.45μ～0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体弃脂质和脂蛋白的提取物；(6)将除去脂质物质抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物加硫酸胺至55％～60％的饱和度，充分搅拌，室温静置3～11小时；(7)高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％～40％的饱和度，充分搅拌，室温静置3～11小时；(8)高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品。
免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的家庭土鸡、白毛乌骨鸡、海兰褐鸡、莱杭鸡、罗曼鸡和明星鸡，第一次免疫后第28天收集免疫母鸡的鸡蛋，第一次免疫后第28天至第320天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体，提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的纯度，采用还原性SDS-PAGE测定，在步骤一中菌体碎片采用石炭酸灭活处理，同时用超声波粉碎机将细菌菌体碎片超声粉碎。
一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用，加入药学上可接受的附加剂制成含有抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的喷雾剂、气雾剂、搽洗液、软膏和胶布，制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于皮肤，用于防治不同临床和病理表现痤疮，以及继发性痤疮感染性炎症。
实施例1：
制备600克抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物生产工艺流程：
步骤一：免疫原的制备
(1)来自于化脓性痤疮患者分离的痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌，经庖肉培养基扩增培养痤疮丙酸杆菌，以及10％的新鲜羊血胰胨肉汤培养基扩增培养金黄色和白色葡萄球菌，经鉴定确认为痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌；
(2)将上述菌体碎片经石炭酸灭活处理，另外，用超声波粉碎机将细菌超声粉碎30分钟，使细菌菌体碎片粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片；
(3)痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片65:25:10数量份混合；
(4)其中细菌与菌体碎片碎片的比例为细菌75份，菌体碎片碎片25份；
(5)将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液与400ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原；
(5)福氏不完全佐剂免疫原的制备则为：将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液与400ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原，每毫升免疫原中含有细菌30亿；
步骤二：免疫产蛋母鸡
(1)使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉80点注射给30周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1.5ml免疫原；
(2)隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡，共4次；
(3)每隔4周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡加强免疫共5次，前后共免疫10次，免疫母鸡总数为400只；
步骤三：抗抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的制备
(1)收集第一次免疫后50～90天的免疫母鸡的鸡蛋，使用70％的酒精浸泡进行鸡蛋表面消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液；
(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:8的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1NHCl调节酸碱度至pH5.0，放置4℃冰柜10小时；
(3)将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，加入2.0％的葡萄糖酸氯已定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.2，并放置4℃10小时；
(4)高速离心10000rpm，20分钟，取上清，将上清经0.45μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物；
(5)抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物经ELISA方法测定其提取物中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1:1000/mg蛋白，或者称粗提取物中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活为1:1000，在IgY抗体粗提取物中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为31.3％。
实施例2：
制备600克抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物生产工艺流程：
步骤一：免疫原的制备
(1)来自于化脓性痤疮患者分离的痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌，经庖肉培养基扩增培养痤疮丙酸杆菌，以及10％的新鲜羊血胰胨肉汤培养基扩增培养金黄色和白色葡萄球菌，经鉴定确认为痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌；
(2)将上述菌体碎片经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体碎片超声粉碎30分钟，使细菌菌体碎片粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片；
(3)痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片65:25:10数量份混合。其中细菌与菌体碎片碎片的比例为细菌75份，菌体碎片碎片25份；
(4)将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液与400ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原；
(5)福氏不完全佐剂免疫原的制备则为：将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液与400ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原，每毫升免疫原中含有细菌30亿；
步骤二：免疫产蛋母鸡
(1)使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉80点注射给30周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1.5ml免疫原；
(2)隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡，共4次；
(3)每隔4周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡加强免疫共5次，前后共免疫10次，免疫母鸡总数为400只；
步骤三：抗抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的制备
(1)收集第一次免疫后50～90天的免疫母鸡的鸡蛋，使用70％的酒精浸泡进行鸡蛋表面消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液；
(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:8的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1NHCl调节酸碱度至pH5.0，放置4℃冰柜10小时；
(3)将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，加入2.0％的氯已定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.2，并放置4℃10小时；
(4)高速离心10000rpm，20分钟，取上清，将上清经0.45μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物；
(5)抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，高速离心10000rpm15分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时；
