CN114752569A - 一种杂交瘤细胞株8d3、单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用，属于阮病毒检测技术领域。本发明所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45105。本发明所述杂交瘤细胞株8D3能高效稳定的分泌单克隆抗体，分泌获得的单克隆抗体特异性好，不仅能特异性识别朊病毒蛋白，还能区分疯牛病和羊痒病病原体。

Description

一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于阮病毒检测技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用。

背景技术

朊病毒是动物和人类传染性海绵状脑病的病原。由于正常PrP(PrP^c)转变为致病PrP(PrPSc)，从而引发了一系列神经系统退行性疾病，根据其具有传染性，并根据其共同的神经病理变化，将其命名为“可传播性海绵状脑病”，也称为朊病毒病。朊病毒病的共同特征是均可引起致死性中枢神经系统的慢性退化性疾病，其典型病理学特点包括神经元死亡、空泡样变性、胶质细胞和星状细胞增生、PrPSc(朊病毒的异常形式)蓄积及淀粉样斑块形成，脑部和中枢神经出现很多空洞，呈海绵状改变，病变通常两侧对称。临床症状主要表现为痴呆或知觉过敏、共济失调、震颤等中枢神经症状，如羊痒病、疯牛病。该潜伏期长，数月至数年，甚至数十年不等，但一旦出现临床症状病程将迅速加快，在几周到几个月内死亡，致死率达100％。

目前，现行欧盟经过评估的TSE诊断方法是同一种方法，是检测脑组织中的PrPsc，既可以用来检测牛，也可以用来检测羊，如果牛脑检测为阳性则判断为疯牛病，如果羊脑检测的为阳性则判断为羊痒病，但不能区分疯牛病和羊痒病。因此，急需一种可用于诊断朊病毒病、并能区分疯牛病和羊痒病病原的单克隆抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株8D3，能够分泌特异性识别朊病毒蛋白的单克隆抗体，可用于由朊病毒引起的疯牛病羊痒病，并区分疯牛病和羊痒病病原体。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种杂交瘤细胞株8D3，所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.45105。

优选的，所述杂交瘤细胞株8D3以OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株8D3。

优选的，所述OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物由羊PrP多肽和载体蛋白keyholelimpet hemocyanin偶联而成。

本发明还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株8D3分泌产生。

优选的，所述单克隆抗体的腹水效价为1:10⁵。

优选的，所述单克隆抗体特异性识别朊病毒蛋白。

本发明还提供了上述杂交瘤细胞株8D3和/或单克隆抗体在制备检测朊病毒病产品中的应用。

优选的，所述朊病毒病包括疯牛病和/或羊痒病。

本发明还提供了上述杂交瘤细胞株8D3和/或单克隆抗体在制备区分疯牛病和羊痒病病原体产品中的应用。

优选的，所述区分疯牛病和羊痒病病原体的方法包括：将感染组织用蛋白酶K处理后，经过电泳、转印，得到单克隆抗体后，进行免疫学检测，该单抗8D3只与痒病PrP^sc反应，而不与疯牛病PrP^sc反应。

本发明具有如下有益效果：

本发明杂交瘤细胞株8D3能高效稳定的分泌单克隆抗体，分泌获得的单克隆抗体特异性好，不仅能特异性识别朊病毒蛋白，还能区分疯牛病和羊痒病病原体。

保藏说明

本发明提供的杂交瘤细胞株8D3(抗养PrP蛋白特异性片段鼠杂交瘤细胞株)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为 2022年3月1日，保藏地址为保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.45105。

附图说明

图1为8D3株单克隆抗体纯化的SDS-PAGE，其中1为低分子量蛋白 Marker，2为纯化腹水(1ul)，3为纯化腹水(2ul)，4为腹水(1ul)，5 为腹水(2ul)；

图2为杂交瘤细胞8D3培养上清及腹水中单抗ELISA效价的测定曲线；

图3为8D3株腹水与重组PrP抗原、正常羊脑组织和的western-blot检测结果，其中1为重组PrP，2为蛋白分子量Marker，3为蛋白酶K处理的羊脑组织匀浆，4为羊脑组匀浆，5为羊痒病263K感染仓鼠脑组织；

