ES2432749T3 - Evento DAS-59122-7 de maíz y métodos para su detección - Google Patents
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Abstract
Una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de: (a) la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:23; (b) la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y (c) la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22.
Description
Evento DAS-59122-7 de maíz y métodos para su detección
Campo de la invención
Las realizaciones de la presente invención se refieren al campo de la biología molecular de plantas, específicamente una realización de la invención se refiere a una construcción de DNA para conferir a una planta resistencia a los insectos. Las realizaciones de la invención se refieren más específicamente a una planta DAS59122-7 de maíz resistente a los insectos y a ensayos para detectar la presencia del DNA de la planta DAS-591227 de maíz en una muestra y en sus composiciones.
Una realización de esta invención se refiere al maíz resistente a los insectos, planta DAS-59122-7 (Zea mays), también denominada línea DAS-59122-7 de maíz o evento DAS-59122-7 de maíz, y a la construcción de expresión en la planta del DNA de la planta DAS-59122-7 de maíz y a la detección de la región de inserción del transgén/flanqueante en la planta DAS-59122-7 de maíz y su progenie.
El maíz es un cultivo importante y es una fuente principal de alimento en muchas zonas del mundo. El daño causado por las plagas de insectos es un factor importante en la pérdida de los cultivos de maíz en el mundo, a pesar del uso de medidas protectora, tales como los plaguicidas químicos. En vista de esto, la resistencia a los insectos ha sido diseñada por ingeniería genética en cultivos, tales como el maíz con el fin de controlar el daño de los insectos y reducir la necesidad de los plaguicidas químicos tradicionales. Un grupo de genes que se han utilizado para la producción de cultivos transgénicos resistentes a los insectos son las delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). Las delta-endotoxinas se han expresado con éxito en plantas de cultivo, tales como algodón, patatas, arroz, girasol, así como maíz y han demostrado proporcionar un excelente control sobre las plagas de insectos. (Perlak, F.J. et al., (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:313321; Fujimoto H. et al., (1993) Bio/Technology 11:1151-1155; Tu et al., (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; publicación de patente PCT Nº WO 01/13731; y Bing JW et al., (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO).
Se sabe que la expresión de genes extraños en plantas está influenciada por su localización en el genoma de la planta, debido tal vez a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de los elementos reguladores de la transcripción (por ejemplo, potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). Al mismo tiempo, la presencia del transgén en diferentes localizaciones en el genoma influirá de diferentes modos en el fenotipo global de la planta. Por esta razón, frecuentemente es necesario cribar un gran número de eventos con el fin de identificar un evento caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación entre eventos en los niveles de expresión de un gen introducido. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos de la planta, que pueden no corresponder a los patrones esperados de los elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción del gen introducido. Por esta razón, es usual producir cientos a miles de diferentes eventos y cribar dichos eventos para obtener un solo evento que tenga los niveles y patrones deseados de expresión de transgenes para fines comerciales. Un evento que tiene los niveles o patrones deseados de la expresión de transgenes es útil para introgresar el transgén en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual externo utilizando métodos de cultivo convencionales. La progenie de estos cruces mantiene las características de expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se utiliza para asegurar la expresión génica fiable en un número de variedades que están bien adaptadas a las condiciones locales de cultivo.
Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento particular con el fin de determinar si la progenie de un cruce sexual contiene un transgén de interés. Además, un método para detectar un evento particular sería de gran ayuda para el cumplimiento de las regulaciones que requieren la aprobación previa a la comercialización y el etiquetado de alimentos derivados de plantas de cultivos recombinantes, por ejemplo, o para su uso en la vigilancia ambiental, la vigilancia de rasgos en cultivos en el campo o la vigilancia de productos procedentes de una cosecha del cultivo, así como para su uso en asegurar el cumplimiento de las partes sometidas a los términos reglamentarios o contractuales.
Es posible detectar la presencia de un transgén por cualquier método de detección de ácidos nucleicos conocido en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o hibridación de DNA usando sondas de ácidos nucleicos. Estos métodos de detección generalmente se centran en elementos genéticos utilizados con frecuencia, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., debido a que en muchas construcciones de DNA, la región codificadora es intercambiable. Como resultado, dichos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, en particular los producidos usando la misma construcción de DNA
o construcciones muy similares a menos que se conozca la secuencia de DNA del DNA flanqueante adyacente al DNA heterólogo insertado. Por ejemplo, un ensayo de PCR específico para el evento se describe en la Patente de EE.UU. Nº 6.395.485 para la detección del evento élite GAT-ZM1. En consecuencia, sería deseable disponer de un método sencillo y discriminatorio para la identificación del evento DAS-59122-7.
Las realizaciones de esta invención se refieren a métodos para producir y seleccionar una planta de cultivo
5 monocotiledónea resistente a los insectos. Más específicamente, se proporciona una construcción de DNA que cuando se expresa en células vegetales y en plantas confiere resistencia a los insectos. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una construcción de DNA, capaz de introducción y replicación en una célula hospedante, que cuando se expresa en células vegetales y en plantas confiere a las células vegetales y plantas resistencia a los insectos. La construcción de DNA está constituida por una molécula de DNA denominada
10 PHI17662A e incluye tres (3) casetes de expresión del transgén. El primer casete de expresión comprende una molécula de DNA que incluye el promotor, el exón no traducido en 5' y el primer intrón del gen de la ubiquitina (Ubi1) de maíz (Christensen et al., (1992) Plant Mol. Biol., 18:675-689 y Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una δ-endotoxina de B.t. identificada como Cry34Ab1 (Patentes de EE.UU. Nº 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593) conectada operativamente a una
15 molécula de DNA que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de patata (Gyheung An et al., (1989) Plant Cell. 1:115-122). El segundo casete de expresión del transgén de la construcción de DNA comprende una molécula de DNA que codifica el promotor de peroxidasa de trigo (Hertig et al., (1991) Plant Mol. Biol.. 16:171174) conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una δ-endotoxina de β.t. identificada como Cry35Ab1 (Patente de EE.UU.. Nº 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593) conectada operativamente a una molécula de
20 DNA que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de patata (Gyheung An et al., (1989) Plant Cell. 1:115-122). El tercer casete de expresión del transgén de la construcción de DNA comprende una molécula de DNA del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell J.T. et al., (1985) Nature 313:810-812; Mitsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59) conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica un gen de fosfinotricina-acetiltransferasa (PAT) (Wohlleben W. et al., (1988) Gene 70:25-37) conectada operativamente a
25 una molécula de DNA que comprende una terminador de la transcripción en 3' del promotor 35S de CaMV (véase Mitsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59). También se proporcionan plantas que contienen la construcción del DNA.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan composiciones y métodos para identificar una nueva planta de maíz denominada DAS-59122-7, basándose dichos métodos en cebadores o sondas que
30 reconocen específicamente las secuencias flanqueantes en 5' y/o en 3' de DAS-59122-7. Se proporcionan moléculas de DNA que comprenden secuencias de cebadores que cuando se utilizan en una PCR producirán amplicones únicos para el evento transgénico DAS-59122-7. Estas moléculas se pueden seleccionar del grupo que consiste en:
5'-GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC-3' (SEQ ID NO:1);
5'-AATTGAGCGCTTGCACGTTT-3' (SEQ ID NO:3);
5'-AACAACAAGACCGGCCACACCCTC-3' (SEQ ID NO:4);
5'-GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA-3' (SEQ ID NO:5);
5'-TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA-3' (SEQ ID NO:6);
5'-AACCCTTAGTATGTATTTGTATT-3' (SEQ ID NO:8);
5'-CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG-3' (SEQ ID NO:9);
5'-TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG-3' (SEQ ID NO:10);
5'-GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT-3' (SEQ ID NO:11);
5'-CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA-3' (SEQ ID NO:13);
5'-CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC-3' (SEQ ID NO:14);
5'-GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA-3' (SEQ ID NO:15);
5'-GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG-3' (SEQ ID NO:16);
5'-CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG-3' (SEQ ID NO:17);
5'-AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC-3' (SEQ ID NO:18)
5'-CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG-3' (SEQ ID NO:36);
5'-GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG-3' (SEQ ID NO:37) y sus complementos. La planta y semillas de maíz que comprenden estas moléculas son una realización de esta invención. Además, se proporcionan kits que utilizan estas secuencias de cebadores para la identificación del evento DAS-59122-7.
Una realización adicional de la invención se refiere a las secuencias flanqueantes específicas de DAS-59122-7 descritas en la presente memoria, que se pueden utilizar para desarrollar métodos específicos de identificación de DAS-59122-7 en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se refiere a las regiones flanqueantes en 5' y/o 3' de DAS-59122-7, la SEQ ID NO:19 flanqueante en 5' y la SEQ ID NO:20 flanqueante en 3', respectivamente, que se pueden utilizar para el desarrollo de cebadores y sondas específicos. Una realización adicional de la invención se refiere a métodos de identificación de la presencia de DAS-59122-7 en muestras biológicas basados en el uso de tales cebadores o sondas específicos.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan métodos de detección de la presencia de DNA correspondiente al evento DAS-59122-7 de maíz en una muestra. Dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende el DNA con un conjunto de cebadores de DNA, que cuando se usan en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con DNA genómico extraído del evento DAS-59122-7 de maíz produce un amplicón indicativo de la presencia del evento DAS-59122-7 del maíz; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de este modo el amplicón; y (c) detectar el amplicón.
Son una realización de esta invención las moléculas de DNA que comprenden la nueva región de inserción del transgén/flanqueante, la SEQ ID NO:21 flanqueante en 5' más interna en 1000 y la SEQ ID NO:22 flanqueante en 3' más interna en 1000 y son homólogas o complementarias a la SEQ ID NO:21 y la SEQ ID NO:22.
Las secuencias de DNA que comprenden la nueva región de inserción del transgén/flanqueante, la SEQ ID NO:2, son una realización de esta invención. Están incluidas las secuencias de DNA que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia del transgén insertado y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica y/o flanqueante del maíz procedente de la planta DAS-59122- 7 de maíz de la SEQ ID NO:21 que son útiles como secuencias de cebadores para la producción de un de producto amplicón indicativo de la presencia de la planta DAS-59122-7 de maíz.
Además, se proporcionan secuencias de DNA que comprenden la nueva región de inserción del transgén/flanqueante, la SEQ ID NO:22. Están incluidas las secuencias de DNA que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia del transgén insertado y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica y/o flanqueante de maíz procedente de la planta DAS-59122-7 de maíz de la SEQ ID NO:22 que son útiles como secuencias de cebadores para la producción de un producto amplicón indicativo de la presencia la planta DAS-59122-7 de maíz.
Las secuencias de DNA que comprenden al menos 11 o más nucleótidos de la porción del transgén de la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:21 o sus complementos y una longitud similar de la secuencia de DNA de maíz flanqueante en 5' de la SEQ ID NO:21 o sus complementos, son útiles como cebadores de DNA en métodos de amplificación de DNA. Los amplicones producidos usando estos cebadores son indicativos de la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz. Por lo tanto, las realizaciones de la invención también incluyen los amplicones producidos por cebadores de DNA homólogos o complementarios a la SEQ ID NO:21.
Las secuencias de DNA que comprenden al menos 11 o más nucleótidos de la porción del transgén de la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:22 o sus complementos y una longitud similar de la secuencia de DNA de maíz flanqueante en 3' de la SEQ ID NO:22 o sus complementos son útiles como cebadores de DNA en métodos de amplificación de DNA. Los amplicones producidos usando estos cebadores son indicativos de la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz, es decir, los amplicones producidos por cebadores de DNA homólogos o complementarios a la SEQ ID NO:22.
Más específicamente, son realizaciones de la invención un par de moléculas de DNA que comprenden un conjunto de cebadores de DNA, en donde las moléculas de DNA son identificadas como la SEQ ID NO:18 o sus complementos y la SEQ ID NO:1 o sus complementos; la SEQ ID NO:2 o sus complementos y la SEQ ID NO:17 o sus complementos; la SEQ ID NO:10 o sus complementos y la SEQ ID NO:9 o sus complementos; la SEQ ID NO:8 o sus complementos y la SEQ ID NO:17 o sus complementos; y la SEQ ID NO:36 o sus complementos y la SEQ ID NO:37 o sus complementos.
Otros amplicones comprenden las moléculas de DNA de la SEQ ID NO:18 y la SEQ ID NO:1; comprendiendo el amplicón las moléculas de DNA de la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:17; comprendiendo el amplicón las moléculas de DNA de la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:9; comprendiendo el amplicón las moléculas de DNA de la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:17, y comprendiendo el amplicón las moléculas de DNA de la SEQ ID NO:36 y la SEQ ID NO:37.
Otras realizaciones de la invención incluyen pares de cebadores, que son útiles en la detección o caracterización del evento DAS-59122-7, seleccionados de: la SEQ ID NO:11 o sus complementos; la SEQ ID NO:5 o sus complementos; la SEQ ID NO:4 o sus complementos; la SEQ ID NO:7 o sus complementos; la SEQ ID NO:6 o sus complementos; la SEQ ID NO:3 o sus complementos; la SEQ ID NO:18 o sus complementos; la SEQ ID NO:14 o sus complementos; la SEQ ID NO:13 o sus complementos; la SEQ ID NO:15 o sus complementos; la SEQ ID NO:17
o sus complementos; la SEQ ID NO:16 o sus complementos; y la SEQ ID NO:12 o sus complementos. Los amplicones se pueden producir por el apareamiento de cualquiera de los cebadores mencionados anteriormente.
