MX2007003725A - Evento de maís das-59122-7 y métodos de detección del mismo - Google Patents
Evento de maís das-59122-7 y métodos de detección del mismoInfo
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Abstract
Composiciones de ADN relacionadas con plantas de maíz transgénicas resistentes a insectos. También se proveen ensayos para detectar la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz sobre la base de una construcción de secuencia de ADN recombinante insertada en el genoma de maíz y de las secuencias de ADN que flanquean al sitio de inserción. Se proveen conjuntos de elementos y condiciones de utilidad para efectuar los ensayos.
Description
EVENTO DE MAÍZ DAS-59122-7 Y MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL MISMO
CAMPO DE LA INVENCION Las realizaciones de la presente invención se relacionan con el campo de la biología molecular vegetal, más específicamente una realización de la invención se relaciona con una construcción de ADN para conferir resistencia a insectos a plantas. Las realizaciones de la invención se relacionan más específicamente con una planta de maíz DAS-59122-7 resistente a insectos y con ensayos para detectar la presencia de ADN de plantas de maíz DAS-59122-7 en una muestra y composiciones con el mismo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una realización de esta invención se relaciona con una planta de maíz (Zea mays) DAS-59122-7 resistentes a insectos, también denominada línea de maíz DAS-59122-7 o evento de maíz DAS-59122-7 y con el ADN de una construcción de expresión vegetal de plantas de maíz DAS-59122-7 y la detección de la región de inserción del transgen/flanqueadora en plantas de maíz DAS-59122-7 y con la progenie de las mismas . El maíz es un cultivo importante y constituye una fuente de alimento primaria en muchas áreas del mundo. Los daños causados por las plagas de insectos constituyen uno de los
principales factores en la pérdida de cultivos de maíz en todo el mundo, a pesar del uso de medidas protectoras tal como pesticidas químicos. En vista de ello, se ha manipulado mediante ingeniería genética la resistencia a insectos en cultivos, tal como maíz, con el fin de controlar los daños ocasionados por los insectos y reducir la necesidad de los pesticidas químicos tradicionales. Un grupo de genes que se ha utilizado para producir cultivos transgénicos resistentes a insectos son las delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). Das delta-endotoxinas se han expresado con éxito en plantas de cultivo, tal como algodón, papas, arroz, girasol, así como maíz, y ha demostrado un excelente control de las plagas de insectos. (Perlak, F.J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11:1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; Publicación PCT N° WO 01/13731; y Bing J et al. (2000) Efficacy of CrylF Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO) . Se sabe que la expresión de genes extraños en plantas es afectada por su ubicación en el genoma vegetal, quizás debido a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de elementos reguladores de la transcripción (por ejemplo, potenciadores ) cerca del sitio
de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22: 421-477, 1988). Al mismo tiempo, la presencia del transgen en diferentes ubicaciones en el genoma afectará al fenotipo general de la planta de distintas maneras. Por este motivo, a menudo es necesario examinar una gran cantidad de eventos con el fin de identificar un evento caracterizado por una expresión óptima del gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede existir una gran variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los distintos eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgen en distintos tejidos vegetales, que posiblemente no correspondan a los patrones esperados de los elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción genética introducida. Por este motivo, es común producir cientos a miles de eventos diferentes y examinar dichos eventos por un solo evento que presente los niveles y patrones de expresión deseados del transgen para fines comerciales. Un evento con los niveles o patrones de expresión deseados del transgen es de utilidad para introducir el transgen en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual empleando para ello los métodos de cria convencionales. La progenie de dichos cruzamientos conserva las características de expresión del transgen del
transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar una expresión genética confiable en numerosas variedades que están bien adaptadas a las condiciones de crecimiento locales . Seria ventajoso poder detectar la presencia de un evento particular con el fin de determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgen de interés. Además, un método para detectar un evento particular seria de gran ayuda para cumplir con las normas de aprobación de precomercialización y rotulación de los alimentos derivados de plantas de cultivo recombinantes, por ejemplo, o para su uso en el monitoreo ambiental, monitoreo de rasgos en cultivos en el campo o monitoreo de los productos derivados de una cosecha del cultivo, asi como su uso para asegurar el cumplimiento de las partes sujetas a términos reguladores o contractuales . Es posible detectar la presencia de un transgen utilizando cualquier método de detección de ácidos nucleicos conocido en el arte incluyendo, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Estos métodos de detección generalmente se basan en los elementos genéticos de uso frecuente, tal como promotores, terminadores , genes marcadores, etc., porque para muchas construcciones de ADN, la región de codificación es intercambiable. Como resultado
de ello, es posible que no se utilicen dichos métodos para distinguir diferentes eventos, en particular los que son producidos usando la misma construcción de ADN o construcciones muy similares a menos que se conozca la secuencia de ADN del ADN flanqueador adyacente al ADN heterólogo insertado. Por ejemplo, un ensayo de PCR especifico del evento se describe en la Patente de EE.UU. N°: 6.395.485 para la detección del evento de élite GAT-ZM1. Por consiguiente, seria conveniente contar con un método simple y distintivo para identificar el evento DAS-59122-7. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las realizaciones de esta invención se relacionan con métodos para producir y seleccionar una planta de cultivo monocotiledónea resistente a insectos. Más específicamente, se provee una construcción de ADN que, cuando se expresa en células vegetales y plantas confiere resistencia a insectos. De acuerdo con un aspecto de la invención, se provee una construcción de ADN capaz de introducirse y replicarse en una célula huésped que, cuando se expresa en células vegetales y plantas confiere resistencia a insectos a dichas células vegetales y plantas. La construcción de ADN se compone de una molécula de ADN denominada PHI17662A e incluye tres (3) casetes de expresión transgenética. El primer cásete de expresión comprende una molécula de ADN que incluye al promotor, un exón no traducido 5' y el primer intrón del gen
de ubiquitina (Ubi-1) de maíz (Christensen et ai. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689 y Christensen y Quail (1996) Transgenics Res. 5: 213-218) ligado operativamente a una molécula de ADN que codifica una d-endotoxina de B.t., identificada como Cry34Abl (Patentes de EE.UU. N°: 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593), ligada operativamente a una molécula de ADN que comprende el Pin II del terminador de la transcripción aislado de papa (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). El segundo cásete de expresión transgénica de la construcción de ADN comprende la molécula de ADN que codifica al promotor de peroxidasa de trigo (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174) ligado operativamente a una molécula de ADN que codifica una d-endotoxina de B.t. identificada como Cry35Abl (Patentes de EE.UU. N°: 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593) ligado operativamente a una molécula de ADN que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de papa (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). El tercer cásete de expresión transgénico de la construcción de ADN comprende una molécula de ADN del virus en mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell J.T. et al. (1985) Nature 313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) ligada operativamente a una molécula de ADN que codifica un gen de fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) ( ohlleben W. et al. (1988) Gene 70: 25-37) ligada operativamente a una molécula de ADN que comprende el
terminador de la transcripción 3' 35S (CaMV) (véase, Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59). También se proveen plantas que contienen la construcción de ADN. De acuerdo con otra realización de la invención, se proveen composiciones y métodos para identificar una nueva planta de maiz designada DAS-59122-7, donde dichos métodos se basan en cebadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia flanqueadora 5' y/o 3' de DAS-59122-7. Se proveen moléculas de ADN que comprenden secuencias cebadoras que, cuando se utilizan en una reacción de PCR, producirán amplicones únicos para el evento transgénico DAS-59122-7. Estas moléculas se pueden seleccionar del grupo formado por: 5 ' -GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC-3' (SEQ ID N°: 1); 5' -CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG-3' (SEQ ID N° : 2); 5' -AATTGAGCGCTTGCACGTTT-3 ' (SEQ ID N° : 3) ; 5' -AACAACAAGACCGGCCACACCCTC-3' (SEQ ID N°: 4); 5' -GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA-3 ' (SEQ ID N°: 5); 5 ' -TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA-3' (SEQ ID N° : 6); 5' -GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA-3' (SEQ ID N° : 7); 5' -AACCCTTAGTATGTATTTGTATT-3' (SEQ ID N° : 8 ) ; 5' -CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG-3' (SEQ ID N° : 9) ; 5' -TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG-3' (SEQ ID N°: 10); 5' -GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT-3' (SEQ ID N° : 11); 5' -GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC-3 ' (SEQ ID N°: 12);
' -CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA-3' (SEQ ID N°: 13); 5' -CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC-3 ' (SEQ ID N°: 14); 5' -GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA-3' (SEQ ID N° : 15); 5' -GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG- 3' (SEQ ID N° : 16); 5' -CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG- 3' (SEQ ID N° : 17); 5' -AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC- 3' (SEQ ID N° : 18) 5' -CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG- 3' (SEQ ID N° : 36) ; 5' -GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG- 3' (SEQ ID N° : 37) y complementos de las mismas. La planta y semill comprende estas moléculas constituyen una realización de esta invención. Además, se proveen conjuntos de elementos que emplean estas secuencias cebadoras para la identificación del evento DAS-59122-7. Un realización adicional de la invención se relaciona con las secuencias flanqueadoras especificas de DAS-59122-7 que se describen aquí, que se pueden usar para desarrollar métodos de identificación específicos para DAS-59122-7 en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se relaciona con las regiones flanqueadoras 5' y/o 3' de DAS-59122-7, SEQ ID N° : 19 para la región flanqueadora 5' y SEQ ID N°: 20 para la región flanqueadora 3', respectivamente, que se pueden usar para desarrollar cebadores y sondas específicos. Una realización adicional de la invención se relaciona con métodos para identificar la presencia de DAS-59122-7 en muestras biológicas basados en el
uso de dichos cebadores o sondas específicos. De acuerdo con otra realización de la invención, se proveen métodos para detectar la presencia del ADN correspondiente al evento de maíz DAS-59122-7 en una muestra. Dichos métodos comprenden: (a) poner la muestra que comprende ADN en contacto con un juego de cebadores de ADN que, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico extraído del evento de maíz DAS-59122-7, produce un amplicón que es diagnóstico para el evento de maíz DAS-59122-7; (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, con lo cual se produce un amplicón; y (c) detectar dicho amplicón. Las moléculas de ADN que comprenden la nueva región de inserción del transgen/flanqueadora, SEQ ID N°: 21, región flanqueadora 5' más 1000 internos y SEQ ID N° : 22, región flanqueadora 3' más 1000 internos y homólogos o complementarios de las SEQ ID N° : 21 y SEQ ID N° : 22 constituyen una realización de esta invención. Las secuencias de ADN que comprenden la nueva región de inserción del transgen/flanqueadora , SEQ ID N°: 21, constituyen una realización de esta invención. Se incluyen las secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia del inserto del transgen y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica y/o flanqueadora de maíz de la planta de maíz DAS-
59122-7 de la SEQ ID N°: 21 que son de utilidad como secuencias cebadoras para la producción de un amplicón diagnóstico de la planta de maíz DAS-59122-7. Además, se proveen secuencias de ADN que comprenden la nueva región de inserción del transgen/flanqueadora, SEQ ID N°: 22. Se incluyen asimismo secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia del inserto del transgen y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica y/o flanqueadora de maíz de la planta de maíz DAS-59122-7 de la SEQ ID N° : 22 que son de utilidad como secuencias cebadoras para · la producción de un amplicón diagnóstico para la planta de maiz DAS-59122-7. De acuerdo con otra realización de la invención, las secuencias de ADN que comprenden al menos 11 o más nucleótidos de la porción del transgen de la secuencia de ADN de la SEQ ID N° : 21, o complementos de las mismas, y una longitud similar de la secuencia de ADN flanqueadora 5' de maiz de la SEQ ID N°: 21, o complementos de las mismas, son de utilidad como cebadores de ADN en los métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos usando estos cebadores son de diagnóstico para el evento de maiz DAS-59122-7. Por ello, las realizaciones de la invención también incluyen los amplicones producidos con cebadores de ADN homólogos o complementarios de la SEQ ID N° : 21.