图4为不同抗体对蛋白酶K处理后的BSE和Scrapie感染组织的PrPres 带型，左图为单抗6H4反应，右图为单抗8D3反应，其中M为分子量Marker， 1为羊痒病263K感染仓鼠脑组织，2为BSE C57BL感染小鼠脑组织；

图5为痒病263K感染仓鼠脑组织经过磷钨酸钠沉淀富集后样品经过 1:10，1:20稀释后的蛋白免疫印迹试验结果，其中1、3、5为未经蛋白酶K 处理(Pk-)后1:10稀释，7、9为未经蛋白酶K处理(Pk-)后1:20稀释， 2、4、6为经蛋白酶处理(PK+)1:10稀释，8、10为经蛋白酶处理(PK+) 1:20稀释。

具体实施方式

本发明提供了一种杂交瘤细胞株8D3，所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.45105。所述杂交瘤细胞株 8D3的保藏时间为2022年3月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号，中国科学院微生物研究所。

在本发明中，所述杂交瘤细胞株8D3优选以OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物(多肽序列：GGGGWGQGGSHSQWNK)为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株8D3。

在本发明中，所述OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物优选由羊PrP多肽和载体蛋白keyhole limpet hemocyanin偶联而成。

在本发明中，以OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株的过程中，所述免疫动物优选的为 Balb/c小鼠。本发明对于杂交瘤细胞融合技术的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规杂交瘤细胞融合技术均可。

本发明还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株8D3分泌产生。

本发明所述单克隆抗体经Southern Biotech试剂盒鉴定为IgG 2b亚类，轻链为κ链，优选的是用杂交瘤细胞株细胞接种到实验动物腹腔产生腹水而获得，所述实验动物优选为Balb/c小鼠。本发明杂交瘤细胞培养血清效价为1:10⁴、腹水效价为1:10⁵。

在本发明中，所述单克隆抗体优选特异性识别朊病毒蛋白。

本发明还提供了上述杂交瘤细胞株8D3和/或单克隆抗体在制备检测朊病毒病产品中的应用。

在本发明中，所述朊病毒病优选包括疯牛病和/或羊痒病。

本发明还提供了上述杂交瘤细胞株8D3和/或单克隆抗体在制备区分疯牛病和羊痒病病原体产品中的应用。

在本发明中，所述区分疯牛病和羊痒病病原体的方法包括：将感染组织用蛋白酶K处理后，经过电泳、转印，得到单克隆抗体后，进行免疫学检测，该单抗8D3只与痒病PrP^sc反应，而不与疯牛病PrP^sc反应。

在本发明中，所述产品优选的包括免疫学诊断试剂、试纸条、试剂盒，所述试剂盒优选的包括酶联免疫吸附试验诊断试剂盒、胶体金试剂盒。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

杂交瘤细胞株8D3的建立

1、免疫原的合成

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成羊PrP多肽(ovPrP 89-104)，合成肽序列：GGGGWGQGGSHSQWNK(详见序列表)，并用戊二醛偶联载体蛋白keyhole limpethemocyanin(血兰蛋白,KLH)，纯度为95％以上，得到 OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物。

2、小鼠的免疫

用合成的OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物作为免疫抗原分别免疫6-7 周龄Balb/c小鼠(购自中科院遗传所)3只，每次免疫途径、剂量和佐剂见表1。前三次免疫每次间隔4周，四免后12～15天断尾小量采血用间接ELISA方法测定血清效价，取效价高的鼠进行加强免疫和融合。

表1动物的免疫

四免后10天抗羊朊蛋白多肽阳性血清ELISA效价最高达到1:1.6×10⁵。结果表明OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物抗原性较好，免疫方案合理可行。

