DE69217623T2

DE69217623T2 - Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuren unter Verwendung von sekundären wasserlöschlichen Helper-Oligonukleotiden und Testsatz dafür

Info

Publication number: DE69217623T2
Application number: DE69217623T
Authority: DE
Inventors: Annie Liu Wu
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1991-10-02
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2012-10-01
Also published as: HK1000253A1; EP0546590B1; SG87728A1; JPH05211899A; US5387510A; DE69217623D1; JP3497518B2; CA2075683A1; EP0546590A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von in Frage stehenden Nucleinsäuren. Die Erfindung betrifft auch ein Testkit, das eine Abfangsonde und sekundäre Oligonucleotide umfaßt, die sich zur Erzielung eines verbessertes Abfang-Hybridisierungswirkungsgrads eignen.
Die Technologie der Nucleinsäuresonden hat sich in den letzten Jahren rasch entwickelt, da von den Forschern ihr Wert für den Nachweis von verschiedenen Krankheiten, Organismen oder genetischen Merkmalen, die in kleinen Mengen in einer humanen oder tierischen Testprobe vorliegen, festgestellt worden ist. Die Verwendung von Sonden beruht auf dem Komplementaritätsprinzip, das besagt, daß komplementäre Stränge von Nucleotiden unter geeigneten Bedingungen unter Bildung eines doppelsträngigen Produkts hybridisieren können und dies auch tatsächlich tun. DNA weist von Natur aus zwei Stränge auf, die über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Nucleotiden (die auch als Nucleotidpaare bekannt sind) aneinander gebunden sind. RNA, die zwar einsträngig ist, kann ebenfalls mit einem komplementären Strang von Nucleotiden hybridisieren.
Die Hybridisierung von komplementären Strängen ist ein zentrales Merkmal von Hybridisierungstests (auch bekannt als genetische Sondentests). Wenn somit mindestens eine Sequenz einer in Frage stehenden Nucleinsäure (als Zielnucleinsäure identifiziert) bekannt ist, kann diese hybridisiert und unter Verwendung geeigneter Oligonucleotide (als Sonden bezeichnet), die komplementär zu der bekannten Sequenz ausgestaltet sind, hybridisiert und nachgewiesen werden. Die Sonde wird im allgemeinen auf bestimmte Weise markiert, so daß ihr Nachweis auch die Anwesenheit des hybridisierten Produkts aus Sonden und Zielnucleinsäure signalisiert. Wenn die Zielnucleinsäure sodann für einen speziellen Organismus, eine virale Infektion oder ein genetisches Merkmal einzigartig ist, kann die Anwesenheit des Organismus, Virus oder genetischen Merkmals leicht festgestellt werden.
In einigen Fällen ist die Zielnucleinsäure (einzelsträngige Form) an einer festen Oberfläche (z. B. einer Nitrocellulosemembran) unlöslich gemacht, um eine unerwünschte Hybridisierung mit von den Sonden abweichenden Ohgonucleotiden zu verhindern. Bei den als "immunometrischen" oder als "Sandwich"-Tests bekannten Tests kann die Zielnucleinsäure unter Verwendung eines weiteren Oligonucleotids, das auf bestimmte Weise, beispielsweise an einer Membran gemäß US-A-4 727 019, immobilisiert ist, abgefangen werden. In anderen Fällen wird das Oligonucleotid an polymeren Teilchen immobilisiert, die in eine poröse Matrix eingebettet sind (beispielsweise gemäß EP-A-0 200 381).
EP-A-0 318 245 beschreibt die Notwendigkeit zur Verbesserung der Kinetik der Hybridisierung zwischen einer wasserlöslichen Sonde (wie einer Nachweissonde) und einer langen Zielnucleinsäure in Lösungs-Hybridisierungstests. Dieser Notwendigkeit wird angeblich durch Verwendung von "Helfer"-Oligonucleotiden Rechnung getragen, von denen angenommen wird, daß sie die sekundäre und tertiäre Struktur der Zielnucleinsäure in Lösung umordnen. Diese Oligonucleotide hybridisieren mit der Zielnucleinsäure in Regionen, die von den Hybridisierungsregionen der Nachweissonde abweichen.
Bei Verwendung einer Abfangsonde in einem Hybridisierungstest ist das an einen wasserunlöslichen Träger (z. B. ein kleines polymeres Teilchen) gebundene Oligonucleotid relativ klein im Vergleich zur Größe des Trägers. Die Länge des Oligonucleotids ist so kurz, daß sie sich nur über einen sehr kurzen Abstand von der Oberfläche des Trägers ausdehnt. Somit wird angenommen, daß eine sterische Hinderung für langsame Hybridisierungsgeschwindigkeiten zwischen der Abfangsonde und der Zielnucleinsäure verantwortlich ist.
Somit besteht ein ständiges Bedürfnis zur Verbesserung des Hybridisierungswirkungsgrads zwischen Zielnucleinsäuren und insolubilisierten Abfangproben mit sehr kurzen Oligonucleotiden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Weg zur Verbesserung der Hybridisierung von relativ kurzen Zielnucleinsäuren mit relativ kurzen Abfangsonden, die kovalent an wasserunlösliche Träger gebunden sind, bereit.
Gemäß einem Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis einer doppelsträngigen Nucleinsäure, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
A. nach Denaturierung einer doppelstrangigen Zielnucleinsäure und unter Hybridisierungsbedingungen das Amplifizieren der Zielnucleinsäure unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, komplementärer Primer und dNTPs,
B. das Bilden eines wasserunlöslichen Hybridisierungsprodukts der amplifizierten Zielnucleinsäure mit einer wasserunlöslichen, nicht nachweisbar markierten Abfangsonde, wobei die Abfangsonde ein wasserunlösliches polymeres Teilchen umfaßt, an das kovalent ein zu einer ersten Sequenz der Zielnucleinsäure komplementäres Oligonucleotid gebunden ist, wobei das Oligonucleotid eine Länge von 15-20 Nucleotiden aufweist, und
gleichzeitig oder vor der Produktbildung das Kontaktieren der amplifizierten Zielnucleinsäure mit einem oder mehreren, wasserlöslichen, gesonderten sekundären Oligonucleotiden, wobei die einzelnen sekundären Oligonucleotide zu einer Sequenz der Zielnucleinsäure, die von der ersten Sequenz abweicht, komplementär sind und wobei die sekundären Oligonucleotide eine Länge aufweisen, die gleich oder größer als die Länge des Abfangsonden-Oligonucleotids ist,
um die sekundären Oligonucleotide mit der amplifizierten Zielnucleinsäure zu hybridisieren, und
C. das Nachweisen des erhaltenen hybridisierten Produkts der Zielnucleinsäure mit der Abfangsonde, umfassend die Verwendung einer Nachweissonde, die komplementar ist zu einer Sequenz der Zielnucleinsäure, die von den zur Abfangsonde und den sekundären Oligonucleotiden komplementären Sequenzen abweicht, oder die Verwendung einer Nachweissonde, die zu mindestens einem der sekundären Oligonucleotide komplementär ist oder die Verwendung von markierten Primern oder die Verwendung von markierten dNTPs.
