BRPI0515922B1 - molécula de dna, kit, constructo, método de identificação do evento, método de detecção, par de moléculas de dna, método de confirmação da pureza, método de varredura, par de sequências de dna - Google Patents
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Abstract
"moléculas de dna isoladas, par de moléculas de dna, sequência de dna isolada, par de sequências de dna isoladas, sequência de iniciador de nucleotídeo de dna isolada, constructo de dna, kit e método de identificação do evento das - 59122-7 em amostra biológica, kit de detecção de dna, métodos de detecção da presença do evento das-59122-7 e de dna correspondente ao evento das-59122-7, métodos de varredura e de confirmação da pureza de semente, método de produção de planta de milho resistente a insetos, método de detecção da presença de inserção do evento das-59122-7 em tecido de milho". a presente invenção refere-se a composições de dna relacionadas a plantas transgênicas de milho resistentes a insetos. a presente invenção refere-se ainda a ensaios de detecção da presença do envio das-59122-7 de milho, baseados na sequência de dna do constructo recombinante inserido no genoma do milho e nas sequências de dna que flanqueiam o sítio de inserção. também são fornecidos kits e condições úteis na realização dos ensaios da presente invenção.
Description
(54) Título: MOLÉCULA DE DNA, KIT, CONSTRUCTO, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DO EVENTO, MÉTODO DE DETECÇÃO, PAR DE MOLÉCULAS DE DNA, MÉTODO DE CONFIRMAÇÃO DA PUREZA, MÉTODO DE VARREDURA, PAR DE SEQUÊNCIAS DE DNA (51) lnt.CI.: C12N 15/82; C12Q 1/68 (30) Prioridade Unionista: 29/09/2004 US 60/614,225 (73) Titular(es): Ε I DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY. DOW AGROSCIENCES LLC. PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC (72) Inventor(es): JAMES WAYNE BING; ROBERT F. CRESSMAN JR.; MANJU GUPTA; SALIM M. HAKIMI; DAVID HONDRED; TODD L. KRONE; MARY E. HARTNETT LOCKE; ABIGAIL K. LUCKRING; SANDRA E. MEYER; DANIEL MOELLENBECK; KENNETH EDWIN NARVA; PAUL D. OLSON; CRAIG D. SANDERS; JIMEI WANG; JIAN ZHANG; GAN-YUAN ZHONG (85) Data do Início da Fase Nacional: 29/03/2007
MOLÉCULA DE DNA, KIT, CONSTRUCTO, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DO EVENTO, MÉTODO DE DETECÇÃO, PAR DE MOLÉCULAS DE DNA, MÉTODO DE CONFIRMAÇÃO DA PUREZA, MÉTODO DE VARREDURA, PAR DE SEQUÊNCIAS
DE DNA
CAMPO DA INVENÇÃO
As inovações da presente invenção estão relacionadas ao campo da Biologia Molecular de Plantas, especificamente relacionadas com um constructo de DNA que confere resistência à insetos. Inovações da invenção são mais especificamente relacionados com a linhagem de milho DAS-59122-7, que apresenta resistência à insetos, e com ensaios para a detecção da presença do DNA da planta de milho DAS-59122-7 numa amostra e as composições destes.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Um avanço desta invenção refere-se à planta de milho (Zea mays) resistente à insetos DAS-59122-7, também referenciada como linhagem DAS-59122-7 ou milho evento DAS-59122-7, e a expressão do DNA da planta DAS-59122-7 e a detecção da região de inserção do transgene/região
Petição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 24/27
2/74 flanqueadora do inserto na planta DAS-59122-7 e na progênie destes.
O milho é um grão de importância e é uma fonte primária de alimento em muitas regiões do mundo. O dano causado por pragas de insetos é o principal fator na perda de colheitas de milho no mundo, apesar do uso de medidas protetoras como a aplicação de pesticidas quimicos. Em vista disso, a engenharia genética tem sido usada para conferir resistência à insetos em plantações como as de milho, com o objetivo de controlar os danos provocados por insetos e reduzir a necessidade dos pesticidas quimicos tradicionais. Um grupo de genes que tem sido usado para a produção de plantas trasgênicas resistentes a insetos é o das delta-endotoxinas do Bacíllus thuríngíensis (B.t.). Delta-endotoxinas têm sido expressas com sucesso em plantas como algodão, batata, arroz, girassol, além do milho, e têm provado conferir excelente controle sobre pestes de insetos (Perlak, F.J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943;
Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22 z 313-321;
Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; PCT publication number WO 01/13731; and Bing JW et al. (2000) Efficacy of CrylF Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO).
expressão de genes exógenos em plantas conhecidamente influenciada pela localização destes no
3/74 a
genoma vegetal, talvez devido à estrutura da cromatina (ex: heterocromatina) ou à proximidade de elementos de regulação da transcrição (ex:enhancers) junto ao sítio de inserção (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988) . Ao mesmo tempo a presença do transgene em diferentes locais do genoma influenciará o fenótipo geral da planta de diferentes maneiras. Por este motivo, é importante pesquisar em um grande número de eventos, de maneira a identificar um caracterizado por uma expressão ótima do gene de interesse introduzido. Por exemplo, tem sido observado em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação nos níveis de expressão de um transgene dentre os eventos. Pode haver também diferenças nos padrões espaciais e temporais de expressão, como por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em variados tecidos vegetais, que podem não corresponder aos padrões esperados de acordo com os elementos reguladores de transcrição presentes na construção do transgene introduzido. Por esta razão, é comum produzir de centenas a milhares de eventos diferentes e procurar dentro destes por um único que apresente níveis de expressão desejados e padrões para propósitos comerciais. Um evento que apresenta níveis ou padrões desejados de expressão do transgene está apto para introduzir o transgene em outras linhagens por meio de cruzamento sexual através de métodos clássicos. A progênie desses cruzamentos mantém as características de expressão dos transformantes originais. Esta estratégia é usada para assegurar o padrão de expressão em um número de
4/14 variedades que são bem adaptadas as condições locais de crescimento.
Seria vantaj oso conseguir detectar a presença de um evento particular de maneira a saber se a progênie de um cruzamento sexual contem o transgene de interesse. Além disso, um método para detectar um evento particular seria útil para obedecer à regulamentações que requerem a aprovação de alimentos derivados das plantas recombinantes antes da entrada do produto no mercado e etiquetagem destes por exemplo, ou a para uso em monitoramento ambiental, monitoramento de traços de plantas no campo, ou monitorar produtos derivados da colheita, assim como para assegurar a conformidade das partes sujeitas a termos regulatórios e contratuais.
É possivel detectar a presença de um transgene por meio de qualquer método de detecção de ácido nucléico conhecido como, porém não limitados a estes, a reação em cadeia da Polimerase (PCR) ou a hibridização de DNA usando sondas de ácido nucléico. Estes métodos de detecção geralmente enfocam elementos genéticos frequentemente usados, como promotores, agentes de terminação, genes marcadores, etc., porque para muitas construções de DNA a região codificante é intercambiável. Como resultado, estes métodos podem não ser muito proveitosos para diferenciar eventos distintos, particularmente aqueles produzidos com o mesmo constructo de DNA ou construções muito similares, a menos que a seqüência de DNA da região flanqueadora
5/74 adjacente ao DNA heterólogo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR para um evento especifico é descrito na patente U.S. Patent No. 6,395,485 para a detecção do principal evento GAT-ZMl. Desta forma, seria desejável haver um método simples e discriminatório para o evento DAS-59122-7.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Avanços desta invenção estão relacionados a métodos para produzir e selecionar plantas monocotiledôneas resistentes a insetos. Mais especificamente, um constructo de DNA é fornecida e quando expressa em células vegetais e plantas confere resistência a insetos. A considerar como um aspecto da invenção, um constructo de DNA, capaz de se introduzir e se replicar em uma célula hospedeira, é fornecido e quando expresso em células vegetais e plantas, confere resistência a insetos nestas células ou plantas. 0 constructo de DNA é composto por uma molécula de DNA chamada PHI17662A e apresenta três (3) cassetes de expressão de transgene. O primeiro cassete de expressão compreende uma molécula de DNA que apresenta o promotor, exon 5'não traduzido, e o primeiro intron do gene que codifica a ubiquitina de milho (Ubi-1) (Christensen et a2. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 e Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) operacionalmente conectado à molécula de DNA que codifica uma B.t. δendotoxina identificada como Cry34Abl (U.S. Pat. Nos.
6,127,180,
6,624,145
6,340,593) conectada
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operacionalmente à molécula de DNA contendo o agente de terminação transcricional Pin II isolado de batata {Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). O segundo cassete de expressão do constructo de DNA compreende uma molécula de DNA que representa o promotor da peroxidase de trigo (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174) conectado operacionalmete à molécula de DNA que codifica uma B.t. δ-endotoxina identificada como Cry35Abl (U.S. Pat. Nos. 6,083,499, 6,548,291 e 6,340,593) operacionalmente conectada à molécula de DNA contendo o agente de terminação transcricional Pin II isolado de batata (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). O terceiro cassete de expressão do constructo de DNA compreende uma molécula de DNA representada pela seqüência correspondente ao promotor 35S do Virus do Mosaico da Couve-flor (Ca MV) (Odell J. T. et al. (1985) Mature 313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) operacionalmente conectado à molécula de DNA que codifica uma fosfinotricina acetiltransferase (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70: 25-37) operacionalmente conectada à molécula de DNA contendo o agente de terminação transcricional 3' do promotor (CaMV) 35S (ver Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59). Plantas contendo o constructo de DNA também são fornecidas.
Considerando outros avanços da invenção, composições e métodos são fornecidos para uma nova planta de milho, designada como DAS-59122-7, os quais são baseados em iniciadores e sondas que reconhecem, especificamente, as
Ί/li regiões flanqueadoras 5' e/ou 3' do DAS-59122-7. São fornecidas as moléculas de DNA que quando utilizadas como iniciadores em uma reação de PCR produzem amplicons específicos do evento transgênico DAS-59122-7. Estas moléculas (iniciadores) podem ser selecionadas do grupo abaixo:
5'-GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC-3' (SEQ ID NO: 1);
5'-CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG-3' {SEQ ID NO: 2); 5'-AATTGAGCGCTTGCACGTTT-3' {SEQ ID NO: 3);
5'-AACAACAAGACCGGCCACACCCTC-3' (SEQ ID NO: 4);
5'-GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA-3' (SEQ ID NO: 5);
5'-TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA-3' {SEQ ID NO: 6);
5'-GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA-3r (SEQ ID NO: 7);
5'-AACCCTTAGTATGTATTTGTATT-3' {SEQ ID NO: 8);
5'-CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG-3' (SEQ ID NO: 9);
5'-TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG-3' (SEQ ID NO: 10);
5'-GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT-3' (SEQ ID NO: 11);
| 5'-GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC-3' | (SEQ | ID | NO: | 12) ; | |
| 20 | 5' -CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA-3' | (SEQ | ID | NO: | 13) ; |
| 5'-CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC-3' | (SEQ ID NO | : 14); | |||
| 5' -GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA-3' | (SEQ | ID | NO: | 15) ; | |
| 5' -GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG-3' | (SEQ | ID | NO: | 16) ; | |
| 5'-CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG-3' | (SEQ | ID | NO: | 17) ; | |
| 25 | 5'-AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC-3' | (SEQ | ID | NO: | 18) |
| 5' -CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG-3' | (SEQ | ID | NO: | 36) ; |
(SEQ ID NO:
5' -GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG-3 complementos destes.
3/Ί4
Plantas de milho e grãos contendo estas moléculas são um avanço desta invenção. Além disso, kits que utilizam estas seqüências de iniciadores para a identificação do evento DAS-59122-7 são fornecidos.
Um avanço adicional desta invenção está relacionado às seqüências flanqueadoras específicas do DAS-59122-7 descritas aqui, que podem ser usadas para realizar um método de identificação específica para DAS-59122-7 em amostras biológicas. Mais particularmente, a invenção se refere às regiões flanqueadoras 5' e/ou 3' do DAS-59122-7, SEQ ID NO: 19, flanqueadora 5' e SEQ ID NO: 20, flanqueadora 3', respectivamente, que podem ser usadas para produzir iniciadores e sondas específicas. Outro avanço da invenção se refere aos métodos de identificação da presença do DAS-59122-7 em amostras biológicas baseados na utilização de destes iniciadores e sondas específicos.
Considerando outro avanço desta invenção, métodos para a detecção da presença do DNA correspondente ao evento em milho DAS-59122-7 em uma amostra é fornecido. Tais métodos consistem em: (a) juntar a amostra contendo o DNA com um jogo de iniciadores, que quando utilizado numa reação de amplificação de ácido nucléico com o DNA genômico extraído do evento milho DAS-59122-7 produz um amplicon que é diagnóstico para o evento DAS-59122-7; (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, pela qual será produzido o fragmento , e (c) detectar o fragmento.
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Moléculas de DNA que compreendem a nova região de flanqueadora mais inserçao/adjacente do transgene, SEQ ID NO: 21, 5' flanqueadora mais 1000 interna e SEQ ID NO: 22, 3'
1000 interna e são homólogas ou complementares à SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 representam um avanço desta invenção.
Sequências de DNA que compreendem a nova região de inserção/adjacente, SEQ ID NO: 21 são um avanço desta invenção. Seqüências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotideos da seqüência transgene e um comprimento suficiente de polinucleotideos genômicos de milho e/ou seqüência flanqueadora de SEQ ID NO: 21 na planta de milho DAS-59122-7, que são úteis como seqüências iniciadores para a produção de um fragmento diagnóstico para a planta de milho DAS-59122-7, estão incluídas.
Além disso, seqüências de DNA que compreendem a nova região de inserção/adjacente, SEQ ID NO: 22, são fornecidas. Seqüências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotideos da seqüência transgene e um comprimento suficiente de polinucleotideos genômicos de milho e/ou seqüência flanqueadora de SEQ ID NO: 22 na planta de milho DAS-59122-7, que são úteis como seqüências iniciadores para a produção de um fragmento diagnóstico para a planta de milho DAS-59122-7, estão incluídas.