3、饲养细胞的制备

于融合前1天，将未经免疫的Balb/c小鼠眼球采血处死(分离血清作为阴性对照，-20℃保存备用)，浸泡于75％酒精内5min，固定于超净工作台无菌腊盘上。小心剪开腹部皮肤，分离皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器吸取适量DMEM营养液注入小鼠腹腔，轻轻震动小鼠腹壁，令腹腔细胞充分进入营养液。吸回营养液并加入无菌离心管内，1000rpm离心10min。沉淀用含1％HAT的营养液悬浮，混匀后加入两块96孔细胞培养板，100ul/孔，置于CO₂培养箱内培养备用。饲养细胞一般在融合前1～2天制备。

4、SP2/0细胞的准备

融合前24-48小时将SP2/0细胞分瓶扩大培养于100mL细胞瓶内。融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管内，1000rpm离心10min，然后用DMEM营养液重新悬浮后计数备用。

5、免疫脾细胞的制备

在强化免疫后第三天取免疫小鼠，眼球采血处死(分离血清作为阳性对照，-20℃保存备用)。处死的小鼠置75％酒精中浸泡5min，转入超净台。无菌取出小鼠脾脏，放入盛有5-10ml DMEM营养液的平皿中，轻轻漂洗。将脾脏移入另一盛有约20ml DMEM营养液的平皿中，用灭菌注射器吸取营养液插入脾脏的一端，推注DMEM液，反复冲洗脾脏数次，直至脾脏颜色变白为止。将洗下的脾细胞移入50ml离心管内，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬浮计数备用。

6、融合

分别吸取10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬液量，加入到一只50 ml离心管内，轻轻混匀。1000rpm离心8min，将上清尽量弃去。用手指轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散混匀成糊状。

吸取1ml DMEM液加入1g灭菌的PEG 4000(事先水浴融化)中，并用7.5％NaHCO₃调pH值至7.5，混匀。一手均匀转动离心管，另一只手吸取1ml上述调好的PEG4000液，沿转动的离心管壁缓缓加入，控制在60s 加完，静置60s。

加入25ml DMEM液终止PEG4000的作用，方法如下：第1分钟加入 1ml DMEM液，第2分钟缓缓加入4ml DMEM液，然后在3分钟内缓慢加入剩余DMEM液。

将融合细胞800rpm/min离心8min，弃上清，加入40ml 1％HAT培养液轻轻吹吸，使沉淀细胞混合均匀。

将悬浮细胞液加入有饲养细胞的96孔板中，每孔100ul，置CO₂培养箱中培养。

每天记录细胞生长情况，融合后第四天用1％HAT选择培养液半量换液，第八天改用1％HT选择培养液全量换液。

7、ELISA筛选方法的建立

分别建立以合成肽为包被抗原、以偶联物高免小鼠血清为阳性对照、以非免疫小鼠血清为阴性对照的间接ELISA方法，共同筛选能分泌特异性抗体的阳性克隆细胞。按上述方法建立羊脑组织匀浆(正常细胞性PrP)间接ELISA方法对合成肽间接ELISA方法筛选出的阳性上清进行再次检测，淘汰假阳性孔。

最佳反应条件的确定

采用方阵法确定抗原最佳包被浓度和阴阳性对照最佳反应浓度，羊抗鼠酶标二抗的稀释度根据产品说明书确定。

判定标准：阳性OD值与阴性OD值比值大于2.1则实验成立，阳性OD 值在1.0左右，阴性OD值小于0.1，且阳性OD值与阴性OD值比值最大时的抗原包被稀释度和阴/阳性血清稀释度为最佳。