Die Erfindung stellt auch ein Kit zur Amplifikation und zum Nachweis einer Zielnucleinsäure bereit, die folgendes umfaßt: eine Sonde mit einem zu einer ersten Sequenz der Zielnucleinsäure komplementären Oligonucleotid und ein oder mehr wasserlösliche, gesonderte sekundäre Oligonucleotide, wobei die sekundären Oligonucleotide jeweils komplementär zu einer Sequenz der Zielnucleinsäure, die von der ersten Sequenz abweicht, sind,
wobei das Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich bei der Sonde um eine wasserunlösliche Abfangsonde handelt, die nicht nachweisbar markiert ist und ein wasserunlösliches polymeres Teilchen enthält, an das das Sondenoligonucleotid gebunden ist, wobei das Oligonucleotid eine Länge von 15-20 Nucleotiden aufweist, und
wobei die sekundären Oligonucleotide jeweils eine Länge aufweisen, die gleich oder größer als die Länge des Abfangsonden-Oligonucleotids ist.
Der hier verwendete Ausdruck dNTP's stellt einen allgemeinen Ausdruck für verschiedene Nucleotidtriphosphat-Einheiten dar, die eine Nucleinsäure bilden und die durch eine Polymerase an das Ende einer Nucleinsäure angefügt werden können. Typischerweise gehören hierzu dATP, dCTP, dGTP und dTTP zusammen mit dUTP für RNA-Moleküle.
Das Verfahren und das Kit der Erfindung bieten ein Mittel zum raschen und empfindlichen Nachweis von Nucleinsäuren unter Anwendung bekannter PCR-Verfahren, die dabei in der Nachweisstufe verbessert sind. Die Verbesserung wird durch Verwendung von sekundären Oligonucleotiden zusammen mit der Abfangsonde, die alle mit der amplifizierten Zielnucleinsäure hybridisieren, erreicht. Ferner bietet der Test insofern Vorteile, als die Abfangsonde leicht von unerwünschten Materialien aufgrund der polymeren Teilchen, an die das Abfangoligonucleotid kovalent und direkt gebunden ist, abgetrennt werden kann. Eine Trennung kann leicht unter Verwendung von Filtrationsmembranen, porösen Matrices, Zentrifugation und anderen Trenntechniken erreicht werden. Ferner kann die Abfangsonde in geeigneter Weise an ein nicht-poröses Teilchen, das leicht mit einem amplifizierten Ziel kontaktiert wird, gebunden sein.
Ferner ist es erfindungsgemäß wichtig, daß die sekundären Oligonucleotide eine bestimmte Länge aufweisen, die nämlich der Länge des Abfangoligonucleotids entspricht oder größer als diese ist. Das Abfangoligonucleotid weist eine Länge von 15 bis 20 Nucleotiden auf. Erfindungsgemäß werden verbesserte Hybridisierungsgeschwindigkeiten zwischen der Zielnucleinsäure und der Abfangsonde erreicht.
Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation und den Nachweis von Nucleinsäuren unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion sind bekannt. Entsprechende Einzelheiten finden sich in zahlreichen Druckschriften, wie US-A-4 683 195, US-A-4 683 202 und US-A-4 965 188.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Amplifikation und den Nachweis von einer oder mehreren spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die in einer oder mehreren Zielnucleinsäuren in einer Testprobe enthalten sind, abgestellt. Derartige Proben können zelluläres oder virales Material, Haare, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien mit einem Gehalt an genetischer DNA oder RNA, die nachgewiesen werden kann, umfassen.
Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere zur Bildung von mindestens einer speziellen Nucleinsäuresequenz in exponentiellen Mengen in bezug zur Anzahl der beteiligten Reaktionsstufen. Beim Produkt handelt es sich um ein diskretes Nucleinsäure-Duplex mit Enden, die den Enden der speziellen verwendeten Primer entsprechen. Beliebige Quellen für Nucleinsäuren, die gereinigt sind oder nicht, können als Ausgangsmaterial verwendet werden. Ein Gemisch von Nucleinsäuren kann gegebenenfalls eingesetzt werden. Bei der zu duplizierenden Sequenz kann es sich um ein Fragment der gesamten Nucleinsäure handeln.
Nachzuweisende Nucleinsäuren lassen sich aus verschiedenen Quellen, einschließlich Plasmiden, natürlich vorkommender DNA oder RNA aus beliebigen Quellen (wie Bakterien, Hefen, Viren, Pflanzen und höhere Tiere, Menschen), erhalten. Sie können aus verschiedenen Geweben, einschließlich Blut, peripheren mononudearen Blutzellen (PBMC), Gewebematerial oder anderen auf dem einschlägigen Gebiet bekannten Quellen unter Heranziehung bekannter Verfahren extrahiert werden. Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere zur Amplifikation und zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen, die in genomischer DNA, bakterieller DNA, Pilz-DNA, viraler RNA oder DNA oder RNA, die in bakteriell oder viral infizierten Zellen auftritt, vorkommen.
Das hier beschriebene Verfahren kann für den Nachweis oder die Charakterisierung von speziellen Nucleinsäuresequenzen, die mit infektiösen Erkrankungen, genetischen Störungen oder zellulären Störungen, wie Krebs, assoziiert sind, verwendet werden. Es kann auch bei forensischen Untersuchungen und bei der DNA-Typisierung eingesetzt werden. Für die Zwecke der Erfindung fallen unter genetische Erkrankungen spezielle Deletionen oder Mutationen in genomischer DNA aus beliebigen Organismen, wie Sichelzellenanämie, cystische Fibrose, α- Thalassämie, β-Thalassamie und andere, für den Fachmann leicht ersichtliche Störungen. Humanes Leukozyten-Antigen (HLA) kann erfindungsgemäß kategorisiert werden. Verschiedene infektiöse Erkrankungen lassen sich dadurch diagnostizieren, daß in einer klinischen Probe kleine Mengen spezifischer DNA-Sequenzen, die für den Organismus, z. B. eine Hefe, ein Bakterium oder ein Virus, charakteristisch sind, vorhanden sind. Zu derartigen nachweisbaren Bakterien gehören (ohne Beschränkung hierauf) Salmonellen, Streptokokken, Chlamydiae, Gonokokken, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Mycoplasma Haemophilus influenzae, Shigella und Listeria. Zu nachweisbaren Viren gehören (ohne Beschränkung hierauf) Herpes-Virus, Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, humaner Papilloma-Virus, Hepatitis-Virus und Retroviren, wie HTLV-I, HIV-I und HIV-II. Weitere nachweisbare Spezies sind für den Fachmann leicht ersichtlich. Die Menge an ß-Globin-DNA kann ebenfalls nachgewiesen werden. Die Erfindung eignet sich insbesondere zum Nachweis des Vorliegens von viraler DNA.
Vorzugsweise weist die Zielnucleinsäure eine Länge von weniger als 250-mer auf. Der Ausdruck "mer" wird für ein einzelnes Nucleotid verwendet.
Der Primer ist vorzugsweise einzelsträngig, um einen maximalen Amplifikationswirkungsgrad zu erreichen. Vorzugsweise handelt es sich beim Primer um ein Oligodesoxyribonucleotid.