(6)高速离心10000rpm15分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品；抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品经ELISA方法测定其抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品中每毫克蛋白的特异性IgY抗体的效价为1:4000/mg蛋白，或者称抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品里每毫克蛋白中的特异性鸡IgY抗体的比活为1:4000。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为86.4％。
实验例3：
痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡，取第一次免疫后40～60天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提取物，应用ELISA方法测定抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体结合不同抗原的生物学效价。
表1抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的效价
根据上述实验结果可以清楚地看到：痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌IgY抗体；根据免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量不同，所产生的各自特异性IgY抗体的效价也不相同，免疫剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高，反之则低；痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体与痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌混合抗原都能起反应，而且总的特异性IgY抗体的效价也增加了，其效价有一定的叠加作用；由上述实验可见，一种抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体可以治疗由上述细菌引起的痤疮及急、慢性痤疮感染性炎症等；同时也可以用一种抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体治疗由上述细菌中的任何一种细菌引起的急、慢性痤疮感染性炎症；由此还可以扩大到由与上述细菌具有共同抗原决定簇的细菌引起的痤疮，以及急、慢性痤疮感染性炎症等，都可以使用本发明的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体治疗。
实验例4：
痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡，取第一次免疫后40～60天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提纯品，应用ELISA方法测定抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体结合不同抗原的生物学效价。
表2抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提纯品的效价
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提取物的特异性IgY抗体结合痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原和痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌细菌各自抗原的生物学效价都要高，基本是按比例增加；痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗三种细菌的特异性IgY抗体；根据免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量不同，所产生的各自特异性IgY抗体的效价也不相同，免疫剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高，反之则低；抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体与痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原都能起反应，而且总的特异性IgY抗体的效价也增加了，其效价有一定的叠加作用；.由上述实验可见，一种抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体可以治疗由上述三种菌引起的急，慢性痤疮及继发性痤疮感染性脓疱疹等；.同时也可以用一种抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体治疗由上述三种菌中的任何一种细菌或真菌引起的急，慢性痤疮及继发性痤疮感染性脓疱疹等；由此还可以扩大到由与上述三种菌有共同抗原决定簇的细菌引起的急，慢性痤疮及继发性痤疮感染性脓疱疹，以及皮疹等都可以使用本发明的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体治疗。
实验例5：
比较不同鸡种的免疫应答和产生抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的能力：以权利要求1所述的一种特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的制备方法，分别免疫规模化笼养海兰褐产蛋母鸡、明星母鸡和莱杭产蛋母鸡，以及放养的产蛋土鸡，采用第一次免疫后40～100天的免疫母鸡的鸡蛋，并按权利要求1所述的方法提取抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的粗提取物，应用ELISA方法测定抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体结合抗原的生物学效价。
表3不同鸡种的产蛋母鸡对同一抗原的免疫应答能力及特异性IgY抗体效价
根据上述实验结果可以清楚地看到：在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出的不同鸡种的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的粗提取物，其特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价基本一致，其中只有土鸡在不同的批次制备的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的粗提取物中，特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价稍有变化，但差异不显著。
实验例6：
按本发明的方法制备出的痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌的菌体碎片及痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片等两种免疫原免疫海兰褐产蛋母鸡，并分别制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌IgY抗体粗提取物和抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌的菌体碎片+菌体碎片碎片IgY抗体粗提取物，应用ELISA方法测定它们抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌抗原的结合生物学效价。
表4不同免疫原诱导的海兰褐母特异性IgY结合三种细菌的生物学效价
根据上述实验结果可以清楚地看到：在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片和痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片等两种不同免疫原免疫海兰褐产蛋鸡，并制备出第一次免疫后40～100天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片IgY抗体粗提取物和抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片IgY抗体粗提取物等两种IgY抗体。这两种IgY抗体分别与痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片抗原反应，结果这两种IgY抗体生物学结合效价有一定的差异，其中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片的IgY抗体的生物学结合效价更高和更稳定，而抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片的IgY抗体的生物学结合效价则批次之间有差异，从1:600/mg蛋白—1:1200/mg蛋白。这些结果说明痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片免疫原的效果比单纯痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片免疫原的效果要更好。
实验例7：
痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片免疫原60点肌肉和皮下注射免疫与单纯3点肌肉注射或单纯数点皮下注射免疫的免疫效果比较。
