DE69936642T2

DE69936642T2 - Verfahren unter verwendung ungleicher primer-konzentrationen zur herstellung von nukleinsäure-amplifikaten

Info

Publication number: DE69936642T2
Application number: DE69936642T
Authority: DE
Inventors: John A. Racine SALITURO; John L. San Diego CARRINO
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2019-05-12
Also published as: JP2002515261A; CA2332518C; EP1076721B1; DE69936642D1; US20020045163A1; EP1076721A2; ATE368129T1; US7037688B2; WO1999060159A3; WO1999060159A2; US20020160406A1; US6391544B1; JP4634608B2; CA2332518A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäureamplifikationsreaktionen und insbesondere betrifft sie Amplifikationsreaktionen, die ein Paar von Primersequenzen verwenden, um Kopien einer Zielsequenz zu erzeugen, worin die erste Primer-Sequenz des Paares in 15% bis 250% molarem prozentualen Überschuß gegenüber der zweiten Primer-Sequenz vorliegt.
Hintergrund der Erfindung
Nukleinsäureamplifikationsreaktionen sind wohl bekannt und werden verwendet, um die Konzentration einer Zielnukleinsäure in einer Testprobe zu erhöhen. Die "Zielnukleinsäure" ist typischerweise in einer Probe in niedrigen Konzentrationen vorhanden und kann deshalb nicht leicht detektiert werden ohne daß sie amplifiziert wird, um die Konzentration der Zielsequenz in der Probe zu erhöhen. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion, die üblicherweise für die Zwecke der Amplifizierung einer Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird.
Gemäß den Prinzipien der PCR werden "Primersequenzen" verwendet, um die Synthese von Kopien der Zielsequenz zu starten. Genauer hybridisieren Primersequenzen, unter geeigneten Bedingungen, an gegenteilige Stränge einer doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz, so daß die Primer an die Zielsequenz angrenzen. Sobald sie hybridisiert sind, werden die Primer unter Verwendung von Enzymen verlängert, wie zum Beispiel DNA Polymerase, welche die Primersequenzen verlängert, um dabei Kopien der Zielsequenz zu erzeugen. Zusätzliche Kopien der Zielsequenz werden erzeugt durch die Kreislaufführung (cycling, Zyklisierung) der obigen Schritte von (i) Hybridisieren und Verlängern der Primersequenzen und (ii) Aufspalten der verlängerten Primersequenzen (oder Kopien der Zielsequenz), so daß zusätzliche Primer an das ursprüngliche Ziel hybridisieren können, ebenso wie Kopien der Zielsequenz. Somit werden vielfache Kopien der Zielsequenz erzeugt.
Sobald sie einmal amplifiziert sind, können Kopien der Zielsequenz detektiert werden, um zu bestimmen, ob die Zielsequenz ursprünglich in der Testprobe vorhanden war. Natürlich sollte, wenn die Zielsequenz nicht vorhanden war, keine Amplifikation auftreten, und die Zielsequenz sollte nicht detektiert werden. In jedem Fall werden amplifizierte Zielsequenzen typischerweise unter Verwendung von Markern detektiert. Marker sind Einheiten, die eine detektierbare Eigenschaft haben, und sie können in die Kopien der Zielsequenz eingeschlossen werden. Marker werden typischerweise in die amplifizierten Zielsequenzen eingeschlossen indem die Marker an Primer-Sequenzen angeheftet werden, welche dann in das Amplifikationsprodukt wie oben angegeben eingeschlossen werden. Alternativ können zum Beispiel Verlängerungsprodukte durch Einschließen von markierten Nukleotiden in solche Produkte während der Primerverängerung markiert werden. Das Vorhandensein der Zielsequenz in der Testprobe kann dann bestimmt werden durch Detektieren des markierten Amplifikationsprodukts.
Amplifizierte Zielsequenzen können auch detektiert werden unter Verwendung von markierten Sonden, welche an einen Strang oder an beide Stränge einer amplifizierten Zielsequenz hybridisieren. Jedoch ist es manchmal wünschenswert, eine Sonde zu verwenden, die nur an einen Strang eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts hybridisiert. Der Effekt eines solchen Detektionsschemas, zumindest was eine doppelsträngige Zielsequenz betrifft, ist, daß ein einzelner Strang einer amplifizierten Zielsequenz detektiert wird, um die Anwesenheit der Zielsequenz in der Testprobe zu bestimmen. Jedoch kann die Detektion eines einzelnen Strangs eines Amplifikationsprodukts ineffizient sein, insofern als das Signal auf einem Plateau stehen bleibt und manchmal abfällt (oder hakt), wenn die Anzahl an Zielsequenzen, die ursprünglich in der Testprobe vorhanden waren, ansteigt. Das Abschwächen des "Hakens (hooking)" oder "Plateaubildungs"-Phänomens und das Bereitstellen eines linearen Signals über einen breiteren Bereich von Zielsequenzkonzentrationen würde nützlich sein, insbesondere für Amplifikations-basierte Assays, die entwickelt wurden, um die Menge einer Zielsequenz in einer Testprobe quantitativ zu bestimmen.