De acuerdo con otra realización de la invención, las secuencias de ADN que comprenden al menos 11 o más nucleótidos de la porción del transgen de la secuencia de ADN de la SEQ ID N° : 22, o complementos de la misma, y una longitud similar de la secuencia de ADN flanqueadora 3' de maíz de la SEQ ID N° : 22 o complementos de la misma, son de utilidad como cebadores de ADN en los métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos usando estos cebadores son de diagnóstico para el evento de maíz DAS-59122-7. Por ello, las realizaciones de la invención también incluyen los amplicones producidos con cebadores de ADN homólogos o complementarios de la SEQ ID N° : 22. Más específicamente, un par de moléculas de ADN que comprenden un juego de cebadores de ADN, donde las moléculas de ADN se identifican como SEQ ID N° : 18 o complementos de la misma y SEQ ID N°: l o complementos de la misma; SEQ ID N°: 2 o complementos de la misma y SEQ ID N°: 17 o complementos de la misma; SEQ ID N° : 10 o complementos de la misma y SEQ ID N°: 9 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 8 o complementos de la misma y SEQ ID N° : 17 o complementos de la misma; y SEQ ID N°: 36 o complementos de la misma y SEQ ID N° : 37 o complementos de la misma, constituyen realizaciones de la invención . Otros aspectos de la invención incluyen un amplicón que comprende las moléculas de ADN de las SEQ ID N° : 18 y SEQ
ID N°: 1; el amplicón que comprende las moléculas de ADN de las SEQ ID N°: 2 y SEQ ID N° : 17; el amplicón que comprende las moléculas de ADN de las SEQ ID N° : 10 y SEQ ID N° : 9; y el amplicón que comprende las moléculas de ADN de las SEQ ID N°: 8 y SEQ ID N°: 17; y el amplicón que comprende las moléculas de ADN de la SEQ ID N° : 36 y SEQ ID N°: 37. Otras realizaciones de la invención incluyen los siguientes cebadores, que son de utilidad para detectar o caracterizar al evento DAS-59122-7: SEQ ID N° : 11 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 5 o complementos de la misma; SEQ ID N° : 4 o complementos de la misma; SEQ ID N° : 7 o complementos de la misma; SEQ ID N° : 6 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 3 o complementos de la misma; SEQ ID N° : 18 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 14 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 13 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 15 o complementos de la misma; SEQ ID N°: 17 o complementos de la misma; SEQ ID N° : 16 o complementos de la misma; y SEQ ID N°: 12 o complementos de la misma. Otras realizaciones también incluyen los amplicones producidos por aparamiento de cualquiera de los cebadores enumerados precedentemente . De acuerdo con otra realización de la invención, se proveen métodos para detectar la presencia de una molécula de ADN correspondiente al evento DAS-59122-7 en una muestra, donde dichos métodos comprenden: (a) poner la muestra que
comprende ADN extraído de una planta de maíz en contacto con una sonda de ADN, donde la molécula se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con el ADN extraído del evento de maíz DAS-59122-7 y no se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con el ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación severas; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN. Más especí icamente, se provee un método para detectar la presencia de una molécula de ADN correspondiente al evento DAS-59122-7 en una muestra, donde dicho método comprende: (a) poner la muestra que comprende ADN extraído de una planta de maíz en contacto con una sonda de una molécula de ADN que consiste de secuencias que son únicas para el evento, por ejemplo secuencias de unión, donde dicha molécula de la sonda de ADN se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con el ADN extraído del evento de maíz DAS-59122-7 y no se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con el ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación severas; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN. Además, se provee un conjunto de elementos y métodos para identificar el evento DAS-59122-7 en una muestra biológica que detecta una región específica de DAS-59122-7 dentro de la SEQ ID N° : 23.
Se proveen moléculas de ADN que comprenden al menos una secuencia de unión de DAS-59122-7 seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 32, 33, 34 y 35 y complementos de las mismas; donde dicha secuencia de unión abarca la unión entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN que flanquea el sitio de inserción en la célula de maíz, es decir el ADN flanqueador y es diagnóstico para el evento DAS-59122-7. De acuerdo con otra realización de la invención, se proveen métodos para producir una planta de maíz resistente a insectos que comprenden los pasos de: (a) cruzar sexualmente una primera linea progenitora de maíz que comprende los casetes de expresión de la invención, que confieren resistencia a insectos y una segunda linea progenitora de maíz que carece de resistencia a insectos, con lo cual se produce una pluralidad de plantas de progenie; y (b) seleccionar una planta de progenie que sea resistente a insectos. Dichos métodos pueden comprender opcionalmente el paso adicional de retrocruzar la planta de progenie con la segunda linea progenitora de maíz para producir plantas de maíz de cultivo puro que sean resistentes a insectos. Una realización adicional de la invención provee un método para producir una planta de maíz resistente a insectos que comprende transformar una célula de maíz con la construcción de ADN PHI17662A (SEQ ID N°: 24), cultivar la
célula de maíz transformada en una planta de maíz, seleccionar la planta de maíz que muestra resistencia a insectos y cultivar dicha planta de maíz hasta obtener una planta de maíz fértil. La planta de maíz fértil se puede autopolinizar o cruzar con variedades de maíz compatibles para producir una progenie resistente a insectos. Otra realización de la invención se relaciona además con un conjunto de elementos para detectar ADN para identificar el evento de maíz DAS-59122-7 en muestras biológicas. El conjunto de elementos de la invención comprende un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueadora 5' o 3' de DAS-59122-7 y un segundo cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN extraño de DAS-59122-7 o dentro del ADN flanqueador, para su uso en un protocolo de identificación por PCR. Otra realización de la invención se relaciona con un conjunto de elementos para identificar el evento DAS-59122-7 en muestras biológicas, donde dicho conjunto de elementos comprende una sonda específica que presenta una secuencia que corresponde a, o que es complementaria de, una secuencia que presenta entre un 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica del evento DAS-59122-7. La secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueadora 5' o 3' del evento DAS-59122-7. Los métodos y conjuntos de elementos que las
realizaciones de la presente invención abarcan se pueden usar para diferentes fines tal como, por ejemplo, los siguientes: para identificar el evento DAS-59122-7 en plantas, un material vegetal o en productos tal como, por ejemplo, productos forrajeros o alimentarios (frescos o procesados) que comprenden el material vegetal o que derivan del mismo; además, o como alternativa, los métodos y conjuntos de elementos se pueden usar para identificar un material vegetal transgénico con el fin de diferenciar un material transgénico de un material no transgénico; además, o como alternativa, los métodos y conjuntos de elementos se pueden usar para determinar la calidad del material vegetal que comprende al evento de maíz DAS-59122-7. Los conjuntos de elementos también pueden contener los reactivos y materiales necesarios para llevar a cabo dicho método de detección. Otra realización de esta invención se relaciona con la planta de maíz DAS-59122-7 o partes de la misma, incluyendo, por ejemplo, polen, óvulos, células vegetativas, los núcleos de las células de polen y los núcleos de las células huevo de la planta de maíz DAS-59122-7 y de la progenie derivada de la misma. La planta y semilla de maiz DAS-59122-7 de las cuales provienen las moléculas de ADN cebadoras que proveen un producto amplicón especifico constituyen una realización de la invención. Los aspectos precedentes y otros aspectos de la
invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figura adjunta. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS. FIG. 1. Secuencia de ADN (SEQ ID N°: 23) donde se muestra el inserto transgénico PHI17662A, asi como las secuencias que flanquean a dicho inserto transgénico. Las regiones de los bordes 5' y 3' , bp 1 a bp 2593 y bp 9937 a bp 11922 respectivamente, están subrayadas. Hay dos diferencias de nucleótidos (bp 6526 y bp 6562) basadas en una comparación con el plásmido transformante PHP17662 que están resaltadas y subrayadas . FIG. 2. Diagrama esquemático de la región del inserto en el evento DAS-59122-7 Cry34/35Abl B.t. dividida en tres secciones separadas; la región del borde 5' con el ADN genómico de maíz, el inserto de ADN-T intacto y la región del borde 3' con el ADN genómico de maiz. Las dos flechas en la parte inferior del diagrama del inserto indican los puntos inicial y final de la secuencia derivada de los fragmentos desplazados del genoma 5' y 3' . Los demás recuadros en la parte inferior del diagrama del inserto representan fragmentos de PCR que fueron amplificados a partir de ADN genómico del evento DAS-59122-7 y secuenciados para abarcar al inserto de ADN-T intacto y las regiones de unión de inserto/borde 5' y 3' . FIG. 3. Diagrama esquemático de la región del
inserto en el evento DAS-59122-7 Cry34/35Abl B.t. dividido en tres secciones separadas; la región del borde 5' con el ADN genómico de maíz, el inserto de ADN-T intacto y la región del borde 3' con el ADN genómico de maíz. Los recuadros en la parte inferior del diagrama del inserto representan fragmentos de PCR ubicados ya sea en las regiones genómicas de los bordes o a través de las regiones de unión 5' y 3' del Inserto de ADN-T con el ADN genómico de maíz que fueron amplificados a partir del ADN genómico del evento DAS-59122-7. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN. Se proveen las siguientes definiciones y métodos para definir mejor la presente invención y guiar a los especialistas en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben interpretarse de acuerdo con el uso convencional que le dan los especialistas en la técnica relevante. Las definiciones de términos comunes de biología molecular también se pueden consultar en Rieger et al., Glossary de Genetics: Classical y Molecular, 5a edición, Springer-Verlag : Nueva York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Se usa la nomenclatura para las bases de ADN indicada bajo 37 CFR § 1822. Tal como se utiliza en la presente, el término "comprende" significa que "incluye pero que no se limita a".
Tal como se utiliza en la presente, el término "maíz" significa Zea mays e incluye todas las variedades vegetales que se puedan criar con maíz, incluyendo especies de maíz salvaj e . Tal como se utiliza en la presente, el término
"especifico de DAS-59122-7" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es adecuada para identificar de manera discriminada al evento DAS-59122-7 en plantas, material vegetal o en productos tal como, por ejemplo, productos forrajeros o alimentarios (frescos o procesados) que comprenden, o derivan del material vegetal. Tal como se utiliza en la presente, los términos "resistente a insectos" y "afectar plagas de insectos" se refiere a efectuar cambios en la alimentación, crecimiento y/o comportamiento de los insectos en cualquier etapa del desarrollo, incluyendo por ejemplo: matar al insecto; demorar el crecimiento; impedir la capacidad reproductora; inhibir la alimentación; y semejantes. Tal como se utiliza en la presente, los términos "actividad pesticida" y "actividad insecticida" se utilizan como sinónimos para hacer referencia a la actividad de un organismo o una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteina) que se pueda medir utilizando diversos parámetros incluyendo, por ejemplo, mortalidad de la plaga, pérdida de peso de la plaga, atracción de la plaga, repelencia de la
plaga y otros cambios físicos y del comportamiento de una plaga después de alimentarse de y/o exponerse al organismo o sustancia por un tiempo apropiado. Por ejemplo las "proteínas pesticidas" son proteínas que presentan actividad pesticida por sí mismos o en combinación con otras proteínas. Una "secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Tal como se utiliza en la presente, los términos "que codifica" o "codificado por", cuando se utilizan en el contexto de un ácido nucleico específico, significa que el ácido nucleico comprende la información necesaria como para guiar la traducción de la secuencia de nucleótidos hasta obtener una proteína específica. La información que codifica la proteína está especificada por el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de dichas secuencias no traducidas intervinientes (por ejemplo, como en el ADNc) . Un "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadoras 5' ) y que siguen (secuencias no codificadoras 3') a la secuencia de codificación. Un "gen nativo" se refiere a un gen tal como se lo encuentra en la naturaleza
con sus propias secuencias reguladoras. Un "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y de codificación que no se encuentran j.untos en la naturaleza. Por consiguiente, el gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que derivan de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias de codificación que derivan de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente que en la naturaleza. Un "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. El término "extraño" se refiere a un material que normalmente no se halla en la ubicación de interés. Por consiguiente, el término "ADN extraño" puede comprender tanto ADN recombinante asi como el ADN reordenado, recientemente introducido de la planta. Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se halla en el organismo huésped, pero que es introducido en dicho organismo huésped por transformación de genes. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o bien, pueden comprender genes quiméricos. Un "transgen" es cualquier gen que es introducido en el genoma de un organismo mediante un procedimiento de transformación. El sitio en el genoma vegetal donde se ha insertado el ADN recombinante se puede denominar "sitio de inserción" o "sitio de interés o blanco" .