Además, se proporcionan un kit y métodos para identificar el evento DAS-59122-7 en una muestra biológica que detecta una región específica de DAS-59122-7 dentro de la SEQ ID NO:23.
Se proporcionan moléculas de DNA que comprenden al menos una secuencia de unión de DAS-59122-7 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos; en donde una secuencia de unión abarca la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA procedente de la célula de maíz que flanquea el sitio de inserción, es decir, el DNA flanqueante, y es indicativo de la presencia del evento DAS-59122-7.
Los métodos para producir un maíz resistente a los insectos pueden comprender las etapas de: (a) cruzar sexualmente una primera línea de maíz parental que comprenda las casetes de expresión de la invención, que confieren resistencia a los insectos, y una segunda línea de maíz parental que carezca de resistencia a los insectos, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de la progenie; y (b) seleccionar una planta de la progenie que sea resistente a los insectos. Dichos métodos pueden comprender opcionalmente la etapa adicional de retrocruzamiento de la planta de la progenie con la segunda línea de maíz parental para producir una planta de maíz de reproducción pura que sea resistente a los insectos.
La producción de una planta de maíz que sea resistente a los insectos puede comprender la transformación de una célula de maíz con la construcción de DNA PHI17662A (SEQ ID NO:24), el crecimiento de la célula de maíz transformada hasta una planta de maíz, la selección de la planta de maíz que muestra la resistencia a los insectos y el crecimiento vegetativo de la planta de maíz hasta una planta de maíz fértil. La planta de maíz fértil puede autopolinizarse o ser cruzada con variedades de maíz compatibles para producir una progenie resistente a los insectos.
Otra realización de la invención se refiere además a un kit de detección de DNA para identificar el evento DAS59122-7 de maíz en muestras biológicas. El kit comprende un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueante en 5' o en 3' de DAS-59122-7 y un segundo cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro del DNA extraño de DAS-59122-7, o dentro del DNA flanqueante, para su uso en un protocolo de identificación por PCR. Un kit puede comprender una sonda específica que tenga una secuencia que corresponda, o sea complementaria, a una secuencia que tenga una identidad de secuencia entre 80% y 100% con una región específica del evento DAS-59122-7. La secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueante en 5' o en 3' del evento DAS-59122-7.
Los métodos y kits abarcados por las realizaciones de la presente invención se puede utilizar para diferentes fines, tales como, aunque sin limitación, los siguientes: para identificar el evento DAS-59122-7 en plantas, en material vegetal o en productos tales como, aunque sin limitación, productos alimenticios o piensos (frescos o procesados) que comprenden o proceden, de material vegetal; adicional o alternativamente, los métodos y kits se pueden utilizar para identificar material vegetal transgénico para los fines de segregación entre material transgénico y no transgénico; adicional o alternativamente, los métodos y kits se pueden utilizar para determinar la calidad del material vegetal que comprende el evento DAS-59122-7 de maíz. Los kits también pueden contener los reactivos y materiales necesarios para la ejecución del método de detección.
Una realización adicional de esta invención se refiere a la planta DAS-59122-7 de maíz o sus partes, incluyendo, aunque sin limitación, polen, óvulos, células vegetativas, los núcleos de las células del polen y los núcleos de las células de los óvulos de la planta DAS-59122-7 de maíz y su progenie derivada.
Por consiguiente, la invención proporciona una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:23;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y
- (c)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22.
La invención también proporciona un kit para identificar el evento DAS-59122-7 en una muestra biológica que detecta una región específica de DAS-59122-7, comprendiendo dicho kit al menos un primer cebador, que reconoce una secuencia dentro de la SEQ ID NO:19 o dentro de la SEQ ID NO:20, y que comprende además al menos un segundo cebador que reconoce una secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia SEQ ID NO:24.
Dichos cebadores al menos primero y segundo, respectivamente, pueden comprender un par de secuencias seleccionadas de:
- (a)
- las secuencias SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1;
- (b)
- las secuencias SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9;
- (c)
- las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17;
- (d)
- las secuencias SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17; y
- (e)
- las secuencias SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37.
La invención también proporciona un kit de detección de DNA específico para el DNA de unión del evento DAS59122-7 de maíz y su progenie que comprende al menos una molécula de DNA de una longitud suficiente de polinucleótidos de DNA contiguos para funcionar en un método de detección de DNA, en donde dicha molécula de DNA se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de DNA de unión del evento DAS-591227 de maíz, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante, y no se hibrida en dichas condiciones de hibridación rigurosas con un DNA de planta de maíz que no sea DAS-59122-7 y dicha molécula de DNA es homóloga o complementaria de una secuencia seleccionada de:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y
- (b)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22. La invención también proporciona un método para identificar el evento DAS-59122-7 en una muestra biológica, que comprende detectar una región específica de DAS-59122-7 amplificando un fragmento de DNA de un ácido nucleico presente en dicha muestra biológica, usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos
cebadores, en donde dicho primer cebador reconoce una secuencia dentro de la SEQ ID NO:19 o la SEQ ID
NO:20, y un segundo cebador reconoce una secuencia dentro de la SEQ ID NO:24.
Dichos cebadores primero y segundo pueden comprender la secuencia de:
SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1,respectivamente;
SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9, respectivamente;
SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17, respectivamente;
SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17, respectivamente; o
SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37, respectivamente.
La invención también proporciona un método para detectar la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz o su
progenie en una muestra biológica, que comprende:
- (a)
- extraer una muestra de DNA de dicha muestra biológica;
- (b)
- proporcionar un par de moléculas de cebador de DNA seleccionado de:
- (i)
- las secuencias SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1;
- (ii)
- las secuencias SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9;
(iii) las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17; y
(iv) las secuencias SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17;
- (c)
- proporcionar condiciones de la reacción de amplificación de DNA;
- (d)
- llevar a cabo dicha reacción de amplificación de DNA, produciendo de ese modo una molécula de amplicón de DNA; y
- (e)
- detectar dicha molécula de amplicón de DNA, en donde la detección de dicha molécula de amplicón de DNA en dicha reacción de amplificación de DNA indica la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz.
La invención también proporciona una molécula de DNA aislada que comprende uno cualquiera de los amplicones producidos por el método anterior.
La invención también proporciona un método para detectar la presencia de DNA correspondiente al evento DAS59122-7 en una muestra, comprendiendo el método:
- (a)
- poner en contacto la muestra que comprende DNA de maíz con una sonda de polinucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con DNA de unión del evento DAS-59122-7 de maíz, abarcando dicho DNA de unión, la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante, y no se hibrida bajo dichas condiciones de hibridación rigurosas con un DNA de la planta de maíz que no sea DAS-59122-7, y dicha sonda es de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia seleccionada de:
- (i)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22;
- (b)
- someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y
- (c)
- detectar la hibridación de la sonda con el DNA de unión, en donde la detección de la hibridación indica la presencia del evento DAS-59122-7.
La invención también proporciona un par de moléculas de DNA que comprende: una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en donde las moléculas de DNA son de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos a una secuencia seleccionada de:
- (a)
- la secuencia descrita en la SEQ ID NO:21 o su complemento; y
- (b)
- la secuencia descrita en la SEQ ID NO:22 o su complemento;
en donde el par de moléculas de DNA es capaz de amplificar, en una reacción en cadena de la polimerasa, un amplicón que comprende una región específica de DAS-59122-7 del evento DAS-59122-7 de maíz y su progenie, en donde dicha región específica de DAS-59122-7 comprende al menos una secuencia de unión dentro de la SEQ ID NO:23, y dicha secuencia de unión abarca la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante.
Cada molécula de DNA puede ser un cebador que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37 o sus complementos.
Cada cebador puede comprender una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:2, 8, 9, 10, 17 y 18 o sus complementos.
La invención también proporciona una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de unión que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos.
La invención también proporciona un método para confirmar la pureza de semillas, que comprende la detección de una región específica de DAS-59122-7 con un cebador o sonda específico que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de unión dentro de la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:22, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante
o su complemento, en una muestra de semillas, y no se hibrida bajo dichas condiciones de hibridación rigurosas con el DNA de una planta de maíz que no sea DAS-59122-7.
La invención también proporciona un método para cribar semillas para detectar la presencia del evento DAS-591227, que comprende la detección de una región específica de DAS-59122-7 con un cebador o sonda específico que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de unión dentro de la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:22, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante o su complemento, en una muestra de un lote de semillas, y no se hibrida bajo dichas condiciones de hibridación rigurosas con el DNA de una planta de maíz que no sea DAS-59122-7.
La invención también proporciona una planta de maíz resistente a los insectos, en la que el DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:23 forma parte del genoma de la planta.
La invención también proporciona una planta descendiente de la planta anterior, en la que el DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:23, forma parte del genoma de la planta.
La invención proporciona también semillas de dichas plantas o plantas descendientes, en las que dichas semillas comprenden la SEQ ID NO:23.
La invención también proporciona un método para detectar la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7 en tejido de maíz, que comprende:
- (a)
- seleccionar un par de cebadores que comprenden cada uno al menos diez nucleótidos de la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:22, en donde cada miembro del par está en lados opuestos de una secuencia indicativa de dicha inserción del evento DAS-59122-7, comprendiendo dicha secuencia al menos una secuencia de unión de DAS59122-7;
- (b)
- poner en contacto una muestra de dicho tejido de maíz con dicho par de cebadores; y
- (c)
- realizar la amplificación de DNA y analizar los amplicones.
En dicho método, cada cebador de dicho par puede seleccionarse de las SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 30, 36 y 37 o sus complementos.
La invención también proporciona un método para detectar la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7 en tejido de maíz que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra de dicho tejido de maíz con una sonda de polinucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una o más secuencias de DNA seleccionada(s) de las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos, en donde la sonda se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante en 5' o en 3' del evento DAS-59122-7 y comprende también una parte del DNA extraño contiguo a dicha región;
- (b)
- someter dicha muestra y dicha sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y
- (c)
- analizar la hibridación de la sonda.
La invención también proporciona un kit de detección de DNA que comprende una sonda de polinucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una o más secuencias de DNA seleccionadas de las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos, y en donde la sonda se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante en 5' o en 3' del evento DAS-59122-7 y comprende también una parte del DNA extraño contiguo a dicha región.
La invención también proporciona un kit de detección de DNA que comprende un par de cebadores, comprendiendo cada cebador al menos 10 nucleótidos dentro de la SEQ ID NO:21 y la SEQ ID NO:22, en donde cada cebador está en los lados opuestos de una secuencia indicativa de la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7, comprendiendo dicha secuencia al menos una secuencia de unión de DAS-59122-7, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante.
En dicho kit de detección de DNA, cada cebador en dicho par se puede seleccionar de las SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37 y sus complementos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1. Secuencia de DNA (SEQ ID NO:23) que muestra el inserto transgénico PHI17662A, así como las secuencias que flanquean el inserto transgénico. Están subrayadas las regiones de borde en 5' y en 3', p desde pb 1 hasta pb 2593 y desde pb 9937 pb hasta pb 11922, respectivamente. Se indican en negrita y subrayadas dos diferencias de nucleótidos (pb 6526 y pb 6562) basadas en la comparación con el plásmido transformante PHP17662.
Figura 2. El diagrama esquemático de la región de inserción del evento DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de B.t. está dividido en tres secciones separadas; la región de borde en 5' con el DNA genómico de maíz, el inserto T-DNA intacto y la región de borde en 3' con el DNA genómico de maíz. Las dos flechas debajo del diagrama del inserto indican los puntos de inicio y final de la secuencia derivada de los fragmentos del desplazamiento sobre el genoma en 5' y 3'. Otros recuadros debajo del diagrama del inserto representan fragmentos de PCR que fueron amplificados a partir de DNA genómico del evento DAS-59122-7 y secuenciados para cubrir el inserto de T-DNA intacto y las regiones de unión del inserto/borde en 5 ' y 3'.
Figura 3. El diagrama esquemático de la región de inserción del evento DAS-59122-7 en Cry34/35Ab1 de B.t. está dividido en tres secciones separadas; la región de borde en 5' con el DNA genómico de maíz, el inserto T-DNA intacto y la región de borde en 3' con el DNA genómico de maíz. Los recuadros debajo del diagrama del inserto representan fragmentos de PCR localizados en las regiones de borde genómicas o a través de las regiones de unión en 5' y 3' del inserto T-DNA con el DNA genómico de maíz que fueron amplificadas a partir de DNA genómico del evento DAS-59122-7
Los siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos se deben entender según su uso convencional por los expertos en la técnica relacionada. Las definiciones de términos comunes en Biología Molecular también se pueden encontrar en Rieger et al,, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag, New York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Se utiliza la nomenclatura de las bases de DNA, establecida en 37 CFR § 1.822.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "que comprende" significa "incluyendo, aunque sin limitación".
Como se usa en la presente memoria, el término "maíz" significa Zea mays, e incluye todas las variedades de plantas que pueden ser cultivadas con maíz, incluidas las especies silvestres del maíz.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "específico de DAS-59122-7" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es adecuada para identificar discriminadamente el evento DAS-59122-7 en plantas, material vegetal o en productos tales como, aunque sin limitación, productos alimenticios o piensos (frescos o procesados) que comprenden, o proceden de material de la planta.
