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AT395434B - Verbessertes verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren und reagenzienkombination und besteck zu seiner durchfuehrung - Google Patents

Verbessertes verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren und reagenzienkombination und besteck zu seiner durchfuehrung Download PDF

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AT395434B
AT395434B AT0064388A AT64388A AT395434B AT 395434 B AT395434 B AT 395434B AT 0064388 A AT0064388 A AT 0064388A AT 64388 A AT64388 A AT 64388A AT 395434 B AT395434 B AT 395434B
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probe
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AT0064388A
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Inventor
Hans Erik Soederlund
Arja Marjatta Weckman
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
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Publication date
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Publication of AT395434B publication Critical patent/AT395434B/de

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Description

AT 395 434 B
Die Erfindung betrifft ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken, bei dem die Detektorsonden als modifizierte Primer in Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut werden, bevor die Hybridisierungsreaiktion durchgeführt wird. Außerdem betrifft die Erfindung eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens. S Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Hilfe von
Hybridisierungstechniken, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer in Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuren eingebaut werden, bevor die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Die Erfindung betrifft ferner eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens.
Bei Hybridisierungsreaktionen wird ein markiertes Oligo- oder Polynukleotid, d. h. das Sondenmolekül, über 10 Basenpaarungen an eine nachzu weisende Nukleinsäure angelagert. Verschiedene Hybridisierungsverfahren wurden zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet. Bei direkten Hybridisierungsverfahren befindet sich die Probe entweder in Lösung oder sie ist an einen festen Träger gebunden. Die nachzuweisende Nukleinsäure wird mit einem markierten Sondenmolekül nachgewiesen.
Die US-PS 4 486 539 beschreibt ein Sandwich-Hybridisierungs-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden zwei 15 getrennte Sondenmoleküle verwendet. Eines davon ist eine Detektorsonde. Sie ist markiert und wird zum Nachweis verwendet Die andere ist eine Einfangsonde. Sie ist an einem festen Träg« immobilisiert und dient der Abtrennung der nachzuweisenden Nukleinsäure vom Reaktionsgemisch.
Das Hybridisierungsverfahren in Lösung wird in der GB-OS 2 169 403 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden zwei verschiedene Sondenmoleküle verwendet, die sich in derselben Lösung befinden. Die Detektorsonde 20 wird mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Die Einfangsonde wird mit einer Gruppe versehen, die eine Affinität für einen anderen Bestandteil aufweist. Nach der Hybridisierung wird das zwischen der Einfangsonde, der nachzuweisenden Nukleinsäure und der Detektorsonde gebildete Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abgetrennt
Die enzymatisch katalysierte DNA-Polymerisation, bei der die Nukleotidsequenz eines vorgegebenen 25 Nukleinsäurestranges, d. h. einer Matrize, exaktkopiert wird und dabei der komplementäre Strang synthetisiert wird, ist aus dem Stand der Technik gut bekannt; vgl. z. B. Komberg, „DNA replication“, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 221 - 225 und 670 - 679,1980, und Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 122,1982. Diese biologische Vermehrung wirdbei Hybridisierungs-Nachweisverfahren verwendet, also in Nachweisverfahren, bei denen der nachzuweisende Mikroorganismus gezüchtet und dadurch 30 seine DNA vor der Durchführung des Tests angereichert wird; vgl. z. B. Woo, Methods Enzymol. 68 (1979), S. 389, und US-PS 4 358 535. Spezifische DNA-Sequenzen lassen sich auch in lebenden Zellen amplifizieren, z. B. durch Verwendung geeigneter Arzneistoffe; vgl. z. B. Clewell und Helinski, J. Bacteriol. 110 (1972), S. 1135, und EP-A 55 742. Eine noch spezifischere DNA-Anreicherung wird in der EP-A175 689 beschrieben. Dabei wild die nachzuweisende Nukleinsäure mit einem Plasmid-Replikon verbunden und in eine geeignete Zelle eingeführt. Eine 35 weitere Methode wird in der EP-A 201184 beschrieben. Dabei wird die Primer-abhängige DNA-Synthese in einer in vitro-Reaktion zur Amplifikation der nachzuweisenden DNA benützt. In der EP-A 200 362 wird ein Verfahren zum Nachweis amplifizierter Nukleinsäure-Sequenzen vorgeschlagen, das jedoch insbesondere zur Durchführung von Reihenuntersuchungen nicht schnell, empfindlich und einfach genug ist
Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein schnell und einfach durchführbares Verfahren 40 zum Nachweis von geringen Nukleinsäure-Konzentrationen bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Hybridisierungsverfahrens gelöst, bei dem entweder die Detektorsonden oder die Einfangsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure während einer matrizenabhängigen Polymerisationsreaktion vor der Durchführung der Hybridisierung eingebaut werden, bei dem also die nachzuweisende Nukleinsäure amplifiziert wird. 45 Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mindestens ein Primer benötigt, der immer modifiziert ist. Wenn die
Detektorsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion dienen, weisen die Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierungodermindestens eine spezifischeStelleauf,an diemindestenseinegeeignete,nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
In einer anderen Ausführungsform werden die Einfangsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion 50 verwendet Dabei weisen die Primer mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine geeignete Stelle auf, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.
