CN111789945A

CN111789945A - 一种妇科炎症的复合外用制剂

Info

Publication number: CN111789945A
Application number: CN202010520198.1A
Authority: CN
Inventors: 张海峰
Original assignee: Nord Neume Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nord Neume Guangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2020-10-20

Abstract

本发明公开了一种妇科炎症的复合外用制剂，所述复合外用制剂的主要活性成分为2‑8％(W/W)的复合卵黄抗体和0.5‑2％(W/W)的壳聚糖。所述复合卵黄抗体包括抗原1与HPV重组蛋白，所述抗原1与HPV重组蛋白的质量比为(1‑5)：(1‑5)。所述抗原1为白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的混合，所述白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的质量比为1:1:1:1。本发明能够有效治疗阴道感染所致的内阴瘙痒、宫颈糜烂、腥臭异味和白带增多等妇科炎症疾病，同时降低妇科炎症的复发率。

Description

一种妇科炎症的复合外用制剂

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种妇科炎症的复合外用制剂。

背景技术

细菌性阴道炎(Bacterial vaginosis，BV)是女性最常见的阴道感染疾病之一。阴道及外阴感染常常伴有人体菌群失衡，人体菌群失衡后的阴道感染常常伴有大量的念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌的大量增殖。少数患者还可能感染HPV病毒，因此在外阴护理制剂中有必要对细菌及病毒进行联合用药从而达到预防与治疗的目的。

人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的发生关系密切，高危型HPV持续性感染是引起宫颈癌的首要因素。HPV是一种微小的DNA病毒，基因组按功能分为3 个区:早期基因区(E)、晚期基因区(L)和非编码区(NCR)。ER区编码E1-E8八个早期蛋白，主要涉及病毒基因组的复制、转录、翻译及细胞转化。LR区负责编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，两者组成病毒的蛋白衣壳，与病毒的增殖有关。靶向HPV E6和E7抗体，目标是通过提高病毒兼肿瘤抗原的识别改善细胞免疫。靶向HPV的L1和L2蛋白的中和抗体可以预防感染，有效的阻断HPV感染。

鉴于此，本发明有必要提供一种妇科炎症的复合外用制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种妇科炎症的复合外用制剂，能够有效治疗阴道感染所致的内阴瘙痒、宫颈糜烂、腥臭异味和白带增多等妇科炎症疾病，同时降低妇科炎症的复发率。

为了达到上述的目的，本发明提供了如下技术方案：

一种妇科炎症的复合外用制剂，所述复合外用制剂的主要活性成分为 2-8％(W/W)的复合卵黄抗体和0.5-2％(W/W)的壳聚糖。

在其中一些实施例中，所述壳聚糖为药用级壳聚糖。壳聚糖具有较强的抗真菌性。一般地，当壳聚糖的浓度达到100μg/mL时，即可表现出抗真菌性，且抗真菌性与壳聚糖颗粒的大小成反比。壳聚糖的聚合度对其抗真菌性有较大的影响，聚合度降低，则壳聚糖所能抑制的真菌种类减少，但抑制的程度加强。壳聚糖对大肠杆菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌等有良好的抑制作用。

在其中一些实施例中，所述复合卵黄抗体包括抗原1与HPV重组蛋白，所述抗原1与HPV重组蛋白的质量比为(1-5)：(1-5)。

在其中一些实施例中，所述抗原1为白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的混合，所述白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的质量比为1:1:1:1。将白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的质量比设为1:1:1:1，能够使抗原1对念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌的抑制效果更平衡。

在其中一些实施例中，所述HPV重组蛋白为HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的混合，所述HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、 HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的质量比为1:1:1:1。将HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的质量比设为1:1:1:1，能够使HPV重组蛋白活性更高，与抗原1复配后对念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌的抑制效果更好。

在其中一些实施例中，所述HPV L1蛋白为酵母表达系统，所述HPV L2 蛋白、HPVE6蛋白和HPV E7蛋白为大肠杆菌表达系统。

本发明中，HPV L1蛋白一般采用真核表达系统表达才具有活性，最廉价的方式是采用酵母系统生产，虽然杆状病毒系统与哺乳动物表达系统生产出的蛋白其结构更加接近天然蛋白，但因生产工艺复杂，价格昂贵而一般不被使用。HPV L2、HPV E6、HPV E7蛋白，在大肠杆菌表达系统中表达，其蛋白具有较高的生物学活性，其成本远低于酵母表达系统与其他哺乳动物表达系统。本发明将酵母表达系统的HPV L1蛋白与大肠杆菌表达系统的HPVL2 蛋白、HPV E6蛋白和HPV E7蛋白混合复配，能够最大程度发挥HPV重组蛋白的活性，且节省成本，使得HPV重组蛋白与抗原1结合形成的复合卵黄抗体对阴道中病菌感染的抑制效果更好。