Como se usa en la presente memoria, los términos "resistente a los insectos" y "que afectan a plagas de insectos" se refiere a la introducción de cambios en la alimentación, el crecimiento, y/o el comportamiento de los insectos en cualquier etapa de desarrollo, incluyendo, aunque sin limitación: matar el insecto; retardar el crecimiento; impedir la capacidad reproductora; inhibir la alimentación; y similares.
Como se usa en la presente memoria, los términos "actividad plaguicida" y "actividad insecticida" se utilizan como sinónimos para referirse a la actividad de un organismo o de una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteína) que puede medirse por numerosos parámetro incluyendo, aunque sin limitación, mortalidad de las plagas, pérdida de peso de plagas, atracción de plagas, repelencia de plagas y otros cambios físicos y de comportamiento de una plaga después de la alimentación y/o exposición al organismo o sustancia durante un período de tiempo apropiado. Por ejemplo, "proteínas plaguicidas" son proteínas que muestran actividad plaguicida por sí mismas o en combinación con otras proteínas.
"Secuencia codificadora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Como se usa en la presente memoria, los términos "que codifica", "codificado" cuando se utilizan en el contexto de un ácido nucleico especificado significan que el ácido nucleico comprende la información necesaria para guiar la traducción de la secuencia de nucleótidos a una proteína especificada. La información por la que se codifica una proteína se especifica por el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias intermedias no traducidas (por ejemplo, como en el cDNA).
"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadoras en 5') y siguen (secuencias no codificadoras en 3') a la secuencia codificadora. "Gen natural" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere cualquier gen que no es un gen natural, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que proceden de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que proceden de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen natural en su localización natural en el genoma de un organismo. "Extraño" se refiere a material que no se encuentra normalmente en la localización de interés. Por lo tanto. "DNA extraño" puede comprender tanto el DNA recombinante, así como el DNA reordenado recién introducido de la planta. Un gen "extraño" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedante, pero que se introduce en el organismo hospedante por transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes naturales insertados en un organismo no natural o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. El sitio en el genoma de la planta donde se ha insertado un DNA recombinante se puede denominar el "sitio de inserción" o el "sitio diana".
Como se usa en la presente memoria, "DNA insertado" se refiere a DNA heterólogo dentro de las casetes de expresión usadas para transformar el material vegetal, mientras que "DNA flanqueante" puede existir como DNA genómico presente de forma natural en un organismo, tal como una planta o DNA extraño (heterólogo) introducido por el proceso de transformación que es ajeno a la molécula de DNA insertada original, por ejemplo fragmentos asociados a la operación de transformación. Una "región flanqueante" o "secuencia flanqueante", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de al menos veinte (20) pares de bases, preferiblemente al menos cincuenta (50) pares de bases, y hasta cinco mil (5000) pares de bases que está localizada ya sea inmediatamente aguas arriba (hacia el extremo 5') y contigua a, o inmediatamente aguas abajo (hacia el extremo 3') y contigua a la molécula de DNA insertada extraña original. Los procedimientos de transformación que conducen a la integración aleatoria del DNA extraño darán como resultado transformantes que contienen diferentes regiones flanqueantes características y únicas para cada transformante. Cuando se introduce DNA recombinante en una planta por cruce tradicional, generalmente no serán cambiadas sus regiones flanqueantes. Los transformantes también contendrán uniones únicas entre un DNA insertado heterólogo y DNA genómico, o dos (2) piezas de DNA genómico, o dos (2) piezas de DNA heterólogo. Una "unión" es un punto en el que están unidos dos (2) fragmentos de DNA específicos. Por ejemplo, existe una unión cuando el DNA insertado está unido al DNA flanqueante. También existe un punto de unión en un organismo transformado cuando dos (2) fragmentos de DNA están unidos de manera que está modificada respecto de la que se encuentra en el organismo natural. "DNA de unión" se refiere a DNA que comprende un punto de unión.
Como se usa en la presente memoria, "heterólogo", con referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificado sustancialmente desde su forma natural en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser de una especie diferente de la que procede la secuencia de nucleótidos o, si es de la misma especie, el promotor no se encuentra de forma natural unido operativamente a la secuencia de nucleótidos. Una proteína heteróloga puede proceder de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificada sustancialmente en su forma original por intervención humana deliberada.
"Secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas aguas arriba (secuencias no codificadoras en 5'), dentro o aguas abajo (secuencias no codificadoras en 3') de una secuencia codificadora, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del RNA, o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias delanteras de la traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.
"Promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora
o RNA funcional. En general, una secuencia codificadora está localizada en 3' respecto a una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste en elementos aguas arriba próximos y más distantes, denominándose frecuentemente potenciadores. En consecuencia, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o especificidad de tejidos de un promotor.
Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen natural o estar compuestos por diferentes elementos procedentes de diferentes promotores encontrados en la naturaleza o incluso comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Los expertos en la técnica entenderán que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células o en diferentes etapas del desarrollo o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que hacen que un fragmento de ácido nucleico sea expresado en la mayoría de tipos de células en la mayoría de las veces son denominados generalmente "promotores constitutivos". Se están descubriendo constantemente nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales; numerosos ejemplos pueden encontrarse en la compilación de Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Se reconoce además que puesto que en la mayoría de los casos no han sido completamente definidos los límites exactos de las secuencias reguladoras, fragmentos de ácido nucleico de diferentes longitudes pueden tener idéntica actividad de promotor.
La "secuencia delantera de la traducción" se refiere a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia del promotor de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia delantera de la traducción está presente en el mRNA completamente procesado aguas arriba de la secuencia de comienzo de la traducción. La secuencia delantera de la traducción puede afectar a numerosos parámetros incluyendo, el procesamiento del transcrito primario a mRNA, la estabilidad y/o la eficacia de la traducción del mRNA. Se han descrito ejemplos de secuencias delanteras de la traducción (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236).
Las "secuencias no codificadoras en 3'" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas aguas abajo de una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del mRNA o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente por afectar a la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor del mRNA. El uso de diferentes secuencias no codificadoras en 3' está ilustrado con ejemplos por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-680.
Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuestos en un orden específico determinado por la secuencia codificadora en un polinucleótido que codifica el polipéptido.
Una construcción de DNA es un ensamblaje de moléculas de DNA unidas entre sí que proporcionan una o más casetes de expresión. La construcción de DNA puede ser un plásmido que está habilitado para auto-replicación en una célula bacteriana y contiene varios sitios de restricción por enzimas endonucleasas que son útiles para la introducción de moléculas de DNA que proporcionan elementos funcionales genéticos, es decir, promotores, intrones, secuencias delanteras, secuencias codificadoras, regiones de terminación en 3', entre otros, o una construcción de DNA puede ser un ensamblaje lineal de moléculas de DNA, tales como una casete de expresión. La casete de expresión contenida dentro de una construcción de DNA comprende los elementos genéticos necesarios para proporcionar la transcripción de un RNA mensajero. La casete de expresión puede ser diseñada para expresarse en células procariotas o células eucariotas. Las casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención están diseñadas para expresarse en células vegetales.
Las moléculas de DNA de las realizaciones de la invención se proporcionan en casetes de expresión para la expresión en un organismo de interés. La casete incluirá secuencias reguladoras en 5' y 3' unidas operativamente a una secuencia codificadora. "Unida operativamente" significa que las secuencias de ácidos nucleicos que están unidas enlazadas son contiguas y, cuando es necesario se une dos regiones codificadoras de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. Se entiende que unidas operativamente indica una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de DNA correspondiente a la segunda secuencia. La casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser co-transformado en el organismo. Alternativamente, el(los) gen(es) adicional(es) puede(n) proporcionarse en múltiples casetes de expresión o múltiples construcciones de DNA.
La casete de expresión incluirá en la dirección 5' a 3' de la transcripción: una región de iniciación de la transcripción y de la traducción, una región codificadora y una región de terminación de la transcripción y de la traducción funcional en el organismo que sirve como hospedante. La región de iniciación de la transcripción (es decir, el promotor) puede ser natural o análoga o extraña o heteróloga para el organismo hospedante. Además, el promotor puede ser una secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Las casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias delanteras en 5' en la construcción de la casete de expresión. Tales secuencias delanteras pueden actuar para potenciar la traducción.
Ha de entenderse que como se utiliza en la presente memoria, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heterólogo incluyendo los transgénicos inicialmente así alterados, como los creados por cruces sexuales o propagación asexual del transgénico inicial. El término "transgénico", como se usa en la presente memoria no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) mediante métodos convencionales de cultivo de plantas o por eventos que ocurren de modo natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.
Un "evento" transgénico es producido por transformación de células vegetales con una(s) construcción(es) de DNA heteróloga(s), que incluye(n) un casete de expresión de ácido nucleico que comprende un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas resultantes de la inserción del transgén en el genoma de la planta, y la selección de una planta particular caracterizada por inserción en una localización particular del genoma. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgén. A nivel genético, un evento es parte de la constitución genética de una planta. El término "evento" se refiere también a la progenie producida por un cruzamiento sexual externo entre el transformante y otra variedad que incluye el DNA heterólogo. Incluso después de un retrocruzamiento repetido con un precursor recurrente, el DNA insertado y el DNA flanqueante del precursor transformado está presente en la progenie del cruce en la misma localización cromosómica. El término "evento" también se refiere a DNA procedente del transformante original que comprende el DNA insertado y la secuencia flanqueante inmediatamente adyacente al DNA insertado que se esperaría fuera transferida a una progenie que recibe DNA insertado incluyendo el transgén de interés como resultado de un cruce sexual de una línea parental que incluye el DNA insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultante de la autofecundación
- o autopolinización) y una línea parental que no contiene el DNA inverso.
Una planta DAS-59122-7 de maíz resistente a los insectos puede ser cultivada cruzando primeramente sexualmente una primera planta de maíz parental que consiste en una planta de maíz cultivada procedente de la planta DAS-59122-7 de maíz transgénico y su progenie obtenida de la transformación con casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención que confiere resistencia a los insectos, y una segunda planta de maíz parental que carece de resistencia a los insectos, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de la primera progenie; y seleccionando luego una planta de la primera progenie que es resistente a los insectos; y autopolinizando la planta de la primera progenie, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de la segunda progenie; y a continuación, seleccionando de las plantas de la segunda progenie una planta resistente a los insectos. Estas etapas pueden incluir además el retrocruzamiento de la planta de la primera progenie resistente a los insectos o de la planta de la segunda progenie resistente a los insectos con la segunda planta de maíz parental
- o con una tercera planta de maíz parental, produciendo de este modo una planta de maíz que es resistente a los insectos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc), semillas, células vegetales, y su progenie. Se entiende que partes de plantas transgénicas que caen dentro del alcance de la invención y son también una realización de la presente invención comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones, así como flores, tallos, frutos, hojas y raíces y que se originan de plantas transgénicas o su progenie previamente transformada con una molécula de DNA de la invención y por lo tanto, que consiste al menos en parte en células transgénicas,
Como se usa en la presente memoria, el término "célula vegetal" incluye, sin limitación, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles de técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas.
"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un organismo hospedante, dando como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos hospedantes que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos". Ejemplos de métodos de transformación de plantas incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al., (1987) Meth. Enzymol. 143:277) y la tecnología de transformación acelerada por partículas o "pistola de genes" (Klein et al., (1987) Nature (London) 327:70-73; patente de EE.UU. Nº 4.945.050). A continuación se describen métodos de transformación adicionales.
Por lo tanto, los polinucleótidos aislados de la invención pueden ser incorporados en construcciones recombinantes, típicamente construcciones de DNA, que son capaces de introducción y replicación en una célula hospedante. Dicha construcción puede ser un vector que incluye un sistema de replicación y secuencias que son capaces de transcripción y traducción de una secuencia que codifica el polipéptido en una célula hospedante dada. Un número de vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas ha sido descrito en, por ejemplo, el trabajo de Pouwels et al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vector: A Laboratory Manual, Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plants Molecular Biology, (Academic Press, New York), y Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Típicamente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes de plantas clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras en 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión en plantas también pueden contener una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora controladora inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo de la expresión específica en células o tejidos), un sitio de iniciación de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento del RNA, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.
También ha de entenderse que dos plantas transgénicas diferentes también pueden ser apareadas para producir descendencia que contiene dos genes exógenos segregantes añadidos independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos. También se consideran el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento externo con una planta no transgénica como es la propagación vegetativa. Descripciones de otros métodos de reproducción que se utilizan generalmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de las diversas referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wisconsin (1987).
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual se une un marcador detectable convencional o molécula informadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Dicha sonda es complementaria de una cadena de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención, de una cadena de DNA aislado del evento DAS-59122-7 de maíz, bien sea de una planta de maíz o de una muestra que incluye el DNA del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo los ácidos desoxirribonucleicos
o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de DNA diana y se pueden utilizar para detectar la presencia de esa secuencia de DNA diana.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados que se asocian a una cadena de DNA diana complementaria por hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de DNA diana, a continuación se extienden a lo largo de la cadena de DNA diana por una polimerasa, por ejemplo, una DNA polimerasa. Los pares de cebadores de la invención se usan para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos. La "PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa" es una técnica utilizada para la amplificación de segmentos de DNA específicos (véanse, las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.800.159).