间接ELISA反应程序

(1)包被：抗原用包被液按测定的最佳包被浓度稀释后每孔加100μl (含200ng)，4℃过夜

(2)洗涤：甩干板内液体，洗涤液洗涤3次，每次350μl/孔，作用3 分钟。

(3)封闭：每孔加100μl封闭液，37℃作用60分钟。

(4)洗涤：同上。

(5)加一抗：待检细胞上清原液和用抗体稀释液稀释到最适反应浓度的阴阳性血清，每孔加50μl，37℃作用60分钟。

(6)洗涤：同上。

(7)加酶标二抗：酶标羊抗鼠IgG用抗体稀释液按工作浓度(1:10,000) 稀释，每孔加100μl，37℃作用60分钟。

(8)洗涤：同上。

(9)加底物：每孔加新配制的底物溶液100μl，37℃作用15分钟。

(10)终止反应：每孔加终止液50μl。

(11)读数：测定各孔OD₄₅₀。

不同浓度(μg/孔)包被抗原的OD_450nm值详见表2。

表2不同浓度(μg/孔)包被抗原的OD_450nm值

注:+号为阳性血清；-号为阴性血清。

根据表2，确定抗原的最佳包被浓度为0.2ug/孔，抗体最佳稀释度为 1:5000。

8、阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合后的细胞生长到覆盖细胞孔底部1/4-1/3时，用建立的ELISA方法对所有有细胞生长的培养上清进行筛选。选择检测为阳性的细胞进行扩大培养或选择强阳性孔进行克隆，其中重点选择与正常细胞性PrP反应较强的细胞进行克隆。ELISA检测阴性孔3天后再测一次，如仍为阴性则弃去，若为阳性同上法进一步检测、扩大培养。此外，细胞上清仅与重组牛朊蛋白反应且反应较强的细胞株也同时进行克隆和扩大培养。

PEG法融合后接种2块96孔细胞培养板，第3天可见有细胞克隆生长，其中有杂交瘤细胞生长的168孔，融合率为87.5％，融合后第10天用建立的ELISA法筛选，分泌抗体阳性的有36孔，阳性率为21.4％。同时用正常脑组织匀浆作为包被抗原，以排除假阳性孔。选择3个强阳性孔，经3次克隆，得到3株能稳定分泌抗重组PrP蛋白抗体的杂交瘤细胞株5H9，8A5,8D3，其中仅8D3能特异性识别正常细胞型羊朊蛋白。

9、阳性杂交瘤细胞的克隆和冻存

采用有限稀释法

克隆的前一天制备饲养细胞，方法如前所述。将检测为强阳性的细胞孔细胞用吸管轻轻吹吸使细胞悬浮并分散均匀，吸至1ml含20％胎牛血清的 DMEM液中，取少量悬液进行细胞计数。用1％HT选择培养液稀释阳性杂交瘤至10个/ml、5个/ml、2个/ml、1个/ml，并分别加到有饲养细胞的96 孔培养板中，100ul/孔，每一稀释度加32个孔。

每天观察并记录细胞生长情况。第四天，1％HT选择培养液半量换液，第八天，1％HT选择培养液全量换液，检测上清。选择仅有一个克隆生长的阳性孔再次进行克隆化，直至阳性孔达到100％。

获得稳定分泌抗体的单克隆细胞株后，及时扩大培养并冻存。

选择处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下。细胞悬液1000 rpm离心10min，弃上清。用冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于细胞冻存管中， 1.5ml/管，加盖封严，注明细胞代号、冻存日期。将冻存管于4℃放置4小时，转入-80℃过夜，最后将之移入液氮罐内长期保存。

实施例2

单克隆抗体的制备

1、杂交瘤细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中，晃动使其尽快融化。 1000rpm离心10min，弃上清。用20％血清DMEM液将沉淀悬浮，加入细胞瓶中，置CO₂培养箱内培养。第二天，用含20％血清DMEM换液培养。

2、单克隆抗体的制备可采用体外培养法和/或体内诱生腹水法

体外培养法

将已建立的杂交瘤细胞株8D3扩大培养，并持续培养直至细胞全部死亡。收集细胞培养上清，1000rpm离心10min，上清液-20℃保存备用。

体内诱生腹水法

挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只。10天后，将扩大培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10min，弃上清，用5ml DMEM 重新悬浮，计数。每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞10⁶个。7-10天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水。将腹水5000rpm离心10min，收集上清，-20℃保存备用。