在其中一些实施例中，所述复合卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：1) 培养白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌，提取活性蛋白，混合后为抗原1；2)将重组HPV蛋白提取纯化后加入抗原1，将这混合液以 (1-10)：(1-10)比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以25000-30000rpm 高速匀化，形成油包水乳液，制得复合抗原2；3)将步骤2)获得的复合抗原2 应用到免疫产蛋鸡，取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；4)纯化蛋黄中的卵黄抗体IgY，即得复合卵黄抗体。

本发明中白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌的细菌培养过程简单，不需要进口的培养设备，只需要在安全实验室即可进行培养。无需基因工程菌株的制备，因此直接培养上述细菌，灭活后提取抗原成分进行动物免疫，更加接近免疫反应的天然状态，成分也更安全。

IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG。研究表明IgY的基因组成和生物学功能与哺乳动物IgG和IgE的相近。应用 IgY抗体有以下优点：无需采血，只需收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得抗体 IgY；使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY；由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。因此，IgY具有广泛的应用价值。本发明通过将HPV L1蛋白、 HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白、白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白、加德纳菌提取蛋白作为抗原作用到免疫产蛋鸡获得免疫蛋来纯化后得到高纯度卵黄抗体IgY，其具有高效的免疫效果，能提高人体对念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌以及HPV的免疫效果。

在其中一些实施例中，所述步骤3)中将步骤2)获得的复合抗原2应用到免疫产蛋鸡具体为：选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用步骤2)制得的复合抗原2进行注射免疫，其中，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第18天开始拣取高免疫蛋。

在其中一些实施例中，所述步骤4)中纯化蛋黄中的卵黄抗体IgY具体为：取步骤3)所得蛋黄，加入10倍量纯化水稀释搅拌均匀，用醋酸调节PH至 5.5–6.0，在4–6℃下静置10-16小时，10000-12000r/min高速离心20-30分钟，取上清液，将上清液超滤浓缩5-10倍，加入饱和硫酸铵，IgY析出后，再次离心获得高纯度的蛋白沉淀，蛋白复融后，进行疏水层析，得到高纯度的蛋白样品，蛋白样品经过病毒过滤后，超滤换液，除菌过滤，得到纯品蛋白。

本发明还提供妇科炎症的复合外用制剂在妇科炎症中的应用，所述妇科炎症包括阴道感染所致的内阴瘙痒、宫颈糜烂、腥臭异味和白带增多。

本发明所提供的一种妇科炎症的复合外用制剂，相比于现有技术具有如下有益效果：

本发明通过将HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白、白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白、加德纳菌提取蛋白作为抗原作用到免疫产蛋鸡获得免疫蛋来纯化后得到高纯度卵黄抗体IgY，具有高效的免疫效果，能提高人体对念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌以及HPV的免疫效果。将复合卵黄抗体与壳聚糖复配制备得到的妇科炎症复合外用制剂，能够有效治疗阴道感染所致的内阴瘙痒、宫颈糜烂、腥臭异味和白带增多等妇科炎症疾病，同时降低妇科炎症的复发率。

本发明成分安全，无抗生素，不产生耐药性；直接外用于感染部位，治疗效果好。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作详细说明。

实施例1

一种妇科炎症的复合外用制剂，所述复合外用制剂的主要活性成分为8％ (W/W)的复合卵黄抗体和0.5％(W/W)的壳聚糖。

所述复合卵黄抗体包括抗原1与HPV重组蛋白，所述抗原1与HPV重组蛋白的质量比为1：5。

所述抗原1为白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的混合，所述白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的质量比为1:1:1:1。

在其中一些实施例中，所述HPV重组蛋白为HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的混合，所述HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、 HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的质量比为1:1:1:1。

所述复合卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：1)从阴道炎患者体内分离念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌，并采用常规方法培养；建立种子库，包括种子菌库的建立，细菌的冻存与复苏标准方法的建立，细菌培养工艺流程的建立，从而保证了每批的抗原菌生产的稳定性，抗原菌发酵培养后，收集细菌，匀浆机中进行高压溶菌破碎，细菌破碎后，提取细菌蛋白，混合后即为抗原1，蛋白提取后，对蛋白进行分析，根据中间体的中控标准进行放行；