Las sondas y los cebadores son de suficiente longitud de nucleótidos para unirse a la secuencia de DNA diana específicamente en las condiciones de hibridación o las condiciones de reacción determinadas por el operador. Esta longitud puede ser cualquier longitud que sea suficiente para ser útil en un método de detección elegido. En general, se utilizan longitudes de once (11) nucleótidos o más, dieciocho (18) nucleótidos o más, y veintidós (22) nucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia diana en condiciones de hibridación de alta rigurosidad. Las sondas y cebadores de acuerdo con realizaciones de la presente invención pueden tener similitud de secuencias completas de DNA de nucleótidos contiguos con la secuencia diana, aunque se pueden diseñar por métodos convencionales sondas que difieran de la secuencia de DNA diana y que conserven la capacidad de hibridarse con secuencias de DNA diana. Las sondas se pueden utilizar como cebadores, pero por lo general están diseñadas para unirse al DNA o RNA diana y no se utilizan en un proceso de amplificación.
Se pueden usar cebadores específicos para amplificar un fragmento de integración para producir un amplicón que se puede utilizar como una "sonda específica" para identificar el evento DAS-59122-7 en muestras biológicas. Cuando la sonda se hibrida con los ácidos nucleicos de una muestra biológica en condiciones que permiten la unión de la sonda a la muestra, esta unión se puede detectar y por lo tanto permite una indicación de la presencia de evento DAS-59122-7 en la muestra biológica. Dicha identificación de una sonda unida se ha descrito en la técnica. En una realización de la invención, la sonda específica es una secuencia que, en condiciones optimizadas, se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante en 5' o 3' del evento y también comprende una parte del DNA extraño contiguo a la misma. La sonda específica puede comprender una secuencia de al menos 80%, entre 80 y 85%, entre 85 y 90%, entre 90 y 95%, y entre 95 y 100% idénticos (o complementarios) a una región específica del evento.
Los métodos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989 (en lo sucesivo, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo, "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de cebadores para PCR pueden proceder de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas de ordenador destinados a este propósito, tales como la herramienta de análisis de cebadores de PCR en Vector NTI versión 6 (Informax Inc., Bethesda MD); PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison, WI), y Primer (Versión 0.5©, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Adicionalmente, la secuencia se puede escanear visualmente y los cebadores identificarse manualmente utilizando directrices conocidas por los expertos en la técnica.
Un "kit", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un conjunto de reactivos con el fin de llevar a cabo las realizaciones de los métodos de la invención, más particularmente, la identificación del evento DAS-59122-7 en muestras biológicas. El kit de la invención se puede utilizar, y sus componentes pueden ajustarse específicamente, para fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas), detección del evento DAS-59122-7 en material vegetal o material que comprende o procede de material vegetal, tales como, aunque sin limitación, productos alimenticios o piensos. "Material vegetal", como se usa en la presente memoria se refiere a material que se obtiene o procede de una planta.
Los cebadores y las sondas basados en las secuencias del inserto y del DNA flanqueante descritas en la presente memoria se pueden utilizar para confirmar (y, si es necesario, para corregir) las secuencias descritas por métodos convencionales, por ejemplo, por re-clonación y secuenciación de dichas secuencias. Las sondas y cebadores de ácidos nucleicos de la presente invención se hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de DNA diana. Se puede usar cualquier método convencional de hibridación o de amplificación de ácidos nucleicos para identificar la presencia de DNA de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o sus fragmentos son capaces de hibridarse específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en ciertas circunstancias. Como se usa en la presente memoria, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse específicamente entre sí, si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácidos nucleicos bicatenaria y anti-paralela.
Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Como se usa en la presente memoria, se dice que las moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan asociadas entre sí bajo al menos condiciones convencionales "de baja rigurosidad". Del mismo modo, se dice que las moléculas son "complementarias" si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan asociadas entre sí bajo condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Las condiciones de rigurosidad convencionales están descritas por Sambrook et al., 1989, y por Haymes et al., en: Nucleic Acid Hibridation, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Las desviaciones de la complementariedad completa son, por tanto, admisibles siempre y cuando tales desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas de formar una estructura bicatenaria. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o sonda sólo necesita ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones particulares empleadas de disolvente y sal.
En las reacciones de hibridación, la especificidad es típicamente función de lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. El punto de fusión térmico (Tm) es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente apareada. Para los híbridos DNA-DNA, la Tm se puede calcular aproximadamente por la ecuación de Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC)- 0,61 (% form)-500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de los nucleósidos guanosina y citosina del DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm se reduce en aproximadamente 1ºC por cada 1% de desapareamiento; por tanto, la Tm, la hibridación, y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridarse con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad > 90%, la Tm puede disminuir 10ºC. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente 5ºC por debajo de la Tm para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones estrictamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4ºC por debajo que la Tm; las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9
o 10ºC por debajo de la Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20ºC por debajo de la Tm.
Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada, los expertos en la técnica entenderán que las variaciones en la rigurosidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado están descritas inherentemente. Si el grado deseado de desapareamiento da como resultado una Tm inferior a 45ºC (solución acuosa) o a 32ºC (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo se pueda aplicar una temperatura más alta. Una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993)
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York), y Ausubel et al., eds. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Véase Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York.).
Como se usa en la presente memoria, una secuencia sustancialmente homóloga es una molécula de ácido nucleico que se hibridará específicamente con el complemento de la molécula de ácido nucleico a la que se está comparando en condiciones de alta rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de DNA, por ejemplo, solución de cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado con SSC 2X a 50ºC, son conocidas por los expertos en la técnica o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1,5 M de ion Na, típicamente una concentración de alrededor 0,01 a 1,0 M de ion Na (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden lograr con la adición de un agente desestabilizante, tal como formamida. Ejemplos de condiciones de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución tampón de formamida del 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato sódico) al 1% a 37ºC, y un lavado en SSC 0,5X de 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55ºC. Las condiciones de restricción moderada ilustrativas incluyen hibridación en formamida de 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37ºC, y un lavado en SSC de 0,5 X a 1X de 55 a 60ºC. Las condiciones de alta rigurosidad ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en SSC 0,1 X de 60 a 65ºC. Un ácido nucleico de la invención se puede hibridar específicamente con una o más de las moléculas de ácidos nucleicos únicas para el evento DAS-59122-7 o sus complementos o fragmentos de cualquiera bajo condiciones moderadamente rigurosas.
Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede conseguir utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación por homología de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.. 48:443-453; el método de búsqueda por similitud de Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:2264, modificado por Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5873-5877.
Se pueden utilizar implementaciones por ordenador de estos algoritmos matemáticos para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencias. Tales implementaciones, incluyen, aunque sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (versión 2.0); el programa ALIGN PLUS (versión 3.0, derechos de autor 1997); y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA de Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible en Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121, USA). Se pueden realizar alineaciones con estos programas utilizando los parámetros por defecto.
El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins and Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992) y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). Los programas ALIGN y ALIGN PLUS se basan en el algoritmo de Myers and Miller (1988) supra. Los programas BLAST de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) supra. La familia de programas BLAST que se pueden utilizar para la búsqueda de similitud en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de nucleótidos consultada frente a las secuencias de nucleótidos de la base de datos; BLASTX para secuencias de nucleótidos consultada frente a las secuencias de proteínas de la base de datos; BLASTP para secuencias de proteínas consultada frente a las secuencias de proteínas de la base de datos; TBLASTN para secuencias de proteínas consultadas frente a las secuencias de nucleótidos de la base de datos; y TBLASTX para secuencias de nucleótidos consultadas frente a las secuencias de nucleótidos de la base de datos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). La alineación también se puede realizar manualmente por inspección visual.
Para obtener alineaciones con huecos para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al., (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase www.ncbi.hlm.nih.gov.
Como se usa en la presente memoria, "identidad de secuencias" o "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a los residuos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia con referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas frecuentemente difieren en sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos de aminoácidos están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencias" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, esto implica puntuar una sustitución conservadora como parcial en lugar de una falta de coincidencia completa, aumentando de este modo el porcentaje de identidad de las secuencias. Así, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservadora se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservadora se le da una puntuación entre cero y
1. Se calcula la puntuación de las sustituciones conservadoras, por ejemplo, tal como se aplica en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
Como se usa en la presente memoria "porcentaje de identidad de secuencias" significa el valor determinado por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que las bases de ácidos nucleicos o los residuos de aminoácidos idénticos se encuentran en ambas secuencias lo que proporciona el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.
En cuanto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, por PCR) usando un par de cebadores de amplificación particular, "condiciones rigurosas" son las condiciones que permiten que el par de cebadores se hibride sólo a la secuencia de ácido nucleico diana a la que se uniría un cebador que tiene la secuencia de tipo natural correspondiente (o su complemento) y preferiblemente para producir un único producto de amplificación, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de DNA.
El término "específico para (una secuencia diana)" indica que una sonda o cebador se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas sólo con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.
Como se usa en la presente memoria, "DNA amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana que es parte de un molde de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si una planta de maíz resultante de un cruzamiento sexual contiene DNA genómico del evento transgénico de la planta de maíz de la invención, el DNA extraído de la muestra de tejido de la planta de maíz puede ser sometido a un método de amplificación de ácido nucleico utilizando un par de cebadores de DNA que incluye un primer cebador procedente de una secuencia flanqueante adyacente al sitio de inserción de DNA heterólogo insertado, y un segundo cebador procedente del DNA heterólogo insertado para producir un amplicón indicativo de la presencia de DNA del evento. Alternativamente, el segundo cebador puede proceder de la secuencia flanqueante. El amplicón tiene una longitud y una secuencia que también es indicativa de la presencia del evento. El amplicón puede variar en longitud respecto a la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de bases de nucleótidos hasta cualquier longitud de amplicón producible por un protocolo de amplificación de DNA. Alternativamente, los pares de cebadores pueden proceder de la secuencia flanqueante en ambos lados del DNA insertado de modo que produzcan un amplicón que incluye toda la secuencia de nucleótidos del inserto de la construcción de expresión PHI17662A, así como la secuencia que flanquea el inserto transgénico, véase la FIG. 1 (SEQ ID NO:23), de aproximadamente un tamaño de doce (12) Kb. Un miembro de un par de cebadores procedentes de la secuencia flanqueante puede ser situado a una distancia de la secuencia de DNA insertada, pudiendo variar esta distancia desde un par de bases de nucleótidos hasta los límites de la reacción de amplificación, o aproximadamente veinte mil pares de bases de nucleótidos. El uso del término "amplicón" excluye específicamente los dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica de DNA.
La amplificación de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conocen en la técnica una variedad de métodos de amplificación que están descritos, entre otras publicaciones, en las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.683.202 y en los PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Se han desarrollado métodos de amplificación por PCR para amplificar hasta 22 Kb de DNA genómico y hasta 42 Kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:5695-5699, 1994). Estos métodos, así como otros métodos conocidos en la técnica de amplificación de DNA se pueden usar en la práctica de las realizaciones de la presente invención. Ha de entenderse que se puede necesitar un número de parámetros de un protocolo de PCR específico para ajustarse a las condiciones específicas de laboratorio y puede ser ligeramente modificado e incluso permitir la recuperación de resultados similares. Estos ajustes serán evidentes para los expertos en la técnica.
El amplicón producido por estos métodos puede ser detectado por una pluralidad de técnicas, incluyendo, aunque sin limitación, Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al., Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994), en donde se diseña un oligonucleótido de DNA que se solapa tanto con la secuencia de DNA flanqueante adyacente como con la secuencia de DNA insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de micropocillos. Después de la PCR de la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante adyacente) un producto monocatenario de PCR se puede hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como molde para una reacción de extensión de una sola base utilizando una DNA polimerasa y ddNTP marcados específicos para la base siguiente esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia insertada/ flanqueante debido al resultado esperado de la amplificación, la hibridación, y la extensión de una sola base.
Otro método de detección es la técnica de pirosecuenciación que está descrita en el trabajo de Winge (Innov. Pharma Tech 00:18-24, 2000). En este método se diseña un oligonucleótido que se solapa con la unión del DNA adyacente y el DNA insertado. El oligonucleótido se hibrida con un producto monocatenario de PCR a partir de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia flanqueante) y se incuba en presencia de una DNA polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina-5'-fosfosulfato y luciferina. Se añaden los dNTP de forma individual y la incorporación da como resultado una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia de inserción del transgén/ flanqueante debido al resultado esperado de la amplificación o la hibridación, y la extensión de una o varias bases.
La polarización de la fluorescencia como se ha descrito por Chen et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999) es también un método que se puede utilizar para detectar un amplicón de la invención. Usando este método se diseña un oligonucleótido que se solapa con la unión del DNA flanqueante y el insertado. El oligonucleótido se hibrida a un producto monocatenario de PCR a partir de la región de interés (un cebador en la secuencia del DNA insertado y otro en la secuencia del DNA flanqueante) y se incuba en presencia de una DNA polimerasa y un ddNTP marcado fluorescentemente. La extensión de una sola base da como resultado la incorporación del ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio en la polarización utilizando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia del inserto del transgén/ flanqueante debido al resultado esperado de la amplificación, la hibridación, y la extensión de una sola base.
Como un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de DNA se describe Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y se entiende completamente en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En pocas palabras, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que se solapa con la unión del DNA flanqueante y el insertado. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de DNA insertado y otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y los dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado la escisión y liberación del resto fluorescente alejado del resto atenuador en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/del inserto del transgén debido a los resultados esperados de la amplificación y la hibridación.
Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencias como las encontradas en el trabajo de Tyangi et al., (Nature Biotech. 14:303-308, 1996). En pocas palabras, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que se solapa con la unión del DNA flanqueante y el insertado. La estructura única de la sonda FRET da como resultado una estructura secundaria que mantiene los restos fluorescentes y los restos de atenuación en estrecha proximidad. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de DNA insertado y otro en la secuencia flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y los dNTP. Después del resultado esperado de la amplificación por PCR c, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia diana da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de atenuación. Se produce una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/de inserto del transgén debido al resultado esperado de la amplificación y la hibridación.
Una reacción de hibridación que utiliza una sonda específica para una secuencia que se encuentra dentro del amplicón es también otro método utilizado para detectar el amplicón producido por una PCR.
Las realizaciones de la presente invención se definen con más detalle en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos se dan solamente a modo de ilustración. Por la exposición anterior y estos Ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención, y sin apartarse de su espíritu y alcance, puede efectuar diversos cambios y modificaciones de las realizaciones de la invención para adaptarlas a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, a partir de la descripción anterior serán evidentes para los expertos en la técnica diversas modificaciones de las realizaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria. Tales modificaciones también están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1. Transformación de maíz por la transformación con Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas que contienen los genes Cry34Ab1 y Cry35Ab1 (Cry34/35Ab1)
Una molécula de DNA de aproximadamente 7,4 Kb, denominada PHI17662A (SEQ ID NO:24), que incluye una primera casete de expresión de transgén que comprende una molécula de DNA que incluye el promotor, el exón no traducido en 5' y el primer intrón del gen de ubiquitina de maíz (Ubi-1) (Christensen et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 y Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una δ-endotoxina de B.t. identificada como Cry34Ab1 (Patentes de EE.UU. Nº 6.127.180,
6.624.145 y 6.340.593) conectada operativamente a una molécula de DNA que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de patata (Gyheung An et al., (1989) Plant Cell. 1:115-122). La segunda casete de expresión de transgén de la construcción de DNA comprende una molécula de DNA que codifica el promotor de peroxidasa de trigo (Hertig et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174) conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una δ-endotoxina de B.t. identificada como Cry35Ab1 (Patentes de EE.UU. Nº. 6.083.499,
6.548.291 y 6.340.593) conectada operativamente a una molécula de DNA que comprende un terminador de la transcripción Pin II aislado de patata (Gyheung An et al., (1989) Plant Cell. 1:115-122). Para transformar el tejido embrionario de maíz se utilizó la tercera casete de expresión de transgén de la construcción de DNA que comprende una molécula de DNA del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell J.T. et al., (1985) Nature 313:810-812; Mitsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59) conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica un gen de fosfinotricina-acetiltransferasa (PAT) (Wohlleben W. et al., (1988.) Gene 70:25-37) conectada operativamente a una molécula de DNA que comprende un terminador de la transcripción en 3’ del 35S de CaMV (véase Mitsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59).
Las plantas de maíz con Cry34/35Ab1 de B.t. se obtuvieron mediante la transformación con Agrobacterium, empleándose el método de Zhao (Patente de EE.UU. Nº 5.981.840 y la publicación de patente PCT WO98/32326). En pocas palabras, se aislaron embriones inmaduros de maíz y se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium, en donde las bacterias eran capaces de transferir DNA de PHI17662 (SEQ ID NO:24) a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). Específicamente, en esta etapa los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se cultivaron conjuntamente durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cultivo conjunto). Específicamente, los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido después de la etapa de infección. Después de este periodo de cultivo conjunto se proporcionó una etapa de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones se incubaron en presencia de al menos un antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (etapa 3: la etapa de reposo). En particular, los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y durante una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivaron en medio que contenía un agente selectivo y se recuperó el callo transformado creciente (etapa 4: la etapa de selección). Específicamente, los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con un agente selectivo dando como resultando el crecimiento selectivo de células transformadas. A continuación se regeneró el callo en las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración) y, específicamente, los callos crecidos en el medio selectivo se cultivaron en medio sólido para regenerar las plantas. Durante el cultivo se mantuvieron físicamente separados los embriones individuales y la mayoría de los explantes murieron en el medio selectivo.
A los embriones que sobrevivieron y produjeron tejido de callo sano resistente al glufosinato se les asignaron códigos de identificación únicos que representaban supuestos eventos de transformación y se transfirieron continuamente a un medio de selección recién preparado. Las plantas se regeneraron a partir del tejido procedente de cada evento único y se transfirieron a un invernadero. Se tomaron muestras de las hojas para análisis molecular que verificara la presencia del transgén por PCR y confirmara la expresión de la proteína Cry34/35Ab1 por ELISA. A continuación se sometieron las plantas a un bioensayo de toda la planta usando insectos gusanos de la raíz del maíz occidental. Se cruzaron plantas positivas con líneas endogámicas para obtener semillas de las plantas transformadas iniciales. Se evaluó en el campo un número de líneas. Se seleccionó el evento DAS-59122-7 de una población de eventos transgénicos independientes basada en una combinación superior de características, incluyendo la resistencia a los insectos y el comportamiento agronómico.
Ejemplo 2. Identificación de la línea de maíz DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de Bacillus thuringiensis Se evaluó la semilla del evento DAS-59122-7. La semilla T1S2 representa la transformación en el antecedente Hi-II, seguido de un cruce con la línea endogámica PH09B y dos series de auto-cruzamiento. Todas las semillas se obtuvieron de Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA). La caracterización primaria se realizó en el tejido de la hoja de la planta durante el estudio por confirmación de la actividad de la fosfinotricina-acetiltransferasa (PAT) por medio de pintura con herbicida de la hoja y la expresión de Cry34Ab1 usando dispositivos de flujo lateral.
Las sustancias de control de este estudio se definieron como semillas no modificadas representativas de los antecedentes de la sustancia de ensayo. Las semillas de control de los antecedentes Hi-II y PH09B se utilizaron como controles negativos. Estas semillas no modificadas no contienen las unidades de transcripción de la planta para los genes Cry34Ab1, Cry35Ab1 y PAT. Todas las semillas se obtuvieron de Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA).
Muestras de DNA de dos eventos con Cry34/35Ab1 de B.t. adicionales; el evento DAS-45214-4 y el evento DAS45216-6 se utilizaron como controles negativos para el análisis por PCR específico de eventos. Los dos eventos se produjeron por medio de la transformación con Agrobacterium utilizando el mismo vector utilizado para producir el evento DAS-59122-7 y por consiguiente contenían las unidades de transcripción de la planta para los genes Cry34Ab1, Cry35Ab1 y PAT. Sin embargo, los sitios de inserciones de T-DNA en los eventos DAS-45214-4 y DAS45216-6, incluyendo las regiones de los bordes del DNA genómico, eran diferentes de los del evento DAS-59122-7. Muestras de DNA del evento DAS-45214-4 y del evento DAS-45216-6 se aislaron y caracterizaron por análisis de transferencia Southern. (Datos no mostrados).
Las semillas de maíz para el evento DAS-59122-7 y las semillas de control no modificadas (Hi-II y PH09B) se sembraron en cámaras de crecimiento en la Estación Experimental de DuPont (Wilmington, DE) para producir un número suficiente de plantas para análisis del DNA. Para la caracterización del evento DAS-59122-7, se sembraron diez (10) semillas de T1S2. También se sembraron diez (10) semillas para cada línea de control no modificada. Se sembró una (1) semilla por tiesto y el tiesto se identificó de forma única. Las condiciones de siembra y cultivo eran propicias para el crecimiento saludable de las plantas incluyendo la regulación de luz y agua.
Se recogieron muestras de hojas para cada una de las plantas de control y con el evento DAS-59122-7. Para cada muestra, se recogió material de hojas suficiente por encima del punto de crecimiento y se introdujo en una bolsa de muestras previamente etiquetada. Las muestras se colocaron en nieve carbónica y se transfirieron a un congelador de ultra baja temperatura después de la recogida. Todas las muestras se mantuvieron congeladas hasta su tratamiento. Todas las muestras de hojas se etiquetaron de modo individual con la identificación de la planta y la fecha de la cosecha.
Para confirmar la expresión de la proteína Cry34Ab1 en el evento DAS-59122-7 y la ausencia de expresión en los controles, se recogieron muestras de hojas de todas las plantas con el evento DAS-59122-7 y de control y se cribó la proteína transgénica usando dispositivos de flujo lateral específicos para Cry34Ab1 (Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE). Se tomaron de cada planta perforaciones de hojas y se trituraron en una solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 para extraer en bruto la proteína. Se sumergió en el extracto una tira para determinar la presencia o ausencia de la proteína Cry34Ab1. Los resultados del inmunoensayo se utilizaron para confirmar la identidad de las plantas objeto del ensayo antes del análisis molecular, como se muestra en la Tabla 1.
Para confirmar la expresión de fosfinotricina-acetiltransferasa (PAT) en las plantas con el evento DAS-59122-7, se realizó una pintura con herbicida de las hojas. Todas las plantas utilizadas en este estudio eran hojas pintadas para confirmar la identidad de la planta. Las plantas se analizaron antes de la etapa de crecimiento R1. Los ensayos se realizaron siguiendo un procedimiento estándar conocido en la técnica de pintura con herbicida de hojas para la identificación de plantas transgénicas que expresan PAT. Específicamente, una porción de una hoja de cada planta se trató con una solución de aproximadamente 2% del herbicida glufosinato, Basta® (Bayer CropScience) en agua y se comprobó visualmente el tejido pardo o necrótico en la zona de hoja pintada 4-12 días después de su aplicación. Se registraron los resultados de cada planta y se usaron para determinar la expresión de PAT en cada planta de ensayo, como se muestra en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 1, de las diez (10) plantas analizadas para determinar la generación de T1S2 con el evento DAS-59122-7, seis (6) plantas expresaban tanto Cry34Ab1 como PAT, mientras que cuatro (4) plantas no expresaban ninguna proteína. Todos los controles no modificados dieron negativo para los ensayos tanto de CryAb1 como de PAT (datos no mostrados).
Tabla 1: Datos de la expresión de las proteínas Cry34Ab1 y PAT y de la hibridación Southern para el evento DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de B.t.
- DI de la planta
- DI de la muestra Expresión de Cry34Ab1 y PAT1 Sonda Cry34Ab12 para transferencia Southern Sonda Cry35Ab12 para transferencia Southern Sonda PAT2 para transferencia Southern
- 02-122C 1
- T1S2 1 con DAS59122-7 positiva + + +
- DI de la planta
- DI de la muestra Expresión de Cry34Ab1 y PAT1 Sonda Cry34Ab12 para transferencia Southern Sonda Cry35Ab12 para transferencia Southern Sonda PAT2 para transferencia Southern
- 02-122C 2
- T1S2 2 con DAS59122-7 positiva + + +
- 02-122C 3
- T1S2 3 con DAS59122-7 positiva + + +
- 02-122C 4
- T1S2 4 con DAS59122-7 negativa - - -
- 02-122C 5
- T1S2 5 con DAS59122-7 positiva + + +
- 02-122C 6
- T1S2 6 con DAS59122-7 negativa - - -
- 02-122C 7
- T1S2 7 con DAS59122-7 positiva + + +
- 02-122C 8
- T1S2 8 con DAS59122-7 negativa - - -
- 02-122C 9
- T1S2 9 con DAS59122-7 negativa - - -
- 02-122C 10
- T1S2 10 con DAS59122-7 positiva + + +
- 1. La expresión positiva de Cry34Ab1 indica la detección de la expresión de la proteína determinada por el dispositivo de flujo lateral basado en inmunoensayo específico para la detección de la proteína Cry34Ab1. La expresión negativa indica que no se ha detectado la proteína Cry34Ab1. La expresión positiva de PAT indica plantas que eran tolerantes al tratamiento con herbicida y la expresión negativa indica plantas que eran sensibles al herbicida. 2. + indica que hay señal de hibridación en la transferencia Southern, - indica que no hay señal de hibridación en la transferencia Southern. La sonda del gen Cry34Ab1 se hibridó con el fragmento T-DNA interno esperado de 1,915 kb, la sonda del gen Cry35Ab1 se hibridó con el fragmento T-DNA interno esperado de 2,607 kb y la sonda del gen PAT se hibridó con un fragmento del borde de 3,4 kb coherente con una única inserción de T-DNA intacta determinada por análisis de transferencia Southern.
Ejemplo 3. Análisis por transferencia Southern de la línea de maíz DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de Bacillus thuringiensis
Cantidades de un gramo de muestras de hojas se trituraron bajo nitrógeno líquido y se aisló el DNA genómico utilizando DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) o utilizando un procedimiento estándar de tampón de
5 extracción de urea. Después de la extracción, se visualizó el DNA en un gel de agarosa para determinar la calidad del DNA y se cuantificó usando el reactivo Pico Green® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y análisis espectrofluorométrico.
Para estimar los tamaños de los fragmentos de DNA en geles de agarosa se utilizó la escalera de DNA de 1 Kb (Invitrogen, Carlsbad, CA).