DieErfindungbetrifftaucheineReagenzienkombinationundeinBesteckzur Durchführungdeserfindungsgemäßen Verfahrens. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Reagenzienkombination in einem unterteilten Behälter. 55 Durch die Verwendung der Detektor- oder Einfangsonden als Primer in einer Polymerisationsreaktion ist es möglich, die Empfindlichkeit der Hybridisierungsreaktion um mehrere Größenordnungen gegenüber Nachweisverfahren zu steigern, bei denen die nachzuweisende Nukleinsäure direkt gemessen wird. Außerdem wird -2-
AT 395 434 B erfindungsgemäß ein bequemes Verfahren zur Durchführung der Hybridisierungsreaktion in Lösung bereitgegestellt, so daß die Hybridmoleküle einfach und schnell aus der Hybridisierungslösung nach der Hybridisierungsieaktion abgetrennt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders brauchbar zur Diagnose bestimmter Krankheiten, die mit S üblichen Verfahren nur sehr schwer zu diagnostizier»! sind. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet zur Identifizierung von Cytomegalie-Viren und HIV- bzw. AIDS-Viren. Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz der modifizierten Primer (Pa und P5) und der selektiven Sondenmoleküle (Sj und S2), die in den Beispielen 1 bis 3 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer (Pa und P5) und der selektiven Sondenmoleküle (Sj und S2) in der in diesem Fall nachzuweisenden 10 Nukleinsäure. Die durchgehenden Linien (A und B) bezeichnen die beiden nachzuweisenden Stränge, die in beiden
Richtungen weitergehen. Die Pfeilspitzen an den Primern (Pa und P|,) bezeichnen die Richtung, in der sie während der Polymerisation verlängert werden.
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz der modifizierten Primer (Pa und Pj,) und des selektiven Sondenmoleküls (S), die in Beispiel 4 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer (Pa und P|,) und IS des selektiven Sondenmoleküls (S) in der in diesem Falle nachzuweisenden Nukleinsäure. Die Linie (A) bezeichnet die RNA und ihre identischen DNA-Kopien und die Linie (B) zeigt die komplementären DNA-Kopien. Die Pfeilspitzen an den Primern (Pa und Pjj) bezeichnen die Richtung, in der sie bei der Polymerisation verlängert werden.
Präparation von Sondenmolekülen 20 Die erfindungsgemäß verwendeten Sondenmoleküle sind Oligo- oder Polynukleotide. Sie können synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt werden, je nach dem, welche Herstellungsweise für die als Primer zu verwendenden Sondenmoleküle bevorzugt wird. Außerdem lassen sich die Sondenmoleküle durch DNA-Rekombinationsverfahren oder aus unmittelbar aus der Natur isolierten Nukleinsäuren herstellen. Ein Sondenmolekül kann an einen geeigneten Vektor gebunden werden. Es kann gegebenenfalls Vektorteile enthalten. Eine Reihe erfindungsgemäß verwendbarer 25 Primer und Sondenmoleküle ist im Handel erhältlich.
Die Detektorsonden als modifizierte Primer
In einem der erfindungsgemäßen Verfahren sind die Detektorsonden Oligo- oder Polynukleotide, die an die nachzuweisende Nukleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden und als Prim» für eine matrizenabhängige, 30 enzymatische Nukleinsäuresynthese dienen. Wesentlich ist, daß die als Detektorsonde wirkenden Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
Als Markierunglassen sich verschiedeneradioaktivelsotope oder radioaktivmarkierte Verbindungen verwenden. Die Markierungssubstanz kann auch fluoreszieren, lumineszieren, lichtemittieren oder enzymatisch oder 35 immunologisch nachweisbar sein. Es lassen sich auch Markierungen verwenden, die auf der Affinität von Biotin zu
Avidin oder Streptavidin beruhen, Lanthanid-Chelate, Ferritin- und Häm-Verbindungen. Weitere Beispiele sind immunologisch nachweisbare Haptene, wie AAF und AIF(Acetoxyacetylfluorenderivate).DieIdentifizieningkann auch mit Hilfe von vermittelnden Molekülen, z. B. Proteinen, durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hängt nicht von der verwendeten Markierung ab. Alle gegenwärtig bekannten 40 Markierungssubstanzen, die für die Hybridisierung von Nukleinsäuren geeignet sind, lassen sich verwenden. Es ist jedoch wesentlich, daß die Markierung aus einer Gruppe von Markierungen ausgewählt wird, die nicht die Funktion des Primers stören, sofern die Detektorsonden als Primer verwendet werden. Der als Detektorsonde verwendete Primer muß so mit der Markierung versehen werden, daß die Nukleinsäure-Polymerase den Primer immer noch als solchen erkennt. 45
Die Einfangsonden als modifizierte Primer
In einem anderen erfmdungsgemäßen Verfahren sind die Einfangsonden Oligo- oder Polynukleotide, die an die nachzuweisendeNukleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden undalsPrimer bei einer matrizenabhängigen, enzymatischen Nukleinsäuresynthese wirken. Wesentlich ist, daß die als Einfangsonde wirkenden Primer minde-50 stens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle auf weisen, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann. Das Teil oder die Teile des Affinitätspaares lassen sich auch über ein vermittelndes Molekül an den als Einfangsonde wirkenden Primer binden. Die einzigen Bedingungen sind, daß sich das Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des Affinitätspaares abtrennen läßt und daß die Funktion des Primers nicht beeinträchtigt wird. 55 Das Teil des Affinitätspaares ist ein Bestandteil mit einer Affinität für einen anderen Bestandteil. Beispiele solcher Affinitätspaare sind Biotin - Avidin oder Streptavidin, ein Schwermetallderivat - eine Thiogruppe, verschiedene Homopolynucleotide, wie Poly dG - Poly dC, Poly dA - Poly dT und Poly dA - Poly U. Es lassen sich -3-
AT 395 434 B aber auch andere Paare von Verbindungen verwenden, vorausgesetzt, daß sie eine ausreichende Affinität für die spezifischeBindung des modifizierten, als Einfangsonde wirkenden Primers, der in die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäureeingebaut ist, an den festen Träger aufweisen. Geeignete Affinitätspaare sind auch in immunologischen Verfahren verwendete Liganden und Konjugate. 5
Die selektive Einfangsonde
In einem der erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Detektorsonde als Primer verwendet wird, wird eine selektive Einfangsonde benötigt, um die selektive Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, daß die Einfangsonden ausreichend 10 homolog zur nachzuweisenden Nukleinsäure sind, um ihre spezifische Hybridisierung mit den Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure zu gestatten und dadurch die selektive Abtrennung und den Nachweis der als Detektorsonde wirkenden Prima: zu ermöglichen, die in die Kopien dar nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut sind. IS Die selektive Detektorsonde
In einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer verwendet werden, wird eine selektive Detektorsondebenötigt, um den Nachweis der Kopien der nachzuweisendenNukleinsäuren zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, daß die Detektorsonde ausreichend homolog zur nachzuweisenden Nukleinsäure ist, um spezifisch mit dieser zu hybridisieren und dadurch die 20 nachzuweisende Nukleinsäure selektiv zu identifizieren. Die Detektorsonden können geeignete, nachweisbare Markierungen aufweisen, beispielsweise die vorstehend genannten.