表5不同免疫方式诱导的海兰褐母鸡产生的特异性IgY抗体的生物学效价比较
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备的相同的免疫原以不同的免疫方式免疫相同海兰褐产蛋母鸡，并按本发明的方法制备出第一次免疫后40～100天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的粗提取物，其抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价要数本发明的60点肌肉和皮下注射免疫的方式所产生的生物学效价最高，因此本发明的免疫方法最好。
实验例8：
痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎片碎片免疫原60点肌肉和皮下注射免疫与单纯3点肌肉注射或单纯3点皮下注射免疫所产生的高生物学效价特异性IgY抗体的时间长短的比较。
表6不同免疫方式诱导的海兰褐母鸡产生高效价的特异性IgY抗体的时间比较
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备的相同的免疫原以不同的免疫方式免疫相同海兰褐产蛋母鸡，并按本发明的方法制备出第一次免疫后50～280天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提取物。通过ELISA方法测定长达2～9个月时间的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的效价变化，结果发现60点肌肉和皮下注射免疫的方法，其在2～9个月后特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体效价基本不变，而单纯数点肌肉注射或单纯数点皮下注射免疫的母鸡产生特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的能力明显下降，特异性IgY抗体效价也明显下降。这进一步说明，本发明的60点肌肉和皮下注射免疫的方式在高效价的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体产生的时间长短方面有着显著优势，效果明显好于其它两种方法。
实验例9：
本发明的10次免疫注射的方法与传统的三次免疫注射的方法的效果比较。
表7不同免疫次数诱导的海兰褐母鸡产生高效价的特异性IgY抗体能力的比较
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的10次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡与传统的3次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡比较其特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的产生能力，并按本发明的方法制备出第一次免疫后150～200天的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物和280～300天的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物。通过ELISA方法测定不同时间的两种免疫方法所诱导的特异性IgY抗体的生物学效价，结果表明两种免疫方法在首次免疫后第150～200天的时间里产生的特异性IgY抗体的生物学效价变化并不大，本发明的10次免疫方法比传统的三次免疫方法要好；在长达280～300天的时间后，本发明的10次免疫方法要比传统的三次免疫方法好很多，其特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价与之相比有十分显著的差异。本发明的10次免疫方法所免疫的母鸡产生高效价的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的时间更长。
实验例10：
痤疮丙酸杆菌及金黄色、白色葡萄球菌等三种细菌不同组成比例对特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体产生的影响。
表8三种菌不同组成比的免疫原诱导海兰褐母鸡产生特异性IgY抗体的比较
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备的相同的免疫原虽然痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌组成比例不同，但免疫产蛋海兰褐母鸡后，并按本发明的方法制备出第一次免疫后40～60天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提取物，其抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原的IgY抗体的生物学效价基本是一致的。这说明虽然痤疮丙酸杆菌、金黄色及白色葡萄球菌组成比例不同，但产生总的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价不变。
实验例11：
痤疮丙酸杆菌、金黄色及白色葡萄球菌不同组成比例复合抗原产生的IgY抗体分别抗痤疮丙酸杆菌、金黄色及白色葡萄球菌特异性结合的影响。
表9三种菌不同组成比产生的IgY抗体对三种不同细菌的特异性结合的影响
根据上述实验结果可以清楚地看到：痤疮丙酸杆菌、金黄色及白色葡萄球菌等三种细菌不同组成比例分别按本发明的方法制备免疫原，免疫产蛋海兰褐母鸡，并按本发明的方法制备出第一次免疫后40～60天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的提取物，其抗痤疮丙酸杆菌抗体效价，抗金黄色葡萄球菌抗体效价，抗白色葡萄球菌抗体效价分别随不同的细菌免疫剂量的增减而发生基本相同的抗体效价的增减变化。这些抗体效价的变化都在有效IgY抗体活性范围内增减，这说明抗体效价虽然对痤疮丙酸杆菌、金黄色及白色葡萄球菌等三种细菌组成比例不同有一定的波动，但它们诱导鸡产生抗痤疮丙酸杆菌、金黄色及白色葡萄球菌IgY抗体的生物学效价仍在有效范围。
实验例12：
抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体对中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌的影响：本发明的方法制备出第一次免疫后30～120天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物与活金黄色葡萄球菌及人耳垂血或静脉血，在37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中共同孵育30分钟，结果促进了人耳垂血和静脉血中性粒细胞吞噬活金黄色葡萄球菌。中性粒细胞的吞噬率随着IgY浓度的升高而增加。
表10特异性IgY抗体对耳垂血中性粒细胞吞噬活金黄色葡萄球菌的作用
注：细胞吞噬率(％)：1组:3组p<0.01；1组:2组p<0.05；2组:3组p<0.01。
表11特异性IgY抗体对静脉血中性粒细胞吞噬活金黄色葡萄球菌的作用
注：细胞吞噬率(％)：1组:3组p<0.01；1组:2组p<0.05；2组:3组p<0.01。
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备出第一次免疫后30～120天免疫母鸡的鸡蛋的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗体提取物，其能够促进人中性粒细胞增强吞噬活的金黄色葡萄球菌。这种调理吞噬促进作用可能与改变了细菌表面结构和电场效应相关。这说明了按本发明的方法制备出的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物，其治疗由痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌等细菌引起的性炎症的作用机理。
实施例13：喷剂
经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和气雾剂的罐中。
实施例14：女性专用
| 成份 | 重量比 |
| 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物 | 0.15 |
| 维甲酸 | 0.05 |
| 醋酸环丙孕酮 | 0.1 |
| 水 | 90.28 |
| 甘油 | 5 |
| 愈创木磺酸钠 | 0.30 |
| EDTA二钠 | 0.1 |
| 芦荟提取物 | 0.5 |
| 蜂胶 | 2 |
| 增溶剂 | 0.5 |
| EGF | 0.5 |
| 小青瓜 | 0.02 |
| 防腐剂 | 0.5 |
经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和气雾剂的罐中。
实施例15：
灌装入消毒的铝箔和塑料软管。