Tal como se utiliza en la presente, "ADN de inserto" se refiere al ADN heterólogo dentro de los casetes de expresión que se utiliza para transformar el material vegetal, en tanto el "ADN flanqueador" puede ser el ADN genómico naturalmente presente en un organismo, tal como una planta, o el ADN extraño (heterólogo) introducido mediante un proceso de transformación que es extraño para la molécula de ADN del inserto original, por ejemplo fragmentos asociados con el evento de transformación. Una "región flanqueadora" o "secuencia flanqueadora" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de al menos veinte (20) pares de bases, preferentemente al menos cincuenta (50) pares de bases y hasta cinco mil (5000) pares de bases que está ubicada ya sea inmediatamente 5' de y contiguo de o inmediatamente 3' de y contiguo de la molécula de ADN del inserto extraño original. Los procedimientos de transformación que conducen a una integración aleatoria del ADN extraño dará como resultado transformantes que contienen diferentes regiones flanqueadoras características y únicas para cada transformante. Cuando se introduce ADN recombinante en una planta por medio de un cruzamiento tradicional, las regiones flanqueadoras del mismo generalmente no cambian. Los transformantes también van a contener uniones únicas entre una extensión del ADN heterólogo del inserto y el ADN genómico o dos (2) extensiones de ADN genómico o dos (2)
extensiones de ADN heterologo. Una "unión" es el punto donde se unen dos (2) fragmentos específicos de ADN. Por ejemplo, existe una unión donde el ADN del inserto se une al ADN flanqueador. También existe un punto de unión en un organismo transformado donde unen dos (2) fragmentos de ADN se unen entre sí de una manera que está modificada con respecto a la forma encontrada en el organismo nativo. El "ADN de unión" se refiere al ADN que comprende un punto de unión. Tal como se utiliza en la presente, el término "heterologo" con referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico originario de una especie extraña o si de la misma especie, está modificado sustancialmente con respecto a su forma nativa en cuando a composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser de una especie diferente a la especie de la cual derivó la secuencia de nucleótidos o si es de la misma especie, el promotor no está ligado operativamente de forma natural a la secuencia de nucleótidos. La proteína heteróloga puede ser originaria de una especie extraña o si es de la misma especie, está sustancialmente modificada con respecto a su forma original por intervención humana deliberada . Las "secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótidos ubicadas 5' (secuencias no
codificadoras 5' ) , dentro o 3' (secuencias no codificadoras 3' ) de una secuencia de codificación y que afectan la transcripción, procesamiento de ARN o estabilidad o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias directrices de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . Un "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos que tiene la capacidad de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, la secuencia de codificación está ubicada 3' con respecto a la secuencia promotora. La secuencia del promotor consta de elementos hacia el extremo 5' proximales y más distales, denominándose potenciadores a estos últimos elementos. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para aumentar el nivel o la especificidad de tejidos de un promotor. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de distintos promotores presentes en la naturaleza o bien, pueden hasta comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Los especialistas en el arte comprenderán que distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en
diferentes tejidos o tipos celulares, en diferentes etapas del desarrollo o como respuesta a distintas condiciones ambientales. Los promotores que permiten que un fragmento de ácido nucleico se exprese en la mayor parte de los tipos celulares en cualquier momento se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Continuamente se están descubriendo nuevos promotores de diversos tipos que son de utilidad en células vegetales; se pueden consultar numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg (1989) Biochemistry de Plants 15: 1-82. Se considera además que dado que en la mayoría de los casos no se han definido por completo los límites exactos de las secuencias reguladoras, los fragmentos de ácidos nucleicos de diferentes longitudes pueden presentar una actividad promotora idéntica. La "secuencia directriz de la traducción" se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia directriz de la traducción está presente en el ARNm completamente procesado hacia el extremo 5' de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia directriz de la traducción puede afectar uno o varios de los siguientes: procesamiento del transcripto primario en ARNm, estabilidad del ARNm y la eficiencia de traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias directrices de la traducción (Turner y Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3: 225-236).
Las "secuencias no codificadoras 3'" se refieren a secuencias de nucleótidos ubicadas hacia el extremo 3' de la secuencia de codificación e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente por afectar la adición de extensiones de ácido poliadenilico al extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificadoras 3' se puede consultar, por ejemplo, en Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1: 671-680. Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuestos en un orden específico determinado por la secuencia de codificación del polinucleótido que codifica dicho polipéptido. Una construcción de ADN es un ensamblaje de moléculas de ADN ligadas entre sí que proveen uno o más casetes de expresión. La construcción de ADN puede ser un plásmido capaz de autorreplicarse en una célula bacteriana y contiene numerosos sitios de enzimas endonucleasas de restricción que son de utilidad para introducir moléculas de ADN que proporcionen elementos genéticos funcionales, es decir, promotores, intrones, directrices, secuencias de codificación, regiones de terminación 3', entre otros; o la construcción de ADN puede ser un ensamblaje lineal de
moléculas de ADN, tal como un cásete de expresión. El cásete de expresión contenido en la construcción de ADN comprende los elementos genéticos necesarios para permitir la transcripción de un ARN mensajero. El cásete de expresión puede ser diseñado para expresarse en células procariotas o células eucariotas. Los casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención están diseñados para expresarse en células vegetales. Las moléculas de ADN de las realizaciones de la invención se proveen en casetes de expresión para su expresión en el organismo de interés. El cásete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operativamente a la secuencia de codificación. El término "ligado operativamente" significa que las secuencias de ácido nucleico ligadas son contiguas y cuando fuera necesario unir las regiones codificadoras de dos proteínas, son contiguas y en el mismo marco de lectura. El término ligado operativamente hace referencia a una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia del promotor inicia e interviene en la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a dicha segunda secuencia. El cásete puede contener además al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Como alternativa, se puede proveer uno o más genes adicionales en múltiples casetes de expresión o múltiples construcciones de ADN.
El cásete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5' a 3' : una región de inicio de la transcripción y traducción, una región de codificación y una región de terminación de la transcripción y traducción funcional en el organismo que sirve de huésped. La región de inicio de la transcripción (es decir, el promotor) puede ser nativa o análoga, o extraña o heteróloga para el organismo huésped. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o, como alternativa, una secuencia sintética. Los casetes de expresión pueden contener además secuencias directrices 5' en la construcción del cásete de expresión. Dichas secuencias directrices pueden actuar aumentando la traducción. Se debe tener en cuenta que, tal como se utiliza en la presente, el término "transgénicos" incluye cualquier célula, linea celular, callos, tejido, parte de planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heterólogo incluyendo los transgénicos alterados inicialmente, asi como los creados por cruzamientos sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", tal como se utiliza en la presente, no abarca la alteración del genoma (cromosómica o extracromosómica) por métodos de cria de plantas convencionales o por eventos naturales, tal como cruzamiento-fertilización aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no
recombinante o mutación espontánea. Un "evento" transgénico se produce por transformación de células vegetales con una o varias construcciones heterólogas de ADN, incluyendo un cásete de expresión con un ácido nucleico que comprende un transgen de interés, la regeneración de la población de plantas que es el resultado de la inserción del transgen en el genoma de la planta y selección de una planta particular caracterizada por la inserción del mismo en una ubicación particular del genoma. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgen. A nivel genético, un evento forma parte de arreglo genético de una planta. El término "evento" también se refiere a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye el ADN heterólogo. Aún después de un retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueador del progenitor transformado están presentes en la progenie del cruzamiento en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también se refiere al ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y la secuencia flanqueadora inmediatamente adyacente del ADN insertado que se espera transferir a la progenie que recibirá el ADN insertado, incluyendo el transgen de interés como resultado del cruzamiento sexual de una linea progenitora que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante
original y la progenie resultante del autocruzamiento) con una linea progenitora que no contiene al ADN insertado. La planta de maíz DAS-59122-7 resistente a insectos se puede criar con un primer cruzamiento sexual de una primera planta de maíz progenitora que consiste de una planta de maíz cultivada a partir de la planta de maíz DAS-59122-7 transgénica y la progenie de la misma, derivada de la transformación con los casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención que confieren resistencia a insectos y una segunda planta de maíz progenitora sin resistencia a insectos con lo cual se produce una pluralidad de primeras plantas de progenie; y luego seleccionar una primera planta de progenie que sea resistente a insectos; y autocruzar la primera planta de progenie, con lo cual se produce una pluralidad de segundas plantas de progenie; y luego seleccionar entre las segundas plantas de progenie una planta resistente a insectos. Estos pasos pueden incluir además la retrocruza de la primera planta de progenie resistente a insectos o la segunda planta de progenie resistente a insectos con la segunda planta de maíz progenitora o una tercera planta de maíz progenitora, con lo cual se produce una planta de maíz que es resistente a insectos . Tal como se utiliza en la presente, el término "planta" hace referencia a plantas completas, órganos vegetales (por
ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales y progenie de los mismos. Las partes de plantas transgénicas que se consideran dentro del alcance de la invención comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones, así como flores, tallos, frutas, hojas y raíces originarias de las plantas transgénicas o la progenie de las mismas transformadas previamente con una molécula de ADN de la invención y que por ello consisten, al menos en parte, de células transgénicas, también constituyen una realización de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente, el término "célula vegetal" incluye, por ejemplo, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas , tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas que se puede usar en los métodos de la invención es en general tan amplia como la clase de plantas superiores que sea pasible de las técnicas de transformación, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas . El término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácidos nucleicos a un genoma de un organismo huésped, dando como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácidos nucleicos transformados se denominan "organismos transgénicos" . Los ejemplos de métodos de
transformación de plantas y células vegetales incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277) y tecnología de transformación con partículas aceleradas o "pistola de genes" (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73; Patente de EE.UU. N°: 4.945.050, incorporada en este documento a modo de referencia) . Más adelante se describen otros métodos de transformación. Por consiguiente, los polinucleótidos aislados de la invención se pueden incorporar en construcciones recombinantes , típicamente construcciones de ADN, capaces de introducirse y de replicarse en una célula huésped. Dicha construcción puede ser un vector que incluye un sistema de replicación y secuencias capaces de transcribir y traducir una secuencia que codifica un polipéptido en una célula huésped dada. Se han descrito numerosos vectores adecuados para una transfección estable de células vegetales o para establecer plantas transgénicas , por ejemplo, Pouwels et al., (1985; Sup. 1987) Cloning vectors: A Laboratory Manual, Weissbach y eissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, Nueva York); y Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Típicamente, los vectores de expresión vegetal incluyen por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras 5' y 3'
y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión vegetal también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla una expresión inducible o constitutiva, regulado por el entorno o por el desarrollo o especifica de células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación . También se debe tener en cuenta que es posible asimismo cruzar dos plantas transgénicas diferentes para producir una descendencia que contenga dos genes exógenos, agregados de segregación independiente. La autocruza de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes exógenos introducidos. También se contempla la retrocruza con una planta progenitora y el cruzamiento con una planta no transgénica, asi como la propagación vegetativa. La descripciones de otros métodos de cria que son de uso común para diferentes rasgos y cultivos se pueden consultar en cualquiera de las numerosas referencias, por ejemplo, Fehr, en ethods of Breeding for Cultivar Development, Wilcos J. ed., American Society de Agronomy, Madison is . (1987) . Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual se ha unido una marca detectable convencional o una molécula
informante, por ejemplo, un isótopo radioactivo, un ligando, un agente quimioluminescente o una enzima. Dicha sonda es complementaria de una cadena del ácido nucleico de interés, en el caso de la presente invención, de una cadena de ADN genómico del evento de maíz DAS-59122-7, ya sea de una planta de maíz o de una muestra que incluya el ADN del evento. Las sondas acordes con la presente invención no sólo incluyen ácido desoxirribonucleico o ribonucleico sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente con la secuencia de ADN de interés y que se pueden emplear para detectar la presencia de dicha secuencia de ADN de interés. Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados que se alinean en frío con una cadena de ADN complementaria de interés por medio de hibridación del ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN de interés, luego se extienden a lo largo de la cadena de ADN de interés por acción de una polimerasa por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de la invención están destinados a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos. La "PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa" es una técnica usada para la amplificación de segmentos específicos de ADN (véase, las
Patentes de EE.UU. N° : 4.683.195 y 4.800.159; incorporadas en este documento a modo de referencia) . Las sondas y los cebadores son de suficiente longitud de nucleótidos como para unirse a la secuencia de ADN de interés específicamente, en las condiciones de hibridación o las condiciones de reacción determinadas por el operador. Esta longitud puede ser cualquier longitud que sea suficiente para ser de utilidad en el método de detección de elección. En general, se utilizan once (11) nucleótidos o más de longitud, preferentemente dieciocho (18) nucleótidos o más y con mayor preferencia veintidós (22) nucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores se hibridizan específicamente con una secuencia blanco bajo condiciones de hibridación de gran severidad. Las sondas y los cebadores acordes con realizaciones de la presente invención pueden presentar una similitud de secuencia de ADN completa con los nucleótidos contiguos de la secuencia de interés, si bien es posible diseñar sondas que difieran de la secuencia de ADN de interés y que retengan la capacidad de hibridizarse con la secuencia de ADN de interés mediante métodos convencionales. Se pueden usar sondas como cebadores, pero en general están diseñadas para unirse al ADN o ARN de interés y no para un proceso de amplificación . Se pueden usar cebadores específicos para amplificar un fragmento de integración con el fin de producir
un amplicón que se pueda usar como una "sonda específica" para identificar el evento DAS-59122-7 en muestras biológicas. Cuando la sonda se hibridiza con los ácidos nucleicos de una muestra biológica bajo condiciones que permitan la unión de la sonda con la muestra, esta unión puede ser detectada y por consiguiente puede ser indicativa de la presencia del evento DAS-59122-7 en la muestra biológica. La identificación de la unión de la sonda está descrita en el arte. En una realización de la invención, la sonda específica es una secuencia que, bajo condiciones óptimas, se hibridiza específicamente con una región dentro de la región flanqueadora 5' o 3' del evento y también comprende una parte del ADN extraño contigua de la misma. La sonda específica puede comprender una secuencia al menos un 80%, entre un 80 y 85%, entre un 85 y 90%, entre 90 y 95% y entre 95 y 100% idéntica (o complementaria) de una región específica del evento. Los métodos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (de aquí en adelante, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (de aquí en adelante, "Ausubel et al., 1992"); e
Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de cebadores para PCR pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, utilizando programas para computadora destinados a tal fin, tal como el programa PCR Primer Analysis Tool en Vector NTI versión 6 (Informax Inc., Bethesda MD) ; PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison, WI); y Primer (Versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Además, la secuencia puede ser escaneada visualmente y los cebadores pueden ser identificados manualmente usando los lineamientos conocidos por los especialistas en el arte. Un "conjunto de elementos", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un juego de reactivos destinados a llevar a cabo las realizaciones de métodos de la invención, más particularmente, la identificación del evento DAS-59122-7 en muestras biológicas. El conjunto de elementos de la invención se puede usar, y los componentes se pueden ajustar específicamente, para un control de calidad (por ejemplo, la pureza de lotes de semillas), la detección del evento DAS-59122-7 en un material vegetal o en un material que comprende o que deriva del material vegetal, tal como por ejemplo productos forrajeros o alimentarios. Un "material vegetal", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un material que se obtiene o deriva de una planta.