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Considerando outro avanço desta invenção, sequências de DNA que apresentam 11 ou mais nucleotídeos da porção transgênica da seqüência de DNA da SEQ ID NO: 21 ou complementos desta, e um tamanho similar ao da região flanqueadora 5'do DNA de milho da seqüência SEQ ID NO: 21 ou complementos deste são úteis como iniciadores em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos com estes iniciadores servem como diagnóstico para o evento DAS-59122-7. Consequentemente, dentre os avanços desta invenção incluem-se os amplicons produzidos por iniciadores homólogos ou complementares a SEQ ID NO: 21.
Considerando outro avanço desta invenção, sequências de DNA que apresentam 11 ou mais nucleotídeos da porção transgênica da seqüência de DNA da SEQ ID NO: 22 ou complementos desta, e um tamanho similar ao da região flanqueadora 3' do DNA de milho da seqüência SEQ ID NO: 22 ou complementos deste são úteis como iniciadores de DNA em métodos de amplificação de DNA. . Os amplicons produzidos com estes iniciadores servem como diagnóstico para o evento DAS-59122-7. Consequentemente, dentre os avanços desta invenção incluem-se os amplicons produzidos por iniciadores homólogos ou complementares a SEQ ID NO:
22.
Mais especificamente, um par de moléculas de DNA compreendendo um jogo de iniciadores, onde moléculas de DNA são identificadas como SEQ ID NO: 18 ou complementos desta e SEQ ID NO: 1 ou complementos desta; SEQ ID NO: 2 ou
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complementos desta e SEQ ID NO: 17 ou complementos desta; SEQ ID NO: 10 ou complementos desta e SEQ ID NO: 9 ou complementos desta; SEQ ID NO: 8 ou complementos desta e SEQ ID NO: 17 ou complementos desta; e SEQ ID NO: 36 ou complementos desta e SEQ ID NO: 37 ou complementos desta são avanços desta invenção.
Outros avanços da invenção incluem o amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 1; o amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 17; o amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; o amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 17; o amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37.
Outros avanços da invenção incluem os seguintes iniciadores, que são úteis para detectar ou caracterizar o evento DAS-59122-7: SEQ ID NO: 11 ou complementos deste; SEQ ID NO: 5 ou complementos deste; SEQ ID NO: 4 ou complementos deste; SEQ ID NO: 7 ou complementos deste; SEQ ID NO: 6 ou complementos deste; SEQ ID NO: 3 ou complementos deste; SEQ ID NO: 18 ou complementos deste;
SEQ ID NO: 14 ou complementos deste; SEQ ID NO: 13 ou complementos deste; SEQ ID NO: 15 ou complementos deste;
SEQ ID NO: 17 ou complementos deste; SEQ ID NO: 16 ou complementos deste; e SEQ ID NO: 12 ou complementos deste. Outros avanços também incluem os amplicons pelo pareamento de qualquer dos iniciadores listados acima.
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Considerando outra inovação da invenção, métodos de detecção da presença de uma molécula de DNA correspondente ao evento DAS-59122-7 em uma amostra, tais métodos consistem em: (a) misturar a amostra contendo o DNA genômico da planta de milho com uma sonda de DNA, a molécula que hibridiza sob condições severas de hibridização com o DNA extraído do evento DAS-59122-7 e não hibridiza em condições severas com o DNA de uma planta de milho controle; (b) expor a amostra e a sonda à condições severas de hibridização , e (c) detectar a hibridização da sonda ao DNA. Mais especificamente, um método para detecção da presença da molécula de DNA correspondente ao evento DAS-59122-7 em uma amostra, tais métodos, consistindo em (a) colocar em contato uma amostra contendo o DNA extraído de uma planta de milho com uma sonda de DNA que consiste em sequências específicas ao evento, como por exemplo, sequências de junção, onde a dita sonda de DNA hibridiza, sob condições severas, com o DNA extraído do evento DAS59122-7 e não hibridiza com uma planta controle sob as mesmas condições de hibridização; (b) sujeitar a amostra e a sonda à condições severas de hibridização , e (c) detectar a hibridização da sonda ao DNA.
Além disso, um kit e métodos para a identificação do evento DAS-59122-7 em uma amostra biológica capaz de detectar uma região específica do DAS-59122-7 dentro da SEQ ID NO: 23 são fornecidos.
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| São fornecidas | moléculas | de | DNA que | compreendem ao |
| menos uma seqüência | de junção | do | DAS-59122· | -7 selecionadas |
| do grupo composto por SEQ ID | NO: | 32, 33, | 34, e 35 e os |
complementos destas; onde uma seqüência de junção expande a 5 junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA adjacente ao sitio de inserção no DNA da célula de milho, isto é, a seqüência flanqueadora, e é diagnóstico para o evento DAS-59122-7.
Considerando outra inovação da invenção, métodos de produzir uma planta de milho resistente a insetos englobam os passos de: (a) cruzamento sexual da linhagem parental contendo os cassetes de expressão da invenção, que confere resistência a insetos, com uma segunda linhagem parental de milho que não apresenta resistência a insetos, produzindo, a partir desta, uma progênie variada de plantas; e (b) selecionar na progênie uma planta resistente a insetos. Tais métodos podem opcionalmente compreender passo adicional de retro-cruzamento da 'planta filha' com a segunda linhagem parental para obter uma matriz verdadeira de planta de milho resistente a insetos.
Uma inovação adicional desta invenção fornece um método de produzir uma planta de milho resistente a insetos, a partir da transformação de uma célula de milho com o constructo de DNA PHI17662A (SEQ ID NO: 24), crescer a célula transformada até esta tornar-se uma planta de milho, selecionar a planta de milho que apresenta resistência a insetos, e ainda o crescimento desta em uma
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planta fértil de milho. A planta fértil de milho pode ser auto polinizada ou cruzada com variedades compatíveis para produzir uma progênie resistente a insetos.
Outra inovação da invenção é ainda relacionada ao kit de detecção de DNA para identificar o evento de milho DAS59122-7 em amostras biológicas. O kit compreende em um primeiro iniciador que reconhece especificamente as regiões 5' ou 3' que flanqueiam o DAS-59122-7, e um segundo iniciador que reconhece especificamente uma seqüência dentro do DNA exógeno de DAS-59122-7, ou dentro do DNA adjacente, para uso em um protocolo PCR de identificação. Outra inovação da invenção está relacionada com um kit de identificação do evento DAS-59122-7 em amostras biológicas, o qual consiste em uma sonda específica cuja seqüência corresponde ou é complementar a uma seqüência tendo entre 80% e 100% de identidade com uma região específica do evento DAS-59122-7. A seqüência da sonda corresponde a uma região específica contendo parte da região 5' ou 3' que flanqueia o evento DAS-59122-7.
Os métodos e kits abrangidos pelas inovações da presente invenção podem ser usados com diferentes propósitos tais como, mas não limitados a estes:
identificar o evento DAS-59122-7 em plantas, material vegetal ou em produtos como: alimentos ou produtos da alimentação (frescos ou processados) contendo, ou derivados de material vegetal; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits podem ser utilizados para identificar
15/74 material transgênico com o propósito de separar material transgênico de não transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits podem ser utilizados para determinar a qualidade do material vegetal contendo o evento de milho DAS-59122-7 . Os kits também podem conter reagentes e materiais necessários para a execução do método de detecção.
Uma inovação adicional desta invenção está relacionada à planta de milho DAS-59122-7 ou partes desta, incluindo, mas não limitado a pólen, óvulos, células vegetativas, os núcleos das células de pólen, e os núcleos das células ovo da planta de milho DAS-59122-7 e a progênie derivada desta. A planta de milho e a semente DAS-59122-7, das quais iniciadores de DNA fornecem um produto específico de amplicon representam uma inovação desta invenção.
Os aspectos antecedentes e outros da tornarão mais claros a partir da descrição seguir e das figuras apresentadas.
invenção se detalhada a
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
FIG. 1. Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 23) mostrando o 25 inserto transgênico PHI17662A, assim como as sequências flanqueadoras do inserto. As bordas 5' e 3', pbl a pb2593 e pb 9937 a pb 11922 , respectivamente, estão sublinhadas.
Duas diferenças de nucleotídeos (pb 6526 e pb 6562) baseadas na comparação com o plasmídeo de tranformação
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ΡΗΡ17662 estão marcadas em negrito e sublinhadas.
FIG. 2. Diagrama esquemático da região de inserção B.t. Cry34/35Abl no evento DAS-59122-7 é dividida em seções separadas; a região da borda 5' com o DNA genômico de milho. As duas setas abaixo do diagrama do inserto indicam os pontos inicial e final da seqüência derivada dos fragmentos 5' e 3'de caminhar sobre o genoma. As outras caixas abaixo do diagramado inserto representam amplicons, por PCR, do DNA genômico do evento DAS-59122-7 e seqüenciados de modo a cobrir todo o inserto intacto de TDNA e as regiões 5' e 3' de junção borda/inserto.
FIG. 3. Diagrama esquemático da região de inserção B.t. Cry34/35Abl no evento DAS-59122-7 é dividida em seções separadas; a região da borda 5' com o DNA genômico, o inserto de T-DNA intacto , e a região da borda 3' com o DNA genômico de milho. As caixas abaixo do diagrama do inserto representam fragmentos de PCR localizados ou nas regiões de borda do DNA genômico ou ao longo das regiões 5' e 3' de junção do inserto de T-DNA com o DNA genômico de milho, que foram amplificados a partir do DNA genômico do evento DAS-59122-7.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
As definições e métodos a seguir são fornecidos para melhor definir a presente invenção e para guiar aqueles com conhecimento básico na matéria desta invenção. A menos que
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visto de outra maneira, os termos usados são compreensíveis de acordo com o uso corrente para aqueles com conhecimentos básicos na matéria. Definições de termos comuns em Biologia Molecular também podem ser encontrados em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classícal and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag; New York, 1991; and Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. A nomenclatura para as bases de DNA é usada como determinada no 37 CFR §1.822.
Como usado aqui, o termo compreendendo significa incluindo, mas não limitado à.
Como usado aqui, o termo milho significa Zea mays e 15 inclui todas as variedades de plantas que podem ser cruzadas com milho, incluindo espécies de milho selvagem.
Como usado aqui, especifico de DAS-59122-7 refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de identificar discriminadamente o evento DAS-59122-7 em plantas, material vegetal, ou em produtos como, mas não limitados a: alimentos ou produtos da alimentação (frescos ou processados) contendo, ou derivados de material vegetal.
Como aqui usado, os termos resistente a insetos e impactando pragas de insetos refere-se a mudanças que afetam a alimentação de insetos, o crescimento, e/ou o comportamento em qualquer estágio do desenvolvimento, incluindo, mas não limitado a: matar o inseto, retardar o
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crescimento, impedir a capacidade reprodutiva, inibir a alimentação, e semelhantes.
Como aqui usado, os termos atividade pesticida e atividade inseticida são usados como sinônimos para se referir à atividade de um organismo ou uma substância (como por exemplo, uma proteína) que pode ser medida através de inúmeros parâmetros incluindo, mas não limitado a, mortalidade da praga, perda de peso da praga, atração da praga, repulsão da praga, e outras mudanças físicas e de comportamento da praga depois de se alimentar e/ou se expor ao organismo ou substância por um período de tempo apropriado. Por exemplo, proteínas pesticidas são proteínas que apresentam atividade pesticida por elas próprias ou combinadas com outras proteínas.
Sequências codificantes referem-se a uma seqüência de nucleotídeos que codificam uma seqüência específica de aminoácidos. Como aqui usado, os termos codificar ou codificado quando usados no contexto de um ácido nucléico específico significa que o ácido nucléico contém a informação necessária para guiar a tradução de uma seqüência de nucleotídeo em uma proteína específica. A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Um ácido nucléico codificando uma proteína pode conter sequências não traduzidas (chamadas introns) dentro de suas regiões traduzidas ou pode não conter uma região não traduzida, como em cDNA.
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Gene refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo as sequências regulatórias precedentes (regiões 5' não codificantes) e as seqüências subsequentes à seqüência codificante (regiões 3' não codificantes). Gene nativo refere-se a um gene encontrado na natureza com suas seqüências próprias de regulação. Gene quimérico refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo as seqüências regulatórias e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Desta forma, um gene quimérico pode compreender seqüências regulatórias e codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou seqüências regulatórias e codificantes que são derivadas da mesma fonte, mas arranjadas de maneira diferente da encontrada na natureza. Gene endógeno refere-se a um gene nativo na sua localização natural no genoma de um organismo. Exógeno refere-se ao material não encontrado normalmente na localização de interesse. Logo, DNA exógeno pode compreender tanto DNA recombinante como DNA recentemente introduzido, rearranjado na planta. Um gene exógeno refere-se a um gene não normalmente encontrado em organismo hospedeiro, mas que foi introduzido neste por transformação genética. Genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um transgene é um gene que foi introduzido em um genoma por meio de um procedimento de transformação. O local no genoma da planta onde um DNA recombinante foi inserido pode ser chamado de sítio de inserção ou sítio alvo.
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Como aqui usado, inserto de DNA refere-se ao DNA heterólogo contido no cassete de expressão usado para transformar o material vegetal, enquanto DNA flanqueador pode ser tanto o DNA genômico naturalmente presente em um organismo como uma planta, ou um DNA exógeno (heterólogo) introduzido via um processo de transformação, o qual é estranho ao inserto original da molécula de DNA, como por exemplo, fragmentos associados com o evento de transformação. Uma região flanqueadora ou seqüência flanqueadora como usados aqui se referem a uma seqüência de pelo menos vinte (20) pares de bases, preferencialmente pelo menos cinquenta (50) pares de base, e até cinco mil (5000) pares de base que são localizadas a montante de e contígua ou imediatamente a jusante de e contígua ao inserto exógeno da molécula de DNA. Procedimentos de transformação levando a uma integração randômica do DNA exógeno vão resultar em transformantes contendo diferentes regiões flanqueadoras características e únicas para cada transformante. Quando o DNA recombinante é introduzido em uma planta por cruzamento tradicional, suas regiões flanqueadoras geralmente não serão alteradas.