综上所述，在本实施例中，按照本实施例的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用，按本发明的方法提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的纯度，经非还原性SDS-PAGE测定，鸡IgY抗体的纯度达到31％以上；而经过本发明的方法提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品的纯度，经非还原性SDS-PAGE测定，IgY抗体的纯度达到82％以上；提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的生物学效价，经ELISA方法测定其特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体结合痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的效价大于或等于1:400～600，即效价≥1:400～600/mg蛋白，或者称粗提取物里每毫克蛋白中特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的比活为≥1:400～600；而按本发明的方法提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品的生物学活性，即：效价，经ELISA方法测定其特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体结合痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的效价大于或等于1:1600～2400，即效价≥1:1600/mg蛋白，或者称纯品里每毫克蛋白中特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的比活为≥1:1600；提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体水提取物的生物学效价经ELISA方法测定其特异性抗痤疮丙酸杆菌抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗痤疮丙酸杆菌抗原结合效价为1:200～400/mg蛋白；特异性抗葡萄球菌混合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性结合葡萄球菌混合抗原≥1:200～400/mg蛋白，而按本发明的方法提取的抗痤疮丙酸杆菌IgY抗体纯品的生物学活性，即：效价，经ELISA方法测定其特异性抗痤疮丙酸杆菌抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗痤疮丙酸杆菌抗原结合效价为1:800～1600mg蛋白；特异性抗葡萄球菌混合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性结合葡萄球菌混合抗原1:800～1600mg蛋白；制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于面部、全身皮肤，既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏面部及全身皮肤正常菌群的微生态环境、不导致局部菌群失调等效果，也无毒副作用，更无抗菌素局部使用易产生耐药性等问题；IgY抗体不激活补体系统，不与类风湿因子产生非特异性结合，不固定金黄色葡萄球菌A蛋白，不与蛋白G，以及人类细胞Fc受体结合，因而不易发生变态反应。抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗体提取物不产生急性毒性反应和慢性毒性反应，属于实际无毒级；抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物三致试验阴性，属于无致畸、致癌、致突变的制品，同时也无眼结膜、粘膜、皮肤刺激性。
Claims (10)
1.一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，包括以下方法：
步骤一：免疫原制备，取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白色葡萄球菌及菌体碎片混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原；
步骤二：免疫，将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡；
步骤三：抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备，收集免疫母鸡的鸡蛋并取蛋黄液与蒸馏水混合搅拌，并调节酸碱取上清，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物。
2.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，在步骤一中免疫原制备包括：
(1)取致病的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片碎片40～90份，金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片碎片10～60份混合成菌液；
(2)将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌免疫原；
(3)将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌、金黄色和白色葡萄球菌免疫原；
(4)、每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中，均含有细菌20亿～40亿。
3.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，在步骤二中免疫包括：
(1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉30～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.7ml～1.5ml免疫原；
(2)每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.5ml皮下和肌肉50～80点注射给产蛋母鸡；
(3)使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫3～4次后，每隔四周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.5ml皮下和肌肉50～80点注射给产蛋母鸡加强免疫5次，前后共免疫9～10次。
4.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，在步骤三中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备包括：
(1)收集免疫30天免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用用自开水洗净、酒精消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液；
(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:6～9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并用1NHCl调节酸碱度至pH4.9～5.2，在温度4℃下静置10小时或过夜；
(3)将蛋黄稀释液高速离心30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩8～15倍；
(4)加入0.02％～5.0％的葡萄糖酸氯已定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并在温度4℃下静置10小时或过夜；
(5)高速离心15～30分钟，取上清，将上清经0.45μ～0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体弃脂质和脂蛋白的提取物；
(6)将除去脂质物质抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物加硫酸胺至55％～60％的饱和度，充分搅拌，室温静置3～11小时；
(7)高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％～40％的饱和度，充分搅拌，室温静置3～11小时；
(8)高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品。
5.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的家庭土鸡、白毛乌骨鸡、海兰褐鸡、莱杭鸡、罗曼鸡和明星鸡。
6.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，第一次免疫后第28天收集免疫母鸡的鸡蛋，第一次免疫后第28天至第320天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体。
7.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的纯度采用还原性SDS-PAGE测定。
8.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法，其特征在于，在步骤一中菌体碎片采用石炭酸灭活处理，同时用超声波粉碎机将细菌菌体碎片超声粉碎。
9.一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用，其特征在于，加入药学上可接受的附加剂制成含有抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的喷雾剂、气雾剂、搽洗液、软膏和胶布。
10.如权利要求9所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用，其特征在于，制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于皮肤，用于防治不同临床和病理表现痤疮，以及继发性痤疮感染性炎症。
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