Los cebadores y las sondas basados en el ADN flanqueador y las secuencias insertadas que se describen en este documento se pueden utilizar para confirmar (y, si fuera necesario, para corregir) las secuencias descriptas mediante métodos convencionales, por ejemplo, por reclonación y secuenciación de dichas secuencias. Las sondas y los cebadores de ácidos nucleicos de la presente invención se hibridizan bajo condiciones estrictas con la secuencia de ADN de interés. Se puede utilizar cualquier método de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos convencional para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o los fragmentos de los mismos tienen la capacidad de hibridizarse específicamente con otras moléculas de ácido nucleico bajo determinadas circunstancias. Tal como se utiliza aquí, se dice que dos moléculas de ácidos nucleicos tienen la capacidad de hibridizarse específicamente entre si, si las dos moléculas pueden formar una estructura de ácido nucleico de cadena doble, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es
"complementaria" de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Tal como se utiliza aquí, se considera que las moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementaria de un nucleótido de la otra.
Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si se pueden hibridizar entre sí ' con suficiente estabilidad como para permanecer alineadas en frío entre sí bajo por lo menos condiciones de "severidad baja" convencionales. De manera similar, se considera que las moléculas son "complementarias" si se hibridizan entre sí con suficiente estabilidad como para permanecer alineadas en frío entre sí bajo condiciones de "severidad alta" convencionales. Las condiciones de severidad convencionales fueron descriptas por Sambrook et al., 1989, y por Haymes et al., En: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985); por ello, son posibles los desviaciones de la complementariedad completa, siempre que dichos desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de cadena doble. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda solamente es necesario que sea suficientemente complementaria en cuanto a secuencia como para formar una estructura de cadena doble estable bajo las concentraciones particulares de solvente y sales empleadas. En las reacciones de hibridación, la especi icidad es típicamente una función de los lavados de posthibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. El punto de fusión térmica (Tm) es la temperatura (bajo una fuerza iónica
y pH definidos) a la cual el 50% de una secuencia complementaria de interés se hibridiza con una sonda perfectamente coincidente. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984), Anal. Biochem. , 138: 267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/1; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de falta de coincidencia; por lo tanto, es posible ajusfar la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede disminuir en 10 °C. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a l, 2, 3 ó 4 °C menos que la Tm; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10 °C menos que la Tm; las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20 °C menos
que la Tm. Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los especialistas comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se puede consultar una guia muy extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology—Hybridization con Nucleic Acids Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, Nueva York) ; y Ausubel et al., eds . (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capitulo 2 (Greene Publishing y iley-Interscience , Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) . Tal como se utiliza en la presente, una secuencia sustancialmente homologa es una molécula de ácido nucleico que se hibridizará específicamente con el complemento de la molécula de ácido nucleico con el que está siendo comparado bajo condiciones de gran severidad. Las condiciones de severidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, cloruro de sodio /citrato de sodio 6X (SSC) a 45
°C aproximadamente, seguido de un lavado de SSC 2X a 50 °C, son conocidas para los especialistas en el arte o se pueden consultar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). 6.3.1-6.3.6. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es menor que aproximadamente 1,5 M del ión de Na, típicamente entre 0,01 y 1,0 M aproximadamente de concentración del ión de Na (u otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es de al menos 30 °C aproximadamente para sondas cortas (por ejemplo, entre 10 y 50 nucleotidos) y al menos 60 °C aproximadamente para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleotidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M / citrato trisódico 0,3 M) a 50-55 °C. Los ejemplos condiciones de severidad moderada incluyen hibridación en formamida 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,5X a IX a 55-60 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen hibridación en formamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C. Un ácido nucleico de la invención puede hibridizarse específicamente con una o varias de las
moléculas de ácido nucleico únicas para el evento DAS-59122-7, o complementos del mismo o fragmentos de cualquiera de ellos bajo condiciones moderadamente severas. Los métodos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en el arte. Por consiguiente, la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias cualesquiera se puede realizar usando un algoritmo matemático. Los ejemplos preferidos y no limitantes de dichos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17, el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math, 2: 482; el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48: 443-453; el método búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87: 2264, modificado como se describe en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5877. Las implementaciones computarizadas de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, pero sin limitaciones: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California) ; el programa ALIGN (Versión 2.0); el programa ALIGN PLUS (versión 3.0, copyright 1997); y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el
Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121, EE.UU.). Las alineaciones que utilizan estos programas se pueden realizar usando los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito en Higgins y
Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994). Los programas ALIGN y ALIGN PLUS se basan en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Los programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. La familia de programas BLAST que se puede usar para las búsquedas de similitud en bases de datos incluye: BLASTN para consultar secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos; BLASTX para la consulta de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de proteínas; BLASTP para la consulta de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de proteínas; TBLASTN para la consulta de secuencias de proteínas en la base de datos de secuencias de nucleótidos; y TBLASTX para las consultas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds . , Greene
Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York (1995). La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección visual. Con el fin de obtener alineaciones con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, se puede emplear Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para efectuar una búsqueda iterada que permite detectar relaciones distantes entre las moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo}, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) . Véase www . ncbi . hlm. nih . go . Tal como se utiliza en la presente, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos se refieren a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia máxima en la ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se utiliza con referencia a proteínas se comprenderá que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos aminoacídicos son
sustituidos por otros residuos aminoacidicos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por ello no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajusfar hacia arriba con el fin de corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras poseen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para efectuar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en el arte. Típicamente, involucra la calificación de una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de completa, con lo cual aumenta el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una calificación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una calificación de cero, la sustitución conservadora recibe una calificación entre cero y 1. La calificación de sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE ( Intelligenetics , Mountain View. California). Tal como se utiliza en la presente, el "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado por comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, donde la porción de una secuencia
de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con una secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales aparece la base de ácido o residuo aminoacidico en ambas secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo la cantidad de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.- Con respecto a la amplificación de la secuencia del ácido nucleico blanco (por ejemplo por PCR) con un par de cebadores de amplificación determinados, las "condiciones severas" son aquellas condiciones que permiten que el par de cebadores solamente se hibridice con la secuencia del ácido nucleico blanco con el cual se uniría un cebador que tiene la correspondiente secuencia de tipo salvaje (o el complemento de la misma) para producir preferentemente un producto de amplificación único, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de ADN. El término "específico para (una secuencia de interés o blanco) " indica que la sonda o el cebador se hibridiza bajo condiciones de hibridación estrictas con la
secuencia blanco solamente en una muestra que comprende dicha secuencia blanco. Tal como se utiliza en la presente, el "ADN amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de la amplificación del ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico blanco que forma parte de una templado de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de maíz que es el resultado de un cruzamiento sexual contiene el evento transgénico del ADN genómico transgénico de una planta de maíz de la invención, se puede someter el ADN extraído de una muestra de tejido de la planta de maíz a un método de amplificación de ácido nucleico usando un par de cebadores de ADN que incluye un primer cebador derivado de la secuencia flanqueadora en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN insertado heterólogo y un segundo cebador derivado del ADN insertado heterólogo para producir un amplicón que es diagnóstico de la presencia del evento de ADN. Como alternativa, el segundo cebador puede derivar de la secuencia flanqueadora. El amplicón es de una longitud y tiene una secuencia que también es diagnóstico del evento. El amplicón puede variar en su longitud desde la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de bases de nucleótidos hasta cualquier longitud de amplicón que se pueda producir con un protocolo de amplificación de ADN. Como alternativa, el par de cebadores puede derivar de las
secuencias flanqueadoras a ambos lados del ADN insertado para producir un amplicón que incluya toda la secuencia de nucleótidos de la construcción de expresión PHI17662A asi como la secuencia que flanquea al inserto transgénico, véase la FIG. 1 (SEQ ID N°:23), de un tamaño de aproximadamente 12 (doce) Kb. Uno de los miembros del par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta puede estar ubicado a una distancia de la secuencia de ADN insertado, y esta distancia puede variar en un rango de un nucleótido hasta los limites de la reacción de amplificación o de aproximadamente veinte mil pares de bases nucleotidicas . El uso del término "amplicón" excluye específicamente los dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica del ADN. La amplificación del ácido nucleico se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en el arte, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . En el arte se conoce una gran variedad de métodos de amplificación y se describen, entre otros, en las Patentes de EE.UU. N°: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Los métodos de amplificación por PCR fueron desarrollados para amplificar hasta 22 kb de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN de bacteriófagos (Cheng et al.,
Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91: 5695-5699, 1994). Estos métodos, asi como otros métodos conocidos en el arte de amplificación de ADN, se pueden emplear en la práctica de las realizaciones de la presente invención. Se considera que puede ser necesario ajustar numerosos parámetros en un protocolo de PCR especifico con el fin de cumplir con las condiciones de laboratorio especificas y pueden ser modificados ligeramente y aún obtener resultados similares. Estos ajustes serán evidentes para el especialista en el arte. El amplicón producido con estos métodos puede ser detectado mediante una pluralidad de técnicas incluyendo, por ejemplo, el Análisis de Bits Genéticos (Nikiforov, et al., Nucleic Acid Res. 22: 4167-4175, 1994) por el cual se diseña un oligonucleótido de ADN que se superpone tanto a la secuencia de ADN genómico flanqueador adyacente como a la secuencia de ADN insertado. El oligonucleótido es inmovilizado en las cavidades de una placa de microcavidades. Después de la PCR de la región de interés (utilizando un cebador para la secuencia insertada y uno para la secuencia genómica flanqueadora adyacente) , se puede hibridizar un producto de la PCR de cadena simple con el oligonucleótido inmovilizado y puede servir como templado para una reacción de extensión de una sola base utilizando una ADN polimerasa y ddNTP marcados específicos para la siguiente base esperada.
La lectura se puede basar en fluorescencia o en un ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia del inserto/flanqueadora debida a una amplificación, hibridación y extensión de una sola base exitosas. Otro método es la técnica de pirosecuenciación descripta por inge (Innov. Phrma. Tech. 00: 18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que se superpone a la unión del ADN genómico adyacente y del ADN de unión del inserto. El oligonucleótido se hibridiza con un producto de PCR de cadena simple de la región de interés (un cebador para la secuencia insertada y uno para la secuencia genómica flanqueadora) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Los DNTP se agregan individualmente y la incorporación da como resultado una señal de luz que se mide. La señal de luz indica la presencia de la secuencia del inserto transgénico/flanqueadora debido a una amplificación, hibridación y extensión de bases únicas o múltiples . La Polarización de Fluorescencia descripta por
Chen, et al. (Genome Res. 9: 492-498, 1999) también es un método que se puede utilizar para detectar el amplicón de la invención. El uso de este método permite diseñar un oligonucleótido que se superpone a la unión del ADN genómico flanqueador e insertado. El oligonucleótido se hibridiza con
un producto de PCR de cadena simple de la región de interés (un cebador para la secuencia del ADN insertado y uno para el ADN genómico flanqueador) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de una sola base da como resultado la incorporación del ddNTP. Dicha incorporación se puede medir como un cambio en la polarización usando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia del inserto transgénico/flanqueadora debido a una amplificación, hibridación y extensión de una sola base exitosas. El Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN y está muy bien explicado en las instrucciones provistas por el proveedor. Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que se superpone a la unión entre el ADN genómico flanqueador y del inserto. La sonda FRET y los cebadores para PCR (un cebador para la secuencia del ADN insertado y uno para la secuencia genómica flanqueadora) se ciclan en presencia de una ADN polimerasa termoestable y los dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado la hidrólisis o "clivaje" y la liberación del grupo fluorescente del grupo neutralizante sobre la sonda FRET. Una señal fluorescente es indicadora de la presencia de la secuencia flanqueadora/inserto transgénico debido a una amplificación e hibridación exitosas.