Transformantes também vão conter junções únicas entre um pedaço de inserto de DNA heterólogo e DNA genômico, ou dois
| (2) pedaços | de | DNA genômico, ou dois (2) pedaços | de DNA |
| heterólogo. | Uma | junção é um ponto onde dois (2) | pedaços |
| específicos | de | DNA se juntam. Por exemplo, uma | j unção |
| existe onde | um | inserto de DNA se conecta com | o DNA |
| flanqueador. | Um | ponto de junção também existe em organismo |
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transformado onde dois (2) fragmentos de DNA se juntam de maneira que é modificada daquela encontrada no organismo nativo. DNA de junção refere-se ao DNA compreendido em ponto de junção.
Como aqui usado, heterólogo em referência a um ácido nucléico é um ácido nucléico originário de uma espécie exógena, ou, se oriundo da mesma espécie, está substancialmente modificado da sua forma nativa em sua composição e/ou de seu lócus genômico por deliberada intervenção humana. Por exemplo, um promotor operacionalmente conectado com uma seqüência heteróloga de nucleotídeos pode ser de uma espécie diferente daquela de onde a seqüência de nucleotídeos é derivada, ou, se forem da mesa espécie, o promotor não está operacionalmente conectado com a seqüência de nucleotídeos. Uma proteína heteróloga pode ser originada de uma espécie exótica, ou, se for da mesma espécie, é substancialmente modificada da sua forma original por deliberada intervenção humana.
Sequências regulatórias se referem a seqüências de nucleotídeos localizadas a montante {seqüências 5'não codificantes) e/ou a jusante (seqüências 3'não codíficantes) de uma seqüência codificante, e que influenciam a transcrição, o processamento ou a estabilidade do RNA, ou a tradução da seqüência codificante associada. Seqüências regulatórias podem incluir promotores, seqüências indicadoras de tradução, introns, e seqüências de reconhecimento de poliadenilação.
22/74 if/
Promotor refere-se a uma seqüência de nucleotídeo capaz controlar a expressão de uma de uma seqüência codificante ou de um RNA funcional. Em geral, uma seqüência codificante está situada a 3' da seqüência promotora. A seqüência promotora consiste nos elementos próximos ou mais distantes à montante, os últimos elementos são ainda conhecidos como enhancers. Desta forma, um enhancer é uma seqüência de nucleotídeos que pode estimular a atividade do promotor e pode ser um elemento inatodo promotor ou um elemento heterólogo inserido para estimular o nível ou a tecido-especificidade de um promotor. Promotores podem ser ínteiramente derivados de um gene nativo, ou compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou até compreende segmentos sintéticos de nucleotídeos. É conhecido por especialistas na área que diferentes promotores direcionam a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios do desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Promotores que proporcionam um fragmento de ácido nucléico ser expresso na maioria das células, na maior parte do tempo, são normalmente chamados promotores constitutivos. Novos promotores de vários tipos úteis em células vegetais estão constantemente sendo descobertos, numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação feita por Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Reconhece-se ainda que na maioria dos casos os limites exatos das seqüências reguladoras não
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foram completamente definidos, fragmentos de ácidos nucléicos de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.
A seqüência lider de tradução refere-se a uma seqüência nucleotídica localizada entre a seqüência promotora do gene e a seqüência codificante. A seqüência lider de tradução está presente no mRNA totalmente processado a montante da seqüência de inicio da tradução. A seqüência lider de tradução pode afetar numerosos parâmetros incluindo, o processamento do transcrito primário em mRNA, a estabilidade do mRNA e/ou a eficiência de tradução. Exemplos de seqüência lider de tradução foram descritos (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol.
3:225-236) .
As regiões nao codificantes'
seqüências nucleotidicas localizadas abaixo, à jusante, de uma seqüência codificadora e incluerr reconhecimento de poliadenilação e outras seqüências que codificam sinais regulatórios capazes referem-se
| à jusante, | de |
| seqüências | de |
| seqüências | que |
| de afetar | o |
| 0 sinal | de |
| : adicionar | uma |
| o precursor | do |
mRNA. 0 uso de diferentes regiões 3'não codificantes é exemplificado por Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell
1:671-680.
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Uma proteína ou um polipeptídeo é uma cadeia de aminoácidos arranjados em uma ordem específica determinada por seqüência codificante em um polinucleotídeo, codificando um polipeptídeo.
Um constructo de DNA é uma mistura de moléculas de DNA que ligadas umas às outras constituem um ou mais cassetes de expressão. 0 constructo DNA pode ser um plasmídeo capaz de se auto-replicar em uma célula bacteriana e contém vários sítios de endonucleases de restrição que são úteis para introduzir moléculas de DNA que possuem elementos genéticos funcionais tais como, promotores, introns, sequências líderes, sequências codificantes, seqüências 3' não codificantes, entre outras; ou um constructo de DNA pode ser a junção linear de moléculas de DNA, como um cassete de expressão. 0 cassete de expressão contido em um constructo de DNA compreende os elementos genéticos necessários para prover a transcrição de um RNA mensageiro. O cassete de expressão pode ser projetado para ser expresso em células procarióticas ou eucarióticas. Os cassetes de expressão das inovações da presente invenção estão projetados para ser expressos em células vegetais.
As moléculas de DNA das inovações da invenção são 25 fornecidas em cassetes de expressão para a expressão em um organismo de interesse. O cassete incluirá as seqüências reguladoras 5' e 3' , operacionaimente conectada à uma seqüência codificante. Operacionalmente conectado significa que as seqüências de ácidos nucléicos ligadas são
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contíguas e, onde necessário para juntar duas regiões codificantes de proteínas, contíguas e na mesma fase de leitura. Operacíonalmente conectado tem o objetivo de indicar uma ligação funcional entre o promotor e a segunda seqüência, onde a seqüência promotora inicia e media a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda seqüência. O cassete pode também conter um gene adicional para co-transformar o organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(s) pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão ou múltiplas construções de DNA.
O cassete de expressão incluirá na direção 5' a 3' da transcrição: uma região de iniciação da transcrição e da tradução, uma região codificante, e uma região terminal funcional de transcrição e tradução no organismo servido como hospedeiro. A região de iniciação transcricional (promotor) pode ser nativa ou análoga, exógena ou heteróloga ao organismo hospedeiro. Ainda, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter seqüências líder 5' na construção do cassete de expressão. Tais seqüências líder podem estimular a tradução.
É para ser entendido que da maneira como usado aqui, o termo transgênico inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta, ou planta, o genótipo da qual foi alterado pela presença de um ácido nucléico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente
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alterados, assim como aqueles criados por cruzamento sexual ou propagação assexuada dos transgênicos iniciais. 0 termo transgênico como aqui usado não abrange a alteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico) por métodos convencionais de reprodução vegetal ou por eventos naturalmente ocorridos como fertilização cruzada randômica, infecção viral não-recombinante, transformação bacteriana não-recombinante, transposição não-recombinante, ou mutação espontânea.
Um evento transgênico é produzido por transformação de células vegetais com um constructo de DNA heterólogo, incluindo um cassete de expressão de ácido nucléico que compreende um transgene de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e a seleção de uma planta paricular caracterizada pela inserção em localização particular do genoma. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. No nível genético, um evento é parte da composição genética de uma planta. O termo evento também se refere à progênie, produzida por cruzamento sexual entre a transformante e outra variedade, que contém o DNA heterólogo. Até depois de retro-cruzar repetidamente com um parente recorrente, o DNA inserido e a região flanqueadora do 'pai' transformado está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo evento também se refere ao DNA do transformante original, compreendendo o DNA inserido e a sequência flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que
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Μ deveria ser transferido para a progênie que recebe o DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que contem o inserto de DNA (ou seja, o transformante original e progênie resultante de autofecundação) e uma linhagem parental que não contém o inserto.
Uma planta de milho DAS-59122-7 resistente a inseto pode ser gerada, fazendo-se primeiramente um cruzamento sexual de uma primeira planta parental de milho crescida da planta transgênica DAS-59122-7 e a progênie desta, derivada da transformação com os cassetes de expressão dos avanços da presente invenção que confere resistência a insetos, e a uma segunda planta parental de milho que não apresenta resistência a insetos, produzindo por meio deste cruzamento uma pluralidade de plantas de primeira progênie; e então selecionando uma planta da primeira progênie que seja resistente a insetos; e auto-fecundando esta planta da primeira progênie, produzindo por meio deste cruzamento uma pluralidade de plantas de segunda progênie; e então selecionando da segunda progênie, uma planta que seja resistente a insetos. Estes passos podem incluir adicionalmente o retro-cruzamento de planta da primeira progênie resistente ou de planta da segunda progênie resistente com a segunda ou terceira planta parental de milho, produzindo por meio deste, uma planta de milho resistente a insetos.
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Como aqui usado, o termo planta inclui referências à plantas completas, órgãos vegetais (ex:folhas, caules, raizes, etc.), sementes, células vegetais, e a progênie desta. Entende-se por partes de plantas transgênicas dentro do escopo da invenção, por exemplo, células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões assim como flores, caules, frutos, folhas, e raizes originadas em plantas transgênicas ou a progênie destas previamente transformadas com uma molécula de DNA da invenção e consequentemente consistindo pelo menos em parte de células transgênicas, são também avanços da presente invenção.
Como aqui usado, o termo célula vegetal inclui, sem limitação, sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calo, folhas, raizes partes aéreas, gametófitos, esporófitos, polens, e micrósporos. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos desta invenção é geralmente tão ampla quanto a ciasse de vegetais superiores que estão aptos para as técnicas de transformação, incluindo plantas monocotiledôneas e dicotiiedôneas.
Transformação refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico para dentro do genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo fragmentos de ácido nucléico transformado são conhecidos como organismos transgênicos. Exemplos de métodos de transformação de plantas incluem transformação mediada por Agrobacteríum (De
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Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) e tecnologias de transformação por aceleração de partícula ou bombardeamento genético (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; U.S. Patent No. 4,945,050, aqui incorporado como referencia). Métodos adicionais de transformação estão divulgados abaixo.
Assim, polinucleotideos isolados da invenção podem ser incorporados em construções recombinantes, tipicamente construções de DNA, que são capazes de se introduzir e se replicar dentro de uma célula hospedeira. Tal constructo pode ser um vetor que contém um sistema de replicação e seqüências que são capazes de transcrever e traduzir uma seqüência codificante de um polipeptideo, em uma dada célula hospedeira. Um número de vetores apropriados para a transfecção estável de células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicas tem sido descrito em, por exemplo, Pouwels et al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Bíology, (Academic Press, New York); e Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Tipicamente, vetores de expressão em plantas apresentam, por exemplo, um ou mais genes vegetais clonados sob controle transcricionai das regiões regulatórias 5' e 3' e um marcador de seleção dominante. Tais vetores de expressão em plantas também podem conter uma região reguladora do promotor (ex: uma região reguladora indutivel ou constitutiva, regulada ambientalmente ou por fase de desenvolvimento, ou de
30/74 r\\\ expressão de célula- ou tecido-específica) , um sítio de iniciação de transcrição, um sítio de ligação a ribossomo, sinal de processamento de RNA, um sítio de terminação da transcrição, e/ou um sinal de poliadeniiação.
Também é para ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes podem ser cruzadas de maneira a produzir uma prole contendo dois genes exógenos introduzidos segregando independentemente. A autofecundação de uma progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos introduzidos. 0 retro-cruzamento com uma planta parental e o cruzamento externo com uma planta não transgênica são também contemplados, assim como a propagação vegetatíva. Descrições de outros métodos de cruzamento que são regularmente utilizados em diferentes grãos podem ser encontradas em uma de várias referências, por exemplo, Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).
Uma sonda é um ácido nucléico isolado no qual é acoplado um marcador convencional detectável ou uma molécula sinal, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimiluminescente, ou enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, a uma fita do DNA isolado do evento de milho DAS-5 9122-7 seja de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácido
31/74 desoxirribonucléico ou ácido ribonucléico, mas também poliamidas e outros materiais da sonda que se ligam especificamente a seqüência alvo de DNA e podem ser usados para detectar a presença daquela seqüência alvo de DNA.
Iniciadores são ácidos nucléicos isolados que são anelados a uma fita simples complementar de DNA alvo por hibridização de ácido nucléico, para formar um hibrido entre o iniciador e a fita simples do DNA alvo, então estendidos ao longo da fita do DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Pares de iniciadores da invenção referem-se ao uso destes para a amplificação de uma seqüência alvo de ácido nucléico, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácidos nucléicos. PCR ou reação em cadeia da polimerase é uma técnica usada para a amplificação de segmentos de DNA específicos (veja, U.S. Patent Nos. 4,683,195 e 4,800,159, aqui incorporados como referência).
Sondas e iniciadores são de comprimentos de nucleotídeos suficientes para se ligar a seqüência alvo de DNA especificamente nas condições de hibridização e reação determinadas pelo operador. Este comprimento deve ser de qualquer tamanho que seja suficiente para ser útil em um método de detecção de escolha. Geralmente, onze (11) nucleotídeos ou mais em tamanho, dezoito (18) nucleotídeos ou mais, e vinte e dois (22) nucleotídeos ou mais, são usados. Tais sondas e iniciadores hibridizam
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especificamente em uma seqüência alvo sob condições de elevada estringência. Sondas e iniciadores de acordo com os avanços da presente invenção podem ter completa similaridade de seqüência de DNA de nucleotídeos contíguos com a seqüência alvo, embora sondas diferindo da seqüência do DNA alvo e que retém a habilidade de hibridizar com seqüências do DNA alvo podem ser desenhadas por métodos convencionais. Sondas podem ser usadas como iniciadores, mas são geralmente projetadas para ligar ao DNA ou ao RNA alvo e não são usadas no processo de amplificação.