Die genaue Größe der einzelnen Primer variiert je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck, der Komplexität der Zielsequenz, der Reaktionstemperatur und der Quelle des Primers. Im allgemeinen weisen die erfindungsgemäß verwendeten Primer 12 bis 60 Nucleotide und vorzugsweise 18 bis 45 Nucleotide auf.
Primer, Sonden, Oligonucleotide und sekundäre Oligonucleotide, die erfindungsgemäß geeignet sind, lassen sich aus einer Anzahl von Quellen erhalten oder unter Anwendung bekannter Techniken und Einrichtungen herstellen, wozu beispielsweise ein ABI-DNA-Synthesizer (erhältlich von der Fa. Applied Biosystems) oder ein Biosearch-Synthesizer der Serie 8600 oder 8800 (erhältlich von der Fa. Milligen-Biosearch, Inc.) und bekannte Verfahren zu ihrer Verwendung gehören (beispielsweise in US-A-4 965 188 beschrieben). Natürlich auftretende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert worden sind, sind ebenfalls geeignet (z. B. Verdauungsprodukte mit Restriktions-endonucleasen).
Der hier verwendete Ausdruck "Abfangsonde" betrifft ein wasserunlösliches Material, das ein festes polymeres Teilchen (nachstehend beschrieben) umfaßt, an das kovalent ein Oligonucleotid gebunden ist, das im wesentlichen komplementär zu einer "ersten" Nucleinsäuresequenz der Zielnucleinsäure ist.
Das Oligonucleotid der Sonden weist eine kritische Länge, d. h. 15 bis 20 Nucleotide, auf, um einen optimalen Nachweis von einzelnen Basenmutationen oder -deletionen in einer Zielnucleinsäure zu erfassen.
Im Stand der Technik wird über eine Anzahl von thermostabilen DNA-Polymerasen berichtet, einschließlich die in US-A-4 965 188 und US-A-4 898 818 erwähnten Enzyme. Besonders geeignete Polymerasen sind solche, die aus verschiedenen bakteriellen Thermus-Spezies, wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus oder Thermus flavus, erhältlich sind. Weitere geeignete thermostabile Polymerasen sind in WO-A-89/06691 beschrieben.
Die in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten sekundären Oligonucleotide weisen im allgemeinen eine Länge auf, die der Länge des Sondenoligonucleotids entspricht oder größer als diese ist. Insbesondere beträgt die Länge 15 bis 35 Nucleotide. Erfindungsgemäß wird mindestens ein sekundäres Oligonucleotid verwendet, das jeweils zu einer bestimmten Sequenz der Zielnucleinsäure komplementär ist. Diese bestimmten Sequenzen unterscheiden sich von der "ersten" Sequenz, zu der das Sondenoligonucleotid komplementär ist.
Eine Zielnucleinsäure läßt sich aus einer Vielzahl von Quellen erhalten. Im allgemeinen wird sie auf bestimmte Weise extrahiert, um sie für einen Kontakt mit den Primern und anderen Reaktionsmaterialien verfügbar zu machen. Dies bedeutet im allgemeinen die Entfernung von unerwünschten Proteinen und zellulären Bestandteilen aus der Probe auf geeignete Weise. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Vorgehensweisen bekannt.
Da es sich bei der zu verstärkenden oder nachzuweisenden Nucleinsäure üblicherweise um eine doppelsträngige Form handelt, müssen die beiden Stränge aufgetrennt (d. h. denaturiert) werden, bevor der Startvorgang ("Priming") stattfinden kann. Die Denaturierung wird unter Anwendung einer Wärmebehandlung allein oder in Kombination mit einer beliebigen anderen geeigneten physikalischen, chemischen oder enzymatischen, aus dem Stand dei: Technik bekannten Maßnahme erreicht.
Die denaturierten Stränge werden sodann auf eine zweite Temperatur abgekühlt, die im allgemeinen im Bereich von 55 bis 70ºC liegt, wo däs Priming und die Primererweiterung in Gegenwart der nachstehend aufgeführten DNA-Polymerisationsreagenzien durchgeführt werden. Die erhaltenen doppelstrangigen Primer-Extensionsprodukte werden zur Denaturierung der Stränge erwärmt. Nachdem die Stränge getrennt sind, stehen sie als Matrizen bereit, mit denen weitere Primer-Extensionsprodukte gebildet werden können.
Die Probe wird mit der thermostabilen DNA-Polymerase, geeigneten Desoxyribonucleotid-5'-triphosphaten (beispielsweise dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und einem geeigneten Satz von Primern zu Beginn des ersten Zyklus vermischt. Die Menge der einzusetzenden thermostabilen DNA-Polymerase ist aus dem Stand der Technik bekannt.
Die dNTP's und Primer sind in Mengen vorhanden, die für einen Ablauf der DNA-Polymerisation wirksam sind, wobei derartige Mengen aus dem Stand der Technik bekannt sind. Vorzugsweise sind auch weitere Reagenzien vorhanden, einschließlich Salze, wie Magnesiumchlorid, Streckungsmittel, wie Gelatine oder andere wasserlösliche oder in Wasser dispergierbare Kolloide. Das Reaktionsgemisch wird im allgemeinen auf einen pH-Wert von 7 bis 9 gepuffert, wobei ein pH-Wert von 8 bevorzugt wird. Hierzu wird ein beliebiger Puffer aus einer Anzahl von aus dem Stand der Technik bekannten, geeigneten Puffern verwendet. Das Volumen des Reaktionsgemisches, die die Zielnucleinsäure enthält, ist nicht kritisch, wobei aber mit kleineren Volumina die Wärme rascher zugeführt und abgeführt werden kann.
Die Reagenzien für die Polymerisation können der die Zielnucleinsäure enthaltenden Probe zu einem beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Zeitpunkt zugesetzt werden. Die Reagenzien können zu mehreren und verschiedenen Zeitpunkten während eines Amplifikationszyklus zugesetzt werden. Der Fachmann ist befähigt, eine geeignete Vorgehensweise für die Reagenzzugabe auszuarbeiten.
Das neue synthetisierte, hybridisierte Produkt der Matrize und deren aus dem Primer gebildete komplementäre Nucleinsäure werden in den nachfolgenden Stufen des Verfahrens eingesetzt. Sie werden sodann durch Erwärmen denaturiert und als Matrizen für weitere Priming-, Erweiterungs- und Denaturierungszyklen verwendet, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Die Zeitspanne für jeden Zyklus kann je nach der verwendeten Ausrüstung und den Reagenzien stark variieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dauert jeder Zyklus 120 Sekunden oder weniger. Der Zyklus kann so oft durchgeführt werden, wie es zur Bildung der gewünschten Menge der Zielnucleinsäure erforderlich ist.
Nach dem letzten Zyklus können die endgültigen Primer-Extensionsprodukte auf die nachstehend beschriebene Weise nachgewiesen werden. Vorzugsweise werden die Produkte ein letztes Mal denaturiert, wodurch man Mehrfachkopien der Stränge der Zielnucleinsäure erhält.