Se ha descrito el uso de Molecular Beacons [Marcadores Moleculares] para la detección de secuencias en Tyangi, et al. (Nature Biotech. 14: 303-109, 1996). Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que se superpone a la unión del ADN genómico flanqueador y del inserto. La estructura única de la sonda FRET permite que contenga una estructura secundaria que conserva los grupos fluorescentes y neutralizantes próximos entre si. La sonda FRET y los cebadores para PCR (un cebador para la secuencia de ADN del inserto y el otro para la secuencia genómica flanqueadora ) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y los dNTP. Después de una amplificación por PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia blanco da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los grupos fluorescentes y neutralizantes. Se obtiene una señal fluorescente. La señal fluorescente es indicadora de la presencia de la secuencia flanqueadora/inserto transgénico debida a una amplificación e hibridación exitosas. Una reacción de hibridación con una sonda especifica para la secuencia contenida en el amplicón constituye otro método para detectar el amplicón producido por la reacción de PCR. Las realizaciones de la presente invención se definen además en los siguientes ejemplos. Se debe tener en
cuenta que estos ejemplos solamente se ofrecen a modo ilustrativo. A partir de la descripción anterior y estos ejemplos, el especialista en el arte puede comprender las características esenciales de esta invención y sin apartarse del espíritu y alcance de las mismas, puede efectuar distintos cambios y modificaciones a las realizaciones de la invención con el fin de adaptarla a diversos usos y condiciones. Por consiguiente, las diversas modificaciones de las realizaciones de la invención, además de las que se muestran y describen aquí, serán evidentes para el especialista en el arte a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. El contenido de cada referencia citada en la presente es incorporado por completo en este documento a modo de referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1. Transformación de maiz por transformación con Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas que contienen a los genes Cry34Abl y Cry35Abl (Cry34/35Abl) Para transformar el tejido embrionario de maíz se usó una molécula de ADN de 7,4 Kb aproximadamente, denominada PHI17662A (SEQ ID N°: 24), que incluye un primer cásete de expresión transgénico que comprende una molécula de ADN que incluye al promotor, un exón no traducido 5' y el primer
intrón del gen de la ubiquitina (Ubi-1) de maíz (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 y Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) ligado operativamente a una molécula de ADN que codifica una d-endotoxina de B.t. identificada como Cry34Abl (Patentes de EE.UU. N° : 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593) ligada operativamente a una molécula de ADN que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de papa (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122) . El segundo cásete de expresión transgénico de la construcción de ADN comprende una molécula de ADN que codifica al promotor de peroxidasa de trigo (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174) ligado operativamente a una molécula de ADN que codifica una d-endotoxina de B.t. identificada como Cry35Abl (Patentes de EE.UU. N° : 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593) ligada operativamente a una molécula de ADN que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de papa (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122) . El tercer cásete de expresión transgénico de la construcción de ADN comprende una molécula de ADN del promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell J.T. et al. (1985) Nature 313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) ligado operativamente a una molécula de ADN que codifica un gen de fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70: 25-37) ligado operativamente a una molécula
de ADN que comprende un terminador de la transcripción 3' del 35S (CaMV) (véase Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) . Se obtuvieron plantas de maíz Abl Cry34/35 B.t. por transformación con Agrobacterium, empleándose el método de Zhao (Patente de EE.UU. N° : 5.981.840, y la publicación de patente PCT W098/32326; cuyos contenidos se incorpora en este documento a modo de referencia) . Brevemente, se aislaron embriones inmaduros de maíz y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias pudieron transferir el ADN PHI17662 (SEQ ID N°:24) a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (paso 1: el paso de infección). Específicamente, en este paso se sumergieron los embriones inmaduros en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se co-cultivaron por un tiempo con el Agrobacterium (paso 2: el paso de cocultivo) . Específicamente, los embriones inmaduros se cultivaron sobre un medio sólido después del paso de infección. Después de este período de co-cultivo se aplicó un paso de "reposo". En este paso de reposo, los embriones se incubaron en la presencia de al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes vegetales (paso 3: paso de reposo). En particular, los embriones inmaduros se cultivan sobre un
medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para eliminar el Agrobacterium y para proporcionales una fase de reposo a las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados fueron cultivados sobre un medio que contiene un agente selectivo y se recuperaron los callos transformados en crecimiento (paso 4: el paso de selección) . Específicamente, los embriones inmaduros se cultivaron sobre un medio sólido con un agente selectivo dando como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. Después, los callos se regeneraron en plantas (paso 5: el paso de regeneración) y, específicamente, los callos cultivados sobre medio selectivo se cultivaron sobre medio sólido para regenerar las plantas. Durante el cultivo, los embriones individuales se mantuvieron físicamente separados y la mayoría de los explantes murieron sobre el medio selectivo. Aquellos embriones que sobrevivieron y produjeron tejido de callo saludable, resistente a glufosinato recibieron códigos de identificación únicos que representaban eventos de transformación putativos y continuamente eran transferidos a medio de selección fresco. Se regeneraron plantas a partir del tejido derivado de cada evento único y luego fueron transferidas al invernadero. Se tomaron muestras de hoja para el análisis molecular con el fin de verificar la presencia del transgen por PCR y para confirmar
la expresión de la proteina Cry34/35Abl por ELISA. A continuación, las plantas fueron sometidas a un bioensayo con plantas completas usando gusanos de la raíz de maíz del oeste. Las plantas positivas fueron cruzadas con lineas endogámicas para obtener semillas de las plantas transformadas iniciales. Se evaluaron numerosas lineas en el campo. El evento DAS-59122-7 se seleccionó entre una población de eventos transgénicos independientes basado en una combinación de características superior, incluyendo resistencia a insectos y rendimiento agronómico. Ejemplo 2. Identificación de la linea de maiz DAS-59122-7 Cry34/35Abl Bacillus thuringiensis Se evaluaron semillas del evento DASD59122D7. Las semillas T1S2 representan la transformación en el antecedente Hi-II, seguido de un cruzamiento con la línea endogámica PH09B y dos rondas de autocruzamiento . Todas las semillas se obtuvieron de Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA) . La caracterización primaria se efectuó con tejido vegetal foliar durante el estudio confirmando la actividad de la fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) mediante pintado de las hojas con el herbicida y expresión de Cry34Abl usando dispositivos de flujo lateral. En este estudio las sustancias control se definieron como semillas no modificadas representativas del antecedente de la sustancia de prueba. Se usaron semillas
control con antecedentes Hi-II y PH09B como controles negativos. Estas semillas no modificadas no contienen las unidades de transcripción para los genes cry34Abl, cry35Abl y pat. Todas las semillas se obtuvieron de Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA) . Se utilizaron muestras de ADN de dos eventos Cry34/35Abl B.t. adicionales, el evento DAS-45214-4 y el evento DAS-45216-6, como controles negativos para un análisis por PCR especifico del evento. Los dos eventos se produjeron mediante transformación con Agrobacterium usando el mismo vector empleado para producir el evento DAS-59122-7 y por ello contenia las unidades de transcripción vegetales para los genes cry34Abl, cry35Abl y pat. Sin embargo, los sitios de inserción de ADN-T en los eventos DAS-45214-4 y DAS-45216-6, incluyendo el ADN genómico de las regiones de los bordes, eran diferentes del correspondiente en el evento DAS-59122-7. Se aislaron muestras de ADN del evento DAS-45214-4 y del evento DAS-45216-6 y se caracterizaron mediante análisis de transferencia Southern (No se muestran los datos.) Se sembraron semillas de maíz para el evento DAS- 59122-7 y semillas control no modificadas (Hi-II y PH09B) en cámaras de crecimiento en la estación experimental DuPont (Wilmington, DE) para producir cantidades suficientes de plantas para analizar el ADN. Para la caracterización del evento DAS-59122-7, se sembraron diez (10) semillas T1S2.
También se sembraron diez (10) semillas para cada linea control no modificada. Se sembró una (1) semilla por maceta, y la maceta se identificaba inequívocamente. Las condiciones de siembra y cultivo eran apropiadas para el crecimiento de plantas saludables, incluyendo la regulación de luz y agua. Se recolectaron muestras de hoja para cada una de las plantas control y del evento DAS-59122-7. Para cada muestra, se recolectó suficiente material foliar por encima del punto de crecimiento y se colocó en una bolsa para muestras pre-rotulada . Las muestras se colocaron sobre hielo seco y luego fueron transferidas a un congelador de muy baja temperatura después de la recolección. Todas las muestras se mantuvieron congeladas hasta el procesamiento. Todas las muestras de hojas eran rotuladas inequívocamente con el identificador de la planta y la fecha de la cosecha. Para confirmar la expresión de la proteína Cry34Abl en el evento DAS-59122-7 y la ausencia de expresión en los controles, se recolectaron muestras de hoja de todas las plantas del evento DAS-59122-7 y control, y se rastreó en las mismas la proteína transgénica usando dispositivos de flujo lateral específicos para Cry34Abl (Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE). Se tomaron muestras de las hojas de cada planta con sacabocados y se molieron en una solución amortiguadora salina de fosfato con Tween 20 para extraer la proteína en crudo. Se sumergió un dispositivo con tiras en
el extracto para determinar la presencia o ausencia de la proteina Cry34Abl. Los resultados del inmunoensayo se utilizaron para confirmar la identidad de la sustancia de prueba en las plantas antes del análisis molecular según se muestra en la Tabla 1. Para confirmar la expresión de fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) en plantas del evento DAS-59122-7, se pintaron las hojas con herbicida. Todas las plantas usadas en este estudio fueron pintadas en las hojas para confirmar la identidad de la planta. Las plantas fueron evaluadas antes de la etapa de crecimiento Rl. Los ensayos se condujeron utilizando un procedimiento estándar conocido en el arte para el pintado de las hojas con herbicida con el fin de identificar de las plantas transgénicas que expresan PAT. Específicamente, se trató una porción de una hoja de cada planta con una solución al 2% aproximadamente del herbicida glufosinato, Bastaá (Bayer CropScience) en agua y se comprobó visualmente la presencia de tejido marrón o necrótico en el área pintada de las hojas 4-12 días después de la aplicación. Se registraron los resultados para cada planta y se usaron para determinar la expresión de PAT en cada planta de prueba y se muestran en la Tabla 1. Tal como se muestra en la Tabla 1, de las diez (10) plantas evaluadas por la generación del evento DAS-59122-7 T1S2, seis (6) plantas expresaron tanto Cry34Abl como PAT, en tanto cuatro (4) plantas no expresaron
ninguna de las proteínas. Todos los controles no modificados dieron negativo para ambos ensayos CryAbl y PAT (no se muestran los datos) . Tabla 1 : Expresión de las proteínas Cry3 Abl y PAT y datos de hibridación Southern para el evento DAS-59122-7 Cry34/35Abl B. t.