Reagenzienkombinationen
Die Detektorsonde als modifizierter Primer 25 Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenzienkombination, enthaltend mindestens einen modifizierten
Primer, der mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann, und mindestens eine selektive Einfangsonde, die mindestens ein Teil eines Affinitätspaaies oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann. 30
Die Einfangsonde als modifizierter Primer
Die vorliegendeEifindung betrifftauch eineReagenzienkombination enthaltend mindestens einen modifizierten Primer, der mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaaies oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann, und mindestens eine selektive 35 Detektorsonde, die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
Die Erfindung beschreibt auch ein für den Nachweis von Nukleinsäure geeignetes Besteck. Das Besteck enthält, gegebenenfalls verpackt in einen unterteilten Behälter, eine der vorstehend genannten Reagenzienkombinationen in Verbindungmitmindestens einem derfolgendenReaktantenoderder folgenden Einrichtungen, diebeimTestverfahren 40 benötigt werden, d. h. gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation, gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Desoxynucleosidtriphosphaten, gegebenenfalls eine für die Durchführung der Polymerisation undder Hybridisierung geeigneteEinrichtung, gegebenenfalls eine zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Einrichtung, und gegebenenfalls eine zum Nachweis der Markierung geeignete Einrichtung. Die bevorzugten Einrichtungen und Reaktanten werden nachstehend näh«1 45 erläutert.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächstmindestens zwei modifiziertePrimer zu einer denaturierten Probenlösung zugegeben. Beide Primer sind entweder als Detektorsonde oder als Einfangsonde wirkende Primer. Dabei lagern sich die modifizierten Primer jeweils an den komplementären Strang der nachzuweisendenNukleinsäure, d. h. die Matrize, an. Nach der Zugabe eines Enzyms, das matrizenabhängig Nukleinsäure synthetisiert, werden die 50 Primer verlängert. Dieses Verfahren schreitetin vitro mithoher Ausbeute fort Dabei werden neueNukleinsäurestränge geschaffen, die mehrere tausend Nukleotide lang sein können, sofern die gewählten Bedingungen dafür geeignet sind.
Durch Verwendung eines Überschusses der modifizierten Primer kann der Vorgang wiederholt werden, um komplementäre Kopien der neu synthetisierten Stränge herzustellen, die somit identische Kopien der zunächst 55 verwendeten Matrizen darstellen. Durch Wiederholung dieses Vorgangs wird eine Reaktionskaskade eingeleitet, durch die die nachzuweisende Nukleinsäure vervielfältigt wird. Dieser Vorgang läßt sich so oft wie gewünscht wiederholen, um die gewünschte Nachweisempfindlichkeit zu erhalten. In Fällen, in denen die Konzentration der
AT 395 434 B nachzuweisenden Nukleinsäure nicht extrem niedrig ist, reicht eine Vervielfältigung aus, um die Nukleinsäure nachweisbar zu machen.
Es ist auch möglich, lediglich einen modifizierten Primer beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden. In diesem Fall wird die Vervielfältigung jedoch nicht so wirksam sein, wie bei der Verwendung von mindestens zwei 5 Primern, da keine Reaktionskaskade eingeleitet wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl DNA als auch RNA bestimmt werden. Falls jedoch die zu bestimmende Nukleinsäure eine RNA ist, ist es bequemer, zunächst eine entsprechende cDNA-Kopie der RNA mit einer reversen Transkriptase anzufertigen und sodann das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.
Nachdem die modifizierten Primer in die Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäuren eingebaut sind, wird das 10 Reaktionsgemisch mit einem geeigneten selektiven Sondenmolekül versetzt, das die zu bestimmende Sequenz und ihre Kopien erkennt, und die Hybridisierung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für den gewünschten Hybridisierungsvorgang geeignet sind.
Bei der Hybridisierungsreaktion wird je nach Wahl der modifizierten Primer entweder eine selektive Einfangsonde oder eine selektive Detektorsonde mit den Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäure hybridisiert, die 1S nunmehr in vielfachen Mengen gegenüber der Ausgangssituation vorliegt.