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wird auf kontinuierliche, automatisierte Art und Weise durchgeführt, so daß das Reaktionsgemisch in kontrollierter Weise für eine gewünschte, vorher festgelegte Anzahl von Durchgängen dem Temperaturzyklus unterworfen wird. Eine Anzahl von Instrumenten wurde für diesen Zweck ermittelt, wie es dem Fachmann bekannt ist. Ein derartiges Instrument für diesen Zweck ist ausführlich in US-A-4 965 188 und EP-A-0 236 069 beschrieben. Mit diesem Instrument werden Flüssigkeiten unter kontrollierten Bedingungen von einem Temperaturmilieu zu einem anderen gebracht.
Ein weiteres Instrument bedient sich einer Temperatur-Zyklusführung ohne ein flüssiges Handhabungssystem; es ist in einiger Ausführlichkeit in US-A-4 965 188 und EP-A-0 236 069 beschrieben. Im allgemeinen umfaßt dieses Instrument einen wärmeleitenden Behälter zur Aufnahme einer Anzahl von ein Reaktionsgemisch enthaltenden Reaktionsrohren, einer Einrichtung zum Erwärmen, zum Kühlen und zum Konstanthalten der Temperatur und eine Recheneinrichtung zur Erzeugung von Signalen zur Steuerung der Amplifikationssequenz, der Temperaturänderungen und der Zeitgebung.
Ein bevorzugtes Instrument zur Bearbeitung von Amplifikationsreaktionen in einer chemischen Einmal-Testpackung ist in einiger Ausführlichkeit in EP-402 994 beschrieben. Im allgemeinen umfaßt dieses Instrument eine Trägerfläche, die eine chemische Testpackung trägt, auf der Fläche befindliche Vorrichtungen zum Anlegen von Druck, um auf die Reaktionspackung einzuwirken und um Flüssigkeiten zwischen benachbarten Kammern in der Testpackung zu übertragen, sowie eine Einrichtung zum Betätigen der Druckvorrichtungen über einen Bewegungsbereich, der sich über die Testpackung erstreckt.
EP-402 995 bringt Einzelheiten über geeignete chemische Testpackungen, die bei Verwendung des in EP-402 994 beschriebenen Instruments verarbeitet werden können. Dort sind auch Einrichtungen zum Erwärmen und zum Abkühlen der Testpackung in wiederholten Intervallen (d. h. über die Zyklen hinweg) beschrieben, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vorteilhafter Weise zum raschen Nachweis einer Zielnucleinsäure, die beispielsweise in einem infektiösen Mittel enthalten ist, verwendet werden. Nachdem die gewünschte Menge der Zielnucleinsäure erzeugt worden ist, wird sie durch Bildung eines wasserunlöslichen Hybridisierungsprodukts davon mit einer Abfangsonde, die nicht markiert ist, nachgewiesen.
Die Abfangsonde umfaßt ein wasserunlösliches, polymeres Teilchen, an das ein Oligonucleotid (15-20 Nucleotide) kovalent gebunden ist, das komplementär zu einer ersten Sequenz der Zielnucleinsäure ist.
Das Oligonucleotid kann direkt über kovalente Bindungen, die sich durch eine chemische Reaktion des Oligonucleotids mit reaktiven Gruppen an den Teilchen ergeben, gebunden werden. Alternativ kann eine Abstandshaltergruppe eines bestimmten Typs an das Teilchen oder an das Oligonucleotid vor der Bindungsbildung angebracht werden. Eine derartige geeignete Abstandshaltergruppe und Verfahren zu ihrer Verwendung sind in US-A-4 914 210 beschrieben.
Eine Vielzahl von polymeren Teilchen kann bei der praktischen Durchführung der Erfindung eingesetzt werden, wozu Teilchen gehören, die aus natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymeren hergestellt worden sind. Vorzugsweise weisen die Teilchen eine kugelförmige Gestalt auf und besitzen eine durchschnittliche Größe (größte Abmessung) von 0,01 bis 10 mm, obgleich die Größe sowie die strukturelle und räumliche Konfiguration nicht kritisch sind. Bevorzugte Teilchen weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,01 bis 5 mm auf. Zahlreiche derartige Teilchen sind im Handel aus einer Anzahl von Quellen erhältlich. Alternativ sind Reagenzien und Verfahren zur Herstellung von derartigen Teilchen beispielsweise aus EP-A-0 323 692 bekannt.
Das Oligonucleotid wird kovalent an die Oberfläche der Teilchen gebunden, wozu man eine aus dem Stand der Technik bekannte Anzahl von reaktiven Gruppen und Reaktionen heranzieht. Reaktive Gruppen können an der Oberfläche der Teilchen als ein Teil der Struktur des Polymeren bereitgestellt werden oder sie können hinzugefügt werden, indem man ein inertes Material beschichtet oder chemisch behandelt. Für den Fachmann ist es leicht ersichtlich, wie derartige Materialien mit geeigneten reaktiven Gruppen hergestellt werden können, wobei beispielsweise folgende Gruppen in Frage kommen (ohne Beschränkung hierauf): Carboxy-, 2-subst.-Ethylsulfonyl-, 2- subst. -Ethylcarbonyl-, Vinylsulfonyl-, Amino-, Sulfhydryl-, Vinylcarbonyl-, Epoxy-, Aldehyd-, aktive Halogen-, Hydrazid- und aktive Estergruppen, wie Succinimidoxycarbonyl.
Besonders geeignete teilchenförmige Trägermaterialien sind polymere Kügelchen, beispielsweise gemäß EP-A-0 323 692, die aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren mit einer aktiven Halogengruppe, aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen hergestellt werden. Weitere besonders geeignete Teilchen mit reaktiven Carboxylgruppen sind in EP-A-0 466 220 beschrieben.
Zu geeigneten Homo- und Copolymeren gehören (ohne Beschränkung hierauf) Poly- (styrol-co-acrylsäure) (70:30 Molverhältnis), Poly-(m & p-chlormethylstyrol), Poly- (styrol-co- m & p-chlormethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (67:30:3 Molverhältnis), Poly-[styrol-co-m & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)-styrol] (96:4 Molverhältnis), Poly-{styrol-co-N-[m & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)-phenyl]-acrylamid} (99,3:0,7 Molverhältnis), Poly-(m & p-chlormethylstyrol-co-methacrylsäure) (95:5 Molverhältnis), Poly-[styrol-co-m & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)-styrol-co-methacrylsäure] (93,5:4,5:2 Molverhältnis) und Poly-[styrol-co-4-(2-chlorethylsulfonylmethyl)-styrol] (95,5:4,5 Molverhältnis).
Die Bildung eines Hybridisierungsprodukts der amplifizierten Zielnucleinsäure und der Abfangsonde kann erreicht werden, indem man die beiden Materialien unter herkömmlichen Bedingungen vermischt, beispielsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 45ºC für eine Zeitspanne von mindestens 5 Minuten. Repräsentative spezielle Bedingungen sind im nachstehenden Beispiel beschrieben.
Gleichzeitig mit der Hybridisierung der Abfangsonde und der Zielnucleinsäure oder vor diesem Vorgang wird auch die Zielnucleinsäure mit einem oder mehreren gesonderten sekundären Oligonucleotiden hybridisiert. Jedes dieser Oligonucleotide ist komplementär zu einer gesonderten Sequenz der Zielnucleinsäure, die sich von der ersten, vorstehend erwähnten Sequenz unterscheidet und die untereinander unterschiedlich sind. Die Länge dieser Oligonucleotide ist vorstehend angegeben. Sie sind im allgemeinen unmarkiert und wasserlöslich. Vorzugsweise werden im Test zwei sekundäre Oligonucleotide verwendet, gegebenenfalls können aber auch mehr eingesetzt werden. Ferner ist es bevorzugt, daß die amplifizierte Zielnucleinsäure im wesentlichen gleichzeitig mit der Abfangsonde und den sekundären Oligonucleotiden kontaktiert wird. Die Menge des sekundären Oligonucleotids kann stark variieren, es ist aber vorzugsweise in etwa der gleichen Konzentration wie das Oligonucleotid der Abfangsonde vorhanden.