La expresión Cry34Abl positiva indica que hubo detección de expresión de la proteina determinada con el dispositivo de flujo lateral basado en inmunoensayos para detectar la proteina Cry34Abl. La expresión negativa indica que no hubo detección de la proteina Cry34Abl. La expresión PAT positiva indica que las plantas eran tolerantes al tratamiento con el herbicida y negativa indica que las plantas eran sensibles al herbicida . 2' + indica que hubo señal de hibridación con la transferencia Southern; - indica que no hubo señal de hibridación con la transferencia Southern. La sonda del gen cry34Abl se hibridizó con el fragmento de ADN-T interno esperado de 1.915 kb, la sonda del gen cry35Abl se hibridizó con el fragmento de ADN-T interno esperado de 2.607 kb y la sonda del gen pat se hibridizó con un fragmento del borde de 3,4 kb consistente con una sola inserción de ADN-T intacto determinada mediante análisis por transferencia Southern. Ejemplo 3. Análisis por transferencia Southern de la linea de maíz DAS-59122-7 con Cry34/35Abl de Bacill s thuringiensis Se molieron muestras de un gramo de hojas bajo nitrógeno liquido y se aisló el ADN genómico usando el conjunto de elementos para plantas DNeasy® (Qiagen, Valencia, CA) o usando el procedimiento con solución amortiguadora de extracción estándar de urea. Después de la extracción, el ADN se visualizó sobre un gel de agarosa para determinar la
calidad del mismo y se cuantificó utilizando análisis de espectrofluorometria con el reactivo Pico Green® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . Se usó el estándar de ADN de 1 Kb (Invitrogen, Carlsbad, CA) para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN sobre los geles de agarosa. El ADN genómico aislado de las plantas con el evento DAS-59122-7 se digirió con Neo I y se separó por electroforesis, se transfirió a membranas de nylon y se hibridizó con las sondas de los genes cry34Abl, cry35Abl y pat usando los procedimientos estándar conocidos en el arte. Los transferidos fueron expuestos a una película para rayos X por uno o más períodos de tiempo para detectar los fragmentos hibridizantes y para visualizar los estándares de peso molecular. La imágenes se capturaron luego digitalmente tomando fotografías de las películas de rayos X y/o por detección con un instrumento Lumi-Imager™ (Roche, Indianápolis , IN) . Se documentaron tamaños de las bandas detectadas para cada sonda. Se utilizó análisis por transferencia Southern como un medio para verificar la presencia de la inserción en las plantas de prueba y confirmar que todas las plantas del evento DAS-59122-7 contenían la misma inserción como se muestra en la Tabla 1. (no se muestran los datos de la transferencia Southern.) El análisis por transferencia Southern indicó que el evento DAS-
59122-7 contenía una sola inserción que consistía de una copia intacta de la región de ADN-T del plásmido PHP17662, en tanto los segregantes nulos, determinados con el análisis de expresión de proteínas no se hibridizaron con las sondas de los genes. Además, las plantas con el evento DAS-59122-7 que expresan las dos proteínas mostraron patrones de hibridación idénticos con las transferencias Southern (no se muestran los datos). Específicamente, la sonda del gen cry34Abl se hibridizó con el fragmento de ADN-T interno esperado de 1.915 kb, la sonda del gen cry35Abl se hibridizó con el fragmento de ADN-T interno esperado de 2.607 kb y la sonda del gen pat gene se hibridizó con un fragmento del borde de 3,4 kb coherente con una sola inserción intacta de ADN-T determinada según los resultados de la transferencia Southern. Ejemplo 4. Secuenciacion del inserto de ADN-T y de la región que flanquea el borde de Cry34/35Abl de Bacillus thuringiensis en la linea de maiz DAS-59122-7 Se clonaron el inserto de ADN-T y las regiones que flanquean los bordes del ADN-T de Cry34/35Abl B.t. del evento DAS59122-7 usando los métodos basados en PCR diagramados en las Figuras 2 y 3. Específicamente, se obtuvieron las secuencias que bordean los extremos 5' y 3' del inserto en el evento DAS-59122-7 usando dos técnicas de desplazamiento por el genoma. El primer método de desplazamiento era esencialmente el método descrito para el conjunto de
elementos Universal Genome Walker (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) y el segundo método se aplicó de acuerdo con el protocolo de splinkerette descrito en Devon et al., (1995) Nucleic Acids Research 23 ( 9) : 1644-1645, con las modificaciones descritas por Stover (2001), U.C. Irvine (comunicación personal) . Brevemente, se digirió ADN genómico con diversas enzimas de restricción (Dra I, EcoR V, Pvu II, Sma I y Stu I para el método Universal Genome Walker y BamH I, EcoR I, Hind III y Xba I para el método splinkerette) y luego se ligó con adaptadores de extremos adhesivos para el método de Genome Walker y con adaptadores específicos de la enzima de restricción usada para el método splinkerette. Los adaptadores para ambos métodos de desplazamiento por el genoma fueron diseñados para impedir la extensión del extremo 3' del adaptador durante la PCR y por ende reducir o eliminar la amplificación no específica. Los fragmentos de ADN genómico ligados a adaptadores se denominaron luego bibliotecas para desplazamiento por el genoma o bibliotecas splinkerette, una biblioteca por cada enzima de restricción. Las bibliotecas se prepararon a partir del ADN genómico aislado de tres plantas individuales T1S2 con el B.t. Cry34/35Abl del evento DAS-59122-7; plantas DAS-59122-7 T1S2 1, DAS-59122-7 T1S2 2 y DAS-59122-7 T1S2 10, y de una planta control Hi-II y una planta control PH09B.
Después de construir las bibliotecas, se completaron las amplificaciones por PCR anidadas con el fin de amplificar la secuencia blanco usando el conjunto de elementos para PCR Advantage™-GC Genomic (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) . La amplificación primaria por PCR empleó un cebador con identidad para el adaptador y un cebador especifico del gen. El cebador del adaptador no amplificará un producto en el primer ciclo de la PCR primaria y solamente se producirán productos a partir del cebador especifico del gen. La alineación a menor temperatura y amplificación a partir del cebador para el adaptador solamente tendrán lugar una vez producida la cadena complementaria a partir del cebador especifico del gen. Después de la amplificación por PCR primaria, se efectuó una reacción de PCR secundaria anidada para incrementar la especificidad de las reacciones de PCR genómicas. Los cebadores anidados consistieron de secuencias especificas del gen y especificas del adaptador internas para los respectivos cebadores usados en la PCR primaria. Para las secuencias flanqueadoras de los bordes 5' , la PCR anidada se inició usando cebadores específicos para el extremo 5' del ADN-T insertado junto con cebadores complementario de la secuencia del adaptador ligado al ADN digerido. De manera similar, la clonación de las secuencias flanqueadoras de los bordes 3' comenzó con un cebador
especifico para el extremo 3' del ADN-T insertado y un cebador complementario de la secuencia del adaptador. Se utilizaron secuencias de ADN internas para las secuencias del borde derecho y del borde izquierdo del ADN-T dentro de la región de ADN-T como puntos iniciales para el "desplazamiento" hacia la secuencia genómica de maíz, porque representaban secuencias únicas (no homologas de las secuencias genómicas endógenas de maíz) a partir de las cuales se podía anclar a los cebadores para el desplazamiento por el genoma. Los productos producidos por la PCR anidada fueron analizados mediante electroforesis sobre gel de agarosa (no se muestran los datos) . Los fragmentos visibles en las bibliotecas preparadas a partir de una o más de las muestras de ADN del evento DAS-59122-7 y ausentes en las bibliotecas preparadas a partir de las muestras de ADN genómico Hi-II y PH09B fueron identificados para su posterior caracterización. Los fragmentos amplificados por PCR identificados fueron separados mediante electroforesis sobre gel preparatoria, aislados usando el conjunto de elementos para extracción de geles QIAquick (Qiagen) y enviados directamente para su secuenciación o clonados en el vector plásmido pGEM-T Easy usando el Sistema I de vectores pGEM-T Easy (Promega Corp., adison, WI) antes de la secuenciación del ADN. Las reacciones de secuenciación se efectuaron con los cebadores
usados para la amplificación por PCR anidada o con los cebadores específicos para su uso con el vector pGEM-T Easy. La secuencia obtenida se usó para diseñar otros cebadores específicos del gen para continuar con el "desplazamiento" por la secuencia genómica desconocida de maíz. Se aplicaron múltiples rondas de desplazamiento por el genoma hasta obtener al menos 500 bp de la secuencia del borde a partir de los extremos del inserto de ADN-T. Para asegurar la validez de las secuencias que flanquean los bordes, se efectuaron amplificaciones adicionales por PCR específicas del evento con ADN genómico del evento DAS-59122-7. Los fragmentos amplificados fueron secuenciados con el fin de extender aún más la región de superposición de la secuencia de la región del inserto de ADN-T con el ADN genómico de los bordes 5' y 3' . Los cebadores, que se muestran en la Tabla 2, se diseñaron sobre la base de la secuencia obtenida a partir de los experimento de desplazamiento por el genoma para amplificar un fragmento que abarcara la unión única del ADN-T con el ADN genómico de maíz. El juego de cebadores 03-O-506/02-O-476 (SEQ ID N° : 10/SEQ ID N°:9) abarcó la unión 5' y amplificó un fragmento de 313 bp (desde bp 2427 hasta bp 2739, véase la Figura 1) y el juego de cebadores 02-O-447/03-O-577 (SEQ ID N°: 8/SEQ ID N°:17) abarcó la unión 3' y amplificó un fragmento de 754 bp (desde bp 9623 hasta bp 10376, véase la Figura 1) .
Tabla 2. Secuencias de los cebadores
Ubicación en la secuencia del evento DASD59122D7 (véase la Figura 1). Bases 1 - 2593 = borde 5', bases 2594 - 9936 = Inserto de ADN-T, bases 9937 - 11922 = borde 3' . Para verificar la secuencia de ADN que se había insertado en el genoma de maíz, se efectuó una PCR para amplificar, clona y secuenciar el ADN-T insertado del evento DASD59122D7. Se utilizaron los juegos de cebadores para PCR (SEQ ID N°: 11/SEQ ID N°:5); (SEQ ID N° : 4/SEQ ID N°:7); y (SEQ ID N°: 6/SEQ ID N°:3) que se muestran en la Tabla 3 para amplificar tres fragmentos superpuestos indicados como 221-1 (SEQ ID N°: 25), 221-2 (SEQ ID N°: 26) y 221-3 (SEQ ID N°: 27) que representan la secuencia de la región 5' del ADN-T que pasa hacia la región 3' del inserto de ADN-T desde bp 2687 hasta bp 9846 para el evento DAS-59122-7 (véase la
Figura 1) . La información del amplicón de la PCR se informa en la Tabla 3 y las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2.
Tabla 3. Descripciones de los cebadores y amplicones de la PCR
1. Ubicación en la secuencia del evento DAS-59122-7 (véase la Figura 1). Bases 1 - 2593 = borde 5', bases 2594 - 9936 = Inserto de ADN-T, bases 9937 - 11922 = borde 3' .