实施例3

单克隆抗体的鉴定

1、单克隆抗体的免疫球蛋白亚类及轻链种类鉴定

用SouthernBiotech试剂盒鉴定。具体方法如下：

(1)包被：将试剂盒中提供的抗体用pH值9.6的磷酸盐缓冲溶液稀释至浓度为5～10ug/ml，100ul/孔，4℃过夜。

(2)洗涤：用含0.05％Tween-20的PBS洗涤三次。

(3)封闭：用含1％牛血清白蛋白的PBST封闭，200ul/孔，37℃孵育 1h。

(4)洗涤：同上。

(5)加样：加入杂交瘤细胞培养上清，100ul/孔，37℃孵育1h。

(6)洗涤：同上。

(7)加酶：用含1％牛血清白蛋白的PBST稀释碱性磷酸酶标记的免疫球蛋白类、亚类、轻链和重链到合适浓度加入酶标板中，100ul/孔，37℃孵育1h。

(8)洗涤：同上。

(9)显色：将底物稀释至1mg/ml(试剂盒提供的5mg片剂加入5ml 底物缓冲溶液)，加入反应孔中，100ul/孔，显色10～20min时经酶标仪测定其在450nm处的OD值。

判定标准：以OD值最高的为McAb亚类。

经Southern Biotech试剂盒测定，杂交瘤细胞8D3为IgG 2b亚类，轻链为κ链。

2、腹水中单克隆抗体的纯化

腹水纯化(采用辛酸-饱和硫酸铵法)

(1)取腹水10ml，加入0.06M醋酸钠-醋酸缓冲液(pH4.0)20ml，边加边搅拌。

(2)用1M氢氧化钠将腹水pH值调至4.8后，边搅拌边加入正辛酸0.33 ml，冰浴搅拌30min。

(3)腹水经10000rpm离心30min后，弃沉淀，上清用1M氢氧化钠将 pH值调至7.2，边搅拌边缓慢加入等体积饱和硫酸铵，搅拌30min后，经 10000rpm离心30min，弃上清，沉淀溶于5.5ml PBS中。

(4)缓慢滴入4.5ml饱和硫酸铵，并不断搅拌30min后，10000rpm离心30min，将沉淀溶于2.2ml PBS中，移至透析袋中4℃透析48小时。收集，-20℃保存。

SDS-PAGE法检测腹水单克隆抗体的纯化效果。

纯化和未纯化腹水各取少量进行SDS-PAGE，浓缩胶和分离胶的浓度分别为5％、12％，恒压150V电泳约一个小时，至溴酚兰迁移至凝胶边缘。小心取下凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，染色半小时，脱色至蛋白条带清晰。凝胶成像系统观察记录结果。

由图1可知，辛酸-饱和硫酸铵法提纯8D3株单抗后进行SDS-PAGE，纯化前后比较，腹水中大部分杂蛋白已被去除，得到了较好的纯化效果。该株单抗重链分子质量约为50KD，轻链分子质量约为25KD。

3、杂交瘤细胞培养上清及腹水中单抗ELISA效价的测定

杂交瘤细胞培养上清从1:10开始作10倍倍比稀释，腹水从1:100开始作10倍倍比稀释，按建立的ELISA方法测定其效价，详情见图2。

根据图2可知，由杂交瘤细胞8D3得到的单克隆抗体ELISA效价为1： 10⁴，腹水中单抗ELISA效价的1:10⁵。

4、单克隆抗体的稳定性测定

将杂交瘤细胞8D3冻存3个月后复苏，经培养收集细胞上清，用间接 ELISA法测定杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性，杂交瘤细胞分泌的单抗 10⁴稀释时ELISA值判为阳性，详情见表3。

表3单抗8D3的稳定性测定

由表4可知，8D3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体效价达到1:10⁴，能够稳定分泌抗羊PrP的抗体。