Iniciadores específicos podem ser usados para amplificar um fragmento de integração para produzir um amplicon que pode ser usado como uma sonda específica para identificar o evento DAS-59122-7 em amostras biológicas. Quando uma sonda é hibridizada com ácidos nucléicos de uma amostra biológica sob condições que permitem a ligação da sonda à amostra, esta ligação pode ser detectada e,portanto permitir a indicação da presença
| 20 | do evento DAS-59122-7 em | ||
| identificação de | uma | sonda | |
| arte. Em uma inovação | desta | ||
| uma seqüência | que, | sob | |
| especificamente | com | uma | |
| 25 | flanqueadoras 5' | e 3 | f do € |
uma amostra biológica. Tal ligada tem sido descrita na invenção, a sonda específica é condições ótimas, hibridiza região entre as regiões vento e também compreende uma parte contígua com o DNA exógeno. A sonda específica pode compreender uma seqüência de pelo menos 80%, entre 80 e 85%, entre 85 e 90%, entre 90 e 95%, e entre 95e 100%
33/74 idêntica (ou complementar) a evento.
uma região específica do
Métodos para preparação e uso de sondas e iniciadores estão descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ná ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (em seguida, Sambrook et al., 1989); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (em seguida, Ausubel et al., 1992); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de iniciadores para PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, através do uso de programas de computador criados para este propósito, tal como a ferramenta de análise de iniciador para PCR em Vetor NTI versão 6 (Informax Inc., Bethesda MD); Iniciadoreselect (DNASTAR Inc., Madison, WI); e Primer (Version 0.5®, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Adicionalmente, a seqüência pode ser visualmente copiada e os iniciadores identificados manualmente usando regras conhecidas por especialistas na arte.
Um kit como usado aqui se refere a um jogo de reagentes com o propósito de desenvolver as inovações metodológicas da invenção, mais particularmente, a identificação do evento DAS-59122-7 em amostras biológicas. O kit da invenção pode ser utilizado, e seus componentes
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podem ser especificamente aj ustados, com propósitos de controle de qualidade (ex: pureza dos lotes de sementes), detecção do evento DAS-59122-7 em material vegetal, ou material compreendendo ou derivado de material vegetal, tais como, mas não limitados a alimentos ou produtos da alimentação. Material vegetal como usado aqui se refere ao material que é obtido ou derivado de uma planta.
Iniciadores e sondas baseados nas sequências flanqueadoras de DNA e do inserto aqui divulgadas podem ser usadas para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências descobertas por métodos convencionais, por exemplo, por re-clonar e seqüenciar tais sequências. As sondas e iniciadores de ácidos nucléicos da presente invenção hibridizam sob condições severas com uma seqüência alvo de DNA. Qualquer hibridização convencional de ácido nucleico ou método de amplificação pode ser usado para identificar a presença do DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucléico ou fragmentos destas são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácidos nucléicos sob certas circunstâncias. Como aqui usadas, duas moléculas de ácidos nucléicos são ditas capazes de hibridizar especificamente uma com a outra se as duas são capazes de formar uma estrutura antiparalela de ácido nucléico dupla fita.
Uma molécula de ácido nucléico é dita complemento de outra molécula de ácido nucléico se elas exibem total complementaridade. Como aqui usado, moléculas são ditas
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que exibem total complementaridade quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas minimamente complementares se elas podem hibridizar uma na outra com estabilidade suficiente para mantê-las aneladas uma a outra sob pelo menos condições convencionais de baixa estringência. Similarmente, as moléculas são ditas complementares se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permanecer aneladas uma a outra sob condições convencionais de alta estringência. Condições convencionais de estringência são descritas por Sambrook et al.r 1989, e por Haymes et al., Em: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D. C. (1985), quebras de complementaridade total são consequentemente permissíveís, contanto que tais quebras não impossibilitem completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura em dupla fita. Com o objetivo de uma molécula de ácido nucléíco servir como iniciador ou sonda, esta precisa apenas ser suficientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar uma estável estrutura em dupla fita sob as concentrações particulares de solvente e sais empregados.
Em reações de hibridização, especificidade é 25 tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. A temperatura de fusão (Tm) é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência complementar alvo hibridiza com uma sonda
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Μ perfeitamente correspondente. Para híbridos DNA DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, %GC é a porcentagem dos nucleotídeos Guanina e Citosina no DNA, % form é o percentual de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de não correspondência, logo, Tm, hibridização, e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar seqüências de identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com mais de 90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser decaída em 10°C. Geralmente, condições severas são estabelecidas em torno de 5°C abaixo da Tm para a seqüência específica e seu complemento em condições definidas de pH e força iõnica. Entretanto, condições severamente severas podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 1,2,3,ou 4 °C mais baixo que a Tm, condições moderadamente severas podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10 °C mais baixo que a Tm, condições de baixa estringência podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20 °C mais baixo que a Tm.
Usando a equação, composições de lavagens e hibridização, e TM desejada, aqueles com conhecimentos básicos entenderão que as variações de estringência das soluções de hibridização e/ou lavagem estão inerentemente descritas. Se o grau desejado de não correspondência
37/74 resultar em uma Tm menor do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC a ponto que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um extensivo guia de hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Veja Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New
York) .
Como aqui usado, uma seqüência substancialmente homólogoa é uma molécula de ácido nucléico que vai hibridizar especificamente com o complemento da molécula de ácido nucléico com a qual está sendo comparada sob elevadas condições de estringência. Condições apropriadas de estringência que promovem a hibridização de DNA, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio 6X (SSC 6X) em torno de 45°C, seguido por uma lavagem com SSC 2X a 50°C, são conhecidas por aqueles com conhecimentos no estado da arte ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6. Tipicamente, condições severas serão aquelas cuj a concentração de sal é menor do que 1,5 M de íon Na, tipicamente em torno de 0,01 a 1,0M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7.0 a 8.3 e com temperatura de
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pelo menos aproximadamente 30°C para sondas pequenas {ex: de 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos aproximadamente 60°C para sondas longas (ex: acima de 50 nucleotídeos) . Condições severas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tal qual a formamida. Exemplificando, condições de baixa estringência incluem híbridização com uma solução tampão 30 a 35% de formamida, 1M NaCl, 1% SDS (sódio dodecil sulfato) a 37 °C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (SSC 20X - 3.0 M NaCl/0.3 M citrato trissódico) a 50-55 °C. Exemplificando, condições de estringência moderada incluem híbridização com uma solução tampão 40 a 45% de formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 60 °C. Exemplificando, condições de alta estringência incluem híbridização em uma solução de 50% de formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,lX SSC a 60-65 °C. Um ácido nucléico da invenção pode hibridizar especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucléico originais do evento DAS-59122-7 ou complementos deste ou fragmentos de ambos sob condições moderadas de estringência.
Métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem conhecidos na arte. Consequentemente, a determinação do percentual de identidade entre quaisquer duas seqüências pode ser obtida com o uso de um algoritmo matemático. Exemplos ilimitados de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miiler (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de homologia local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento
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por homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 87:2264, modificado por Karlin e Altschul (1993)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.
Execuções por computador destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências para determinar a identidade da seqüência. Tais execuções incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível pela Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0); o ALIGN PLUS (versão 3.0, Copyright 1997); e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA dentro do Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível pela Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121, USA) . Alinhamentos usando estes programas podem ser realizados usando os parâmetros padrões.
O programa CLUSTAL está bem descrito por Higgins e Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Nuoleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), e Pearson, et al. ,
Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994). Os programas ALIGN e ALIGN PLUS são baseados no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados
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no algoritmo Karlin e Altschul ¢1990) supra. A família de programas BLAST que pode ser usada em pesquisas de similaridade em bases de dados inclui: BLASTN para consulta de seqüências de nucleotídeos em bases de dados de seqüências de nucleotídeos; BLASTX para consulta de seqüências de nucleotídeos em bases de dados de seqüências de proteínas; BLASTP para consulta de seqüências de proteínas em bases de dados de seqüências de proteínas; TBLASTN para consulta de seqüências de proteínas em bases de dados de seqüências de nucleotídeos; e TBLASTX para consulta de seqüências de nucleotídeos em bases de dados de seqüências de nucleotídeos. Veja, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção visual.
Para obter alinhamentos abertos com obj etivo de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma busca iterada que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. Veja Altschul et al. (1997) supra. Quando utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrões dos respectivos programas (ex:BLASTN para seqüências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. Consulte www.ncbi.hlm.nih.gov.
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Como aqui usado, identidade de seqüência ou identidade no contexto de duas seqüências de ácidos nucléicos ou de peptídeos faz referência a resíduos que são os mesmos nas duas seqüências, quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação específica. Quando a porcentagem de identidade de seqüência é usada em referência a proteínas, é reconhecido que as posições de resíduos que não são idênticas frequentemente diferem de substituições conservadas de aminoácidos, onde resíduos de aminoácidos são substituídos por outros que apresentam propriedades químicas similares (ex;carga ou hidrofobicidade) e consequentemente não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando seqüências se diferem em substituições conservadas, o percentual de identidade de seqüência pode ser ajustado para cima de maneira a corrigir a natureza conservadora da substituição. Seqüências que diferem por tais substituições conservadas são ditas ter similaridade de seqüência ou similaridade. Os meios para fazer estes ajustes são bem conhecidos por especialistas na arte. Tipicamente isto envolve dar pontos a uma substituição conservada como se fora uma falta de correspondência parcial em vez de considerá-la uma falta de correspondência total, logo, aumentando o percentual de identidade de seqüência. Desta forma, por exemplo, um aminoácido idêntico recebe 1 ponto e uma substituição não conservada ganha 0 ponto, uma substituição conservada recebe uma pontuação entre 0 e 1. A pontuação de substituições não-conservadas é calculada,
42/74 por exemplo, como implementada no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).
Como aqui usado, percentual de identidade de seqüência significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas, dentro de uma j anela de comparação, onde a porção de uma seqüência de polinucleotideos na j anela de comparação deve compreender adições ou deleções (ex: falhas) quando comparada com a
| seqüência | de | referência | (que não | apresenta | adições | ou |
| deleções) | para | o alinhamento ótimo | das duas seqüências. | 0 | ||
| percentual | é | calculado | pela determinação do | número | de | |
| posições onde | cada base | de ácido | nucléico ou | resíduo | de |
aminoácido idênticos ocorre em ambas as seqüências para gerar o número de posições equivalentes, dividindo o número de posições equivalentes pelo número total de posições dentro da janela de comparação, e multiplicando o resultado por lOOpara fornecer o percentual de identidade de seqüência.
A respeito da amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo (ex: por PCR) usando um par de iniciadores específico, condições severas são condições que permitem o par de iniciadores hibridizar apenas na seqüência de ácido nucléico alvo para qual um iniciador tendo a seqüência selvagem correspondente (ou o complemento desta) poderia se ligar e preferencialmente gerar um produto único de amplificação, o amplicon, em uma reação térmica de amplificação de DNA.
43/74 termo específico para (uma seqüência alvo) indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições severas de hibridização somente com a seqüência alvo em uma amostra contendo a seqüência alvo.
Como aqui usado, DNA amplificado ou amplicon refere-se ao produto da amplificação de ácido nucléico de uma seqüência de ácido nucléico que é parte de um ácido nucléico molde. Por exemplo, para determinar se uma planta de milho resultante de cruzamento sexual contém o DNA genômico do evento transgênico de uma planta da invenção, o DNA extraído de uma amostra de tecido vegetal deve ser submetido a um método de amplificação de ácido nucléico usando um par de iniciador de DNA que incluí um primeiro iniciador derivado da região flanqueadora adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido, de modo a gerar um amplicon que é diagnóstico para a presença do evento. Alternativamente, o segundo iniciador pode ser derivado da seqüência flanqueadora. O amplicon é de um tamanho e tem uma seqüência que também é diagnostica para o evento. O amplicon pode variar em comprimento, do tamanho dos pares de iniciadores combinados mais um par de base de nucleotídeo até qualquer tamanho de amplicon produzível por um protocolo de amplificação de DNA. Altemativamente, pares de iniciadores podem ser derivados das sequências flanqueadoras de ambos os lados do DNA inserido, de maneira a produzir um amplicon que inclui toda a seqüência
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nucleotídica inserida do constructo de expressão PHI17662A assim como a seqüência fianqueadora do inserto transgênico, veja FIG 1 (SEQ ID NO: 23), de aproximadamente 12 kb de tamanho. Um membro de um par de iniciadores derivado da seqüência fianqueadora deve estar localizado a uma distância da sequência do DNA inserido, esta distância pode variar de um par de base de nucleotideo até os limites da reação de amplificação, ou em torno de vinte mil pares de bases. O uso do termo amplicon especificamente exclui dímeros de iniciadores que podem se formar durante a reação térmica de amplificação.
A amplificação de ácidos nucléicos pode ser realizada por vários métodos de amplificação de ácidos nucléicos conhecidos na arte, incluindo a reaçãoem cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na arte e está descrita, 'inter alia', em U.S. Pat. Nos. 4,683,195 e 4,683,202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic press, San Diego, 1990. Métodos de amplificação por PCR têm sido desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5695-5699, 1994). Estes métodos, assim como outros métodos conhecidos na arte de amplificação de DNA, podem ser usados na prática dos avanços da presente invenção. É conhecido que alguns parâmetros em um específico protocolo de PCR podem precisar ser ajustados para específicas condições de laboratório e podem ser sutilmente modificados e ainda assim permitir a
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obtenção de resultados similares. Estes ajustes serão evidentes para uma pessoa conhecedora da arte.
O amplicon por estes métodos pode se detectado por várias técnicas, incluindo, mas não limitado a, Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acíd Res. 22:41674175, 1994) onde um oligonucleotídeo de DNA é desenhado e ultrapassa tanto a seqüência da região flanqueadora adjacente quanto a seqüência do DNA inserido. 0 oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa. Seguindo uma PCR da região de interesse {usando um iniciador na região flanqueadora adjacente e outro na seqüência do inserto), uma fita simples de DNA produto de PCR pode hibridizar com o oligonucleotídeo imobilizado e servir como molde para areação de extensão de uma única base usando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados especificamente para a próxima base esperada. A leitura pode ser feita por fluorescência ou baseada em método ELISA. Um sinal indica a presença da seqüência inserida/flanqueadora devido aos bem sucedidos processos de amplificação, hibridização e extensão de uma base simples.