Se usó el conjunto de elementos para PCR GC2 Advantageá Polymerase (BD Biosciences Clontech, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del proveedor para amplificar los fragmentos del inserto (221-1 (SEQ ID N°: 25), 221-2 (SEQ ID N° : 26) y 221-3 (SEQ ID N°: 27)). Brevemente, una reacción de 50 µ? contenia cebadores 5' y 3' a una concentración final de 0,2 µ? y 40 ng de ADN genómico. Las reacciones de PCR se efectuaron por duplicado usando la preparación de ADN genómico de las plantas DAS-59122-7 T1S2 1 y DAS-59122-7 T1S2 2. Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial a 95°C durante 1 min, seguido de 35 ciclos de 94°/95°C durante 30 seg, 55°C durante 30 seg y 68°C durante 5 min, con una extensión final a 68°C durante 6 min. Los productos de la amplificación por PCR se visualizaron bajo luz UV, después de electroforesis a través de un gel de agarosa 1% en TBE IX (Tris-Borato 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) teñido con bromuro de etidio . Los fragmentos de PCR 221-1 (SEQ ID N° : 25), 221-2 (SEQ ID N°: 26) y 221-3 (SEQ ID N° : 27) se purificaron recortando los fragmentos de un gel de agarosa 0,8% en TBE IX teñido con bromuro de etidio y luego se purificaron los fragmentos de la agarosa usando el conjunto de elementos para extracción de geles QIAquick (Qiagen) . Los fragmentos de la PCR se clonaron en el vector plásmido pGEM-T Easy usando el Sistema I de vectores del pGEM-T Easy (Promega Corp.). Los
fragmentos clonados se verificaron con una minipreparación del ADN del plásmido (conjunto de elementos para QIAprep Spin Miniprep, Qiagen) y digestión por restricción con Not I. Los clones del plásmido y/o los fragmentos de PCR purificados del inserto fueron enviados luego para la secuenciación del inserto completo. Las reacciones de secuenciación se efectuaron con los cebadores diseñados para ser específicos para las secuencias conocidas de ADN-T o con cebadores específicos para su uso con el vector pGEM-T Easy. Todos los cebadores de PCR fueron sintetizado por Sigma-Genosys , Inc. (The Woodlands, TX) , que se utilizaron a una concentración final de 0,2-0,4 µ? en las reacciones de PCR. Las reacciones de PCR con el ADN genómico aislado para Cry34/35Abl B.t. de los eventos DASD59122D7, DASD45214D4 y DAS-45216-6, y de las líneas control no modificadas Hi-II y PH09B se utilizaron para confirmar (1) la presencia de ADN genómico de maíz en las regiones de los bordes secuenciadas del evento DAS-59122-7, y (2) la amplificación específica del evento por las uniones de los bordes del inserto de ADN-T y del ADN genómico en el evento DAS-59122-7. Los cebadores de PCR diseñados para amplificar la secuencia del borde que flanquea al inserto en el evento DAS-59122-7 se utilizaron para confirmar la presencia de dichas regiones en las líneas control no modificadas, así como en el evento DAS-59122-7. Se evaluaron dos (2) juegos de cebadores
para cada uno de los bordes 5' y 3' (cuatro (4) juegos en total) . Los juegos de cebadores 03-O-784/03-O-564 (SEQ ID N°: 18/SEQ ID N°:14) y 03-O-784/03-O-543 (SEQ ID N°: 18/SEQ ID N°:13) se utilizaron para amplificar fragmentos de 136 bp y 263 bp, respectivamente, de la secuencia del borde 5' con el inserto de ADN-T en el evento DAS-59122-7 (Figuras 2 y 3) . De manera similar, se utilizaron los juegos de cebadores 03-O-569/03-O-577 (SEQ ID N° : 15/SEQ ID N°:17) y 03-O-570/03-O-542 (SEQ ID N°: 16/SEQ ID N°:12) para amplificar fragmentos de 227 bp y 492 bp, respectivamente, del borde genómico 3' ( Figuras 2 y 3 ) . Se utilizaron cebadores diseñados para amplificar los fragmentos de la unión de la secuencia del y del inserto de ADN-T con el fin de establecer los fragmentos de PCR específicos del evento para el evento DAS-59122-7. Se seleccionó un juego de cebadores para cada una de las dos uniones. El juego de cebadores 03-O-78 /02-O-215 (SEQ ID N°: 18/SEQ ID N°:l) fue diseñado para amplificar un fragmento de 555 bp para la unión 5' y el juego de cebadores 02-O-219/03-0-577 (SEQ ID N° : 2/SEQ ID N°:17) fue diseñado para la amplificación de un fragmento de 547 bp para la unión 3' . Se usó un juego de cebadores, IVR1(0197) (SEQ ID N° : 39) 5'-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3' e IVR2(0198) (SEQ ID N°: 40) 5'-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3 ' , basado en el gen de invertasa endógeno de maíz (Hurst et al., (1999) Molecular Breeding 5
( 6 ) : 579-586 ) , para generar un producto de amplificación de 226 bp como un control positivo interno para todas las muestras de ADN genómico de maíz. Todos los cebadores para PCR fueron sintetizados por Sigma-Genosys , Inc. y se usaron a una concentración final de 0,2-0,4 µ? en las reacciones de PCR. Las secuencias de los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 2. Para las amplificaciones por PCR, se usó el conjunto de elementos para PCR Advantage™-GC 2 (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se empleó aproximadamente 10-100 ng de templado de ADN genómico por cada reacción de PCR de 50 µ? . Las condiciones de la PCR fueron: desnaturalización inicial del templado a 94°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 60°C durante 2 minutos y 72°C durante 3 min, con una extensión final a 72°C durante 7 min. Los productos de la amplificación por PCR se visualizaron bajo luz UV después de electroforesis sobre un % gel de agarosa 1% con TBE IX y bromuro de etidio. Se revisaron los datos de secuencia obtenidos para el inserto de ADN-T y las regiones de los bordes del evento DAS-59122-7 y se ensamblaron usando el software Seqman II™ Versión 4.0.5 (DNAStar, Inc., Madison, I). Las secuencias que flanquean los bordes 5' y 3' del inserto presentes en el evento DAS-59122-7 se utilizaron para las búsquedas de homología en las bases de datos públicas de GenBank con el
fin de caracterizar aún más el sitio de inserción en el genoma de maiz. El análisis para identificar los marcos de lectura abiertos en las regiones de unión entre los bordes flanqueadores y el inserto de ADN-T en el evento DAS-59122-7 se efectuó usando el vector NTI 8.0 (InforMax™, Inc., Frederick, MD) . En total, se confirmaron 11922 bp de secuencia del ADN genómico del evento DAS-59122-7 (véase la Figura 1) . Por el extremo 5' del inserto de ADN-T, se identificaron 2593 bp de la secuencia que flanquea al borde y se obtuvieron 1986 bp de la secuencia que flanquea al borde por el extremo 3' a partir de fragmentos derivados de los experimentos de desplazamiento por el genoma. Se clonó un total de 7160 bp del inserto de ADN-T y se secuenciaron usando juegos de cebadores para PCR diseñados para amplificar tres fragmentos superpuestos denominados 221-1 (2501 bp) (SEQ ID N°:25), 221-2 (3027 bp) (SEQ ID N°:26) y 221-3 (2830 bp) (SEQ ID N°:27) que representan la secuencia de la región 5' del ADN-T pasando hasta la región 3' del inserto de ADN-T para el evento DAS-59122-7 desde bp 2687 hasta bp 9846 (véase la Figura 1) . El resto del inserto de la región de ADN-T fue secuenciado a partir de dos fragmentos de PCR, 0506/0476 (SEQ ID N°: 10/SEQ ID N°:9) y 0447/0577 (SEQ ID N° : 8/SEQ ID N°:17) que abarcaban las uniones 5' y 3' , respectivamente, del inserto de ADN-T con el ADN genómico de maiz. Los
cebadores usados fueron diseñados basado en la secuencia obtenida con los experimentos de desplazamiento por el genoma para amplificar un fragmento que abarcaba la unión única del ADN-T con el ADN genómico de maíz. El juego de cebadores 03-O-506/03-O-476 (SEQ ID N° : 10/SEQ ID N°:9) abarcó la unión 5' y permitió amplificar un fragmento de 313 bp (desde bp 2427 hasta bp 2739) y el juego de cebadores 03O447/03-O-577 (SEQ ID N°: 8/SEQ ID N°:17) abarcó la unión 3' y permitió amplificar un fragmento de 754 bp (desde bp 9623 hasta bp 10376) . Combinados, se clonó un total de 7343 bp del inserto de ADN-T en el evento DASD59122D7 y se secuenció (desde bp 2594 hasta bp 9936, véase la Figura 1) y se comparó con la secuencia del plásmido transformante, PHP17662. Se observaron dos diferencias de nucleótidos en los bp 6526 y bp 6562 en la región del inserto de ADN-T no traducida del promotor de peroxidasa de trigo (véase la Figura 1) . Ninguno de los cambios de bases observados afectó la composición del marco de lectura abierto del inserto de ADN-T. Se encontró que ambas regiones de los extremos 3' y 5' del inserto de ADN-T estaban intactas, excepto por la supresión de los últimos 22 bp en el extremo 5' y 25 bp en el extremo 3' abarcando las regiones de los bordes derecho e izquierdo del ADN-T, respectivamente. Aunque se sabe que las secuencias de los bordes del ADN-T cumplen una función critica en la inserción del ADN-T en el genoma, éste resultado no es
inesperado dado que a menudo las inserciones son imperfectas, en particular por el borde izquierdo del ADN-T (Tinland (1996) Trends in Plant Science 1 ( 6) : 178-184 ) . El análisis con BLAST (Herramienta de Búsqueda por Alineación de Bases Local [Basic Local Alignment Search Tool] ) de las regiones genómicas de los bordes del evento DAS-59122-7 mostró una homología limitada con las secuencias disponibles al público (Reléase 138.0, GenBank, 25 de octubre, 2003) . El análisis de la región del borde 5' mostró dos áreas con homología significativa para las secuencias genómicas y de EST (Marca de Secuencia expresada [Expressed Secuencia Tag] ) de maíz. El primer área abarcaba 179 bp (bp 477 a bp 655 de la secuencia del borde) y presenta similitud con diversos marcadores moleculares, secuencias cromosómicas y secuencias consenso obtenidos por alineación de diversos EST. La segunda área se observa en las bp 1080 a bp 1153 (74 bp) de la secuencia del borde 5' y presenta similitud con numerosas de secuencias EST y genómicas diferentes de maíz. La región del borde 3' también presentaba dos pequeñas regiones no contiguas de similitud con secuencias de ADN de plantas. La región interna 3' de 162 bp (bp 9954 a bp 10115) mostró similitud con el extremo 3' no traducido de dos genes genómicos de alcohol deshidrogenasa (adhl) de Zea mays así como con varias secuencias consenso EST. Una región menor (57 bp) en la mitad del borde 3' (bp 10593 a bpl0649) mostró
similitud con las regiones no codificantes de múltiples secuencias genómicas de maíz. En general, no se identificaron regiones homologas de más de 179 pares de bases en ninguna de las secuencias genómicas de los bordes, ni tampoco se encontró más de una región homologa de la misma secuencia conocida. Se examinaron Accesos individuales que presentaban similitud con las secuencias de bordes del evento DAS-59122-7 para determinar si la inserción en el evento DAS-59122-7 era en la secuencia de codificación de la proteína caracterizada. Ninguna de las regiones de similitud correspondía a secuencias de codificación de ninguna proteína conocida. La alineación local de toda la secuencia del plásmido de transformación, PHP17662, con las secuencias de bordes del evento DAS-59122-7 no mostró una homología significativa, lo que indica que las regiones de los bordes que flanquean al inserto de ADN-T no contenían fragmentos del plásmido transformante. Por ello, la identificación y caracterización de la secuencia genómica que flanquea al sitio de inserción en el evento DAS-59122-7 eran limitadas debido a la ausencia de regiones de homología significativa con secuencias conocidas . Se analizó en las regiones de unión 5' y 3' entre la secuencia de bordes genómicos de maíz y el inserto de ADN-T en el evento DAS-59122-7 la presencia de nuevos marcos de
lectura abiertos. No se identificaron marcos de lectura abiertos de tamaño significativa (> 100 aminoácidos) en las regiones de unión de los extremos (bordes) 5' o 3' , lo que indica que no se generaron marcos de lectura abiertos nuevos como resultado de la inserción del ADN-T. Además, las búsquedas de homología no indicaron la presencia de marcos de lectura abiertos endógenos de maíz en las regiones de los bordes que pudieron haber sido interrumpidos por la inserción del ADN-T en Cry34/35Abl B.t del evento DAS-59122-7. Ejemplo 5. Cebadores para PCR Se utilizaron pares de cebadores específicos para el ADN del evento para producir un amplicón de diagnóstico para DAS-59122-7. Estos pares de cebadores del evento incluyen, a modo de ejemplo, las SEQ ID N° : 18 y SEQ ID N°: 1; las SEQ ID N° : 2 y SEQ ID N° : 17; las SEQ ID N° : 10 y SEQ ID N°: 9; y las SEQ ID N°: 8 y SEQ ID N° : 17; y las SEQ ID N°: 36 y SEQ ID N°: 37. Además de estos pares de cebadores, cualquier par de cebadores derivado de las SEQ ID N°: 21 y SEQ ID N° : 22 que, cuando se usan en una reacción de amplificación de ADN produce un amplicón de ADN diagnóstico para o DAS-59122-7, constituye una realización de la presente invención. Cualquier modificación de estos métodos que emplee cebadores de ADN, o complementos de los mismos, para producir una molécula de ADN amplicón que sea diagnóstico para DAS-59122-7 es propia de la habilidad del arte. Además,
se incluyen pares de cebadores control, que comprenden IVRl (0197) /IVR2 (0198) (SEQ ID N° : 39/SEQ ID N° : 40) para la amplificación de un gen endógeno de maíz, como estándares internos para las condiciones de reacción. El análisis de los extractos de ADN de tejido vegetal para verificar la presencia del evento DAS-59122-7 debería incluir un control de ADN de extracto de tejido positivo (una muestra de ADN conocida por contener las secuencias transgénicas ) . Una amplificación exitosa del control positivo demuestra que la PCR se corrió bajo condiciones que permiten la amplificación de secuencias blanco. También se debería incluir un control negativo, o de tipo salvaje, de ADN de extracto en el cual se provee ADN templado ya sea ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica o de una planta no transgénica para DAS-59122-7. Además un control negativo que no contenga ADN templado de extracto de maíz constituye una estimación útil de los reactivos y las condiciones usadas en el protocolo de PCR. Los especialistas en el arte de los métodos de amplificación de ADN podrán seleccionar otras moléculas de cebadores de ADN de longitud suficiente entre la SEQ ID N° : 21 y la SEQ ID N°: 22, y podrán optimizar las condiciones para la producción de un amplicón de diagnóstico para el evento DAS-59122-7. El uso de estas secuencias de cebadores de ADN con modificaciones con respecto a los métodos que se
muestran en estos Ejemplos se encuentra dentro del alcance de la invención. Un amplicón en el cual hay al menos una molécula de cebador de ADN de suficiente longitud derivada de la SEQ ID N° : 21 y de la SEQ ID N° : 22 que es de diagnóstico para el evento DAS-59122-7 constituye una realización de la invención. Un amplicón en el cual hay al menos un cebador de ADN de suficiente longitud derivado de cualquiera de los elementos genéticos de PHI17662A que sea diagnóstico para el evento DAS-59122-7, constituye una realización de la invención. El ensayo para el amplicón DAS-59122-7 se puede efectuar usando un termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o Eppendorf Mastercycler Gradient, o mediante métodos y aparatos conocidos por los especialistas en el arte. Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, resultará evidente para los especialistas en el arte que es posible modificar la invención en cuanto a disposición y detalle sin apartarse de dichos principios. Los autores reivindican todas las modificaciones que se encuentren dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones y documentos de patente publicadas en esta memoria descriptiva se incorporan en este documento a modo de referencia hasta el mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual se
incorporara específicamente e individualmente a modo de referencia .