Falls die ursprüngliche Probe die nachzuweisende Sequenz enthält, hybridisiert das selektive Sondenmolekül mit den neu synthetisierten Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäure. Es wird ein Hybrid zwischen dem kopierten Molekül, in das der modifizierte Primer eingebaut ist, und dem selektiven Sondenmolekül gebildet Die gebildeten Hybride lassen sich erfindungsgemäß aus der Hybridisierungslösung in einfacher Weise mit Hilfe des Teils des 20 Affinitätspaares abtrennen, die entweder an dem als Einfangsonde wirkenden Primer oder an der seleküven Einfangsonde befestigt ist. Während der Fraktionierung bleiben die Hybride, die einen solchen Einfangteil aufweisen, an einem festen Träger mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares haften. Die Menge der selektiven Detektorsonde oder des als Detektorsonde wirkenden Primers, die am Träger haften bleibt, kann in an sich bekannter Weise direkt am Trägermaterial oder nach der Elution im Eluat bestimmt werden. Die ermittelte Menge der 25 Markierung ist ein Maß für die Menge der zu bestimmenden Nukleinsäure.
Vor der Fraktionierung wird die Lösung gegebenenfalls verdünnt, um die Bedingungen vorteilhaft für das Affinitätspaar zu beeinflussen. Sodann wird die Lösung mit dem festen Träger in Berührung gebracht. Der zu verwendende Träger kann beispielsweise eine Affmitätschromatographiesäule, ein Filter, eine Plastikoberfläche oder eine Glasoberfläche sein. Günstige Einrichtungen zur Durchführung der Abtrennung sind unterschiedliche 30 Typen von Mikrotiterplatten, Eintauchsystemen oder magnetischen Teilchen. Es ist aber auch möglich, die Abtrennung in Teströhrchen oder mit Körnchen durchzuführen.
Als Trägermaterial kann für die Affinitätschromatographiesäulebeispielsweise ein natürliches oder synthetisches Polymer, wie die Cellulose, Polyacrylamid, Polystyrol, Dextran oder Agarose, verwendet werden. DieseMaterialien können auch als Suspensionen in einem Teströhrchen eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform 35 werden Teströhrchen verwendet, an deren innerer Oberfläche das andere Teil des Affinitätspaares gebunden ist Eine
Voraussetzung für das ausgewählte Material ist, daß es die Bindung eines Bestandteils mit Affinität zu dem Teil des Affinitätspaares gestattet, an den als Einfangsonde wirkenden Primer oder die selektive Einfangsonde gebunden ist.
Es ist nicht erforderlich, das Teil oder die Teile des Affinitätspaares an den als Einfangsonde wirkenden Primer zu Beginn der Polymerisation zu binden. Auch ist es nicht notwendig, die nachweisbare Markierung an den als 40 Einfangsonde wirkenden Primer vor der Polymerisation zu binden. Sie können auch nach der Polymerisation an den modifizierten Primer angelagert oder gebunden werden, der in die Kopien da- nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut ist. Wenn beispielsweise die nachweisbare Markierung bei den Hybridisierungsbedingungen nicht beständig ist, kann sie auch nach der Hybridisierung der selektivenEinfangsondemit denKopien der nachzuweisenden Nukleinsäure zugegeben werden. 45 Wenn die Detektorsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut sind, läßt sich das Hybrid aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe selektiver Einfangsonden abtrennen, die an festen Trägem immobilisiert sind. Bei einem derartigen Verfahren wird die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch begrenzt, daß die nachzuweisende Nukleinsäure und ihre Kopien, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit der selektiven Einfangsonde hybridisieren müssen, die an einem festen Träger immobilisiert ist. 50 Deshalb wird bei der vorliegenden Erfindung die Hybridisierung in Lösung bevorzugt Falls das Verfahren jedoch mit einer immobilisierten Einfangsonde durchgeführt wird, wird das am festen Träger gebildete Hybrid gewaschen, und die Menge der Markierung am Trägermaterial wird in an sich bekannter Weise gemessen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. 55 Beispiel 1
Nachweis von Cvtomeealievinis-DNA mit als modifizierte Primer wirkenden Detektorsonden
In diesem erfindungsgemäßen Beispiel wird als nachzuweisende Nukleinsäure das rekombinante Plasmid -5-
AT 395 434 B pBR322/CMV Hindin L verwendet. Dieses enthält ein 12,3 kbFragmentdes Cytomegalievirus-Genoms (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Die beiden als Detektorsonde verwendeten Primer (Pa und Pj,) (vgl. Fig. 1) haben eine Länge von 20 Nukleotiden und wurden in an sich bekannter Weise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Sie entsprechen zwei Regionen der CMV-spezifi sehen Insertion, die 111 Nukleotide voneinander entfernt sind. Die beiden selektiven Einfangsonden S j und S2 (vgl. Fig, 1) erkennen Bereiche in jedem der beiden DNA-Stränge, die zwischen den beiden als Detektorsonde wirkenden Primern liegen. Die als Detektorsonde wirkenden Primer (Pa und Ρ^) werden mit ^2P an ihren 5-Enden so markiert, daß ihre spezifische Aktivität 4x10^ CPM/pg beträgt. Die Markierung wird in an sich bekannter Weise mit Polynukleotidkinase und Gamma-^P-ATP durchgeführt; vgl. Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Die 3'-Enden der Einfangsonden werden mit biotinylierten Nukleotiden versehen. Dabei wird Bio 11-dUTP (BRL) und eine terminale Transferase (Promega Biotech.) verwendet; vgl. Riley et al., DNA 5 (4) (1986), S. 333 -337. Das nachzuweisende Plasmid wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, wurde bei Boehringer-Mannheim und Streptavidin-Agarose bei BRL gekauft.