Das erhaltene hybridisierte Produkt der amplifizierten Zielnucleinsäure, der Abfangsonde und der sekundären Oligonucleotide kann auf beliebige geeignete Art und Weise, die dem Fachmann geläufig ist, nachgewiesen werden.
Im allgemeinen ist es zum Nachweis erforderlich, daß das hybridisierte Produkt von den übrigen Materialien im Reaktionsmedium abgetrennt wird. Dies kann auf vielfältige Weise erfolgen, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation oder andere geeignete Trenntechniken.
Zu besonders geeigneten Trenneinrichtungen gehören mikroporöse Filtrationsmembranen, wie die Polyamid-Membranen der Fa. Pall Corp. Sie können in unbeschichteter Form oder in einer mit Tensiden oder anderen Materialien, die den Fluidstrom erleichtern, vorbeschichteten Form vorliegen. Weitere Typen von Filtern können ebenfalls eingesetzt werden.
Die Membran oder der Filter können als ein getrennter Gegenstand zusammen mit geeigneten Behältern zum Sammeln von flussigen und wasserlöslichen Materialien eingesetzt werden. Vorzugsweise sind jedoch die Membranen als ein Teil einer Testvorrichtung angebracht. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, beispielsweise aus US-A-3 825 410, US-A-3 888 629, US-A-3 970 429 und US-A- 4 446 232. Besonders geeignete Vorrichtungen sind in US-A-4 921 677 beschrieben.
Alternativ zur vorstehend beschriebenen Trennung kann die Zielnucleinsäure unter Verwendung der Abfangsonde nachgewiesen werden, die auf einem flachen Substrat, wie den vorstehend beschriebenen mikroporösen Filtrationsmembranen, oder auf dünnen polymeren Filmen, unbeschichteten Papieren oder polymerbeschichteten Papieren, für die zahlreiche Beispiele aus dem Stand der Technik bekannt sind, Glasobjektträgern und anderen nicht-porösen Substraten, die dem Fachmann geläufig sind, immobilisiert ist.
In einer Ausführungsform kann der Nachweis des hybridisierten Produkts unter Verwendung einer Nachweissonde erreicht werden, die entweder mit der Abfangsonde oder einer anderen Sequenz der Zielnucleinsäure (d. h. eine Sequenz, die von den mit der Abfangsonde und den sekundären Oligonucleotiden komplementären Sequenzen abweicht) komplementär ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Nachweis unter Verwendung einer Nachweissonde erreicht werden, die zu mindestens einem der sekundären Oligonucleotide komplementär ist.
Verfahren zum Anbringen von Markierungen für den Nachweis und zur Herstellung von derartigen Sonden sind aus dem Stand der Technik bekannt; vgl. z. B. Agrawal et al., Nucleic Acid Res., Bd. 14 (1986), S. 6227-6245, US-A-4 914 210 bezüglich Biotinmarkierungen, US-A-4 962 029 bezüglich Enzymmarkierungen, sowie die dort genannten Literaturstellen. Zu geeigneten Markierungen gehören Radioisotope, elektronendichte Reagenzien, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszierende Reste, Ferritin und andere magnetische Teilchen (vgl. US-A-4 795 698 und US-A-4 920 061), chemilumineszierende Reste und Enzyme (die bevorzugt werden) . Zu geeigneten Enzymen gehören Glucose-oxidase, Peroxidasen, Uricase, alkalische Phosphatase und andere aus dem Stand der Technik bekannte Produkte. Diese können unter Anwendung bekannter Verfahren an Oligonucleotide gebunden werden. Substrate und Reagenzien zur Bereitstellung eines nachweisbaren kolorimetrischen, fluorimetrischen oder chemilumineszierenden Signals in Anwesenheit einer vorgegebenen Enzymmarkierung sind bekannt; vgl. beispielsweise US-A-4 994 373.
Sofern es sich bei der Markierung um ein bevorzugtes Enzym, wie eine Peroxidase, handelt, werden zu einem bestimmten Zeitpunkt des Tests Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Zusammensetzungen zugegeben, um für einen nachweisbaren Farbstoff zu sorgen. Zu geeigneten farbstoffbildenden Reagenzien gehören beispielsweise Tetramethylbenzidin und Derivate davon, und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (gemäß US-A-4 089 747) oder andere Verbindungen, die unter Bereitstellung eines Farbstoffs in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid reagieren. Besonders wertvolle farbstoffbildende Zusammensetzungen sind in EP-A-0 308 236 beschrieben.
Der Nachweis des erhaltenen Signals kann unter Anwendung einer geeigneten Nachweiseinrichtung und von Verfahrensweisen, die bekannt sind, erreicht werden. Bestimmte Sonden können Signale liefern, die ohne Anwendung einer Nachweiseinrichtung für das Auge sichtbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird einer der Primer mit einem spezifisch bindenden Liganden, wie Biotin, einem Antikörper oder Lectin, markiert. Der markierte Primer liefert (über Amplifikation) eine amplifizierte Zielnucleinsäure, an der der spezifisch bindende Ligand angebracht ist. Diese amplifizierte Nucleinsäure wird unter Verwendung eines nachweisbar markierten Rezeptors für den spezifisch bindenden Liganden nachgewiesen. Wenn es sich beispielsweise bei dem spezifisch bindenden Rest um Biotin handelt, so handelt es sich beim Rezeptor um Avidin oder um ein Äquivalent davon. Der Rezeptor, z. B. Avidin, kann mit einem Enzym konjugiert sein oder einen radioaktiven Rest aufweisen, der gemäß den vorstehenden Angaben ein nachweisbares Signal liefert.
In einer weiteren Ausführungsform kann die amplifizierte Zielnucleinsäure durch Einverleibung eines Radioisotops in das amplifizierte Produkt unter Verwendung von dNTPs in der Primererweiterung, die mit einem Radioisotop markiert sind, nachgewiesen werden.
Ferner ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren in einem geeigneten Behälter durchzuführen. Zu derartigen Behältern gehören allgemein Teströhrchen, Küvetten, Kolben oder Bechergläser, wobei aber speziellere Behälter entwickelt worden sind, um automatisierte Abläufe zur Durchführung des Verfahrens zu erleichtern. Beispielsweise wird eine Küvette, die so konstruiert ist, daß sie bei der praktischen Durchführung des Verfahrens bestimmte Temperatureigenschaften gewährleistet, in US-A-4 902 624 beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der erfindungsgemäßen Praxis, sollen diese aber in keiner Weise beschränken. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich, sofern nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht.