Claims (49)
- REIVINDICACIONES 1. Una molécula aislada de ADN, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 19; b) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 20; c) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°:23; d) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 21; y e) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 22.
- 2. Un conjunto de elementos [kit] para identificar al evento DAS-59122-7 en una muestra biológica que permite detectar una región especifica de DAS-59122-7, caracterizado porque el conjunto de elementos comprende al menos un primer cebador, que reconoce una secuencia en la SEQ ID N°: 19 o en la SEQ ID N° : 20.
- 3. El conjunto de elementos de la cláusula 2, caracterizado porque además comprende al menos un segundo cebador que reconoce una secuencia de nucleótidos en una secuencia seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia de la SEQ ID N°:24; y b) la secuencia de la SEQ ID N°: 20.
- 4. El conjunto de elementos de la cláusula 2, caracterizado porque el primer cebador reconoce una secuencia de nucleótidos en una secuencia seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia de SEQ ID N° : 19; y b) la secuencia de SEQ ID N° : 20.
- 5. El conjunto de elementos de la cláusula 3, caracterizado porque el al menos primer y segundo cebadores, respectivamente, comprenden un par de secuencias seleccionadas del grupo formado por: a) las secuencias de la SEQ ID N°:18 y SEQ ID N°:l; b) las secuencias de la SEQ ID N°:10 y SEQ ID N°:9; c) las secuencias de la SEQ ID N°:2 y SEQ ID N°:17; d) las secuencias de la SEQ ID N°:8 y SEQ ID N°:17; y e) las secuencias de la SEQ ID N° : 36 y SEQ ID N° : 37.
- 6. Un conjunto de elementos para la detección de ADN especifico para ADN de unión del evento DAS-59122-7 de maíz y su progenie, caracterizado porque comprende al menos una molécula de ADN de una longitud suficiente de polinucleotidos de ADN contiguos como para funcionar en un método de detección de ADN, que es homologa o complementaria de una secuencia seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 21; y b) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N° : 22.
- 7. Un conjunto de elementos para identificar al evento DAS-59122-7 en una muestra biológica, caracterizado porque el conjunto de elementos comprende una sonda especifica que comprende una secuencia que se hibridiza con secuencias seleccionadas del grupo formado por: a) las secuencias de la SEQ ID N° : 19 y SEQ ID N°:24; y b) las secuencias de la SEQ ID N° : 20 y SEQ ID N°: 24; contiguas de la misma.
- 8. Un conjunto de elementos para la detección de ADN, caracterizado porque comprende al menos una molécula de ADN de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios de la SEQ ID N° : 21 o de la SEQ ID N°: 22 que funciona como un cebador o sonda de ADN especifico del evento DAS-59122-7 de maíz y la progenie de la misma.
- 9. Una construcción de ADN, caracterizada porque comprende: un primer, segundo y tercer cásete de expresión, donde dicho primer cásete de expresión comprende, ligado operativamente: (a) un promotor de ubiquitina de maíz; (b) un exón no traducido 5' de un gen de ubiquitina de maíz; (c) un primer intrón de ubiquitina de maíz; (d) una molécula de ADN que codifica Cry34Abl; y (e) un terminador de la transcripción Pinll; donde dicho segundo cásete de expresión comprende, ligado operativamente : (i) un promotor de peroxidasa de trigo; (ii) una molécula de ADN que codifica Cry35Abl; y (iii) un terminador de la transcripción Pinll; y donde el tercer cásete de expresión comprende, ligado operativamente : (1) promotor 35S CaMV; (2) una molécula de ADN que codifica pat; y (3) un terminador de la transcripción 3' de 35S (CaMV) .
- 10. Una planta, caracterizada porque comprende la construcción de ADN de la cláusula 9.
- 11. La planta de la cláusula 10, caracterizada porque dicha planta es una planta de maíz.
- 12. Un método para identificar al evento DAS-59122-7 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende detectar una región especifica de DAS-59122-7 con una primera sonda o cebador que reconoce específicamente una secuencia en la SEQ ID N°: 19 o en la SEQ ID N°: 20.
- 13. El método de la cláusula 12, caracterizado porque además comprende amplificar un fragmento de ADN a partir de un ácido nucleico presente en la muestra biológica usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, donde el primer cebador reconoce una secuencia en la SEQ ID N° : 19 o en la SEQ ID N°: 20, y un segundo cebador reconoce una secuencia en la SEQ ID N° : 20 o SEQ ID N° : 24.
- 14. El método de la cláusula 13, caracterizado porque el primer cebador reconoce una secuencia en la SEQ ID N° : 19 y el segundo cebador reconoce una secuencia en la SEQ ID N° : 24.
- 15. El método de la cláusula 13, caracterizado porque el primer cebador reconoce una secuencia en la SEQ ID N°: 20 y un segundo cebador reconoce una secuencia en la SEQ ID N° : 20.
- 16. El método de la cláusula 14, caracterizado porque los primer y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID N°: 18 y de la SEQ ID N°:l, respectivamente.
- 17. El método de la cláusula 14, caracterizado porque los primer y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID N°: 10 y de la SEQ ID N°:9, respectivamente.
- 18. El método de la cláusula 15, caracterizado porque los primer y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID N°: 2 y de la SEQ ID N°: 17, respectivamente.
- 19. El método de la cláusula 15, caracterizado porque los primer y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID N°: 8 y de la SEQ ID N°: 17, respectivamente.
- 20. El método de la cláusula 14, caracterizado porque los primer y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID N°: 36 y de la SEQ ID N°: 37, respectivamente.
- 21. El método de la cláusula 16, caracterizado porque comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 555 bp usando un protocolo de identificación por PCR de DAS-59122-7.
- 22. El método de la cláusula 17, caracterizado porque comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 313 bp usando un protocolo de identificación por PCR de DAS-59122-7.
- 23. El método de la cláusula 18, caracterizado porque comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 547 bp usando un protocolo de identificación por PCR de DAS-59122-7.
- 24. El método de la cláusula 19, caracterizado porque comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 754 bp usando un protocolo de identificación por PCR de DAS-59122-7.
- 25. El método de la cláusula 20, caracterizado porque comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 104 bp usando un protocolo de identificación por PCR de DAS-59122-7.
- 26. Un método para detectar la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz o progenie del mismo en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) extraer una muestra de ADN de dicha muestra biológica; (b) proveer un par de moléculas de cebadores de ADN seleccionado del grupo formado por: i) las secuencias de la SEQ ID N°:18 y SEQ ID N°:l; ii) las secuencias de la SEQ ID N°:10 y SEQ ID N°:9; iii) las secuencias de la SEQ ID N°:2 y SEQ ID N°:17; y iv) las secuencias de la SEQ ID N°:8 y SEQ ID N°:17; (c) proveer las condiciones de una reacción de amplificación de ADN; (d) realizar la reacción de amplificación de ADN, produciendo de esa manera una molécula de amplicón de ADN; y (e) detectar la molécula de amplicón de ADN, donde la detección de dicha molécula de amplicón de ADN en la reacción de amplificación de ADN indica la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz.
- 27. Una molécula aislada de ADN, caracterizada porque comprende cualquiera de los amplicones producidos mediante el método de la cláusula 26.
- 28. Un método para detectar la presencia de ADN correspondiente al evento DAS-59122-7 en una muestra, caracterizado porque el método comprende: (a) poner la muestra que comprende ADN de maíz en contacto con una sonda de polinucleótidos que se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con ADN del evento DAS-59122-7 de maíz y no se hibridiza bajo dichas condiciones de hibridación severas con un ADN vegetal que sea de DAS-59122-7 de maíz; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación severas; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN, donde la detección de la hibridación indica la presencia del evento DAS-59122-7.
- 29. Una secuencia de nucleótidos de ADN aislada de un cebador, caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por: las SEQ ID N°:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37, o un complemento de la misma.
- 30. La secuencia de nucleótidos de ADN aislada a partir de un cebador de la cláusula 29, caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por: las SEQ ID No.: 1, 2, 8, 9, 10, 17 y 18, o un complemento de la misma.
- 31. Un par de moléculas de ADN, caracterizado porque comprende: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, donde las moléculas de ADN son de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 21 o un complemento de la misma; y b) la secuencia que se muestra en la SEQ ID N° : 22 o un complemento de la misma; para funcionar como cebadores o sondas de ADN de diagnóstico para el ADN extraído de una planta de maíz DAS-59122-7 o progenie de la misma.
- 32. Una molécula aislada de ADN, caracterizada porque comprende una secuencia de unión que comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 32, 33, 34 y 35 y complementos de la misma.
- 33. Un método para confirmar la pureza de semillas, caracterizado porque comprende detectar una región especifica de DAS-59122-7 con un cebador o sonda especifico que reconoce específicamente una secuencia en la SEQ ID N°: 19 o en la SEQ ID N° : 20, en una muestra de semillas.
- 34. Un método para examinar en semillas la presencia del evento DAS-59122-7, caracterizado porque comprende detectar una región específica de DAS-59122-7 con un cebador o sonda específico que reconoce específicamente una secuencia en la SEQ ID N°: 19 o en la SEQ ID N° : 20 en una muestra de un lote de semillas.
- 35. Una planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma, caracterizada porque contiene un ADN que presenta al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 32, 33, 34 y 35, y complementos de las misma, forman parte del genoma de la planta .
- 36. Una planta que desciende de la planta de maíz resistente a insectos de la cláusula 35, caracterizada porque contiene ADN que presenta al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 32, 33, 34 y 35, y complementos de la misma, forma parte del genoma de la planta.
- 37. Semillas, caracterizadas porque son de la planta de la cláusula 35 ó 36.
- 38. Un método para producir una planta de maíz resistente a insectos, caracterizado porque comprende la cria con una planta de la cláusula 35 ó 36 y la selección de la progenie analizando la presencia de al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N° : 32, 33, 34 y 35 y complementos de la misma.
- 39. Una secuencia de ADN aislada, caracterizada porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37, o complementos de la misma.
- 40. Un par de secuencias de ADN aislada, caracterizado porque cada una de ellas comprende al menos diez nucleótidos y que cuando se usan juntos en un procedimiento de amplificación de ADN producirá un amplicón de diagnóstico para el evento DAS-59122-7.
- 41. El par de secuencias de ADN aisladas de la cláusula 40, caracterizado porque cada secuencia se selecciona de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia de la SEQ ID N° : 21; y b) la secuencia de la SEQ ID N° : 22.
- 42. Un método para detectar la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7 en tejido de maíz, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar un par de cebadores, cada uno de los cuales comprende al menos diez nucleótidos de la SEQ ID N°:21 o de la SEQ ID N° : 22 donde cada miembro del par se encuentra sobre lados opuestos de una secuencia de diagnóstico para dicha inserción del evento DAS-59122-7 ; (b) poner la muestra de dicho tejido de maiz en contacto con dicho par de cebadores; (c) efectuar una amplificación del ADN y analizar los amplicones.
- 43. El método de la cláusula 42, caracterizado porque el par de cebadores se selecciona del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37 o complementos de la misma.
- 44. Un método para detectar la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7 en tejido de maiz, caracterizado porque comprende: (a) poner una muestra de dicho tejido de maiz en contacto con una sonda de polinucleótidos que se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con una o más secuencias de ADN seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N°: 32, 33, 34 y 35 y complementos de la misma; (b) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación severas; y (c) analizar la hibridación de la sonda.
- 45. Un conjunto de elementos para la detección de ADN, caracterizado porque comprende una sonda de polinucleótidos que se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con una o más secuencias de ADN seleccionadas del grupo formado por las SEQ ID N°: 32, 33, 34 y 35 y complementos de las mismas .
- 46. Un conjunto de elementos para la detección de ADN, caracterizado porque comprende un par de cebadores cada uno de los cuales comprende al menos 10 nucleótidos de la SEQ ID N°: 21 y de la SEQ ID N°:22, donde cada uno se encuentra sobre lados opuestos de una secuencia de diagnóstico para la inserción del evento DAS-59122-7.
- 47. El ADN detección conjunto de elementos de la cláusula 46, caracterizado porque el par de cebadores se selecciona del grupo formado por las SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37 y complementos de las mismas.
- 48. Un conjunto de elementos para identificar al evento DAS-59122-7 en una muestra biológica, caracterizado porque permite detectar una región especifica de DAS-59122-7 en la SEQ ID N°: 23.
- 49. Un método para identificar DAS-59122-7 en una muestra biológica, caracterizado porque permite detectar una región especifica de DAS-59122-7 en la SEQ ID N° : 23.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| US60/614,225 | 2004-09-29 |
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