Outro método de detecção é a técnica de Piroseqênciamento descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:
18-24, 2000). Neste método, um oligonucleotídeo é desenhado para ultrapassar a junção entre o DNA adjacente e o DNA do inserto. O oligonucleotídeo é hibridizado com uma fita simples de DNA produto de PCR da região de interesse (usando um iniciador na região flanqueadora adjacente e
Αξ>/Ί A outro na seqüência do inserto) e incubado na presença de uma DNA polimerase , ATP, sulfurilase, apirase, adenosina 5'fosfosulfato e luciferina. dNTPs são adicionados individualmente os resultados de incorporação em um sinal luminoso são medidos. Um sinal luminoso indica a presença do inserto trensgênico/seqüência flanqueadora devido às bem sucedidas amplificação e extensão simples ou de várias bases.
Polarização fluorescente como descrita por Chen et al., (Genome Res. 9:492-4 98, 19 99) também é um método que pode ser usado um amplicon da invenção. Usando este método um oligonucleotídeo é projetado de maneira que ultrapasse a junção entre a região flanqueadora e o DNA inserido. 0 oligonucleotídeo é hibridizado com uma fita simples de DNA produto de PCR da região de interesse (usando um iniciador na região flanqueadora e outro na seqüência do inserto) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado com fluorescência. A extensão de uma base simples resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um leitor de fiuorometria. Uma mudança de polarização indica a presença do inserto trensgênico/seqüência flanqueadora devido às bem sucedidas amplificação, hibridização e extensão uma única base.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é descrito como um método de detecção e quantificação da presença de uma seqüência de DNA e é bastante claro nas
47/74 instruções fornecidas pelo fabricante. Em resumo, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada de maneira que complemente a junção entre a região flanqueadora e o DNA inserido. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na região flanqueadora e outro na seqüência do inserto) passam por ciclos na presença de uma polimerase termo-estável e de dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na divagem e liberação da metade fluorescente da outra metade, chamada quencher, na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença do inserto trensgênico/seqüência flanqueadora devido às bem sucedidas amplificação e hibridização.
O método Molecular Beacons foi descrito para uso na detecção de seqüências como apresentado em Tyangi et al. {Nature Biotech. 14:303-308, 1996). Em resumo, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada de maneira que complemente a junção entre a região flanqueadora e o DNA inserido. A estrutura única da sonda FRET apresenta uma estrutura secundária do tipo haste-loop que mantém as metades fluorescente e quencher, absorvedora de energia, bem próximas. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na região flanqueadora e outro na seqüência do inserto) passam por ciclos na presença de uma polimerase termo-estável e de dNTPs. Após a bem sucedida amplificação por PCR, a hibridização da sonda FRET na seqüência alvo resulta na remoção da da estrutura secundária da sonda e a separação espacial das metades fluorescente (fluoróforo) e 'quencher' gerando um sinal fluorescente.
Um sinal
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fluorescente indica a presença do inserto trensgênico/seqüência flanqueadora devido às bem sucedidas amplificação e hibridização.
Uma reação de hibridização que usa uma sonda especifica a uma seqüência encontrada dentro de um amplicon é ainda outro método para detectar o amplicon gerado em uma reação de PCR.
Avanços da presente invenção são novamente definidos nos Exemplos a seguir. Deve ser entendido que estes Exemplos são dados meramente à titulo de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um especialista pode verificar as características essenciais desta invenção, e sem fugir do espirito e do escopo desta, pode realizar várias modificações nos avanços desta invenção, para adaptá-la à variadas utilizações e condições. Consequentemente, várias modificações dos avanços da invenção, além daqueles aqui apresentados e descritos, serão aparentes especialistas de acordo com a descrição apresentada. Tais modificações também são pretendidas para entrar no escopo das reivindicações feitas aqui .
A divulgação de cada referência aqui feita é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
EXEMPLOS
49/74 ii
Exemplo 1. Transformação de Milho por Agrobacterium transformação e Regeneração de Plantas Transgênicas
Contendo os Genes Cry34Abl e Cry35Abl (Cry34/35Abl)
Uma molécula de DNA de aproximadamente 7.4 kb, designada PHI17662A (SEQ ID NO: 24), que contém um primeiro cassete de expressão de transgene compreendendo uma molécula de DNA que inclui o promotor, um exon 5'não traduzido, e um primeiro intron do gene que codifica ubiquitina de milho (Ubi-1) (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 e Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) operacionalmente conectado à molécula de DNA que codifica uma B.t.
identificada como Cry34Abl (U.S. Pat. Nos.
6,340,593) operacionalmente δ-endotoxina
6,127,180, conectada à
6,624,145 e molécula de DNA contendo o agente de terminação transcricionai Pin II isolado de batata (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). O segundo cassete de expressão do constructo de DNA compreende uma molécula de 20 DNA que representa o promotor da peroxidase de trigo (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174) operacionalmente conectado à molécula de DNA que codifica uma B.t. δ-endotoxina identificada como Cry35Abl (U.S. Pat. Nos. 6,083,499, 6,548,291 e 6,340,593) operacionalmente conectada à molécula de DNA contendo o agente de terminação transcricionai Pin II isolado de batata (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). O terceiro cassete de expressão do constructo de DNA compreende uma molécula de DNA representada pela seqüência correspondente ao promotor
50/74 l\h
35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (Ca MV) (Odeii J.T. et al. (1985) Nature 313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) operacionalmente conectado à molécula de DNA que codifica uma fosfinotricina acetiltransferase (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70: 25-37) operacionalmente conectada à molécula de DNA contendo o agente de terminação transcricional 3' do promotor (CaMV) 35S (vej a Mitsuhara et al. (1996) Plant
Cell Physiol. 37: 49-59) foi utilizado pra transformar tecido embrionário de milho.
Plantas de milho B.t. Cry34/35 Abl foram obtidas por transformação via Agrobacterium, utilizando o método se Zhao (U.S. Patent No. 5,981,840, e publicação de patente PCT WO98/32326;cujo conteúdo aqui está incorporado por referência). Em resumo, embriões imaturos foram isolados de plantas de milho e colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias foram capazes de transferir o DNA PHI17662 (SEQ ID NO:24) para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (passo l:passo de infecção). Especificamente neste passo os embriões imaturos foram foramimersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inocuiação. Os embriões foram co-cultivados com Agrobacterium durante um tempo (passo 2: passo de co-cultivo). Especificamente, os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido após o passo de infecção. Depois deste período de co-cultivo, um passo de descanso foi realizado. Durante este descanso, os embriões foram incubados na presença de pelo menos um
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antibiótico conhecido como inibidor do crescimento de Agrobacteríum sem a adição de um agente seletivo para plantas transformantes (passo 3: passo de descanso). Particularmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente seletivo, para a eliminação da Agrobacteríum e para a fase de descanso das células infectadas. A seguir, os embriões inoculados foram cultivados em meio contendo o agente seletivo e os calos transformados em crescimento foram coletados (passo 4:passo de seleção). Especificamente os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido contendo agente seletivo, resultando no crescimento seletivo de células transformadas. O calo então se regenerou em plantas (passo 5: passo de regeneração) e, especificamente, calos crescidos em meio seletivo foram cultivados em meio sólido para dar origem a plantas. Cada embrião foi colocado fisicamente separado durante a cultura, e a maioria dos explantes morreram em meio seletivo.
Estes embriões que sobreviveram e produziram tecidos de caio saudáveis, glufosinato-resistente receberam identificações específicas representando ptenciais eventos de transformação. Plantas foram regeneradas de tecido derivado cada evento original e transferidas para a casa de vegetação. Amostras de folha foram coletadas para análise molecular para a verificação da presença do transgene por PCR a para confirmar a expressão da proteína Cry34/35Abl por ELISA. Plantas foram então submetidas a um bio-ensaio de planta inteira usando larvas do inseto Diabrotica
52/74 virgifera virgifera. Plantas positivas foram retrocruzadas com linhagens endogâmicas não transformadas com o objetivo de obter sementes das plantas transformadas iniciais. Um número de linhagens foi avaliado no campo. 0 evento DAS-59122-7 foi selecionado de uma população de independentes baseado em uma de características, eventos transgênícos combinação superior incluindo resistência a inseto e performance agronômica
Exemplo 2._Identificação da linhagem de milho
Bacillus thuringiensis Cry34/35Abl DAS-59122-7
Semente do evento DAS-59122-7 foi avaliada. A semente T1S2 representa a transformação em fundo Hi-II, seguida por um cruzamento com a linhagem endogâmica PH09B e duas seqüências de endocruzamento. Toda semente foi obtida da Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA) . A caracterização preliminar foi conduzida em tecido vegetal de folha durante o estudo por confirmação da atividade da fosfinotricina acetiltransferase (PAT) via marcação da folha com herbicida e a expressão de Cry34Abl usando lateral flow devices (LFD).
Substâncias controle foram definidas neste estudo como 25 sementes não modificadas representantes da substância de fundo de teste. Sementes controle de fundo Hi-II e PH09B foram usadas como controles negativos. Estas sementes não modificadas não apresentam transcritos para os genes cry34Abl, cry35Abl, e pa t. Toda semente foi obtida da
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Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA).
Amostras de DNA de dois eventos adicionais de B.t. Cry34/35Abl, evento DAS-45214-4 e evento DAS-45216-6, foram usados como controles positivos as análises de PCR exclusivas do evento. Ambos os eventos foram produzidos por transformação via Agrobacterium, usando o mesmo vetor usado para produzir o evento DAS-59122-7 e, logo, apresentam transcritos para os genes cry34Abl, cry35Abl, e pat. No entanto, os sítios de inserção do T-DNA dos eventos DAS-45214-4 e DAS-45216-6, incluindo as regiões de borda com o DNA genõmico, foram diferentes daqueles encontrados no evento DAS-59122-7. Amostras de DNA dos eventos
DAS-45214-4 e DAS-45216-6 foram isoladas e caracterizadas por análises de Southern blot (Dados não mostrados).
Sementes de milho do evento DAS-59122-7 e sementes controle não modificadas (Hi-II e PH09B) foram plantadas em câmaras na DuPont Experimental Station (Wilmington, DE) para produzir número suficiente de plantas para as análises de DNA. Para a caracterização do evento DAS-59122-7, dez (10) T1S2 sementes foram plantadas. Dez (10) sementes também foram plantadas para cada linhagem controle não modificada. Uma semente foi plantada por vaso, e cada vaso foi identificado. Condições de plantio e crescimento, incluindo regulação de água e luminosidade, levaram a um crescimento vegetal sadio
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Amostras de folhas foram coletadas de cada planta, controle e DAS-59122-7. Para cada amostra, material suficiente de folha de cima do ponto de crescimento foi coletado e guardado em um saco de amostra pré-etiquetado. As amostras foram imediatamente colocadas em gelo seco e transferidas para um freezer ultraflow(-86°C) para estocagem. Todas as amostras foram mantidas congeladas até o processamento. Todas as amostras de folhas foram individualmente etiquetadas com o identificador da planta e a data de coleta.
Para confirmar a expressão da proteína Cry34Abl no evento DAS-59122-7 e a ausência de expressão nos controles, amostras de folhas foram coletadas de todas as plantas controle e evento DAS-59122-7, e varridas em busca da proteína transgênica usando Lateral Flow Devices (LFD) específico para Cry34Abl(Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE). Punhados de folhas foram pegos de cada planta e macerados em uma solução salina de tampão fosfato com
Tween 20 para a extração bruta de proteína. Uma tira foi mergulhada no extrato para determinar a presença ou ausência da proteína Cry34Abl. Os resultados do imunoensaio foram usados para confirmar a identidade da substância teste das plantas antes das análises moleculares como mostrado na Tabela 1.
Para confirmar a atividade da fosfinotricina acetiltransferase (PAT) nas plantas do evento DAS-59122-7, foi feita marcação de folhas com herbicida. Todas as
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plantas usadas neste estudo tiveram folhas marcadas para confirmar a identidade da planta. Plantas foram testadas antes do estagio RI de crescimento. Os ensaios foram realizados de acordo com o procedimento padrão conhecido para marcação de folha com herbicida para a identificação de plantas transgênicas expressando PAT. Especificamente, uma porção de uma folha de cada planta foi tratada com uma solução de aproximadamente 2% do herbicida glufosinato, Basta® (Bayer CropScience), em água e verificada visualmente a ocorrência de tecido marrom ou necrosado na área marcada da folha, 4-12 dias após a aplicação. Os resultados para cada planta foram registrados e usados para determinar a expressão de PAT em cada planta teste como apresentado na Tabela 1. Como mostrado na Tabela 1, das 10 plantas testadas para o evento DAS-59122-7 (geração T1S2) seis (6) plantas expressaram tanto o Cry34Abl quanto o PAT, enquanto quatro (4) não expressaram qualquer proteína. Todos os controles não modificados testaram negativos tanto para ensaio de Cry34Abl quanto para PAT (Dados não mostrados).