Beispiele 1 bis 3: Test auf HLA-DNA

Diese Beispiele erläutern die erfindungsgemäße Praxis zur Amplifikation und zum Nachweis einer repräsentativen Nucleinsäure, nämlich ein Fragment von HLA-DNA.

Materialien und Methoden:

Eine Abfangsonde bestand aus Teilchen aus Poly-(styrolco-acrylsäure) (70:30 Molverhältnis, 2,1 mm durchschnittlicher Durchmesser) mit einem daran kovalent gebundenen Oligonucleotid mit der folgenden Sequenz, die komplementär zu einer ersten Sequenz der Zielnucleinsäure ist:

SEQ ID Nr.: 1:

5'X-GCCTGATGCC GAGTACT-3'
Das Oligonucleotid war mit den Teilchen über "X", einen Aminotetraethylenglykol-Linker mit 16 Ethylenglykoleinheiten, unter Anwendung des in US-A-4 914 210 beschriebenen Verfahrens gebunden. Dabei wurde eine wäßrige Suspension der Teilchen (1 ml, 30 mg Feststoffe) zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Sodann wurden die Teilchen in mit einer Glasanlage destilliertem Wasser (1 ml) durch heftiges Aufwirbeln resuspendiert, wonach sich eine Zentrifugation und Entfernung des Überstands anschloß. Sodann wurden die Teilchen erneut in einer Lösung (1 ml) Natriumchlorid (3 n) in Methylimidazol-Puffer (0,2 m, pH-Wert 7) resuspendiert.
Diese Suspension wurde mit dem angegebenen Oligonucleotid (2,5 nmol) versetzt und anschließend gründlich gemischt. Die aktivierende Verbindung, d. h. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid-hydrochlorid (5 mg), wurde zugegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch gründlich durch Aufwirbeln vermischt und bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren mindestens 2 Stunden inkubiert.
Sodann wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das erhaltene teilchenförmige Reagens wurde mit den nachstehend angegebenen Flüssigkeiten durch Zentrifugation und Abpipettieren des Überstands zwischen den Waschvorgängen gewaschen: a) drei Waschvorgänge mit in einer Glasanlage destilliertem Wasser (jeweils 1 ml) und b) drei Waschvorgänge mit einer Pufferlösung (jeweils 1 ml, pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an Natriumchlorid (0,018 M), Natriumphosphat (1 mM), Ethylendiamintetraessigsäure (0,1 mM) und Dodecylsulfat (0,5%), der auf 70ºC vorerwärmt worden war.
Nach dem letzten Waschvorgang wurden die Reagenzien in mit einer Glasanlage destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 ml unter Bildung einer 3%igen Dispersion resuspendiert. Die Reagenzien wurden bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
Eine Leukofarbstoffzusammensetzung mit einem Gehalt an 2- (4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis-(4-methoxyphenyl)- imidazol wurde auffolgende Weise hergestellt:
Fester Leukofarbstoff (zur Bildung einer 0,1%igen Lösung) wurde in einer Lösung von Poly-(vinylpyrrolidon) (20%) in Natriumphosphatpuffer (5 mM) gelöst. Die Lösung wurde sodann mit einer Lösung von Wasserstoffperoxid (10 mM), 4% -Hydroxyacetanilid-Elektronenübertragungsmittel (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure-Chelatisierungsmittel (10 mM) in Natriumphosphatpuffer unter Erzielung einer Endkonzentration von 1% Polymerem und 0,005% Leukofarbstoff gegeben.
Während der Amplifikation wurde eine DNA-Polymerase verwendet, die aus Thermus aquaticus nach üblichen Verfahren isoliert worden war und die eine Aktivität von 4 Einheiten/ml aufwies. Eine "Einheit" ist als die Menge der Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um 10 nmol Gesamtnucleotide (dNTP's) in eine zu erweiternde Nucleinsäurekette innerhalb von 30 Minuten bei 74ºC einzubauen.
Bei der Zielnucleinsäure handelte es sich um ein HLA-DNA- Fragment, das durch Amplifizieren eines Segments von HLA-DQb- Gens mit 231 bp unter Verwendung von eine hypervariable Region im Exon 1 flankierenden Primern erzeugt worden war. Das HLA-DNA-Fragment wurde aus der Zellinie FPF (Human Genetic Mutant Cell Deposit, Camdem, New Jersey) gemäß den Angaben von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 458, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, isoliert.
Die bei der Amplifikation im Test verwendeten Primer wiesen folgende Sequenzen auf:

SEQ ID Nr.: 2:

5'-Y-CTCGGATCCG CATGTGCTAC TTCACCAACG-3'
und

SEQ ID Nr.: 3:

5'-GAGCTGCAGG TAGTTGTGTC TGCACAC-3'
worin Y einen Biotintetraethylenglykol-Linkerrest bedeutet, der an das Oligonucleotid unter Anwendung des in US-A-4 914 210 beschriebenen Verfahrens gebunden worden ist.
Die in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten sekundären Oligonucleotide wiesen die folgenden Sequenzen auf:

SEQ ID Nr.: 4:

5'-ACGTGGGGGT GTATCGGGCG GTGACGC-3'

SEQ ID Nr.: 5:

5'-GGAACAGCCA GAAGCAAGTC CTGGAG-3'
Sämtliche in diesen Beispielen verwendeten Nucleotide wurden unter Verwendung eines herkömmlichen, automatisierten SAM-1-DNA-Synthesizers (Biosearch) und unter Anwendung bekannter Verfahren (vgl. beispielsweise die Angaben von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859- 1862) hergestellt und gereinigt.

Testverfahren

Eine amplifizierte Zielnucleinsäure wurde durch Amplifikation des angegebenen HLA-DNA-Fragments unter Verwendung von tritierten dNTP's auffolgende Weise bereitgestellt: Das HLA-DNA-Fragment (1 mg) wurde zu einer Pufferlösung (100 ml) mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen gegeben: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer (67 millimolar, pH-Wert 8,8), Ammoniumsulfat (16,6 millimolar), Magnesiumchlorid (2,5 millimolar) und Gelatine (10 mg). Die vorstehend beschriebenen Primer (jeweils 20 pmol) wurden zugesetzt, wonach die Zugabe der tritierten dNTP's (jeweils 0,17 millimolar) und der DNA-Polymerase (12 Einheiten) folgte.
Die Amplifikation wurde für 35 nachstehend angegebene Zyklen unter Verwendung eines üblichen Perkin-Elmer-Thermozyklisierungsgeräts durchgeführt:
Denaturierung bei 95ºC für 30 Sekunden,
Abkühlen auf 65ºC und Hybridisierung bei dieser Temperatur für 30 Sekunden und
Erwärmen auf 70ºC und Primererweiterung bei dieser Temperatur für 1 Minute.
Eine Lösung (10 ml) der erhaltenen amplifizierten Zielnucleinsäure wurde 5 Minuten auf 95ºC erwärmt, um die Nucleinsäurestränge zu denaturieren Anschließend wurden getrennt die folgenden Komponenten zugemischt:
die Abfangsonde (150 mg) allein in einem Kontrolltest,
die Abfangsonde (150 mg) und das sekundäre Oligonucleotid SEQ ID Nr.: 4 (vorstehend angegeben, 50 mM) in Beispiel 1,
die Abfangsonde (150 mg) und das sekundäre Oligonucleotid SEQ ID Nr.: 5 (vorstehend angegeben, 50 mM) in Beispiel 2 und
die Abfangsonde (150 mg) und die beiden sekundären Oligonucleotide SEQ ID Nr.: 4 und SEQ ID Nr.: 5 (vorstehend angegeben, 50 mM) in Beispiel 3.
Die einzeln erhaltenen Suspensionen befanden sich in einer gepufferten Lösung mit einem Gehalt an Natriumphosphat (0,125 M, pH-Wert 6,8), Natriumchlorid (2,5 M) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mM). Sie wurden 10 Minuten bei 42ºC inkubiert, um die Hybridisierung der Abfangsonde und der sekundären Oligonucleotide mit der amplifizierten Zielnucleinsäure zu ermöglichen.
Die hybridisierten Produkte wurden mit einer Lösung (300 ml) mit einem Gehalt an Natriumphosphat (0,85 mM), Natriumchlorid (15 mM) und Natriumdodecylsulfat (0,5%), die jeweils auf 50ºC vorerwärmt worden waren, gewaschen. Die erhaltenen Suspensionen wurden zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert. Die Menge der Tritiummarkierung, die im wasserunlöslichen Produkt verblieb, wurde bei sämtlichen Tests gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 1 zusammengestellt.
Ein getrennter Satz von Suspensionen, die die hybridisierten Produkte aus der Abfangsonde, den sekundären Oligonucleotiden und der amplifizierten Zielnucleinsäure enthielten, wurde unter Verwendung von kolorimetrischen Signalen in Surecell -Einmal-Testvorrichtungen (Eastman Kodak Company) erfaßt. Diese Vorrichtungen enthielten drei Testvertiefungen mit einer mikroporösen Loprodyner -Membran (durchschnittliche Porengröße 1,2 mm, Pall Corp.) in jeder Testvertiefung. Die Suspensionen wurden auf die Testvorrichtungen gegeben. Man ließ Flüssigkeit durch die Membranen fließen, wobei die hybridisierten Produkte an den Membranen festgehalten wurden.
Die Produkte wurden mit einer Lösung (300 ml) mit einem Gehalt an Natriumphosphat (0,85 mM) Natriumchlorid (15 mM) und Natriumdodecylsulfat (0,5%), die auf 50ºC vorerwärmt worden war, gewaschen.
Das Avidin-Meerrettich-peroxidase-Konjugat (30 ml Lösung mit einem Gehalt an 2,3 ng Konjugat) wurde in die Testvertiefungen gegeben. Die Surecell -Testvorrichtungen wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden die Produkte mit einer Lösung (200 ml) mit einem Gehalt an Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (50 millimolar, pH-Wert 8,8), Natriumdodecylsulfat (2,4%), Natriumchlorid (0,5 m) und 1-Methyl-2-pyrrolidinon (0,25 millimolar) gewaschen. Die Leukofarbstoff-Lösung (50 ml) wurde zugegeben, wonach 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Das Farbstoffsignal an den Membranen wurde visuell bewertet und mit einer Farbskala verglichen (Bewertungen 0 bis 10, wobei 10 die höchste Farbdichte darstellt). Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle I zusammengestellt.
Die Ergebnisse zeigen, daß das Vorliegen von einem oder beiden sekundären Oligonucleotiden die Wirksamkeit des Nachweises der amplifizierten Zielnucleinsäure verbessert. Tabelle I

