CN116731186A - 抗人IgG-Fc兔单克隆抗体及其制备方法、多核苷酸分子、表达载体和宿主细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，公开了抗人IgG‑Fc兔单克隆抗体及其制备方法、多核苷酸分子、表达载体和宿主细胞，该单克隆抗体包括重链和轻链，重链包含重链可变区，轻链包括轻链可变区；重链可变区包含3个重链互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8‑10所示；轻链可变区包含3个轻链互补决定区，其氨基酸序列如SE Q ID NO.3‑5所示。该单克隆抗体能同时满足流式和病理应用，具有特异性高、亲和力好和稳定性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及抗人IgG-Fc兔单克隆抗体及其制备方法、多核苷酸分子、表达载体和宿主细胞。
背景技术
免疫球蛋白G(IgG)是一种由血浆B细胞产生和释放的一种抗体，IgG主要由脾、淋巴结和骨髓中的浆细胞合成。人类IgG分为四个亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其中IgG1是人类血清中最丰富的IgG亚类。
IgG是血液和细胞外液的主要抗体类型，它可以控制人体组织的感染。抗体可通过结合多种病原体，如病毒、细菌和真菌，来防止细菌、真菌和病毒引起的感染。母体IgG通过胎盘传递给胎儿，该过程对新生儿免疫防御感染至关重要。在某些情况下，IgG的检测作为一个诊断工具。临床上，IgG水平的测定通常被认为是机体对特定病原体免疫状态的指示。IgG蛋白表达异常与肾小球炎性具有密切相关性，该相关性的提出为肾小球炎性以及一些免疫性疾病的预警和诊断提供了新的途径。
目前，大部分市售IgG-Fc抗体，检测应用主要满足WB、ELIS A或IHC、WB等，少有同时满足流式和病理应用的抗体，且大部分现有的单克隆抗体、多单克隆抗体的特异性偏低。因此开发一种能同时满足流式和病理应用的高特异性，高亲和力，人源的兔单克隆抗体，具有非常重要的临床意义。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供了抗人IgG-Fc兔单克隆抗体及其制备方法、多核苷酸分子、表达载体和宿主细胞，该单克隆抗体能同时满足流式和病理应用，具有特异性高、亲和力好和稳定性好的优点。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种抗人IgG-Fc兔单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链包含重链可变区，所述轻链包括轻链可变区；
所述重链可变区包含3个重链互补决定区，其氨基酸序列如SE Q ID NO.8-10所示；
所述轻链可变区包含3个轻链互补决定区，其氨基酸序列如SE Q ID NO.3-5所示。
在以上技术方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在以上技术方案中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在以上技术方案中，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在以上技术方案中，所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码上述单克隆抗体。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述多核苷酸分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转化有上述表达载体。
本发明还提供了一种抗人IgG-Fc兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：采用人IgG-Fc作为免疫原，免疫兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取所述单克隆抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，构建到表达载体上，转染宿主细胞，获得含有所述单克隆抗体的上清，纯化，即得所述单克隆抗体。
本发明的有益效果在于：本发明抗人IgG-Fc兔单克隆抗体可以识别表达人IgG-Fc的细胞或组织样本，能同时满足流式和病理应用，具有特异性高、亲和力好和稳定性好的优点。
附图说明
图1为用SDS-PAGE胶检测IgG1蛋白纯化图；
图2为构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图；
图3为构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图；
图4为实验兔单克隆抗体通过免疫印迹法细胞裂解液样本中的IgG1结果；
图5为实验兔单克隆抗体通过免疫荧光检测细胞样本中IgG1表达情况；
图6为实验兔单克隆抗体通过免疫荧光检测人扁桃体组织中IgG1表达情况；
图7为实验兔单克隆抗体通过流式细胞术检测阳性细胞样本中IgG1表达情况；
图8为实验兔单克隆抗体通过流式细胞术检测阴性样本293F细胞中IgG1表达情况；
图9为实验兔单克隆抗体通过免疫组化检测人结肠癌及扁桃体组织样本中IgG1表达情况；
图10为实验兔单克隆抗体通过免疫组化法检测人脑组织样本中IgG1表达情况。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
本发明提供一种抗人IgG-Fc兔单克隆抗体，命名为兔单克隆抗体3E3。其氨基酸序列如下：
3E3-轻链全长(FL)序列：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFADIVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASESIANNLAWYQHKPGQRPKLLVFYASTLAPGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQSYYYSPTQSYGNTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO.1)
3E3-轻链可变区(VL)序列：
ADIVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASESIANNLAWYQHKPGQRPKLLVF YASTLAPGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQSYYYSPTQSYGNTF GGGTEVVVK(SEQ ID NO.2)
3E3-轻链互补决定区(LCDR1)序列：
ESIANNLAW(SEQ ID NO.3)
3E3-轻链互补决定区(LCDR2)序列：
LVFYASTLAPGV(SEQ ID NO.4)
3E3-轻链互补决定区(LCDR3)序列：
QSYYYSPTQSYGNTF(SEQ ID NO.5)
3E3-重链全长(FH)序列：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPAGSLTLTCTVSGIDLRSYAVAWVRQAPGKGLEWIGMIDNVANTYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGSGLDYKYYSIWGPGTLVTVSLGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO.6)
3E3-重链链可变区(VH)序列：
QSLEESGGRLVTPAGSLTLTCTVSGIDLRSYAVAWVRQAPGKGLEWIGMI DNVANTYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGSGLDYKY YSIWGPGTLVTVSL(SEQ ID NO.7)
3E3-重链互补决定区(HCDR1)序列：
IDLRSYAVA(SEQ ID NO.8)
3E3-重链互补决定区(HCDR2)序列：
IGMIDNVANTYYATWAK(SEQ ID NO.9)
3E3-重链互补决定区(HCDR3)序列：
YFCARGSGLDYKYYSI(SEQ ID NO.10)
本发明还提供一种抗人IgG-Fc兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：采用特定的重组人IgG-Fc作为免疫原，免疫兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，进一步构建到表达载体上，转染细胞等宿主，获得含有兔单克隆抗体3E3的上清，纯化，即得。
下面针对上述兔单克隆抗体3E3的制备及应用进行举例说明。
试验例1
本发明用来制备抗人IgG-Fc兔单克隆抗体的免疫原(人IgG-Fc)浓度为1.52mg/ml，纯度大于95％(见图1)，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫，四次免疫后用ELISA方法测定血清效价，血清按1:243K稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm大于0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三至四天后取脾脏。
进行B淋巴细胞分选，方法参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，获得B细胞。对于获得的单个B细胞，使用专利CN202010398174.3《一种B淋巴细胞体外培养体系及应用》中的方法进行培养。
编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后根据ZYMO公司Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(货号：R1051)说明书提取RNA并反转录成cDNA，采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体的轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。
其中，3E3单克隆抗体的核酸序列如下：
>3E3-轻链FL基因序列：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTACTTCTTCTTTGGCTCCCCGGTGCTACTTTTGCCGATATTGTTATGACACAGACTCCCAGTTCTGTGTCCGCAGCCGTCGGGGGAACCGTGACTATCAATTGTCAGGCCAGCGAGAGCATAGCCAATAACCTAGCTTGGTATCAACACAAGCCAGGTCAGCGCCCAAAACTACTGGTGTTCTACGCAAGTACACTTGCTCCTGGGGTGCCTAGCCGCTTTAAGGGATCAGGCAGCGGAACTGAGTTCACCCTCACAATTTCAGATCTGGAATGTGCCGATGCGGCCACCTATTACTGTCAGTCATATTACTACTCTCCTACCCAGTCTTATGGAAACACCTTCGGCGGCGGTACAGAGGTTGTTGTGAAGGGCGACCCGGTGGCGCCCACTGTATTGATCTTTCCACCCGCCGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO.11)
>3E3-轻链可变区VL基因序列：
GCCGATATTGTTATGACACAGACTCCCAGTTCTGTGTCCGCAGCCGTCGGGGGAACCGTGACTATCAATTGTCAGGCCAGCGAGAGCATAGCCAATAACCTAGCTTGGTATCAACACAAGCCAGGTCAGCGCCCAAAACTACTGGTGTTCTACGCAAGTACACTTGCTCCTGGGGTGCCTAGCCGCTTTAAGGGATCAGGCAGCGGAACTGAGTTCACCCTCACAATTTCAGATCTGGAATGTGCCGATGCGGCCACCTATTACTGTCAGTCATATTACTACTCTCCTACCCAGTCTTATGGAAACACCTTCGGCGGCGGTACAGAGGTTGTTGTGAAG(SEQ ID NO.12)
>3E3-重链可变区VH基因序列：