Mit diesen Reagenzien wird das folgende Experiment durchgeführt:
Es werden vier unterschiedliche Reaktionen durchgeführt, die 0,10^, 10^ und 108 Moleküle des nachzuweisenden Plasmids enthalten. Dies entspricht 0,2 x IO'™, 2 x IO**8 bzw. 2x10'^ Mol. Weitere Bestandteile des Gesamtreaktionsvolumens von 50 μΐ sind 2 pMol der beiden Primer, 0,5 mM von jedem der vier Desoxy-nuldeosidtriphosphate (d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,50 mM NaCl und 10 mM Dithiothreitol. Das Reaktionsgemisch wird 2 Minuten auf 100 °C erhitzt und dann 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird 1 μ1(1 Einheit) DNA-Polymerase zugegeben. Das Gemisch wird nochmals 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das Auf kochen und das anschließende Anlagem der als Detektorsonde wirkenden Primer sowie die Inkubation mit der DNA-Polymerase bei 37 °C ist ein DNA-Synthesezyklus. Bei diesem Experiment wird der Reaktionszyklus entweder nur einmal durchgeführt oder 5 oder 15 mal wiederholt Nach dem letzten Reaktionszyklus wird die Probe nochmals auf 100 °C erhitzt Sodann werden 100 pMol der selektiven Einfangsonde und 0,9M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 0,1 % Natriumdodecylsulfat zugegeben. Das Gesamtvolumen beträgt 100 μΐ. Die angegebenen Konzentrationen sind die Endkonzentrationen. Das Gemisch wird sodann 1 Stunde bei 50 °C inkubiert Nach dieser Hybridisierungsreaktion werden200μΐ einer 25 %igen Suspension von Streptavidin-Agarose in IM NaCl, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 1 mM EDTA zugegeben. Es wird 15 Minuten bei 37 °C in einem Rotationsmischer inkubiert, damit die biotinylierten Moleküle an die Streptavidin-Agarose binden können. Die Agarose wird kurz abzentrifugiert und der Überstand wird abgebaut Sodann wird die Agarose einmal mit gepufferter IMNaCl-Lösung und zweimal mit einer Lösung enthaltend 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat und 0,2 % Natriumdodecylsulphat (pH 8) bei 37 °C gewaschen. Sodann wird die durch die gebildeten Hybride an die Agarose gebundene Radioaktivität mit einem Zählgerät bestimmt Das Isolierungs- und Waschverfahren der die biotinylierten Markierungen enthaltenden DNA-Hybride erfolgt wie in der GB-A 2169 403.
Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle I zusammengefaßt. Aus Tabelle I ergibt sich, daß bei einem einzigen DNA-Synthesezyklus nur dann genügend Radioaktivität für den Nachweis eingebaut wird, wenn hohe Ausgangskonzentrationen der nachzuweisenden Nukleinsäure vorliegen. Werden jedoch 15 DNA-Synthesezyklen durchgeführt, lassen sich selbst sehr geringe Mengen dies»' nachzuweisenden Nukleinsäure nachweisen. Bei ein» großen Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure und 15 DNA-Synthesezyklen wird dieReaktion durch die Menge des als Detektorsonde wirkenden Primers begrenzt.
Tabelle!
Menge der nachzuweisenden ^P-Aktivität in den gesammelten Hybriden a) weisenden Nukleinsäure (Mol) (CPM über Hintergrund) ®) 1 5 15 Anzahl der DNA-Synthesezyklen 0 0 0 0 2xl0-20 ND ND 650 2xl0‘18 ND 300 11000 2 x 10'16 700 13000 36000 -6-
AT 395 434 B a) Mittelwert aus zwei Messungen b) ND: nicht nachweisebar (weniger als zweimal soviel Radioaktivität wie die mitüeie Hintergrundaktivität) Beispiel 2
Bestimmung von Cvtotnegalievirus-DNA mit Einfangsonden als modifizierte Primer Bei diesem erfmdungsgemäßen Beispiel werden die Einfangsonden als Primer verwendet Bis auf die nachfolgend genannten Abweichungen werden die gleichen Reagenzien wie in Beispiel 1 verwendet Die als Einfangsonde wirkenden Primer (Pa und Pj,) (vgl. Fig. 1) werden nicht mit ^P markiert Statt dessen werden ihre 5'-Enden mit einem Biotinrest versehen. Diese chemische Modifizierung wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, vgl. Cholletund Kawashima,Nucleic AcidsResearch, 13 (1985), S. 1529 -1541. Diebeiden selektiven Sondenmoleküle (Sj und S2) (vgl. Fig. 1) werden in diesem Experiment an ihren 5-Enden markiert Sie werden als Detektorsonden verwendet. Ihre spezifischen Aktivitäten sind 2 x 10^ bzw. 2,5 x 10^ cpm/pg.
Die Reaktionsgemische haben die in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung. Die biotinylierten, als Einfangsonde wirkenden Primer, werden jedoch in lOfacher Menge zugefügt, d. h. 20 pM pro Reaktion. Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 1,5 oder 15 DNA-Synthesezyklen durchgeführt Sodann worden die Proben auf 100 °C erhitzt und 0,5 pM von jedem der 32p-markierten Sondenmoleküle (Sj und S2) werden zugegeben. Die Hybridisierung wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Die Hybride werden sodann an Streptavidin-Agarose gesammelt, gewaschen und die ^-Aktivität wird wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabellen
Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure (Mol) 32p.Aktivität in den gesammelten Hybriden a) (CPM über Hintergrund)**) 1 5 15 Anzahl der DNA-Synthesezyklen 0 0 0 0 2 x 10‘20 ND ND 800 2 x IO*18 ND 400 13000 2xl0*16 300 11000 54000 a) Mittelwert aus zwei Messungen b) ND: nicht nachweisbar (vgl. Beispiel 1)
Beispiel 3
Nachweis von Cvtomegalievirus-DNA aus klinischen Proben mit Einfangsonden als modifizierte Primer
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung klinischer Proben geeignet ist Dies erfolgt durch den Nachweis von CMV aus dem Urin eines Kindes, das bekanntermaßen an einer Cy tomegalievirus-Infektion leidet. Der Urin eines gesunden Kindes wird dabei als Kontrolle verwendet Aus zwei Proben mit jeweils 10 ml Urin wird die Gesamt-DNA isoliert nach der Vorschrift von Virtanen et al., J. Clin. Microbiol.20(6) (1984), S. 1083 -1088. Die in 20μ1 H2O gelösten DNA’s werden als nachzuweisendeNukleinsäure in gemäß Beispiel 2 ausgeführten Reaktionen verwendet Nach 10 DNA-Synthesezyklen wird die Probe mit dem markierten, selektiven Sondenmolekül versetzt Sodann wird die Hybridisierung durchgefiihrt und die Hybride werden gesammelt. Die DNA aus dem Urin des Patienten zeigt in den Hybriden eine deutlich erhöhte Radioaktivität, während die des gesunden Kindes lediglich Hintergrund-Radioaktivität zeigt. Die tatsächlichen cpm-Werte sind 2300 bzw. 240.