(1) Information zur Seq.Id.Nr. 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17 Nucleotide
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Sondenoligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Anti-Sense: nein
(vi) Originalquelle: synthetisch hergestellt
(vii) Unmittelbare Herkunft: synthetisch hergestellt
(x) Angaben zu Publikationen: keine
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
GCCTGATGCC GAGTACT

(1) Information zur Seq.Id.Nr. 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30 Nucleotide
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzeistrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Primer
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Anti-Sense: nein
(vi) Originaiquelle: synthetisch hergestellt
(vii) Unmittelbare Herkunft: synthetisch hergestellt
(x) Angaben zu Publikationen: keine
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:
CTCGGATCCG CATGTGCTAC TTCACCAACG

(1) Information zur Seq.Id.Nr. 3:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 27 Nucleotide
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Primer
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Anti-Sense: nein
(vi) Originalquelle: synthetisch hergestellt
(vii) Unmittelbare Herkunft: synthetisch hergestellt
(x) Angaben zu Publikationen: keine
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3:
GAGCTGCAGG TAGTTGTGTC TGCACAC

(1) Information zur Seq.Id.Nr. 4:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 27 Nucleotide
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Anti-Sense: nein
(vi) Originalquelle: synthetisch hergestellt
(vii) Unmittelbare Herkunft: synthetisch hergestellt
(x) Angaben zu Publikationen: keine
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4:
ACGTGGGGGT GTATCGGGCG GTGACGC

(1) Information zur Seq.Id.Nr. 5:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 26 Nucleotide
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Anti-Sense: nein
(vi) Originalquelle: synthetisch hergestellt
(vii) Unmittelbare Herkunft: synthetisch hergestellt
(x) Angaben zu Publikationen: keine
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5:
GGAACAGCCA GAAGCAAGTC CTGGAG

Claims

1. Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis einer doppelstrangigen Nucleinsäure, umfassend:

A. nach Denaturierung einer doppeisträngigen Zielnucleinsäure und unter Hybridisierungsbedingungen das Amplifizieren der Zielnucleinsäure unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, komplementärer Primer und dNTPs,

B. das Bilden eines wasserunlöslichen Hybridisierungsprodukts der amplifizierten Zielnucleinsäure mit einer wasserunlöslichen, nicht nachweisbar markierten Abfangsonde, wobei die Abfangsonde ein wasserunlösliches polymeres Teilchen umfaßt, an das kovalent ein zu einer ersten Sequenz der Zielnucleinsäure komplementäres Oligonucleotid gebunden ist, wobei das Oligonucleotid eine Länge von 15-20 Nucleotiden aufweist, und

gleichzeitig oder vor der Produktbildung das Kontaktieren der amplifizierten Zielnucleinsäure mit einem oder mehreren, wasserlöslichen, gesonderten sekundären Oligonucleotiden, wobei die einzelnen sekundären Oligonucleotide zu einer Sequenz der Zielnucleinsäure, die von der ersten Sequenz abweicht, komplementär sind und wobei die sekundären Oligonucleotide eine Länge aufweisen, die gleich oder größer als die Länge des Abfangsonden-Oligonucleotids ist,

um die sekundären Oligonucleotide mit der amplifizierten Zielnucleinsäure zu hybridisieren, und

C. das Nachweisen des erhaltenen hybridisierten Produkts der Zielnucleinsäure mit der Abfangsonde, umfassend die Verwendung einer Nachweissonde, die komplementär ist zu einer Sequenz der Zielnucleinsäure, die von den zur Abfangsonde und den sekundären Oligonucleotiden komplementären Sequenzen abweicht, oder die Verwendung einer Nachweissonde, die zu mindestens einem der sekundären Oligonucleotide komplementär ist oder die Verwendung von markierten Primern oder die Verwendung von markierten dNTPs.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von einem beliebigen der Bestandteile humane Leucozyten-Antigen-DNA, HIV- I-DNA, HIV-II-DNA, zytomegalovirale DNA, humane papillomavirale DNA oder β-Globin-DNA oder ein Fragment davon.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die Zielnucleinsäure gleichzeitig mit der Abfangsonde und den sekundären Oligonucleotiden kontaktiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Konzentration der sekundären Oligonucleotide die gleiche wie die des Abfangsonden-Oligonucleotids ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die einzelnen Hybridisierungen bei einer Temperatur von 40-45ºC für mindestens 5 Minuten durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zielnucleinsäure eine Länge von weniger als 250-mer aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Amplifikation unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, die aus einer Thermus-Spezies isoliert ist, oder eines rekombinanten Äquivalents davon und unter mindestens 20 Amplifikationszyklen erreicht wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Abfangsonde an einem Substrat immobilisiert ist, das aus der Gruppe mikroporöse Filtrationsmembranen, polymere Filme und harzbeschichtete Papiere ausgewählt ist und wobei der Nachweis des hybridisierten Produkts am Substrat erfolgt.

9. Kit zur Amplifikation und zum Nachweis einer Zielnucleinsäure nach dem Verfahren von Anspruch 1, umfassend eine Sonde mit einem zu einer ersten Sequenz der Zielnucleinsäure komplementären Oligonucleotid und ein oder mehr wasserlösliche, gesonderte sekundäre Oligonucleotide, wobei die sekundären Oligonucleotide jeweils komplementär zu einer Sequenz der Zielnucleinsäure, die von der ersten Sequenz abweicht, sind,

wobei das Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich bei der Sonde um eine wasserunlösliche Abfangsonde handelt, die nicht nachweisbar markiert ist und ein wasserunlösliches polymeres Teilchen enthält, an das das Sondenoligonucleotid gebunden ist, wobei das Oligonucleotid eine Länge von 15-20 Nucleotiden aufweist, und

wobei die sekundären Oligonucleotide jeweils eine Länge aufweisen, die gleich oder größer als die Länge des Abfangsonden-Oligonucleotids ist.

10. Kit nach Anspruch 9, wobei das Abfangsonden-Oligonucleotid 15-mer bis 20-mer ist und die sekundären Oligonucleotide jeweils unabhängig 15-mer bis 35-mer sind.