5、Western-Blot分析

SDS-PAGE电泳

各泳道依次加入处理的低分子量蛋白质Marker、正常脑组织匀浆、纯化牛朊蛋白，120V稳压电泳约1.5小时，至溴酚兰迁移至凝胶边缘，结束电泳。

转印

采用浸润法。按常规放置滤纸、胶、PVDF膜和滤纸的“三明治”夹层， 200mA稳流电转1小时。剪取Marker做考马斯亮兰染色。

免疫检测

印迹膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，加入2500倍稀释的腹水作用1小时，洗涤3次每次10分钟，加入1:5000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG 37℃作用1小时，洗涤3次每次10分钟，将膜浸泡于新配制的ECL发光试剂中孵育，显影、定影。

免疫印迹试验主要分为SDS-PAGE电泳、转膜和抗体检测三部分，转膜效率会影响到后面的实验，若转膜时间过长，会使PVDF膜上的非特异性条带增多，影响抗体检测试验的特异性，若转膜时间过短，会减少PVDF膜上目的条带的含量，影响抗体检测试验的敏感性，适当提高转印缓冲液中甲醇的含量可提高转膜效率；抗体检测试验中腹水或酶标二抗的浓度过高都会增强反应结果的非特异性，在本次实验中为了优化反应条件，减少非特性反应，将纯化8D3单抗腹水作1:1000、1:2500、1:5000、1:10000倍稀释，将酶标二抗作1:5000和1:10000倍稀释，结果表明，腹水和酶标二抗分别作1:2500、 1:10000倍稀释是最佳反应条件。

由图3可知，8D3株腹水与重组PrP抗原、正常羊脑组织和的反应结果。从图谱中看出，8D3株单抗腹水与正常羊脑组织中分子量约33-35KD处蛋白结合，并与痒病263K感染仓鼠脑组织中27-33KD处发生特异性蛋白反应。因此可以判断8D3株单抗就是针对羊PrP蛋白的特异性抗体。

实施例4

杂交Westernblot鉴别疯牛病与羊痒病方法的建立

1、实验准备

单抗6H4，鼠抗PrPIgG1，工作浓度1:5000稀释(为避免液体沾到瓶壁或瓶盖，管可以离心)

碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体IgG-AP，工作浓度1：2500稀释(为避免液体沾到瓶壁或瓶盖，管可以离心)

抗羊PrP特异性片段单抗8D31:2500稀释

CDP-Star浓缩液，碱性磷酸酶底物(APS)(12.5mM或25mM)Roche 公司

对照样品(BSEPrP^sc样品)，一小瓶在胶上样缓冲液中的正常的PrPc 和分子量标记(97/66/45/30/20/14KD)，使用前混合，如轻打。

2、样品准备

(1)样品编号

(2)所有的样品通过完成检测记录能够追踪到。

(3)在2BⅡ生物安全柜在切割组织。

(4)在切板上修剪组织，用纸巾吸取多余的血液。用2％的漂白剂消毒切板和纸巾一小时，冲洗。把器械放入2N的NaOH浸泡2h，冲洗。漂白剂散发后，在生物安全柜中将纸巾放入开口的生物危害袋中，135℃，高压消毒30分钟。

(5)在2BⅡ罩下从延髓的脑闩部位切取一块组织，把脑闩切块放入事先称重过的匀浆管中，组织块应在0.45-0.70g之间(最好是0.5-0.55g)。

(6)在放入组织块的匀浆管中加入10倍体积的1×匀浆缓冲液(W/V)，盖上盖子。

(7)用FASTH或MediFASTH匀浆机自动匀浆45秒。

(8)取1.5mL 10％的匀浆缓冲液转到2.0mL的微量离心管中。

(9)10℃，5000rpm(1130g)离心5分钟。或在-20℃保存(此管为母管(mastertube))。

3、杂交westernblot方法

(1)用加样器从母管中取100μL上清转入一个新的2ml微量离心管的底部。

(2)加入10μL蛋白酶K和10μL消化缓冲液，吹打混匀(8-10次)。蛋白酶K的终浓度为50μg/ml。

(3)盖上盖，放入孵育加热器中，50℃加热40分钟。

在孵育期间准备17孔12％NuPAGE胶，首先小心地把梳子拔出，撕掉胶底部的白色塑料箔，在左边孔下标号(1-6)，放入电泳槽中，用SDS_MOPS 冲洗胶孔准备上样，加入MOPS至距离胶槽3-5cm，在转印槽中加入1×转印缓冲液，打开冷却装置预冷转印缓冲液。