Beispiel 4
Nachweis von SFV fSemliki Forest-VirusVRNA mit Einfangsonden als modifizierte Primer
Beispiel 4 zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch für den Nachweis von RNA geeignet ist. Als Modellsystem wird SFV (Semliki Forest-Virus)-RNA verwendet
Die verwendeten Reagenzien sind zwei S’-biotinylierte, als Einfangsonde wirkende Primer (vgl. Fig. 2), die wie -7-
AT 395 434 B in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden, eine einzige S'-^^P-markierte, selektive Detektorsonde, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, reverse Transkriptase (Promega Biotech) und DNA-Polymerase, Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim).
Der erste Schritt beim Nachweis der SFV-RNA ist die Synthese ein» cDNA-Kopie. In 20 μΐ Reaktionsgemisch 5 sind 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 mM MgClj, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM von jedem der vier Desoxynukleosidtriphosphate, 0,5 pg t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pM als Einfangsonde wirkender Primer (Pa) und 100 Einheiten reverse Transkriptase enthalten. Dieses Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 37 °C inkubiert Sodann wird das Gemisch 5 Minuten auf 100 °C erhitzt und bei Umgebungstemperatur abgekühlt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 50 pl einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 10 mM Dithiothreitol, 10 pM des als Einfangsonde wirkend» Primers (Pjj) und mit 0,5 mM von jedem der vier
Desoxynukleosidtriphosphate versetzt Die Temperatur wird auf 37 °C erhöht. Nach 5 Minuten wird 1 Einheit DNA-Polymerase zugegeben. Es wird 10 Minuten inkubiert und das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten auf 100 °C erhitzt Sodann wird das Reaktionsgemisch auf 37 °C abgekühlt Insgesamt werden 5 DNA-Synthesezyklen durchgeführt. Nach einem letzten Denaturierungsschritt werden 0,1 pMol (1,2 x 10^ cpm) der selektiven Detektorsonde in 80 μΐ 15 lMNaCl,50mMEDTA, 50 mMNatriumphosphat(pH7,5)und0,l%Natriumdodecylsulfatzugegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei 55 °C inkubiert Anschließend werden die Hybride gesammelt und wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen.
Als negative Kontrolle für die Reaktionen wird eine identische Probe in gleicher Weise behandelt, jedoch ohne Zugabe derreversen Transkriptase. Die Probe, in der ausgehend von der RNA mitreverser Transkriptaseeine cDNA-20 Kopie hergestellt wurde, ergibt eine -^P-Aktivität von 420 cpm in den eingefangenen Hybriden, während die negative Kontrolle lediglich 50 cpm ergibt
Beispiel 5
Vergleich verschiedener Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA 25 In diesem Beispiel werden drei Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA verglichen. Es werden die
Reagenzien und das Vervielfältigungsverfahren von Beispiel 1 und 2 verwendet Jedoch weiden als selektive Einfang- oder Detektorsemden M13-Clone verwendet, die etwa 100 Nukleotide zwischen den Primern erkennen.
Die M13-Clone werden durch Subclonierung eines Haein-Restriktionsfiagmentes des rekombinanten Plasmids pBR322/CMVHindIIILindenPhagen VektorM13mpl0in üblicher Weiseerhalten. Die als selektiveEinfangsonden 30 zu verwendenden M13-Clone werden unter Verwendung von Photoprobe®-Biotin (Vector Laboratories) mitBiotin modifiziert Die als selektive Detektorsonden zu verwendenden M13-Clone werden mit ^P-dCTP unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Primer-Verlängerung markiert so daß die spezifische Aktivität 2 x 10** cpm/pg beträgt; vgl. Hu und Messing, Gene 17 (1982), S. 271 - 277.
Jetzt werden 10 Vervielfältigungszyklen von 3 x 1(? Molekülen (0,5 x 10*^ Mol) des linearisierten Plasmids 35 pBR322/CMV Hindin L durchgeführt. Zum Nachweis nach der Methode 1 und 2 werden jeweils 2 pMol der ^P- markierten, als Detektorsonde wirkenden Primer (Pa und P^) verwendet Das Vervielfältigungsverfahren wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt Zum Nachweis nach der Methode 3 werden 25 pMol der biotinylierten als Einfangsonde wirkenden Primer im Vervielfältigungsverfahren verwendet Dabei wird die Reaktion wie in Beispiel 2 beschrieb» durchgeführt 40
Ergebnisse der Nachweismethode 1;
Verwendungeiner selektiven Einfangsonde zum Einsammeln der in Lösung mit den Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure gebildet» Hybride.