10 El DNA genómico aislado de las plantas con el eventos DAS-59122-7 se digirió con Nco I y se separó por electroforesis, se transfirió a membranas de nilón y se hibridó con las sondas de los genes Cry34Ab1, Cry35Ab1 y PAT utilizando procedimientos estándares conocidos en la técnica. Las transferencias se expusieron a rayos X durante uno o más períodos de tiempo para detectar fragmentos de hibridación y visualizar patrones de peso molecular. A continuación se capturaron digitalmente las imágenes fotografiando las películas de rayos X y/o
15 detectándolas con un instrumento Lumi-Imager™ (Roche, Indianapolis, IN). Para cada sonda se documentaron los tamaños de las bandas detectadas. Se utilizó análisis por transferencia Southern como medio para verificar la presencia de la inserción en las plantas de ensayo y confirmar que todas las plantas con el evento DAS-59122-7 contenían la misma inserción, como se muestra en la Tabla 1. (Las transferencias Southern no se muestran). Los análisis por transferencia Southern indicaron que el evento DAS-59122-7 contenía una única inserción que consistía
20 en una copia intacta de la región del T-DNA del plásmido PHP 17662, mientras que los segregantes nulos, determinados por análisis de expresión de proteínas no se hibridaron con las sondas de genes. Además, las plantas con el evento DAS-59122-7 que expresaban las dos proteínas exhibieron patrones de hibridación idénticos en las transferencias Southern (datos no mostrados). Específicamente, la sonda del gen Cry34Ab1 se hibridó con el fragmento de T-DNA interno esperado de 1,915 kb, la sonda del gen Cry35Ab1 se hibridó con el fragmento de T-DNA interno esperado de 2,607 kb y la sonda del gen PAT se hibridó con un fragmento del borde de 3,4 kb coherente con una única inserción intacta de T-DNA determinada por los resultados de transferencia Southern.
Ejemplo 4. Secuenciación de las regiones de los bordes flanqueantes y del inserto T-DNA de la línea DAS-59122-7 de maíz con Cry34/35Ab1 de Bacillus thuringiensis
Las regiones de los bordes flanqueantes y del inserto T-DNA se clonaron en el evento DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de B.t. utilizando métodos basados en PCR como los representados en diagramas en las Figuras 2 y
3. Específicamente, las secuencias que bordean los extremos 5’ y 3’ del inserto en el evento DAS-59122-7 se obtuvieron utilizando dos técnicas de desplazamiento sobre el genoma. El primer método de desplazamiento era esencialmente el método descrito para el Universal Genome Walker Kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) y el segundo método se realizó de acuerdo con el protocolo splinkerette descrito por Devon et al., (1995) Nucleic Acids Research 23 (9):1644-1645, con las modificaciones descritas por Stover (2001), U.C. Irvine (comunicación personal).
En pocas palabras, el DNA genómico fue digerido con diversas enzimas de restricción (Dra I, EcoR V, Pvu II, Sma I y Stu I para el método de Universal Genome Walker y BamH I, EcoR I, Hind III y Xba I para el método splinkerette) y a continuación ligado a adaptadores de extremos romos para el método de Genome Walker y a adaptadores específicos para la enzima de restricción utilizada para el método splinkerette. Se diseñaron los adaptadores para ambos métodos de desplazamiento sobre el genoma para evitar la extensión del extremo 3’ del adaptador durante la PCR y por lo tanto reducir o eliminar la amplificación no específica. Los fragmentos de DNA genómico ligados al adaptador se denominaron a continuación genotecas de desplazamiento sobre el genoma o genotecas de splinkerette, una genoteca para cada enzima de restricción. Las genotecas se prepararon a partir de DNA genómico aislado de tres plantas T1S2 individuales con el evento DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de B.t.; plantas T1S2 1 con DAS-59122-7, T1S2 2 con DAS-59122-7 y T1S2 10 con DAS-59122-7 y de una planta de control Hi-II y una planta de control PH09B.
Después de la construcción de las genotecas, se completaron las amplificaciones por PCR anidadas para amplificar la secuencia diana utilizando Advantage™-GC Genomic PCR kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). La amplificación por PCR primaria utilizó un cebador con identidad para el adaptador y un cebador específico del gen. El cebador adaptador no amplificará un producto en el primer ciclo de la PCR primaria y sólo se obtendrán productos a partir del cebador específico del gen. La asociación y la amplificación a partir del cebador adaptador sólo tienen lugar después que se ha producido la cadena complementaria a partir del cebador específico del gen. Después de la amplificación por PCR primaria, se realizó una PCR anidada secundaria para aumentar la especificidad de las reacciones genómicas de la PCR. Los cebadores anidados consistieron en secuencias específicas de los genes y específicas del adaptador internas para los respectivos cebadores utilizados en la PCR primaria.
Para las secuencias de los bordes flanqueantes en 5', se inició la PCR anidada utilizando cebadores específicos para el extremo 5' del T-DNA insertado junto con cebadores complementarios a la secuencia del adaptador ligada al DNA digerido. Similarmente, la clonación de la secuencia del borde flanqueante en 3’ comenzó con un cebador específico para el extremo 3' del T-DNA insertado y un cebador complementario a la secuencia del adaptador. Se utilizaron secuencias de DNA internas a las secuencias del borde derecho y del borde izquierdo de T-DNA dentro de la región de T-DNA como puntos de partida para el "desplazamiento" sobre la secuencia genómica del maíz, debido a que representaban una secuencia única (no homólogas con las secuencias genómicas endógenas de maíz) a partir de la cual se anclan los cebadores que se desplazan sobre el genoma.
Los productos obtenidos por la PCR anidada se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (datos no mostrados). Para una caracterización adicional se identificaron fragmentos visibles en las genotecas preparadas a partir de una o más muestras de DNA con el evento DAS-59122-7 y ausentes en las genotecas preparadas a partir de las muestras de DNA genómico de Hi-II y PH09B. Los fragmentos amplificados por PCR identificados se separaron por electroforesis en gel preparatoria, se aislaron utilizando un QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) y se enviaron directamente para secuenciación o se clonaron en un vector plásmido pGEM-T Easy usando el pGEM-T Easy Vector System I (Promega Corp., Madison, WI) antes de la secuenciación del DNA. Las reacciones de secuenciación se realizaron con cebadores utilizados para la amplificación por PCR anidada o con cebadores específicos para uso con el vector pGEM-T Easy. La secuencia obtenida se utilizó para diseñar cebadores específicos de genes adicionales para continuar el "desplazamiento" sobre la secuencia genómica del maíz desconocida. Se realizaron múltiples rondas de desplazamientos genómicos hasta que se obtuvieron al menos 500 pb de la secuencia del borde de los extremos del inserto de T-DNA.
Con el fin de garantizar la validez de las secuencias de los bordes flanqueantes, se realizaron amplificaciones por PCR específicas de eventos adicionales en el DNA genómico a partir del evento DAS-59122-7. Se secuenciaron los fragmentos amplificados con el fin de ampliar aún más la región de solapamiento de secuencias a partir de la región del inserto de T-DNA en el DNA genómico flanqueante en 5' y 3'. Los cebadores, mostrados en la Tabla 2, se diseñaron basándose en la secuencia obtenida a partir de los experimentos de desplazamiento sobre el genoma para amplificar un fragmento que abarcaba la unión única del T-DNA con el DNA genómico de maíz. El conjunto de cebadores 03-O-506/02-O-476 (SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:9) abarcaba la unión en 5' y amplificaba un fragmento de 313 pb (desde el pb 2427 hasta el pb 2739, véase la Figura 1) y el conjunto de cebadores 02-O-447/03-O-577 (SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:17) abarcaba la unión en 3' y amplificaba un fragmento de 754 pb (desde el pb 9623 hasta el pb 10376, véase la Figura 1).
Tabla 2. Secuencias de cebadores
- Nombre del cebador
- Secuencia (5'-3') Localización de la secuencia diana (pb hasta pb)1
- 02-O-215
- (SEQ ID NO:1) GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC 2743-2716
- 02-O-219
- (SEQ ID NO:2) CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG 9830-9858
- 02-O-227
- (SEQ ID NO:3) AATTGAGCGCTTGCACGTTT 9846-9827
- 02-O-370
- (SEQ ID NO:4) AACAACAAGACCGGCCACACCCTC 4871-4894
- 02-O-371
- (SEQ ID NO:5) GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA 5187-5163
- 02-O-372
- (SEQ ID NO:6) TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA 7017-7044
- 02-O-373
- (SEQ ID NO:7) GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA 7897-7873
- 02-O-447
- (SEQ ID NO:8) AACCCTTAGTATGTATTTGTATT 9623-9645
- 02-O-476
- (SEQ ID NO:9) CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG 2739-2714
- 03-O-506
- (SEQ ID NO:10) TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG 2427-2451
- 03-O-514
- (SEQ ID NO:11) GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT 2687-2709
- 03-O-542
- (SEQ ID NO:12) GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC 10766-10742
- 03-O-543
- (SEQ ID NO:13) CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA 2451-2427
- 03-O-564
- (SEQ ID NO:14) CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC 2324-2299
- 03-O-569
- (SEQ ID NO:15) GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA 10150-10174
- 03-O-570
- (SEQ ID NO:16) GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG 10275-10299
- 03-O-577
- (SEQ ID NO:17) CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG 10376-10352
- Nombre del cebador
- Secuencia (5'-3') Localización de la secuencia diana (pb hasta pb)1
- 03-O-784
- (SEQ ID NO:18) AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC 2189-2213
- 67609
- (SEQ ID NO:36) CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG 9862-9886
- 69240
- (SEQ ID NO:37) GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG 9941-9965
- 1. Localización en la secuencia del evento DAS-59122-7 (véase la Figura 1). Bases 1 - 2593 = borde en 5', bases 2594 - 9936 = inserto de T-DNA, bases 9937 - 11922 = borde en 3'.
Para la verificación de la secuencia de DNA que se insertó en el genoma del maíz, se realizó una PCR para amplificar, clonar y secuenciar el T-DNA insertado del evento DAS-59122-7. Se utilizaron los conjuntos de cebadores para PCR (SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:5), (SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:7) y (SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:3) mostrados en la Tabla 3 para amplificar tres fragmentos solapantes etiquetados 22I-1 (SEQ ID NO:25), 22I-2 (SEQ ID NO:26) y 22I-3 (SEQ ID NO:27) que representan la secuencia desde la región 5' del T-DNA hasta la región 3' del inserto de T-DNA desde el pb 2687 hasta el pb 9846 para el evento DAS-59122-7 (véase la Figura 1). En la Tabla 3 se recoge la información del amplicón de PCR y en la Tabla 2 se recogen las secuencias de cebadores.
Tabla 3. Descripciones de cebadores y amplicones de PCR
- Amplicón de PCR
- Tamaño (pb) Secuencia diana Cebador directo Cebador inverso Localización del amplicón de PCR (pb hasta pb)1
- 22I-1 (SEQ ID NO:25)
- 2501 Inserto de T-DNA 03-O-514 (SEQ ID NO:11) 02-O-371 (SEQ ID NO:5) 2687 -5187
- 22I-2 (SEQ ID NO:26)
- 3027 Inserto de T-DNA 02-O-370 (SEQ ID NO:4) 02-O-373 (SEQ ID NO:7) 4871 -7897
- 22I-3 (SEQ ID NO:27)
- 2830 Inserto de T-DNA 02-O-372 (SEQ ID NO:6) 02-O-227 (SEQ ID NO:3) 7017 -9846
- O784/O564 (SEQ ID NO:28)
- 136 Borde genómico en 5' 03-O-784 (SEQ ID NO:18) 03-O-564 (SEQ ID NO:14) 2189 -2324
- O784/O543 (SEQ ID NO:29)
- 263 Borde genómico en 5' 03-O-784 (SEQ ID NO:18) 03-O-543 (SEQ ID NO:13) 2189-2451
- O569/O577 (SEQ ID NO:30)
- 227 Borde genómico en 3' 03-O-569 (SEQ ID NO:15) 03-O-577 (SEQ ID NO:17) 10150 -10376
- O570/O542 (SEQ ID NO:31)
- 492 Borde genómico en 3’ 03-O-570 (SEQ ID NO:16) 03-O-542 (SEQ ID NO:12) 10275 -10766
- O784/O215 (SEQ ID NO:32)
- 555 Unión en 5' 03-O-784 (SEQ ID NO:18) 02-O-215 (SEQ ID NO:1) 2189 -2743
- O219/O577 (SEQ ID NO:33)
- 547 Unión en 3' 02-O-219 (SEQ ID NO:2) 03-O-577 (SEQ ID NO:17) 9830 -10376
- O506/O476 (SEQ ID NO:34)
- 313 Unión en 5' 03-O-506 (SEQ ID NO:10) 02-O-476 (SEQ ID NO:9) 2427 -2739
- O447/O577 (SEQ ID NO:35)
- 754 Unión en 3' 02-O-447 (SEQ ID NO:8) 03-O-577 (SEQ ID NO:17) 9623 -10376
- 67609/69240 (SEQ ID NO:38)
- 104 Unión en 3' 67609 (SEQ ID NO:36) 69240 (SEQ ID NO:37) 9862 -9965
- 1. Localización en la secuencia del evento DAS-59122-7 (véase la Figura 1). Bases 1 - 2593 = borde en 5', bases 2594 - 9936 = inserto de T-DNA, bases 9937 - 11922 = borde en 3'.
Se utilizó el kit de polimerasa PCR GC2 Advantage™ (BD Biosciences Clontech, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante para amplificar los fragmentos de inserción (22I-1 (SEQ ID NO:25), 22I-2 (SEQ ID NO:26) y 22I-3 (SEQ ID NO:27)). En pocas palabras, una mezcla de reacción de 50 µL contenía cebadores en 5' y 3' a una concentración 5 final de 0,2 µM y 40 ng de DNA genómico. Las PCR se realizaron por duplicado utilizando una preparación de DNA genómico de las plantas T1S2 1 con DAS-59122-7 y T1S2 2 con DAS-59122-7. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95ºC durante 1 minuto, seguido por 35 ciclos de 94º/95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 5 minutos, con una extensión final a 68ºC durante 6 minutos. Los productos de amplificación por PCR se visualizaron bajo luz UV, seguido de electroforesis a través de un gel de
10 agarosa al 1% en TBE 1X (Tris- borato 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) teñido con bromuro de etidio.