(4)孵育后，加入10μL消化终止液终止酶消化反应。

(5)在消化管中加入100μL PAGE上样缓冲液，吹打混匀。

(6)在孵育加热器中100℃孵育10分钟(以前在96℃孵育过的旧样品要加热到65℃2分钟)。

(7)14000rpm离心5分钟。

(8)取12μL样品上清加入17孔12％的NuPAGE胶中，从左到右，依次加入分子量Marker，BSE C57BL感染小鼠脑组织，痒病263K感染仓鼠脑组织，空白(预染Marker)，分子量Marker，BSE C57BL感染小鼠脑组织，痒病263K感染仓鼠脑组织。分子量Marker只需加1μL。

(9)在内槽中加入1×SDS-MOPS电泳缓冲液中，确保缓冲液覆盖胶的顶端。

(10)加入500μL抗氧化剂，200V电泳，至染色线距离胶底部1-2cm。 (大约30分钟)。

(11)在电泳的同时，准备PVDF膜，剪切PVDF膜到合适尺寸，放入塑料浅盘中，在甲醇中浸润几秒钟，倒掉甲醇，在1×转印缓冲液中至少平衡10分钟，在转印槽中加入预冷的1×转印缓冲液。

(12)在装有1×转印缓冲液的容器中，弄湿一块海绵，在海绵上放一块一张滤纸，使滤纸也湿润，再把PVDF膜放在滤纸上，在膜的左上角写上板号，确保在容器中有足量的缓冲液，以致在放胶时膜不会干。

(13)用胶刀裂开NuPAGE胶的塑料框，切掉胶的含有孔的顶端部分，切掉超过染色线的底端部分。在有胶号的角处剪个切口，有助于把胶定向到膜上。

(14)把胶放在膜上，如图所示，确保在胶和膜之间没有气泡，气泡会干扰转印。

(15)在胶上放已湿润的滤纸，再放第二块海绵。

(16)小心地把转印三明治转入转印盒里，避免在三明治中产生气泡。

(17)在有连续致冷和混合的4℃条件下，140-150V转印1小时。

(18)转印完成后，把转印膜从三明治中取出放在塑料孵育盒中，用 TBST冲洗，每次1分钟，洗2次。

(19)倒掉TBST，根据膜的大小加入适量的PVDF封闭缓冲液，在板面摇床上室温下震荡60分钟。

(20)倒掉PVDF封闭缓冲液，从PVDF膜的中间(空白道)把该膜切割分成两半，一半用来做6H4免疫反应，一半用来鼠抗羊PrP特异性抗体 8D3免疫反应。根据膜的大小用TBST配制适量的一抗，1)6H4 1:5000，2μL 加入10mL 1倍封闭液中；2)鼠抗羊PrP特异性抗体8D3，4μL加入10mL 1 倍封闭液中，孵育膜4℃过夜。

(21)用50mlTBST洗膜，每次7分钟，洗4次。

(22)倒掉最后一次的TBST洗涤液，根据膜的大小用TBST配制适量的二抗(AP，羊抗鼠AP)，在摇床上室温下震荡60分钟孵育膜。

(23)用50mlTBST洗膜，每次7分钟，洗4次。

(24)倒掉最后一次的TBST洗涤液，用去离子水配制50ml一倍发光缓冲液，取适量的发光缓冲液加入另一个单独的管中，加入膜上震荡5分钟。

(25)加入适量的CDP-Star(12.5mM；50×)或(25mM；100×)到已倒掉部分的发光缓冲液中，黑暗中保存直至使用。

(26)倒掉发光缓冲液，把膜从塑料孵育盒中拿出，放置在塑料或有机玻璃片上。在上面均匀地涂上适量的稀释过的CDP-Star溶液中，室温5分钟，确保整个过程中整个膜处于湿润状态。