CAGAGCTTGGAGGAGAGCGGCGGTAGACTGGTTACCCCCGCCGGAAGTCTAACCCTCACCTGCACCGTGTCTGGGATCGATCTGAGGTCTTATGCTGTTGCCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATAGACAACGTAGCCAACACCTATTACGCCACTTGGGCAAAAGGGCGGTTTACAATCAGCAAGACATCCAGCACTACTGTGGATCTGAAGATGACAAGTCTCACCACTGAGGACACCGCCACTTACTTTTGTGCACGTGGCTCTGGGCTTGATTACAAATATTACTCTATCTGGGGCCCCGGTACTTTGGTGACCGTCAGCCTC(SEQ ID NO.13)
>3E3-重链FH基因序列：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTCCTGAAAGGGGTCCAATGCCAGAGCTTGGAGGAGAGCGGCGGTAGACTGGTTACCCCCGCCGGAAGTCTAACCCTCACCTGCACCGTGTCTGGGATCGATCTGAGGTCTTATGCTGTTGCCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATAGACAACGTAGCCAACACCTATTACGCCACTTGGGCAAAAGGGCGGTTTACAATCAGCAAGACATCCAGCACTACTGTGGATCTGAAGATGACAAGTCTCACCACTGAGGACACCGCCACTTACTTTTGTGCACGTGGCTCTGGGCTTGATTACAAATATTACTCTATCTGGGGCCCCGGTACTTTGGTGACCGTCAGCCTCGGTCAGCCAAAAGCACCGTCCGTGTTTCCACTGGCACCGTGCTGCGGGGATACTCCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA(SEQ ID NO.14)
试验例2
本试验例提供兔单克隆抗体的生产和纯化方法，包括如下步骤：
构建表达载体：
所使用的哺乳动物表达载体见图2-3，其中，pBR322Ori和f1Ori是在E.Coli中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV Promotor为在真核生物中的启动子，SV40_PA_terminator是加尾信号，Heavy chain constant(见图2)和Light chain constant(见图3)分别为兔重链不变区序列和轻链不变区序列。
将含兔单克隆抗体重链不变区(见图2)和轻链不变区(见图3)哺乳动物细胞表达母本质粒分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。
利用尾部带有和载体一致同源序列的PCR引物，对所获得的兔单克隆抗体轻重链可变区(VH和VL)基因进行扩增；PCR反应体系为：95℃3min,然后按下列条件进行25个循环反应，95℃1min，56℃1min，68℃0.5min；最后95℃10min。
其中，重链基因的扩增引物序列为：
5’-tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG-3’；
5’-gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG-3’。
轻链基因的扩增引物序列为：
5’-tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC-3’；
5’-cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG-3’。
对扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链可变区基因和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中去。
经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因、重链基因的表达质粒一起转染到293细胞中去。转染72-96小时后，离心除去细胞，获得的培养上清。
使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的抗人IgG-Fc兔单克隆抗体。亲和层析实验步骤为：将培养上清转移至无菌50ml离心管中，1000g离心，4℃(或常温)离心10分钟，收集上清液。将预处理后的Protein A Agarose(品牌：天地人和；货号：SA023100)悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育室温3～4小时或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将Protein A Agarose悬浮液转移到吸附柱中，用掌上离心机常温离心1分钟，使固液分离，收集流穿液。加入十倍Protein A Agarose体积的洗涤缓冲液(磷酸缓冲液pH为7.0)并重新悬浮颗粒，离心机离心，收集洗杂液，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入洗脱缓冲液(柠檬酸盐缓冲液pH为3.0)，离心机离心，获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋(索莱宝；YA1070)中，透析过夜，收取抗体。抗体纯度均大于90％，将检测合格抗体分装，于-20℃低温保存备用。
试验例3
对试验例2所获得的单克隆抗体进行抗体亲和力的初步鉴定，使用293、Daudi、人扁桃体样本对所获得抗体的亲和力进行初步测定，本次实验通过免疫印迹、免疫荧光检测进行测定，检测数据见图4图5图6：图4免疫印迹检测中,抗人IgG1兔单克隆抗体3E3(0.2mg/ml1:4000稀释)在293提取物上在52KD位置有清晰干净的目的条带；图5图6免疫荧光检测中，抗人IgG1兔单克隆抗体3E3(0.2mg/ml1:100稀释)在93F-IgG(FC)过表达、Daudi、人扁桃体阳性样本上检测到目的蛋白，在293F未转染细胞上未检测到目的蛋白；WB有目的条带且IF检测到目的蛋白说明抗人IgG1兔单克隆抗体3E3可识别人IgG蛋白且无非特异型识别。
试验例4