2)通过反转录的方法获得HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、 HPV E7蛋白基因序列，对基因序列进行密码子优化，HPV L1蛋白通过基因工程的方法在酵母表达系统中表达，HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白在大肠杆菌表达系统中表达，建立工程菌种库，通过生产质控，建立了有效的蛋白表达与生产工艺流程，重组蛋白经纯化、除病毒与除菌后，生产出高活性的HPV重组蛋白，将HPV重组蛋白与步骤1)制得的抗原1混合，然后将这混合液以1:10比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以25000rpm高速匀化，形成油包水乳液，制得复合抗原2；3)选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用步骤2)制得的复合抗原2进行注射免疫，其中，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第18天开始拣取高免疫蛋；4)取步骤3)所得蛋黄，加入10倍量纯化水稀释搅拌均匀，用醋酸调节PH至6.0，在4℃下静置16小时，12000r/min高速离心20分钟，取上清液，将上清液超滤浓缩10倍，加入饱和硫酸铵，IgY析出后，再次离心获得高纯度的蛋白沉淀，蛋白复融后，进行疏水层析，得到高纯度的蛋白样品，蛋白样品经过病毒过滤后，超滤换液，除菌过滤，得到纯品蛋白，即为复合卵黄抗体。

实施例2

一种妇科炎症的复合外用制剂，所述复合外用制剂的主要活性成分为2％ (W/W)的复合卵黄抗体和2％(W/W)的壳聚糖。

所述复合卵黄抗体包括抗原1与HPV重组蛋白，所述抗原1与HPV重组蛋白的质量比为5：1。

2)通过反转录的方法获得HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、 HPV E7蛋白基因序列，对基因序列进行密码子优化，HPV L1蛋白通过基因工程的方法在酵母表达系统中表达，HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白在大肠杆菌表达系统中表达，建立工程菌种库，通过生产质控，建立了有效的蛋白表达与生产工艺流程，重组蛋白经纯化、除病毒与除菌后，生产出高活性的HPV重组蛋白，将HPV重组蛋白与步骤1)制得的抗原1混合，然后将这混合液以10:1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30000rpm高速匀化，形成油包水乳液，制得复合抗原2；3)选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用步骤2)制得的复合抗原2进行注射免疫，其中，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第18天开始拣取高免疫蛋；4)取步骤3)所得蛋黄，加入10倍量纯化水稀释搅拌均匀，用醋酸调节PH至5.5，在6℃下静置10小时，10000r/min高速离心30分钟，取上清液，将上清液超滤浓缩5倍，加入饱和硫酸铵，IgY析出后，再次离心获得高纯度的蛋白沉淀，蛋白复融后，进行疏水层析，得到高纯度的蛋白样品，蛋白样品经过病毒过滤后，超滤换液，除菌过滤，得到纯品蛋白，即为复合卵黄抗体。

实施例3

一种妇科炎症的复合外用制剂，所述复合外用制剂的主要活性成分为5％ (W/W)的复合卵黄抗体和1.2％(W/W)的壳聚糖。

所述复合卵黄抗体包括抗原1与HPV重组蛋白，所述抗原1与HPV重组蛋白的质量比为3：2。

2)通过反转录的方法获得HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、 HPV E7蛋白基因序列，对基因序列进行密码子优化，HPV L1蛋白通过基因工程的方法在酵母表达系统中表达，HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白在大肠杆菌表达系统中表达，建立工程菌种库，通过生产质控，建立了有效的蛋白表达与生产工艺流程，重组蛋白经纯化、除病毒与除菌后，生产出高活性的HPV重组蛋白，将HPV重组蛋白与步骤1)制得的抗原1混合，然后将这混合液以5:7比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以28000rpm高速匀化，形成油包水乳液，制得复合抗原2；3)选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用步骤2)制得的复合抗原2进行注射免疫，其中，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第18天开始拣取高免疫蛋；4)取步骤3)所得蛋黄，加入10倍量纯化水稀释搅拌均匀，用醋酸调节PH至5.7，在5℃下静置13小时，11000r/min高速离心25分钟，取上清液，将上清液超滤浓缩8倍，加入饱和硫酸铵，IgY析出后，再次离心获得高纯度的蛋白沉淀，蛋白复融后，进行疏水层析，得到高纯度的蛋白样品，蛋白样品经过病毒过滤后，超滤换液，除菌过滤，得到纯品蛋白，即为复合卵黄抗体。

对比例1

与实施例3的不同之处在于，对比例1中壳聚糖的添加量为0.4(W/W)。

对比例2

与实施例3的不同之处在于，对比例2中壳聚糖的添加量为2.1(W/W)。

对比例3

与实施例3的不同之处在于，对比例3中复合卵黄抗体的制备方法中卵黄抗体IgY未经纯化。

对比例4

与实施例3的不同之处在于，对比例4中白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的质量比为1:2:3:1。

对比例5

与实施例3的不同之处在于，对比例5中HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、 HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的质量比为3:1:2:5。