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Tabela 1: Expressão protéica de Cry34Abl e PAT e Dados de
Hibridização por Southern para B.t. Cry34/35Abl no Evento
DAS-59122-7
| ID da Planta | ID da amostra | Expressão de Cry34Abl e PAT 1 | Southern Blot com sonda cry34Abl 2 | Southern Blot com sonda cry35Abl 2 | Southern Blot com sonda pa t 2 |
| 02-122C 1 | DAS59122-7 T1S2 1 | Positivo | + | + | + |
| 02-122C 2 | DAS59122-7 T1S2 2 | Positivo | + | + | Ί- |
| 02-122C 3 | DAS59122-7 T1S2 3 | Positivo | + | + | + |
| 02-122C 4 | DAS59122-7 T1S2 4 | Negativo | - | - | - |
| 02-122C 5 | DAS59122-7 T1S2 5 | Positivo | + | + | + |
| 02-122C 6 | DAS59122-7 T1S2 6 | Negativo | - | - | - |
| 02-122C 7 | DAS59122-7 T1S2 7 | Positivo | + | + | + |
| 02-122C 8 | DAS59122-7 T1S2 8 | Negativo | - | - | - |
| 02-122C 9 | DAS59122-7 T1S2 9 | Negativo | - | - | - |
| 02-122C 10 | DAS59122-7 T1S2 10 | Positivo | + | + | + |
Expressão de Cry34Abl positiva indica a detecção da expressão da proteína determinada pelo imuno-ensaio baseado no lateral flow device específico para a detecção da proteína Cry34Abl. Negativo indica a não detecção da proteína Cry34Abl. Expressão de PAT positiva indica plantas que foram tolerantes ao tratamento com herbicida e negativo indica plantas que foram sensíveis ao tratamento com herbicida.
cry34Abl hibridizou com o fragmento esperado de 1.915 kb de TDNA, cry35Abl hibridizou com o fragmento esperado de 2.607 kb de T-DNA, e a sonda do gene pat hibridizou com um fragmento de borda de 3.4 kb consistente com uma única inserção intacta de T-DNA como determinado pela análise do Southern blot.
Exemplo 3. Análise de Southern Blot da linhagem de milho Bacillus thuringiensis Cry34/35Abl DAS-59122-7
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Quantidades de 1 grama de amostras de folha foram maceradas em nitrogênio líquido e o DNA genômico isolado com o DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ou usando um procedimento padrão de extração com tampão de uréia. Após a extração o DNA foi visualizado em gel de agarose para determinar a qualidade do DNA, e foi quantificado usando o Pico Green® reagent (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) e análise espectrofluorimétrica.
O 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usado para estimar os tamanhos dos fragmentos de DNA em géis de agarose.
DNA genômico isolado de plantas do evento DAS-59122-7 foi digerido com Nco I e separado por eletroforese, transferido para membranas de nylon, e hibridizadocom as sondas dos genes cry34Abl, cry35Abl e pat usando procedimentos padrão da técnica. Blots foram expostos a filme de raio-X por um ou mais períodos de tempo para detectar os fragmentos hibridizados e para visualizar os padrões de peso molecular. As imagens foram então digitalizadas fotografando os filmes de raio-X e/ou por detecção com um instrumento Lumi-Imager™ (Roche, Indianapolis, IN). Os tamanhos das bandas detectadas foram documentados para cada sonda. A análise de Southern blot foi realizada com o objetivo de verificar a presença da inserção nas plantas testadas e confirmar que todas as plantas do evento DAS-59122-7 contêm a mesma inserção como mostrado na Tabela 1 (Southern blots não mostrados). A
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análise por Southern blot indicou que o evento DAS-59122-7 contém uma única inserção consistindo de uma única cópia do da região do T-DNA do plasmídio PHP17662, enquanto os segregantes nulos, como determinado pelas análises de expressão de proteínas não hibridizaram com as sondas dos genes.
Adicionalmente, as plantas do evento DAS-59122-7 expressando as duas proteínas exibiram padrões idênticos de híbridização nos Southern blots (dados não mostrados). Especificamente a sonda do gene cry34Abl hibridizou com o fragmento interno de 1.915 kb esperado, cry35Abl hibridizou com o fragmento esperado de 2.607 kb de T-DNA, e a sonda do gene pat hibridizou com o fragmento de borda de 3.4 kb consistente com uma única inserção de T-DNA como determinado pelos resultados de Southern blot.
Exemplo 4: Seqüenciamento do Inserto de T-DNA e da
Região Flanqueadora do Inserto da linhagem de milho
Bacillus thuringiensís Cry34/35Abl DAS-59122-7
O inserto de T-DNA e as regiões fianqueadoras das bordas foram clonadas do evento DAS59122-7, contendo B.t. Cry34/35Abl, com a utilização de métodos baseados em PCR como representado nas Figuras 2 e 3. Especificamente, seqüências adjacentes as pontas 5' e 3' do inserto do evento DAS-59122-7 foram obtidas usando 2 técnicas de genome walking. O primeiro método foi essencialmente o método descrito para o Universal Genome Walker Kit (BD
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Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) , e o segundo método foi conduzido de acordo com o protocolo splinkerette descrito em Devon et al., (1995) Nucleic Acids Research 23 (9) :1644-1645, com as modificações propostas por Stover (2001), U.C. Irvine (personal communication).
Momentaneamente, o DNA genômico foi digerido com várias enzimas de restrição (Dra I, EcoR V, Pvu II, Sma I and Stu I para o método Universal Genome Walker e BamH I, EcoR I, Hind III, and Xba 1 para o método splinkerette) e então ligado a adaptadores de ponta cega para o método Genome Walker e a adaptadores específicos para as enzimas de restrição usadas para o método splinkerette. Os adaptadores para ambos os métodos de Genome Walking foram desenhados para impedir a extensão da ponta 3' destes durante a PCR e consequentemente, reduzir ou eliminar amolificaçoes não específicas. Os fragmentos de DNA genômico ligados a adaptadores foram então chamados de bibliotecas de genome walker ou de bibliotecas de splinkerette, uma biblioteca para cada enzima de restrição. As bibliotecas foram preparadas a partir do DNA genômico de três plantas isoladas T1S2 do evento DAS-591227 B.t. Cry34/35Abl: plantas DAS-59122-7 T1S2 1, DAS-59122-7 T1S2 2 e DAS-5 9122-7 T1S2 10, e de uma planta controle HiII e de outra planta controle PH09B.
Depois do constructo das bibliotecas, as amplificações de PCR aninhadas foram completadas para amplificar a seqüência alvo utilizando o kit Advantage™-GC Genomic PCR
60/74 (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) . A amplificação por PCR preliminar usou um iniciador idêntico ao adaptador e outro gene-específico. O iniciador adaptador não amplificará um produto no primeiro ciclo da PCR preliminar e apenas produtos do iniciador gene-específico serão obtidos. O anelamento e a amplificação a partir do iniciador adaptador só ocorrerão depois que a fita complementar tenha sido produzida pelo iniciador geneespecífico. Depois da PCR preliminar, uma reação secundária de nested-PCR foi realizada para aumentar a especificidade das reações de PCR no genoma. Os iniciadores aninhados {nested-inicíadores) consistiram de seqüências gene-específica e adaptador-específica internas aos respectivos iniciadores utilizados na PCR preliminar.
Para as seqüências flanqueadoras da ponta 5', nestedPCR foi iniciado usando iniciadores específicos para a ponta 5a do T-DNA inserido, juntamente com iniciadores complementares à seqüência adaptadora ligada no DNA digerido. Similarmente, flanqueadora da ponta 3 específico para a ponta 3' do T-DNA inserido e um iniciador a clonagem da seqüência começou com um iniciador
Seqüências internas e direita do T-DNA complementar à seqüência do adaptador às seqüências das bordas esquerda inserido foram usadas como pontos de partida para o walking out pela seqüência genômica de milho, porque estas se representaram únicas (não homólogas à seqüências endógenas do genoma de milho) nas quais pode-se ancorar os iniciadores para o genome walking.
61/74 •α
Os produtos gerados pela nested-PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (dados não mostrados). Fragmentos visíveis nas bibliotecas preparadas de uma ou mais amostras de DNA do evento DAS-59122-7 e ausentes nas bibliotecas preparadas de amostras de DNA genômico Hi-II e PH09B foram identificadas para caracterização adicional. Os amplicons por PCR identificados foram separados por eletroforese preparatória em gel, isolados usando um kit QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), e mandados para seqüenciamento ou clonados num plasmídeo pGEM-T Easy usando o pGEM-T Easy Vector System I (Promega Corp., Madison, WI) antes do seqüenciamento de DNA. As reações de seqüenciamento foram realizadas com iniciadores usados para a amplificação nested-PCR ou com iniciadores específicos para uso com o pGEM-T Easy vector. A seqüência obtida foi usada para desenhar iniciadores específicos adicionais para continuar caminhando pela seqüência genômica desconhecida de milho. Múltiplas rodadas de genome walking foram realizadas até pelo menos 500 pb da seqüência de borda a partir das pontas do inserto de T-DNA serem obtidos.
Para garantir a validade das sequências de borda flanqueadoras, amplificações adicionais de PCR evento25 específicas foram realizadas no DNA genômico do evento DAS-59122-7. Os amplicons foram seqüenciados com o objetivo de estender mais a região de contato a partir da área do T-DNA inserido com as bordas 5' e 3' do DNA genômico. Os iniciadores, mostrados na Tabela 2, foram
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desenhados com base na seqüência obtida dos experimentos de genome walking para amplificar um fragmento ligando a junção original do T-DNA com o DNA genômico de milho. 0 jogo de iniciador 03-0-506/02-0-476 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO:9) ligou a junção 5' e amplificou um fragmento de 313 pb (do pb 2427 até o pb 2739, ver Figura 1) , e o jogo de iniciador 02-0-447/03-0-577 (SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO:17) ligou a junção 3' e amplificou um fragmento de 754 pb (do pb 9623 até o pb 10376, ver Figura 1).
Tabela 2: Seqüências de Iniciadores
| Nome do Iniciador | Seqüência (5' - 3' ) | Localização da seqüência alvo (pb a pb}1 |
| 02-0-215 | (SEQ ID NO: 1) GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC | 2743-2716 |
| 02-0-219 | (SEQ ID NO: 2) CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG | 9830-9858 |
| 02-0-227 | (SEQ ID NO: 3) AATTGAGCGCTTGCACGTTT | 9846-9827 |
| 02-0-370 | (SEQ ID NO: 4} AACAACAAGACCGGCCACACCCTC | 4871-4894 |
| 02-0-371 | (SEQ ID NO: 5) GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA | 5187-5163 |
| 02-0-372 | (SEQ ID NO: 6) TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA | 7017-7044 |
| 02-0-373 | (SEQ ID NO: 7) GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA | 7897-7873 |
| 02-0-447 | (SEQ ID NO: 8} AACCCTTAGTATGTATTTGTATT | 9623-9645 |
| 02-0-476 | (SEQ ID NO: 9) CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG | 2739-2714 |
| 03-0-506 | (SEQ ID NO: 10) TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG | 2427-2451 |
| 03-0-514 | (SEQ ID NO: 11) GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT | 2687-2709 |
| 03-0-542 | (SEQ ID NO: 12) GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC | 10766-10742 |
| Nome do Iniciador | Seqüência (5' - 3') | Localização da seqüência alvo (pb a pb)1 |
| 03-0-543 | (SEQ ID NO: 13) CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA | 2451-2427 |
63/74
| 03-0-564 | (SEQ ID NO: 14) CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC | 2324-2299 |
| 03-0-569 | (SEQ ID NO: 15) GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA | 10150-10174 |
| 03-0-570 | (SEQ ID NO: 16) GAGT GAAGAGATAAGC AAGT CAAAG | 10275-10299 |
| 03-0-577 | (SEQ ID NO: 17) CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG | 10376-10352 |
| 03-0-784 | (SEQ ID NO: 18) AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC | 2189-2213 |
| 67609 | (SEQ ID NO: 36) CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG | 9862-9886 |
| 69240 | (SEQ ID NO: 37) GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG | 9941-9965 |
T Localização na sequência do Evento DAS-59122-7 (see Figure 1). Bases 1 - 2593 = borda 5’, bases 2594 - 9936 = inserto T-DNA, bases 9937 - 11922 = borda 3’.
Para a verificação da seqüência de DNA que foi inserida no genoma de milho, utilizou-se PCR para amplificar, clonar e seqüenciar o T-DNA do evento DAS-59122-7. Os jogos de iniciadores (SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO:5); (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO:7); e (SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO:3) mostrados na Tabela 3 foram usados para amplificar três fragmentos sobrepostos chamados 221-1 (SEQ ID NO: 25), 221-2 (SEQ ID NO: 26), e 221-3 (SEQ ID NO: 27) representando a seqüência a partir da regiãoS' do T-DNA, sequindo até a região 3' do inserto de T-DNA, ou seja, do pb26S7 até o pb9846 do evento DAS-591227 (ver Figura 1) . Informações sobre amplicons estão relatadas na tabela 2 e as seqüências de iniciadores estão listadas na Tabela 2.
Tabela 3: Descrição de Amplicons e de Iniciadores para PCR
| Amplicon | Tamanho (pb) | Seqüência Alvo | Iniciador Direto | Iniciador Reverso | Localização do Amplicon (pb a pb)1 |
| 221-1 (SEQ ID NO:25) | 2501 | Inserto T- DNA | 03-0-514 (SEQ ID NO:11) | 02-0-371 (SEQ ID NO: 5) | 2687 - 5187 |
| 221-2 (SEQ ID NO:26) | 3027 | Inserto T- DNA | 02-0-370 (SEQ ID NO: 4) | 02-0-373 (SEQ ID NO: 7) | 4871 - 7897 |
| 221-3 (SEQ ID NO:27) | 2830 | Inserto T- DNA | 02-0-372 (SEQ ID NO: 6) | 02-0-227 (SEQ ID NO: 3) | 7017 - 9846 |
| 0784/0564 (SEQ ID NO:28) | 136 | Extremidade genômica 5' | 03-0-784 (SEQ ID NO:18) | 03-0-564 (SEQ ID NO:14) | 2189 - 2324 |
| 0784/0543 (SEQ ID NO:29) | 263 | Extremidade genômica 5 | 03-0-784 (SEQ ID NO:18) | 03-0-543 (SEQ ID NO:13) | 2189 - 2451 |
| 0569/0577 (SEQ ID NO:30) | 227 | Extremidade genômica 5' | 03-0-569 (SEQ ID NO:15) | 03-0-577 (SEQ ID NO:17) | 10150 10376 |
| Amplicon de PCR | Tamanh o (pb) | Seqüência alvo | Forward Iniciador | Iniciador reverso | Localização do Amplicon de PCR (pb a pb)1 |
| 0570/0542 (SEQ ID N0:31) | 492 | Extremidade genômica 3’ | 03-0-570 (SEQ ID NO:16) | 03-0-542 (SEQ ID N0:12) | 10275 10766 |
| 0784/0215 (SEQ ID NO:32) | 555 | Junção 5' | 03-0-784 (SEQ ID NO:18) | 02-0-215 (SEQ ID NO: 1) | 2189 - 2743 |
| 0219/0577 (SEQ ID NO:33) | 547 | Junção 3' | 02-0-219 (SEQ ID NO: 2) | 03-0-577 (SEQ ID NO:17) | 9830 10376 |
| 0506/0476 (SEQ ID NO:34) | 313 | Junção 5' | 03-0-506 (SEQ ID NO:10) | 02-0-476 (SEQ ID NO: 9) | 2427 - 2739 |
| 0447/0577 (SEQ ID NO:35) | 754 | Junção 3' | 02-0-447 (SEQ ID NO: 8) | 03-0-577 (SEQ ID NO:17) | 9623 10376 |
| 67609/6924 0 (SEQ ID NO:38) | 104 | Junção 3a | 67609 (SEQ ID NO:36) | 69240 (SEQ ID NO:37) | 9862-9965 |
L Localização na seqüência do Evento DAS-59122-7 (Figura 1). Bases 1 - 2593 = borda 5', bases 2594 - 9936 = inserto T-DNA, bases 9937 11922 = borda 3' .