(27)用软的面巾纸从膜上移去剩余的发光缓冲液(不要使膜完全变干)，立即用塑料保鲜膜覆盖，消除塑料膜下面折痕和气泡，放入胶片盒中。

(28)进入暗室，使膜曝光到X光片(HyperFilm)，直到阳性对照的强信号出现和膜背景或蛋白酶K带出现，(大约4-8分钟)，为达到出现最佳可见信号曝光时间可以更长或更短。也可将膜放在干净的塑料膜上，放在化学发光成像仪，使用CCD-照相机检测系统检测光信号。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

疯牛病BSE C57BL感染小鼠脑组织，羊痒病263K感染仓鼠脑组织经蛋白酶K处理后，电泳、转印、免疫学检测，由图4所示，BSEPrP^sc样品与单抗6H4反应强而与单抗8D3反应非常弱或不反应，痒病PrP^sc样品与单抗6H4 和8D3都显示强反应。并出现了PrPsc的典型三条带，从上到下即双糖基化带、单糖基化带、无糖基化带，分子量在17-30KDa之间分布。且三条带的密度：双糖基化带>单糖基化带>无糖基化带，羊痒病PrP^sc无糖基化带的分子量稍大于BSEPrP^sc。因此，本发明制备得到的单抗8D3能明显鉴别痒病 PrP^sc和疯牛病PrP^sc。

4、磷钨酸钠沉淀法富集PrP^sc的建立

按照杂交western blot的方法，制备20％的脑组织匀浆，取0.6mL加入相同体积的4％的Sarkosyl溶液(含4％Sarkosyl的PBS,pH7.4)，37℃孵育 10分钟，然后再加入DNAseⅠ(100μg/mL)，37℃孵育30分钟，4000rpm (1538g)离心10分钟，离心后取1mL上清加入蛋白酶K，终浓度为 (50μg/mL)，50℃孵育40分钟。蛋白酶消化后，加入终浓度为0.4％的磷钨酸钠溶液(4％，W/V，170mM MgCl，PBS，pH7.4),37℃震荡孵育30 分钟，13000rpm离心30分钟，弃上清，用12μL水悬浮沉淀。然后加入12μL NuPAGE上样缓冲液，100℃加热10分钟，最后按照杂交western blot的方法进行电泳、转印、免疫学检测。

图5显示出了典型的PrPsc带型，且痒病263K感染仓鼠脑组织经过磷钨酸钠沉淀后即使经过1:20稀释信号显著比未用磷钨酸钠沉淀法的强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国海关科学技术研究中心

<120> 一种杂交瘤细胞株8D3、单克隆抗体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys

1 5 10 15

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株8D3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株8D3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45105。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株8D3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株8D3以OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株8D3。

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株8D3，其特征在于，所述OvPrP(89-104aa)-KLH多肽偶联物由羊PrP多肽和载体蛋白keyhole limpet hemocyanin偶联而成。

4.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株8D3分泌产生。

5.根据权利要求4所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的腹水效价效价为1:10⁵。

6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别朊病毒蛋白。

7.一种权利要求1-3任一项所述杂交瘤细胞株8D3和/或权利要求4-6任一项所述单克隆抗体在制备检测朊病毒病产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述朊病毒病包括疯牛病和/或羊痒病。

9.一种权利要求1-3任一项所述杂交瘤细胞株8D3和/或权利要求4-6任一项所述单克隆抗体在制备区分疯牛病和羊痒病病原体产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述区分疯牛病和羊痒病病原体的方法包括：将感染组织用蛋白酶K处理后，经过电泳、转印，得到单克隆抗体后，进行免疫学检测，该单抗8D3只与痒病PrP^sc反应，而不与疯牛病PrP^sc反应。

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