抑菌试验

将本实施例1-3和对比例1-5制得的妇科炎症的复合外用制剂行抑菌实验，使用浓度均为20％，实验方法：采用管碟法，纸片法同时进行。即将念珠菌、葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌四种细菌分别密集划线接种至相应的平板培养基上，然后在每个培养平板上置放两个无菌钢质牛津杯，在牛津杯中分别加入实施例1-3和对比例1-5浓度为20％的悬液0.2ml同时用纸片(直径 6mm高压灭菌后备用)浸透同一浓度药液贴于平板上，细菌培养置37℃24-48 小时观察结果；真菌培养置25℃一周观察结果。

测量牛津杯及纸片周围药物抑菌直径(mm)，结果见表1：

表1

如表1所示，实施例1-3均由于对比例1-5。

典型病例：

谢某，女，26岁，广东省某市某公司职员，几年前下身最明显的感觉就是痒，奇痒无比，更要命的是性生活对她来说成了一种折磨，干涩疼痛，而且有轻微出血，经医院诊断为霉菌性阴道炎。2019年改用本发明实施例1外用制剂，每日2次，28天为一疗程，相隔7天，再使用第二疗程，使用后病情明显好转，霉菌检查为阴性，其他化验结果全部正常。

李某，女，30岁，广东省某市某公司办公室职员，一年前觉得阴部瘙痒，阴道有下坠感，灼热。起初没太在意，一个月后症状加重，疼痛加剧，并出现白带增多，灰白色，伴有臭味。这严重影响到她的工作与生活。经医院诊断为细菌性阴道炎，治疗后稍有好转，症状减轻但未完全消失。一段时间后病症又再度出现，而且比之前还要严重。2020年改用本发明实施例2外用制剂，每日2次，28天为一个疗程，症状完全消失，无再次发作。

张某，女，25岁，广东省某市某公司职员，年前开始出现是白带增多、有腥臭异味，同时脸上长出了不少的色斑，整个人老了好多，而且阴道还出现了不规则的出血。医院诊断为重度宫颈糜烂，医院治疗未见好转。2020年改用本发明实施例3外用制剂，每日2次，28天为一疗程，相隔7天，再使用第二疗程。治后病情明显好转，不仅白带正常了，连脸上的色斑也淡了许多。

在不冲突的情况下，上述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述复合外用制剂的主要活性成分为2-8％(W/W)的复合卵黄抗体和0.5-2％(W/W)的壳聚糖。

2.根据权利要求1所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述壳聚糖为药用级壳聚糖。

3.根据权利要求1所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述复合卵黄抗体包括抗原1与HPV重组蛋白，所述抗原1与HPV重组蛋白的质量比为(1-5)：(1-5)。

4.根据权利要求3所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述抗原1为白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的混合，所述白色念珠菌提取蛋白、金黄色葡萄球菌提取蛋白、淋球菌提取蛋白和加德纳菌提取蛋白的质量比为1:1:1:1。

5.根据权利要求4所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述HPV重组蛋白为HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的混合，所述HPV L1蛋白、HPV L2蛋白、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白的质量比为1:1:1:1。

6.根据权利要求5所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述HPV L1蛋白为酵母表达系统，所述HPV L2蛋白、HPV E6蛋白和HPV E7蛋白为大肠杆菌表达系统。

7.根据权利要求6所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述复合卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：1)培养白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、加德纳菌，提取活性蛋白，混合后为抗原1；2)将重组HPV蛋白提取纯化后加入抗原1，将这混合液以(1-10)：(1-10)比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以25000-30000rpm高速匀化，形成油包水乳液，制得复合抗原2；3)将步骤2)获得的复合抗原2应用到免疫产蛋鸡，取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；4)纯化蛋黄中的卵黄抗体IgY，即得复合卵黄抗体。

8.根据权利要求7所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述步骤3)中将步骤2)获得的复合抗原2应用到免疫产蛋鸡具体为：选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用步骤2)制得的复合抗原2进行注射免疫，其中，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第18天开始拣取高免疫蛋。

9.根据权利要求7所述的妇科炎症的复合外用制剂，其特征在于，所述步骤4)中纯化蛋黄中的卵黄抗体IgY具体为：取步骤3)所得蛋黄，加入10倍量纯化水稀释搅拌均匀，用醋酸调节PH至5.5–6.0，在4–6℃下静置10-16小时，10000-12000r/min高速离心20-30分钟，取上清液，将上清液超滤浓缩5-10倍，加入饱和硫酸铵，IgY析出后，再次离心获得高纯度的蛋白沉淀，蛋白复融后，进行疏水层析，得到高纯度的蛋白样品，蛋白样品经过病毒过滤后，超滤换液，除菌过滤，得到纯品蛋白。

10.根据权利要求1-9任一项所述的妇科炎症的复合外用制剂，在妇科炎症中的应用，所述妇科炎症包括阴道感染所致的内阴瘙痒、宫颈糜烂、腥臭异味和白带增多。