对试验例2所获得的兔单克隆抗体进行流式细胞术方法的检测，使用beckman贝克曼库尔特公司的CytoFLEX S流式分析仪对所获得抗体进行流式应用测定，本次实验通过CytoFLEX S设备进行，使用荧光二抗为Alexa 647conjugated goat anti-rabbitpAb，方法步骤为：
1)将培养好的Daudi、293F-IgG、293F细胞收集于50ml离心管中并计数；400g离心5min，去上清。
2)将收集的细胞用1ml 0.5％ BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，重复2次，用0.5％ BSA/PBS溶液中重悬细胞至500ul。96孔板中每孔加100μl细胞悬液。
3)每孔加200μl Intracellular Fixation buffer，避光室温反应30min。
4)400g离心5min，弃上清，用1x permeablization buffer洗两次。
5)一抗孵育：加入100μL用permeablization buffer稀释好的一抗(2ug/ml)，重悬混合；避光振荡，室温反应30min。
6)400g离心5min，弃上清，用1x permeablization buffer洗两次。
7)二抗孵育：用1X Permeablization buffer稀释好的荧光二抗分配到96孔V型板里，每孔100uL，重悬每孔中的细胞，混合室温避光孵育30min。
8)用1X Permeablization buffer洗2次。
9)用200uL 1X Permeablization buffer重悬每孔细胞，避光保存。
10)分析：使用流式细胞仪进行分析。
11)实验数据见图7图8：抗人IgG1兔单克隆抗体3E3(2ug/ml)在阴性样本293F上无跃迁信号，在阳性样本Daudi和293F-IgG瞬转细胞上有1.5个数量级的跃迁信号，可以看出抗人IgG1兔单克隆抗体3E3满足流式检测用，能特异性识别抗人IgG1蛋白无非特异性识别，能有效避免假阳性结果。
试验例5
对试验例2所获得的兔单克隆抗体进行免疫组化方法检测，本次实验通过光学显微镜对所获得抗体进行病理应用测定。本次实验方法步骤为：
1)样本准备，烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗。
2)抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)高压热修复。
3)内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。
4)封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。
5)一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS工作液稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次(一抗稀释比：1:5000)。
6)二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(剂瓶A)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。
7)显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min。
8)复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min。
9)返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min。
10)脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥。
11)封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出。
12)切片扫描；实验数据见图9图10：抗人IgG1兔单克隆抗体3E3(0.2mg/ml 1:5000稀释)在阳性样本Human colon carcinoma和human tonsil组织上着色显著多于阴性样本Human brain，可以看出抗人IgG-Fc兔单克隆抗体3E3满足病理应用，且亲和力高，特异性好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种抗人IgG-Fc兔单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链包含重链可变区，所述轻链包括轻链可变区；
所述重链可变区包含3个重链互补决定区，其氨基酸序列如SE Q ID NO.8-10所示；
所述轻链可变区包含3个轻链互补决定区，其氨基酸序列如SE Q ID NO.3-5所示。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于：所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于：所述重链可变区的核苷酸序列如SEQID NO.13所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于：所述重链的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
6.一种多核苷酸分子，其特征在于：所述多核苷酸分子编码权利要求1-5任一项所述单克隆抗体。
7.一种表达载体，其特征在于；所述表达载体包含权利要求6所述多核苷酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞转化有权利要求7所述表达载体。
9.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：采用人IgG-Fc作为免疫原，免疫兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取所述单克隆抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，构建到表达载体上，转染宿主细胞，获得含有所述单克隆抗体的上清，纯化，即得所述单克隆抗体。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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