Los fragmentos de PCR 22I-1 (SEQ ID NO:25), 22I-2 (SEQ ID NO:26) y 22I-3 (SEQ ID NO:27) se purificaron por escisión de los fragmentos de gel de agarosa al 0,8% en TBE 1X teñido con bromuro de etidio y purificación del fragmento de la agarosa utilizando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Los fragmentos de PCR se clonaron en un vector plasmídico pGEM-T Easy usando el pGEM-T Easy Vector System I (Promega Corp.). Los 15 fragmentos clonados se verificaron por minipreparación del DNA del plásmido (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen) y digestión con restricción con Not I. Los clones del plásmido y/o fragmentos de inserción de PCR purificados se
usaron a continuación para la secuenciación del inserto completo. Las reacciones de secuenciación se realizaron con cebadores diseñados para ser específicos para las secuencias conocidas de T-DNA o con cebadores específicos para el uso con el vector pGEM-T Easy. Sigma - Genosys, Inc. (The Woodlands, TX) sintetizó todos los cebadores de PCR, que se usaron a una concentración final de 0,2-0,4 µM en las PCR.
Las PCR con DNA genómico aislado de los eventos DAS-59122-7, DAS-45214-4 y DAS-45216-6 con Cry34/35Ab1 de B.t., y las líneas de control sin modificar Hi-II y PH09B se utilizaron para confirmar (1) la presencia de DNA genómico de maíz en las regiones de los bordes secuenciadas del evento DAS-59122-7 y (2) la amplificación específica de los eventos través de las uniones del inserto de T-DNA y los bordes del DNA genómico en el evento DAS-9122 -7.
Los cebadores de PCR diseñados para amplificar la secuencia del borde que flanquea el inserto en el evento DAS59122-7 se utilizaron para confirmar la presencia de las regiones en líneas de control no modificadas así como en el evento DAS-59122-7. Se analizaron dos (2) conjuntos de cebadores para cada uno de los bordes en 5' y 3' (cuatro
(4) conjuntos en total). Los conjuntos de cebadores 03-O-784/03-O-564 (SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:14) y 03-O784/03-O-543 (SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:13) se usaron para amplificar fragmentos de 136 pb y 263 pb, respectivamente, desde la secuencia del borde en 5’ hasta el inserto de T-DNA en el evento DAS-59122-7 (Figuras 2 y 3). Igualmente, los conjuntos de cebadores 03-O-569/03-O-577 (SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:17) y 03-O-570/03O-542 (SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:12) se usaron para amplificar fragmentos de 227 pb y 492 pb, respectivamente,
desde el borde genómico en 3’ (Figuras 2 y 3).
Los cebadores diseñados para amplificar fragmentos por la unión de la secuencia de borde y el inserto de T-DNA se utilizaron para establecer fragmentos de PCR específicos de eventos para el evento DAS-59122-7. Para cada una de las dos uniones se seleccionó un conjunto de cebadores. El conjunto de cebadores 03-O-784/02-O-215 (SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:1) se diseñó para amplificar un fragmento de 555 pb por la unión en 5' y el conjunto de cebadores 02-O-219/03-O-577 (SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:17) se diseñó para la amplificación de un fragmento de 547 pb por la unión en 3'. Se utilizó un conjunto de cebadores, IVR1 (O197) (SEQ ID NO:39) 5'-CCGCTGTATCAC AAGGGCTGGTACC-3' e IVR2 (O198) (SEQ ID NO:40) 5'-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3', basados en el gen endógeno de la invertasa de maíz (Hurst et al., (1999) Molecular Breeding 5 (6): 579-586) para generar un producto de amplificación de 226 pb como control positivo interno para todas las muestras de DNA genómico de maíz.
Todos los cebadores de la PCR fueron sintetizados por Sigma-Genosys, Inc. y se utilizaron a una concentración final de 0,2-0,4 µM en las PCR. Las secuencias de los cebadores de PCR se recogen en la Tabla 2. Para amplificaciones por PCR, se utilizó el Advantage™-GC 2 PCR Kit (BD Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron aproximadamente 10-100 ng de molde de DNA genómico por PCR de 50 µL. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial del molde a 94ºC durante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos, con extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Los productos de amplificación por PCR se visualizaron bajo luz UV seguido de electroforesis en un gel de agarosa al 1% en TBE 1X y bromuro de etidio.
Los datos de las secuencias obtenidos para el inserto de T-DNA y las regiones de los bordes del evento DAS-591227 se revisaron y reunieron utilizando el programa informático Seqman II™ Versión 4.0.5 (DNAStar, Inc., Madison, WI). Las secuencias de los bordes 5' y 3' que flanquean el inserto presente en el evento DAS-59122-7 se utilizaron para la búsqueda de homología frente a las bases de datos públicas de GenBank con el fin de caracterizar adicionalmente el sitio de inserción en el genoma del maíz. El análisis para identificar marcos de lectura abiertos en las regiones de unión entre los bordes flanqueantes y el inserto de T-DNA en el evento DAS-59122-7 se realizó utilizando Vector NTI 8.0 (InforMax™, Inc., Frederick, MD).
En total, se confirmaron 11922 pb de la secuencia del DNA genómico del evento DAS-59122-7 (véase la Figura 1). En el extremo 5' del inserto de T-DNA, se identificaron 2593 pb de la secuencia del borde flanqueante y se obtuvieron 1986 pb de la secuencia del borde flanqueante en el extremo 3' a partir de fragmentos obtenidos de los experimentos de desplazamiento sobre el genoma. Un total de 7160 pb del inserto de T-DNA se clonó y secuenció usando conjuntos de cebadores de PCR diseñados para amplificar tres fragmentos solapantes etiquetados 22I-1 (2501 pb) (SEQ ID NO:25), 22I-2 (3027 pb) (SEQ ID NO:26) y 22I-3 (2830 pb) (SEQ ID NO:27) que representaban la secuencia desde la región 5' del T-DNA que va hasta la región 3' del inserto de T-DNA para el evento DAS- 59122-7 desde el pb 2687 hasta el pb 9846 (véase la Figura 1). El resto de la región del inserto de T-DNA se secuenció a partir de dos fragmentos de PCR, O506/O476 (SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:9) y O447/O577 (SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:17) que abarcaban las uniones a 5' y 3', respectivamente, del inserto de T-DNA con el DNA genómico de maíz. Los cebadores usados se diseñaron basándose en la secuencia obtenida en los experimentos de desplazamiento sobre el genoma para amplificar un fragmento que abarcaba la unión única del T-DNA con el DNA genómico de maíz. El conjunto de cebadores 03-O-506/03-O-476 (SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:9) abarcaba la unión a 5' y amplificó un fragmento de 313 pb (desde el pb 2427 hasta el pb 2739) y el conjunto de cebadores 03-O-447/03-O-577 (SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:17) abarcaba la unión a 3' y amplificó un fragmento de 754 pb (desde el pb 9623 hasta el pb 10376). En combinación, un total de 7343 pb del inserto de T-DNA en el evento DAS-59122-7 se clonó y secuenció (desde el pb 2594 hasta el pb 9936, véase la Figura 1) y se comparó con la secuencia del plásmido transformante, PHP 17662. Se observaron dos diferencias de nucleótidos en el pb 6526 y en el pb 6562 en la región del promotor de peroxidasa de trigo no traducida del inserto de T-DNA (véase la Figura 1). Ninguno de los cambios de bases observado afectó a la composición del marco de lectura abierto del inserto de T-DNA. Se encontró que tanto las regiones de los extremos 3’ como las de 5’ del inserto de T-DNA estaban intactas, excepto por la deleción de los últimos 22 pb en el extremo 5’ y los 25 pb en el extremo 3' incluyendo las regiones de los bordes izquierdo y derecho del T-DNA, respectivamente. Aunque se sabe que las secuencias de los bordes de T-DNA desempeñan un papel crítico en la inserción de T-DNA en el genoma, no se esperaba este resultado puesto que las inserciones son frecuentemente imperfectas, en particular en el borde izquierdo de T-DNA (Tinland (1996) Trends in Plant Science 1(6):178-184).
El análisis con el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de las regiones de los bordes genómicos del evento DAS-59122-7 mostró una homología limitada con las secuencias disponibles públicamente (Release 138.0 GenBank, Oct 25, 2003). El análisis de la región del borde 5’ encontró dos zonas con homología significativa con las secuencias genómicas y EST (Expressed Sequence Tag) de maíz. La primera zona abarca 179 pb (desde el pb 477 hasta el pb 655 de la secuencia del borde) y muestra similitud con varios marcadores moleculares, secuencias cromosómicas y secuencias de consenso obtenidos por alineación de varias EST. La segunda zona se produce en
el pb 1080 hasta el pb 1153 (74 pb) de la secuencia del borde 5’ y muestra similitud con un número de diferentes secuencias EST y genómicas de maíz. La región del borde 3’ tenía también dos pequeñas regiones no contiguas similares a las secuencias del DNA de la planta. La región interior en 3’ de 162 pb (desde el pb 9954 hasta el pb 10115) mostró similitud con el extremo no traducido en 3' de dos genes genómicos de la alcohol-deshidrogenasa (adh1) de Zea mays así como con varias secuencias de consenso de EST. Una región más pequeña (57 pb) en el centro del borde 3’ (desde el pb 10593 hasta el pb 10649) mostró similitud con regiones no codificadoras de múltiples secuencias genómicas de maíz.
En general, no se identificaron regiones homólogas mayor que 179 pares de bases en ninguna de las secuencias de bordes genómicas, ni se encontró más de una región homóloga procedente de la misma secuencia conocida. Se examinaron entradas individuales que mostraban similitud con las secuencias de los bordes del evento DAS-591227 para determinar si la inserción en el evento DAS-59122-7 tenía lugar en una secuencia codificadora de proteínas caracterizadas. Ninguna de las regiones de similitud se encontraba dentro de ninguna de las secuencias codificadoras de proteínas conocidas. La alineación local de toda la secuencia del plásmido de transformación, PHP17662, con las secuencias de los bordes del evento DAS-59122-7 no mostró homologías significativas, lo que indica que las regiones de los bordes que flanquean el inserto de T-DNA no contenían fragmentos del plásmido transformante. Por consiguiente, la identificación y caracterización de la secuencia genómica que flanquea el sitio de inserción en el evento DAS-59122-7 eran limitadas debido a la ausencia de regiones significativas de homología con secuencias conocidas.
Se analizaron las regiones de unión a 5’ y 3’ entre la secuencia del borde genómico de maíz y el inserto de T-DNA en el evento DAS-59122-7 para determinar la presencia de nuevos marcos de lectura abiertos. No se identificó ningún marco de lectura abierto de tamaño significativo (> 100 aminoácidos) en las regiones de unión al borde 5’ o 3’, lo que indicaba que no se generaron nuevos marcos de lectura abiertos como resultado de la inserción de T-DNA. Adicionalmente, las búsquedas de homología no indicaron la presencia de marcos de lectura abiertos endógenos de maíz en las regiones de los bordes que pudieran haber sido interrumpidos por la inserción de T-DNA en el evento DAS-59122-7 con Cry34/35Ab1 de B.t.
Ejemplo 5. Cebadores de la PCR
Se utilizaron pares de cebadores específicos del DNA del evento para producir un amplicón indicativo de la presencia de DAS-59122-7. Estos pares de cebadores de eventos incluyen, aunque sin limitación, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17; y SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37. Además de estos pares de cebadores, cualquier par de cebadores procedentes de SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, que cuando se utilizan en una reacción de amplificación de DNA producen un amplicón de DNA indicativo de la presencia de DAS-59122-7, son una realización de la presente invención. Cualquier modificación de estos métodos que utilizan cebadores de DNA o sus complementos para producir una molécula de DNA amplicón indicativo de la presencia de DAS-59122-7 está dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica. Además, se incluyen como patrones internos para las condiciones de reacción, pares de cebadores de control, que incluyen IVR1(O197)/IVR2(O198) (SEQ ID NO:39/SEQ ID NO:40) para amplificación de un gen endógeno de maíz.
El análisis de los extractos de DNA de tejidos de plantas para determinar la presencia del evento DAS-59122-7 debe incluir un extracto de DNA de tejido positivo de control (una muestra de DNA que se sabe que contiene las secuencias transgénicas). Una amplificación esperada del control positivo demuestra que la PCR se realizó en condiciones que permiten la amplificación de secuencias diana. También debe incluirse un control de extracto de DNA negativo, o de tipo natural, en el que el DNA molde proporcionado es DNA genómico preparado a partir de una planta no transgénica o es una planta transgénica pero que no contiene DAS-59122-7. Adicionalmente, un control negativo que no contiene extracto de DNA molde de maíz será un indicador útil de los reactivos y las condiciones utilizados en el protocolo de la PCR.