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O kit PCR GC2 Advantage™ Polymerase (BD Biosciences Clontech, Inc.) foi usado de accordo as instruções do fabricante para amplificar os fragmentos do inserto (221-1 (SEQ ID NO: 25), 221-2 (SEQ ID NO: 26), e 221-3 (SEQ ID NO: 27)). As reações foram preparadas em um volume de 50pL contendo os iniciadores 5' e 3' na concentração final de 0.22μΜ and 40 ng de DNA genômico. As reações foram preparadas em duplicata usando DNA genômico extraído de plantas DAS-59122-7 T1S2 1 e DAS-59122-7 T1S2 2. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C por 1 min, seguida de 35 ciclos de 94°/95°C por 30 seg, 55°C por 30 seg, e 68°C por 5 min, com uma extensão final à 68°C por 6 min. Os produtos da amplificação por PCR foram visualizados sob luz UV, após eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE IX (89mM Tris-Borato, 2mM EDTA, pB 8.3) e corados com brometo de etídio.
Os amplicons 221-1 (SEQ ID NO: 25), 221-2 (SEQ ID NO: 26) , e 221-3 (SEQ ID NO: 27) foram purificados depois de excisados de gel de agarose 0.8% em tampão TBE IX corado com brometo de etídio, e utilização do kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Os amplicons foram cionados em um plasmídio pGEM-T Easy usando o pGEM-T Easy Vector System I (Promega Corp.). Os fragmentos cionados foram verificados através de minipreparações de DNA plasmidial (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen) e digestão com a enzima Notl. Os clones nos plasmídios e/ou os amplicons do inserto purificados foram então enviados para seqüenciamneto do inserto completo. As reações de seqüenciamento foram
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realizadas com iniciadores desenhados especificamente para seqüências conhecidas do T-DNA ou com iniciadores específicos para o vetor pGEM-T Easy. Todos os iniciadores foram sintetizados por Sigma-Genosys, Inc. (The Woodlands,
TX) e usados na concentração final de 0.2 - 0.4 μΜ nas reações de PCR.
As reações de PCR com DNA genômico isolado dos eventos DAS-59122-7, DAS-45214-4, and DAS-45216-6 contendo B.t. Cry34/35Abl, e das .linhagens controle não modificadas Hi-II e PH09B foram usadas para confirmar (1) a presença do DNA genômico de milho nas regiões de borda do evento DAS-5 9122-7, e (2) amplificação evento-específica nas junções entre o inserto T-DNA e as bordas de DNA genômico no evento DAS-59122-7.
Os iniciadores desenhados para amplificar a seqüência de borda flanqueando o inserto no evento DAS-59122-7 foram utilizados para confirmar a presença destas regiões em linhagens controle não modificadas, assim como no evento DAS-59122-7. Dois (2) jogos de iniciadores foram utilizados para cada borda 5' e 3' (quatro (4) jogos no total) foram testados. Os jogos 03-0-784/03-0-564 (SEQ ID NO: 18/SEQ ID N0:14) e 03-0-784/03-0-543 (SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO:13) foram usados para amplificar os fragmentos de 136pb e 263pb, respectivamente, da seqüência da borda 5' até o inserto de T-DNA no evento DAS-59122-7 (Figuras 2 e 3) . Similarmente, os jogos 03-0-569/03-0-577 (SEQ ID NO:
15/SEQ ID N0:17) e 03-0-570/03-0-542 (SEQ ID NO: 16/SEQ ID
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NO:12) foram usados para amplificar fragmentos de 227 pb e 492 pb, respectivamente, da borda 3' do genoma (Figuras 2 e 3) .
Iniciadores desenhados para amplificar fragmentos na junção entre as seqüências de borda e o T-DNA foram usados para estabelecer amplicons evento-específicos para o evento DAS-59122-7. Um jogo de iniciadores foi selecionado para cada uma das duas junções. 0 jogo 03-0-7 8 4/02-0-215 (SEQ ID NO: 18/SEQ ID N0:l) foi desenhado para amplificar um fragmento de 555pb na junção 5' , e o jogo 02-0-219/03-0-577 (SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 17) foi desenhado para amplificar um fragmento de 547pb na junção 3' . Um jogo de iniciadores IVR1(O197) (SEQ ID NO: 39) 5'- CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3' e IVR2(O198) (SEQ ID N0: 40) 5'- GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC3' , baseado no gene endógeno que codifica a invertase de milho (Hurst et al., (1999) Molecular Breeding 5 (6):579586) , foi utilizado para produzir um fragmento de 226pb, usado como um controle positivo interno para todas as amostras de DNA genômico de milho.
Todos os iniciadores foram sintetizados por SigmaGenosys, Inc. e usados na concentração final de 0.2 - 0.4 μΜ nas reações de PCR. As seqüências dos iniciadores estão listadas na Tabela 2. Para as amplificações por PCR, foi usado o kit Advantage™-GC 2 PCR (BD Biosciences), de acordo com as instruções do fabricante. Aproximadamente10-100ng de DNA genômico de molde foi usado para 50pL de reação. As condições da PCR foram as seguintes: desnaturação do molde
68/74 por 5 minutos a 94°C, seguida por 35 ciclos de 95°C por 1 minuto, 60°C por 2 minutos, e 72°C por 3 minutos, com uma extensão final à 72°C por 7minutos. Os produtos da amplificação por PCR foram visualizados sob luz UV, após eletroforese em gel de agarose 1% com tampão TBE IX e brometo de etidio.
Os dados de seqüência obtidos do inserto de T-DNA e as regiões de borda do evento DAS-59122-7 foram revisados e agrupados usando o software Seqman II™ Version 4.0.5 (DNAStar, Inc., Madison, WI). As seqüências de borda 5' e 3' flanqueando o inserto presente no evento DAS-59122-7 foram usadas para pesquisa de homologia contra as bases de dados públicas do GenBank, com o objetivo de caracterizar o sitio de inserção do T-DNA no genoma do milho. Análise para identificar fases abertas de leitura nas regiões de junção entre as bordas flanqueadoras e o inserto T-DNA no evento DAS-59122-7 foi conduzida usando Vector NTI 8.0 (InforMax™, Inc., Frederick, MD).
No total, 11922 pb de seqüencia do DNA genômico do evento DAS-59122-7 foram confirmados (ver Figura 1) . Na ponta 5' do T-DNA, 2593 pb de seqüência de borda flanqueadora foram identificados, e 1986 pb de seqüência de borda flanqueadora foram obtidos na ponta 3f dos fragmentos derivados do experimentos de genome walking. Um total de 7160 pb do inserto T-DNA foi clonado e sequenciado usando os j ogos de iniciadores desenhados para amplificar três fragmentos sobrepostos nomeados 221-1 (2501 pb) (SEQ ID
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ΝΟ:25), 221-2 (3027 pb) (SEQ ID NO:26), e 221-3 (2830 pb) (SEQ ID NO:27) representando a seqüência a partir da região 5' do T-DNA até a região 3' deste, do evento DAS-59122-7, do pb 2687 até o pb 9846 (ver Figura 1) . O restante da região do inserto T-DNA foi seqüenciado a partir de dois ampiicons por PCR, 0506/0476 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO:9) e 04 47/0577 (SEQ ID NO: 8/SEQ ID N0:17) , que emendam as junçoes 5' e 3' , respectivamente, do inserto T-DNA com o DNA genômico de milho. Os iniciadores usados foram desenhados de acordo com a seqüência obtida com os experimentos de genome walking para amplificar um fragmento emendando a junção específica entre o T-DNA e o DNA genômico de milho. 0 jogo de primer 03-0-506/03-0-476 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO:9) emendou a junção 5' e amplificou um fragmento de 313 pb (do pb 2427 ao pb 2739) e o jogo de iniciador 03-0-447/03-0-577 (SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO:17) emendou a junção 3' e amplificou um fragmento de 754 pb (do pb 9623 ao pb 10376). Combinados, um total de 7343 pb do inserto T-DNA no evento DAS-59122-7 foram clonados e sequenciados ( do pb 2594 até pb 9936, veja Figura 1) e comparados com o plasmídio de transformação PHP17662. Duas diferenças de nucleotídeos nas posições pb 6526 e pb 6562 foram observadas na região promotora não traduzida da peroxidase de trigo no insert T-DNA (veja Figura 1). Nenhuma das mudanças de base observadas alterou a composição da fase aberta de leitura do insert T-DNA. Ambas as regiões 5' e 3' do inserto T-DNA foram encontradas intactas, exceto pela deleção dos últimos 22pb da ponta 3' e 25pb da ponta 3' compreendendo as regiões limites
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esquerda e direita do inserto T-DNA, respectivamente. Apesar das seqüências da borda do inserto T-DNA serem conhecidas por desempenhar um papel importante na inserção do T-DNA no genoma, este resultado não é inesperado uma vez que as inserções são frequentemente imperfeitas, particularmente na ponta esquerda do T-DNA(Tinland (1996) Trends in Plant Science 1(6):178-184).
Análises das regiões de borda genômica do evento DAS-59122-7, usando o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), mostraram homologia limitada com seqüências disponíveis publicamente (Release 138.0 GenBank, Oct 25, 2003). Análise da região 5' encontrou duas áreas com homologia significante com seqüências genômicas e EST (Expressed Sequence Tag) de milho. A primeira área compreende 179 pb (pb 477 até pb 655 da seqüência de borda) e apresenta similaridade com alguns marcadores moleculares, seqüências cromossômicas, e seqüências consenso obtidas a partir do alinhamento de várias ESTs. A segunda área compreende do pb 1080 até o pb 1153 (74 pb) da seqüência da ponta 51 e apresenta similaridade com um número de diferentes seqüências genômicas e EST (Expressed Sequence Tag) de milho. A borda 3' também apresentou duas pequenas regiões não contíguas similares à seqüências de DNA de plantas. A região3' interna de 162 pb (pb 9954 a pb 10115) apresentou similaridade com a região 3' não traduzida de dois genes que codificam álcool desidrogenase (adhl) em Zea mays assim como à várias seqüências EST consenso. Uma região menor no meio da borda 3' (pb 10593 até pb 10649)
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1.¾ mostrou similaridade com regiões não codificantes de várias seqüências genômicas de milho.
De maneira geral, nenhuma região homóloga maior do que 179 pares de bases foi identificada nas regiões de borda do genoma, nem houve mais do que uma região homóloga de uma mesma seqüência conhecida encontrada. Acessos individuais apresentando similaridade com as seqüências de borda do evento DAS-59122-7 foram examinados para determinar se a inserção no evento DAS-59122-7 ocorreu em uma seqüência codificante de proteína caracterizada. Nenhuma das regiões de similaridade ocorreram dentro de seqüências codificantes conhecidas. O alinhamento local da seqüência completa do plasmídio de transformação, PHP17662, com as seqüências de borda do evento DAS-59122-7 não mostrou homologias significantes, indicando que as regiões de borda flanqueando o inserto T-DNA não continham fragmentos do plasmídio de transformação. Consequentemente, a identificação e caracterização de seqüências genômicas flanqueando o sítio de inserção no evento DAS-59122-7 ficou limitada devido a ausência de regiões significantes de homologia com seqüências conhecidas.
As regiões de junção 5' e 3' entre as pontas de DNA 25 genômico e o inserto T-DNA no evento DAS-59122-7 foram analisadas quanto a presença de novas fases abertas de leitura. Nenhuma fase aberta de leitura de tamanho relevante (> 100 aminoácidos) foi identificada nas regiões de junção 5' ou 3r , indicando que nenhuma nova fase aberta
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de leitura foi gerada como resultado da inserção do T-DNA. Ainda, as pesquisas de homologia não indicaram a presença de fases abertas de leitura, endógenas de milho, nas regiões de borda que poderiam ter sido interrompidas pela inserção do T-DNA B.t. Cry34/35Abl no evento DAS-59122-7.
Exemplo 5. Iniciadores para PCR
Pares de iniciadores de DNA específicos para o evento foram usados para produzir um amplicon diagnóstico para DAS-59122-7. Estes pares de iniciadores incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 17; e SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37. Além desses iniciadores, qualquer iniciador derivado de SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 que quando usado em uma reação de amplificação de DNA produz um fragmento de DNA amplificado diagnóstico para DAS-59122-7 é um avanço da presente invenção. Qualquer modificação destes métodos que usam iniciadores de DNA ou complementos destes para produzir um amplicon de molécula de DNA diagnóstico para DAS-59122-7 está inserida no conhecimento corrente da arte. Além disso, iniciadores controle, que incluem IVR1 (0197)/IVR2 (0198) (SEQ ID NO: 39/SEQ ID NO: 40) para a amplificação de um gene endógeno de milho estão incluídos como padrões internos para as condições de reação.