Bei dies» Nachweismethode werden biotinylierte selektive M13 Einfangsonden zum Einsammeln der ver-45 vielfältigten DNA-Fragmente verwendet Nach dem letzten Vervielfältigungszyklus wird das Prob»gemisch auf 100 °C erhitzt und mit jeweils 2 x 10P Molekül» der biotinylierten, selektiven Anfangssonden sowie mit NaCl (0,6 M), EDTA (5 mMol) Natriumphosphat (20 mMol) und SDS (0,1 %) versetzt. Angegeben sind die Endkonzentrationen in einem Endvolum» von 100 μΐ. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 65 °C inkubiert Die gebildeten Hybride werden an Streptavidin-Agarose wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt jedoch wird 50 zusätzlich zweimal jeweils 1 Minute bei 50 °C mit 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat und 0,2 % SDS gewaschen.
Die Radioaktivität d» abgetrennten Hybride wird gemessen.
Nachweismethode 2:
Verw»dung von vor der Hybridisierung mit den Kopien d» nachzuweisenden Nukleinsäure-immobilisierten, 55 selektiven Einfangsonden.
Bei dies» Methode werden immobilisierte, selektive Ml 3-Sondenmoleküle zum Einfangen der vervielfältigten DNA verw»det Nach den letzten Vervielfältigungszyklus w»den die Proben auf 100 °C erhitzt Sodann werden
AT 395 434 B sie mitNaCl (0,6 M), Natriumcitrat (60 mM), Ficoll® (0,02 %), Poly vinylpyrrolidon (0,02 %), Rinderserumalbumin (0,02 % und denaturierter Heringspermien-DNA (0,2 mg/ml) versetzt Wie angegeben, sind die Endkonzentrationen in einem Endvolum«! von 100 |d. Sodann wird jede Probe mit ein« Nitrocellulosefilterscheibe versetzt, an der 5 x 1010 Moleküle von jedem der selektiven Sondenmoleküle nach dem in der US-PS 4 486 539 beschriebenen S Verfahren immobilisiert sind. Das Gemisch wird 2 oder 18 Stunden bei 65 °C mit Filtern inkubiert. Nach der Hybridisierung weiden die Filter zweimal jeweils 20 Minuten bei 50 °C mit 15 mM NaCl, l,5mMNatriumcitratund 0,2 % SDS gewaschen und die an die Filter gebundene Radioaktivität wird gemessen.
Nachweismethode 3: 10 Verwendung ein« selektiven Detektorsonde zum Nachweis.
Bei dies« Methode werden 32p.maikierte, selektive M13-Detektorsonden zum Nachweis der vervielfältigten DNA verwendet. Die Hybride werden mit Hilfe der als Anfangsonde wirkenden Primer abgetrennt, die an ihren 5'-Enden gemäß Beispiel 2 biotinyliert sind. Die vervielfältigt«! Proben w«den auf 100 °C erhitzt und mit 2 x 10® Molekülen (2x 10^ cpm) von jedem d« 32p-markierten, selektiven Sondenmoleküle wie bei Nachweis-IS methode 1 mit Salzen versetzt. Die Hybridisierung und die Abtrennung der gebildeten Hybride wird gemäß Nach weismethode 1 durchgeführt.
Die bei den drei Nachweismethoden erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle m zusammengefaßt und v«glichen.
Die Methoden 1 und 3 haben den Vorteil einer höheren Hybridisi«ungsgeschwindigkeit in Lösung, v«glichen 20 zur Filt«hybridisierung bei d« Methode 2. Die höchste 32p-Aktivität wird bei der Methode 3 «halten, da die selektive Detektorsonde viele 32p-Atome pro Molekül enthält.
Tabelle ΙΠ 25 Methode Primer Selektives Hybridisierungs- 32p-Aktivi- M13-Sonden- zeit tat in den molekül Std. Hybridmole-kühlen (cpm) a) 30 1 32p-markierter biotinylierte 2 870 Primer als Detektorsonde Einfangsonde 35 2 dto. immobilisierte 2 43 Einfangsonde 18 920 3 biotinylierter 32p-markierte 2 7800 40 Primer als Einfangsonde Detektorsonde a) Mittel aus drei Messungen (cpm über Hintergrund) 45
Beispiel 6
Vervielfältigung von Cvtomegalievirus-DNA mit biotinvliertem als Detektorsonde wirkenden Primern und indirekte Bestimmung mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase
Bei diesem Beispiel wird die Vervielfältigung des CMV-Plasmids (pBR322/CMV Hindlll L) mit den als 50 Detektorsonde wirkenden, biotinylierten Primern (Pa und P^) gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Die in Beispiel 5 beschriebenen M13-Clone werden mit Sulfongruppen modifiziert und als selektive Einfangsonden verwendet. Die gebildeten Hybride werden in den Bohrungen von Mikrotiterplatten abgetrennt, die mit Disulfon-modifizierte DNA erkennenden Antikörpern beschichtet sind. Der Nachweis der gebildeten Hybride wird schließlich mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat durchgeführt, das die Biotinreste der Primermoleküle nachweist. 55 Die M13-Clone werden durch eine Sulfonierungsreaktion modifiziert. Dabei werden die von der Firma Orgenics
Ltd (Yavne, Israel) empfohlenen Reagenzien und V«fahren verwendet Polystyrol-Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) werden mit 10 pg/ml IgG in 10 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,6) über Nacht bei 4 °C beschichtet -9-

Claims (9)

  1. AT 395 434 B Das IgG wurde durch Reinigung eines monoclonalen Antikörpers gegen mit Sulfongruppen modifizierte DNA erhalten (QrgenicsLtd.)· Reaktionsgemische «ithalten 3 x 10^ Moleküle des linearisierten Plasmids pBR322/CMV Hindin L oder Kontrollen ohne Plasmid und 25 pMol von jedem der biotinylierten Primer (Pa und Pjj) weiden unter den in Bei-5 spiel 1 beschrieben«! Bedingungen 10 Vervielfältigungszyklen unterworfen. Die Proben werden auf 100 °C erhitzt und dann mit jeweils 2 x 1θ" Molekülen von jeder der sulfonierten, selektiven Einfangsonden zusammen mit den in Beispiel 5 für die Methode I angegebenen Reagenzien versetzt Das Gemisch wird 2 Stunden bei 65 °C inkubiert, mit 100 μΐ 0,2% Tween 20 verdünnt und in die beschichteten Mikrotiterplatten überführt Die Hybride w«den 2 Stunden bei 37 °C an die Bohrungen der Mikrotiterplatte 10 gebunden. Das Reaktionsgemisch wird v«worfen und die Bohrungen werden jeweils 3 mal mit 0,1 % Tween 20 in 0,15 molar Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) (PBS) gewaschen. Es werden 200 μΐ eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Amersham, UK) zugesetzt, das 1: 2000 in einer lprozentigen Rinderserumalbumin-Lösung mit 0,1 % Tween 20 in PBS verdünnt ist Die Bohrungen der Mikrotiteiplatte werden 45 Minuten bei 37 °C inkubiert Auf diese Weise wird viermal gewaschen. Sodann werden 200 μΐ einer 15 Substratlösung, bestehend aus 0,46 mg/ml o-Phenylendiamin, 0,01 %Η2θ2ΐηΟ,1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0) zugegeben. Nach 15 Minuten bei 22° wird die Umsetzung durch Zugabe von 50 μΐ 2N H2SO4 gestoppt und die Absorption des farbigen Reaktionsprodukts bei 492 nm wird mit einem Photospektrometer gemessen. Diese Abtrennungs- und Nachweisverfahren wurden bereits von Syvänen et al in Nucleic Acids Res. 14 (1986), S. 5037 · 5048 beschrieben. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle IV zusammengefaßt 3 x 10^ Moleküle 20 (0,5 x 10-18 Mol) des nachzuweisenden Plasmids sind nach 10 Vervielfältigungszyklen deutlich nachweisbar. 25 Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure (Mol) Absorption bei 492 nm a) 0,5 x IO*18 0,348 30 0 0,120 a) Mittelwert aus drei Messungen. 35 PATENTANSPRÜCHE 40 1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung, dadurch gekennzeichnet, daß man dabei als 45 Einfangsonden modifizierte Primer verwendet die in Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut werden und sodann die Kopien durch mindestens eine selektive Detektorsonde nachweist
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 50 (a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nukleinsäure mit mindestens einem Teil eines Affinitätspaares oder mit mindestens einer spezifischen Stelle bereitstelh, an der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; (b) denoderdiealsEinfangsondewirkendenPrimermitdereinzelsträngigen,nachzuweisendenNukleinsäureunter Bedingungen reagieren läßt die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten; 55 (c) die einzelsträngig«! Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit einer Detektorsonde hybridisiert die selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert; -10- AT 395 434 B (d) die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abtrennt; und (e) vorliegende selektive Detektorsonden nachweist, die mit den Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert haben. 5
  3. 3. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung, bei dem man als Detektorsonden modifizierte Primer verwendet, die in Kopien demachzuweisendenNukleinsäuren eingebaut werden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuren, in die die modifizierten Primer eingebaut sind, zuerst mit mindestens einer selektiven Einfangsonde hybridisiert, das gebildete Hybrid mit Hilfe der Einfangsonde abtrennt, 10 und sodann das vorliegende Hybrid nachweist
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nukleinsäure mit mindestens einer nachweisbaren Markierung 15 oder mindestens einer spezifischen Stelle bereitstellt an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; (b) den oder die als Detektorsonde wirkenden Primer mit der einzelsträngigen, nachzuweisenden Nukleinsäure unter Bedingungen reagieren läßt, die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten; (c) die einzelsträngigen Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer 20 eingebaut sind, mit einer Einfangsonde hybridisiert, die selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert; (d) die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit Hilfe der selektiven Einfangsonde abtrennt; und (e) vorliegende Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuren nachweist. 25
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die selektive Einfangsonde mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestenseinespezifischeStelleaufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.
  6. 6. Reagenzienkombination zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Be standteile enthält: (a) mindestenseinenmodifiziertenPrimereinernachzuweisendenNukleinsäure.dermindestenseinenachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung 35 gebunden werden kann; und (b) mindestens eine Einfangsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.
  7. 7. Reagenzienkombination zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Be standteile enthält: (a) mindestens einen modifizierten Primer einer nachzuweisenden Nukleinsäure, der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestenseine spezifischeStelleaufweist,an diemindestensein Teil eines Affinitätspaares 45 gebunden werden kann; und (b) mindestens eine Detektorsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
  8. 8. Besteck zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält: (a) mindestenseinenmodifiziertenPrimereinernachzuweisendenNukleinsäure,dermindestenseinenachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle auf weist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; 55 (b) mindestens eine Einfangsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; -11- AT 395 434 B (c) gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation; (d) gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier-Desoxynucleosidtriphosphaten; (e) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung; (f) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure; und (g) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung.
  9. 9. Besteck zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält: (a) mindestens einen modifizierten Prim»- der nachzuweisenden Nukleinsäure, der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestenseinespezifischeStelleaufweist, an diemindestensein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; (b) mindestens eine Detektorsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und die mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; (c) gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation; (d) gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Nukleosidtriphosphaten; (e) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung; (f) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure; und (g) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -12-
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