Las moléculas de cebadores de DNA adicionales de longitud suficiente pueden ser seleccionadas de SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22 por los expertos en la técnica de métodos de amplificación de DNA y las condiciones ser optimizadas para la producción de un amplicón indicativo de la presencia del evento DAS-59122-7. El uso de estas secuencias de cebadores de DNA con modificaciones de los métodos mostrados en estos Ejemplos está dentro del alcance de la invención. El amplicón, en el que al menos una molécula de cebador de DNA de longitud suficiente procedente de SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22 que es indicativa de la presencia del evento DAS-59122-7, es una realización de la invención. El amplicón, en el que al menos un cebador de DNA de longitud suficiente procedente de cualquiera de los elementos genéticos de PHI17662A que es indicativo de la presencia del evento DAS-59122-7, es una realización de la invención. El ensayo del amplicón de DAS-59122-7 se puede realizar utilizando un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin - Elmer 9700 o un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient o por métodos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica.
<110> Pioneer Hi-Bred International, Inc. Dow AgroSciences LLC E. I. DuPont de Nemours & Co.
<120> EVENTO DAS-59122-7 DE MAÍZ Y MÉTODOS PARA SU DETECCIÓN
<130> 1895-PCT
<150> 60/614.225
<151>
<160> 40
<170> FastSEQ for Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleótido
<400> 1 gtggctcctt caacgttgcg gttctgtc 28
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleótido
<400> 2 cgtgcaagcg ctcaattcgc cctatagtg 29
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleótido
<400> 3 aattgagcgc ttgcacgttt 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador oligonucleótido
- <400> 4 aacaacaaga ccggccacac cctc
- 24
- <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 5 gaggtggtct ggatggtgta ggtca
- 25
- <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 6 tacaacctca agtggttcct cttcccga
- 28
- <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 7 gaggtctgga tctgcatgat gcgga
- 25
- <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 8 aacccttagt atgtatttgt att
- 23
- <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 9 ctccttcaac gttgcggttc tgtcag
- 26
- <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 10 ttttgcaaag cgaacgattc agatg
- 25
- <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 11 gcgggacaag ccgttttacg ttt
- 23
- <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 12 gacgggtgat ttatttgatc tgcac
- 25
- <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 13 catctgaatc gttcgctttg caaaa
- 25
- <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 14 ctacgttcca atggagctcg actgtc
- 26
- <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 15 ggtcaagtgg acacttggtc actca
- 25
- <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 16 gagtgaagag ataagcaagt caaag
- 25
- <210> 17 <211> 25
- <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- 5
- <400> 17 catgtatacg taagtttggt gctgg 25
- 10
- <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 18 aatccacaag attggagcaa acgac
- 25
- 15
- <210> 19 <211> 2593 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- 20
- <220> <223> secuencia flanqueante en 5' de DAS 59122-7.
- <400> 19
<210> 20
<211> 1986
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia flanqueante en 3' de DAS 59122-7.
<400> 20 <210> 21
<211> 3594
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia que representa parte del inserto PHI17662A así como la secuencia flanqueante en 5' del inserto.
<400> 21
<210> 22
<211> 2987
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia que representa parte del inserto PHI17662A así como la secuencia flanqueante en 3' del inserto.
<400> 22 <210> 23
<211> 11922
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> La secuencia representa la secuencia completa del inserto y las regiones flanqueantes del evento DAS 59122-7.
<400> 23
<210> 24
<211> 7390
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> <223> Esta secuencia representa la molécula DNA usada para transformar la línea de maíz DAS59122-7 y representa el inserto PHI 17662A.
<221> característica_miscelánea
<222> (1)...(25)
<223> Borde derecho de T-DNA
<221> característica_miscelánea
<222> (7366) ... (7390)
<223> Borde izquierdo de T-DNA
<400> 24
<210> 25
<211> 2501
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 221-1 de PCR
<400> 25
<210> 26
<211> 3027
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 221-2 de PCR.
<400> 26
<210> 27
<211> 2830
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 221-3 de PCR.
<400> 27
<210> 28
<211> 136
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 0784/0564 de PCR
<400> 28
<210> 29
<211> 263
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 0784/0543 de PCR
<400> 29
<211> 227
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> 15 <223> Amplicón 0569/0577 de PCR
<400> 30
<210> 31
<211> 492 20 <212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 0570/0542 de PCR
<400> 31
<210> 32
<211> 555
<212> DNA 30 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 0784/0215 de PCR
<400> 32
<210> 33
<211> 547
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 0219/0577 de PCR
<400> 33
<211> 243
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> 15 <223> Amplicón 0506/0476 de PCR
<400> 34
<210> 35
<211> 754 20 <212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Amplicón 0447/0577 de PCR
<400> 35
- <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 36
- cgtattacaa tcgtacgcaa ttcag
- 25
- <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Cebador oligonucleótido
- <400> 37
- ggataaacaa acgggaccat agaag
- 25
- <210> 38 <211> 104 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Amplicón de la SEQ ID NOs: 36 y 37
- <400> 38
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador IVR1 (0197) usado para generar un amplicón 226 bp como un control positivo interno
<400> 39
ccgctgtatc acaagggctg gtacc 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador IVR2 (0198) usado para general un amplicón 226 bp como un control positivo interno
<400> 40
ggagcccgtg tagagcatga cgatc 25
Claims (28)
- REIVINDICACIONES1. Una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:23;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y
- (c)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22.
-
- 2.
- Un kit para identificar el evento DAS-59122-7 en una muestra biológica que detecta una región específica de DAS-59122-7, comprendiendo dicho kit al menos un primer cebador, que reconoce una secuencia dentro de la SEQ ID NO:19 o dentro de la SEQ ID NO:20, y que comprende además al menos un segundo cebador que reconoce una secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia SEQ ID NO:24 .
-
- 3.
- El kit de la reivindicación 2, en donde dichos al menos primero y segundo cebadores, respectivamente, comprenden un par de secuencias seleccionadas de:
- (a)
- las secuencias SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1;
- (b)
- las secuencias SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9;
- (c)
- las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17;
- (d)
- las secuencias SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17; y
- (e)
- las secuencias SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37.
-
- 4.
- Un kit de detección de DNA específico para el DNA de unión del evento DAS-59122-7 de maíz y su progenie, que comprende al menos una molécula de DNA de una longitud suficiente de polinucleótidos de DNA contiguos para funcionar en un método de detección de DNA, en donde dicha molécula de DNA se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de DNA de unión del evento DAS-59122-7 de maíz, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante, y no se hibrida en dichas condiciones de hibridación rigurosas con un DNA de planta de maíz que no es DAS-59122-7 y dicha molécula de DNA es homóloga o complementaria de una secuencia seleccionada de:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y
- (b)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22.
-
- 5.
- Un método para identificar el evento DAS-59122-7 en una muestra biológica, que comprende detectar una región específica de DAS-59122-7 por amplificación de un fragmento de DNA de un ácido nucleico presente en dicha muestra biológica usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, en donde un primer cebador reconoce una secuencia dentro de la SEQ ID NO:19 o la SEQ ID NO:20, y un segundo cebador reconoce una secuencia dentro de la SEQ ID NO:24.
-
- 6.
- El método de la reivindicación 5, en donde dichos primero y segundo cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1, respectivamente.
-
- 7.
- El método de la reivindicación 5, en donde dichos primero y segundo cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9, respectivamente.
-
- 8.
- El método de la reivindicación 5, en donde dichos primero y segundo cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17, respectivamente.
-
- 9.
- El método de la reivindicación 5, en donde dichos primero y segundo cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17, respectivamente.
-
- 10.
- El método de la reivindicación 5, en donde dichos primero y segundo cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO:36 y la SEQ ID NO:37, respectivamente .
-
- 11.
- Un método para detectar la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz o su progenie en una muestra biológica, que comprende:
- (a)
- extraer una muestra de DNA de dicha muestra biológica;
- (b)
- proporcionar un par de moléculas de cebadores de DNA seleccionado de:
- (i)
- las secuencias SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:1;
- (ii)
- las secuencias SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:9;
(iii) las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:17; y(iv) las secuencias SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:17;- (c)
- proporcionar condiciones de reacción de amplificación del DNA;
- (d)
- realizar dicha reacción de amplificación de DNA, produciendo con ello una molécula de amplicón de DNA; y
- (e)
- detectar dicha molécula de amplicón de DNA, en donde la detección de dicha molécula de amplicón de DNA en dicha reacción de amplificación de DNA indica la presencia del evento DAS-59122-7 de maíz.
-
- 12.
- Una molécula de DNA aislada que comprende uno cualquiera de los amplicones producidos por el método de la reivindicación 11.
-
- 13.
- Un método para detectar la presencia de DNA correspondiente al evento DAS-59122-7 en una muestra, comprendiendo el método:
- (a)
- poner en contacto la muestra que comprende DNA de maíz con una sonda de polinucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con DNA de unión del evento DAS-59122-7 de maíz, dicho DNA de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante, y no se hibrida bajo dichas condiciones de hibridación rigurosas con un DNA de planta de maíz que no es DAS-59122-7 y dicha sonda es de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios de una secuencia seleccionada de:
- (i)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:21; y
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:22;
- (b)
- someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y
- (c)
- detectar la hibridación de la sonda con el DNA de unión, en donde la detección de la hibridación indica la presencia del evento DAS-5912-7.
-
- 14.
- Un par de moléculas de DNA que comprende:una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en donde las moléculas de DNA tienen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de:
- (a)
- la secuencia descrita en la SEQ ID NO:21 o su complemento; y
- (b)
- la secuencia descrita en la SEQ ID NO:22 o su complemento;
en donde el par de moléculas de DNA es capaz de amplificar, en una reacción en cadena de la polimerasa, un amplicón que comprende una región específica de DAS-59122-7 procedente del evento DAS-59122-7 de maíz y su progenie, en donde dicha región específica de DAS-59122-7 comprende al menos una secuencia de unión dentro de la SEQ ID NO:23, y dicha secuencia de unión abarca la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante. -
- 15.
- Un par de moléculas de DNA de la reivindicación 14, en donde cada molécula de DNA es un cebador que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37 o sus complementos.
-
- 16.
- Un par de moléculas de DNA de la reivindicación 15, en donde cada cebador comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:2, 8, 9, 10, 17 y 18 o sus complementos.
-
- 17.
- Una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de unión que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos.
-
- 18.
- Un método para confirmar la pureza de semillas, que comprende la detección de una región específica de DAS59122-7 con un cebador o sonda específico que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de unión dentro de la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:22, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante o su complemento, en una muestra de semillas, y no se hibrida en dichas condiciones de hibridación rigurosas con el DNA de una planta de maíz que no es no DAS-59122-7.
-
- 19.
- Un método para cribar semillas para detectar la presencia del evento DAS-59122-7, que comprende la detección de una región específica de DAS-59122-7 con un cebador o sonda específico que se hibrida específicamente en
condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de unión dentro de la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:22, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueanteo su complemento, en una muestra de un lote de semillas, y no se hibrida en dichas condiciones de hibridación rigurosas con el DNA de una planta que no es DAS-59122-7. -
- 20.
- Una planta de maíz resistente a los insectos, en donde el DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:23 forma parte del genoma de la planta.
-
- 21.
- Una planta descendiente de la planta de maíz resistente a los insectos de la reivindicación 20, en donde el DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:23, forma parte del genoma de la planta.
-
- 22.
- Semilla de una planta de la reivindicación 20 o 21, en donde dicha semilla comprende la SEQ ID NO:23.
-
- 23.
- Un método para detectar la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7 en el tejido de maíz que comprende:
- (a)
- seleccionar un par de cebadores comprendiendo cada uno AL menos diez nucleótidos de la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:22, en donde cada miembro del par está en lados opuestos de una secuencia indicativa de la presencia de dicha inserción del evento DAS-59122-7, comprendiendo dicha secuencia al menos una secuencia de unión de DAS-59122-7;
- (b)
- poner en contacto una muestra de dicho tejido de maíz con dicho par de cebadores; y
- (c)
- realizar la amplificación del DNA y analizar los amplicones.
-
- 24.
- El método de la reivindicación 23, en donde cada cebador de dicho par se selecciona de las SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 30, 36 y 37 o sus complementos.
-
- 25.
- Un método para detectar la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7 en el tejido de maíz, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra de dicho tejido de maíz con una sonda de polinucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una o más secuencias de DNA seleccionadas de las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos, en donde la sonda se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante en 5' o 3' del evento DAS-59122-7 y también comprende una parte del DNA extraño contiguo a dicha región;
- (b)
- someter dichas muestra y sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y
- (c)
- analizar la hibridación de la sonda .
-
- 26.
- Un kit de detección de DNA que comprende una sonda de polinucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una o más secuencias de DNA seleccionadas de las SEQ ID NO:32, 33, 34 y 35 y sus complementos, y en donde la sonda se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante en 5'
o 3' del evento DAS-59122-7 y comprende también una parte del DNA extraño contiguo a dicha región. -
- 27.
- Un kit de detección de DNA que comprende un par de cebadores, comprendiendo cada cebador al menos 10 nucleótidos dentro de la SEQ ID NO:21 y la SEQ ID NO:22, en donde cada cebador está en los lados opuestos de una secuencia indicativa de la presencia de la inserción del evento DAS-59122-7, comprendiendo dicha secuencia al menos una secuencia de unión de DAS-59122-7, abarcando dicha secuencia de unión la unión entre el DNA heterólogo insertado en el genoma y el DNA flanqueante.
-
- 28.
- El kit de detección de DNA de la reivindicación 27, en donde cada cebador de dicho par se selecciona de las SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 y 37 y sus complementos.
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