A análise de extratos DNA de tecidos de planta para testar a presença do evento DAS-59122-7 deveria incluir um
73/74 controle positivo de DNA extraído de tecido vegetal (uma amostra de DNA conhecida por conter seqüências transgênicas). Uma amplificação bem sucedida do controle positivo demonstra que a PCR foi realizada em condições que permitem a amplificação das seqüências alvo. Um controle negativo, ou selvagem, no qual o DNA molde é o DNA genômico preparado de uma planta não transgênica, ou de uma planta não transformada com o evento DAS-59122-7, também deveria ser incluído. Adicionalmente, um controle negativo que não contém DNA molde de milho será útil para calibrar os reagentes e as condições do protocolo da PCR.
Moléculas adicionais de iniciadores de DNA de comprimento suficiente podem ser selecionadas de SEQ ID NO:
21 e SEQ ID NO: 22 por especialistas em métodos de amplificação, e condições otimizadas para a produção de um amplicon diagnóstico para o evento DAS-59122-7. O uso destas seqüências de iniciadores de DNA com modificações dos métodos mostrados nestes Exemplos estão internalizadas no escopo da invenção. O amplicon donde pelo menos uma molécula de iniciador de comprimento suficiente derivado de SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 que é diagnóstico para o evento DAS-59122-7é um avanço desta invenção. O amplicon donde pelo menos uma molécula de iniciador de comprimento suficiente derivado de qualquer dos elementos genéticos de PHI17662A que é diagnóstico para o evento DAS-59122-7 é um avanço desta invenção. 0 ensaio para o amplicon
DAS-59122-7 pode ser realizado usando um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf
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Mastercycler Gradient thermocycler, ou por métodos e aparatos conhecidos por especialistas na área.
Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente 5 invenção, deve ser aparente para especialistas na área que a invenção pode ser modificada em ajuste e detalhe sem se distanciar de tais princípios. Nós reivindicamos todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações.
Todas as publicações e documentos de patentes publicados citados nesta especificação estão incorporados aqui por referência ao mesmo conteúdo, como se cada publicação ou publicação de patente fosse especificãmente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
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Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que consiste de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo de:
a) sequência de nucleotídeos definida na SEQ ID NO: 23; b) sequência e de nucleotídeos definida na SEQ ID NO: 21; c) sequência de nucleotídeos definida na SEQ ID NO: 22 . 2. Kit de identificação do evento DAS-59122-7 em amostra biológica, que detecta a região específica de DAS-59122-7, caracterizado pelo fato de que o referido kit compreende um par de iniciadores, em que o primeiro iniciador do par de iniciadores compreende um primeiro iniciador e um segundo iniciador do par de iniciadores, em que o primeiro iniciador do par de iniciadores reconhece a sequência em SEQ ID NO: 19 ou em SEQ ID NO: 20, e o segundo iniciador do par de iniciadores reconhece a sequência de nucleotídeo com a sequência SEQ ID NO: 24, em que os ditos primeiro e segundo iniciadores do par de iniciadores, compreendem, respectivamente, o par de sequências selecionadas do grupo consistindo de:a) sequências da SEQ ID NO: 18 e 1; b) sequências da SEQ ID NO: 10 e 9; c) sequências da SEQ ID NO: 2 e 17; d) sequências da SEQ ID NO: 8 e 17; e) sequências da SEQ ID NO: 36 e 37. Petição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 13/27 - 2/10
- 3. Kit de detecção de DNA, específico para o DNA de junção do evento DAS-59122-7 de milho correspondente a SEQ ID NO: 24, e progênie do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de DNA, que funciona no método de detecção de DNA, em que a referida molécula de DNA hibridiza com uma sequência de DNA de junção do evento DAS-59122-7 de milho correspondente a SEQ ID NO: 24, a referida sequência de DNA de junção abrangendo a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA adjacente, e não hibridiza com DNA de planta de milho que não seja de DAS-59122-7 e a referida molécula de DNA é a sequência selecionada do grupo:a) sequência de nucleotídeos definida em SEQ ID NO: 21, em que a sequência de nucleotídeo da sonda é SEQ IDNos: 34; eb) sequência de nucleotídeos definida em SEQ ID NO: 22, em que a sequência de nucleotídeo da sonda é SEQ IDNos: 38.
- 4. Constructo de DNA, em que o construto de DNA corresponde à
SEQ ID NO: 23 e é flanqueado pela sequência de nucleotídeo estabelecida em SEQ ID NO: 19 e a sequência de nucleotídeo estabelecida em SEQ ID NO: 20, caracterizado pelo fato de que compreende: primeiro, segundo e terceiro cassete de expressão, em que o referido primeiro cassete de expressão compreende, em ligação operacional:(a) promotor de ubiquitina de milho;(b) éxon 5' não traduzido de gene de ubiquitina de milho;(c) primeiro íntron de ubiquitina de milho;(d) molécula de DNA de codificação de Cry34Abl; ePetição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 14/273/10 (e) agente de terminação transcricional de Pinll;o referido segundo cassete de expressão compreende, em ligação operacional:(i) promotor de peroxidase de trigo;(ii) molécula de DNA de codificação de Cry35Abl; e (iii) agente de terminação transcricional de Pinll;e o referido terceiro cassete de expressão compreende, em ligação operacional:(D promotor CaMV 35S; (2) molécula de DNA de codificação de pat; e (3) agente de terminação transcricional 3' de (CaMV) 35S, em que a SEQ ID NO: 19 flanqueia o construto de DNA na extremidade 5' e a SEQ ID NO: 20 flanqueia o construto de DNA na extremidade 3' . 5. Método de identificação do evento DAS-59122-7 em amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende detectar a região específica de DAS-59122-7 através da amplificação do fragmento de DNA de ácido nucléico presente na referida amostra biológica usando a reação em cadeia de polimerase com pelo menos dois iniciadores, em que um primeiro iniciador reconhece especificamente a sequência de SEQ ID NO: 19 ou 20, e um segundo iniciador reconhece a sequência de SEQ ID NO: 24, em que os primeiro e segundo iniciadores compreendem aPetição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 15/274/10 sequência da SEQ ID NO: 18 e 1, respectivamente; a sequência da SEQ ID NO: 10 e 9, respectivamente; a sequência da SEQ ID NO: 2 e 17, respectivamente; a sequência da SEQ ID NO: 8 e 17, respectivamente; ou a sequência da SEQ ID NO: 36 e 37, respectivamente.6. Método de detecção da presença do evento DAS-59122-7 de milho ou progênie do mesmo, em amostra biológica, caracterizado pelo fato de que o método compreende:(a) extrair a amostra de DNA da referida amostra biológica;(b) fornecer o par de moléculas de DNA iniciadoras selecionadas de:i) sequências das SEQ ID NO: 18 e 1; ii) sequências das SEQ ID NO: 10 e 9; iii) sequências das SEQ ID NO: 2 e 17; iv) sequências das SEQ ID NO: 8 e 17; (c) gerar condições reacionais de amplificação de DNA;(d) realizar a referida reação de amplificação de DNA, produzindo a molécula de DNA amplicon; e (e) detectar a referida molécula de DNA amplicon, em que a referida molécula de DNA amplicon corresponde à SEQ ID NOs: 32, 34, 33, ou 35, respectivamente;em que a detecção da referida molécula de DNA amplicon, na referida reação de amplificação de DNA, indica a presença do evento DAS-59122-7 de milho.7. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de quePetição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 16/27 - 5/10 consiste de qualquer um dos amplicons produzidos pelo método como definido na reivindicação 6, em que o amplicon corresponde à SEQ ID NOs: 32, 33, 34, ou 35, respectivamente.8. Método de detecção da presença de DNA correspondente ao evento DAS-59122-7 em amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) contatar a amostra compreendendo DNA de milho com a sonda de polinucleotídeos, a qual hibridiza, sob condições severas de hibridização com o DNA de junção do evento DAS-59122-7 de milho correspondendo a SEQ ID NO: 24, o referido DNA de junção abrangendo a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA flanqueado, e não hibridiza, sob as referidas condições severas de hibridização, com DNA de planta de milho que não seja de DAS-59122-7, e a referida sonda é a sequência selecionada de:(i) a sequência de nucleotídeo estabelecida em SEQ ID NO: 21, em que a sequência de nucleotídeo da sonda compreende SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 9, 11, 10, 13, 15, 16, 17 ou 37; e (ii) a sequência de nucleotídeo estabelecida em SEQ ID NO: 22, em que a sequência de nucleotídeo da sonda compreende SEQ ID Nos: 2, 3, 8, 12, 14, 18 ou36;(b) sujeitar a amostra e a sonda a condições severas de hibridização; e (c) detectar a hibridização da sonda ao DNA de junção, em que a detecção da hibridização indica a presença doPetição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 17/27
- 6/10 evento DAS-59122-7.
9. Par de moléculas de DNA, caracterizado pelo fato de que cada par de moléculas de DNA consiste de uma primeira sequência selecionada do grupo consistindo das sequências SEQ ID NO: 1, , 2, 3, 4, 5 , 6 , 7, 8, 9, 11, e 36, e uma segunda sequência selecionada do grupo consistindo das sequências SEQ ID NO: 10 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 37. 10. Par de moléculas de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA , em que o par de i moléculas de DNA é selecionado de: a) sequências das SEQ ID NO : 18 e 1; b) sequências das SEQ ID NO : 10 e 9; c) sequências das SEQ ID NO : 2 e 17; e d) sequências das SEQ ID NO : 8 e 17; em que o par de moléculas de DNA é capaz de amplificar em uma reação em cadeia de polimerase um amplicon compreendendo região especifica do evento DAS-59122-7 de milho e sua progênie, em que a referida região especifica DAS-59122-7 compreende pelo menos uma sequência de junção com SEQ ID NO: 23, e a referida sequência de junção expande a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA adj acente.11. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que consiste de uma sequência de junção compreendendo a sequência selecionada de SEQ ID NO: 32, 33, 34 e 35 e complementos das mesmas.Petição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 18/27 - 7/1012. Método de confirmação da pureza de semente, caracterizado pelo fato de que compreende detectar a região específica de DAS-59122-7 com o par de iniciador específico, o qual hibridiza especificamente com a sequência de junção SEQ ID NO: 21 ou 22, a referida sequência de junção expande a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA adjacente, ou complemento do mesmo, em amostra de semente, e não hibridiza com o DNA de um não-DAS-59122-7 de planta de milho, em que o par de iniciador específico tem as sequências de SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 1; as sequências das SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; as sequências das SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 17; ou as sequências das SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 17.13. Método de varredura de sementes, para a presença do evento DAS-59122-7, caracterizado pelo fato de que compreende detectar a região específica de DAS-59122-7 com o par de iniciador específico, o qual hibridiza especificamente com a sequência de junção em SEQ ID NO: 21 ou 22, a referida sequência de junção expande a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA adjacente, ou complemento do mesmo, em amostra de lote de semente, e não hibridiza com o DNA de um não-DAS-59122-7 de planta de milho, em que o par de iniciador específico tem as sequências de SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 1; as sequências das SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; as sequências das SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 17; ou as sequências das SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 17.14. Par de sequências de DNA isoladas, caracterizado pelo fato de que cada uma consiste de pelo menos dez nucleotídeos e, quando usadas juntas em procedimentos de amplificação de DNA, produzirão amplicon de diagnóstico, para o evento DAS-59122-7Petição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 19/27
- 8/10 correspondente a SEQ ID NO: 24, em que o par de sequências de DNA isoladas é selecionado a partir do grupo consistindo das sequências SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 1; as sequências das SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; as sequências das SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 17; as sequências das SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 17; e as sequências SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37.15. Método de detecção da presença de inserção do evento DAS59122-7 em tecido de milho, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) selecionar o par de iniciadores, em que o dito par de iniciadores é selecionado a partir das sequências SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 1; as sequências das SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; as sequências das SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 17; as sequências das SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 17; e as sequências SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37;(b) contatar a amostra do referido tecido de milho com o referido par de iniciadores;(c) realizar a amplificação de DNA e analisar os amplicons, em que o amplicon compreende as SEQ ID Nos: 32, 33, 34, 35, 38.16. Método de detecção da presença de inserção do evento DAS59122-7 em tecido de milho, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) contatar a amostra do referido tecido de milho com a sonda de polinucleotídeos que hibridiza, sob condições severas de hibridização, com uma ou mais sequências de DNA selecionadas de SEQ ID NO: 32, 33,Petição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 20/27
- 9/1034 e 35 e complementos das mesmas, em que a sonda hibridiza especificamente com a região dentro das regiões flanqueadoras 5' ou 3' do evento DAS-59122-7 e também compreende uma parte contígua com o DNA exógeno;(b) sujeitar as referidas amostra e sonda a condições severas de hibridização; e (c) analisar a hibridização da sonda.17. Kit de detecção de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende a sonda de polinucleotideos, a qual hibridiza, sob condições severas de hibridização, com um ou mais sequências de DNA selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO: 32, 33, 34 e 35 e complementos das mesmas, e em que a sonda hibridiza especificamente com a região dentro das regiões flanqueadoras 5' ou 3' do evento DAS-59122-7 e também compreende uma parte contígua com o DNA exógeno.18. Kit de detecção de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende o par de iniciadores, da SEQ ID NO: 21 e 22, em que cada iniciador se encontra em lados opostos da sequência de diagnóstico, para a inserção do evento DAS-59122-7, em que cada iniciador do referido par de iniciadores consiste de uma primeira sequência selecionada do grupo consistindo das sequências SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 e 36, e uma segunda sequência selecionada do grupo consistindo das sequências SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 37, a referida sequência de diagnóstico compreendendo pelo menos uma sequência de junção de DAS-59122-7, a referida sequência de junção expande a junção entre o DNA heterólogo inserido noPetição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 21/27
- 10/10 genoma e o DNA adjacente.Petição 870180066507, de 31/07/2018, pág. 22/271/6
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