Es würde erwartet werden, daß das wesentliche Erhöhen der Konzentration von einem Primer gegenüber dem anderen dieses Problem abschwächen würde, indem mehr von der Sequenz erzeugt wird, die detektiert wird. In der Tat beschreibt U.S. Patent Nr. 5,066,584 ein Verfahren zur vorzugsweisen Erzeugung eines Stranges einer doppelsträngigen Zielsequenz durch Erhöhen der Konzentration eines Primers in großem Maße. Jedoch erfordert dies überschüssige Reagenzien und deshalb überschüssige Kosten, die mit der vorzugsweisen Erzeugung von einem von zwei einzelnen Strängen zusammenhängen. Zusätzlich kann das wesentliche Erhöhen von Primerkonzentrationen die Chancen von nicht spezifischem Priming erhöhen und deshalb die Amplifikation von nicht-Zielsequenzen. Desweiteren werden oft kompetitierende nichtspezifische Reaktionen die effiziente Amplifikation der Sequenz von Interesse stören. Deshalb kann erwartet werden, daß das wesentliche Erhöhen der Konzentration von einem Primer gegenüber dem anderen Primer Probleme geben wird in Amplifikationsassays, welche als hochempfindlich entwickelt wurden (d.h. entwickelt, um niedrige Anzahlen einer Sequenz von Interesse zu detektieren).
EP0418960 A2 (27.09.1991) beschreibt ein Verfahren, das die Schritte Amplifizieren durch PCR unter Verwendung von ungleichen Primerkonzentrationen für die Detektion von Nukleinsäuren einschließt. Einer der Primer liegt mindestens in einer 100% größeren Konzentration vor als der andere (molares Verhältnis von mindestens 2:1). Das Verlängerungsprodukt dieses Primers kann markiert werde, unter Verwendung eines markierten Primers, und/oder immobilisiert werden unter Verwendung einer markierten Hybridisierungssonde oder "Einfangsonde" (Seite 4, Zeilen 13-15; Seite 5, Zeilen 34-56; Ansprüche 1, 9 und 10). WO 94/24307 (27.10.1994) beschreibt ein Verfahren der Amplifikation von polymorpher DNA, in welchem einer der Primer in einem Überschuß von 0 bis 25% vorliegen kann (Stöchiometrie von 1:1,25 bis 1:0,8; siehe Zusammenfassung (abstract); Seite 4, Zeilen 26-29; und Anspruch 7). Jedoch offenbart keine von diesen die Verwendung der ungleichen Primerkonzentrationen, um den oben erwähnten "Hak"-Effekt zu reduzieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion einer Zielsequenz in einer Testprobe bereit. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte: (a) Bilden einer Reaktionsmischung, die eine Testprobe, Amplifikationsreagenzien, einen ersten Primer, und einen zweiten Primer umfaßt, so daß die Konzentration des ersten Primers in der Reaktionsmischung 15 Molprozent bis 250 Molprozent größer ist als die Konzentration des zweiten Primers; (b) Amplifizieren der Zielsequenz, um Kopien der Zielsequenz zu erzeugen, welche ein Amplifikationsprodukt aus dem ersten und dem zweiten Primer umfassen; (c) Denaturieren des Amplifikationsprodukts; und (d) Hybridisieren einer Sonde an das Amplifikationsprodukt von dem ersten Primer, um einen Hybridkomplex zu bilden; und (f) Detektieren des Hybridkomplexes als ein Anzeichen für das Vorhandensein der Zielsequenz in der Testprobe. Vorzugsweise wird der Hybridkomplex detektiert unter Verwendung von Markern, die entweder direkt detektierbar oder indirekt detektierbar sein können.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein verbessertes Verfahren zur Amplifikation und Detektion einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Testprobe, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bilden einer Amplifikationsmischung, die eine Testprobe, eine erste und eine zweite Primer-Sequenz und Amplifikationsreagenzien umfaßt, (b) Amplifizieren der Zielsequenz, um Kopien der Zielsequenz zu erzeugen, welche ein Amplifikationsprodukt aus dem ersten und dem zweiten Primer umfassen; und (c) Denaturieren des Amplifikationsprodukts; und (d) Detektieren der Kopien der Zielsequenz als ein Anzeichen für das Vorhandensein der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe; worin die Verbesserung das Bereitstellen der ersten Primer-Sequenz in 15 molprozentigem bis 250 molprozentigem Überschuß gegenüber dem zweiten Primer umfaßt, und worin eine Sonde an das Amplifikationsprodukt von dem ersten Primer hybridisiert wird, um einen Hybridkomplex zu bilden, und der Hybridkomplex wird als ein Anzeichen für das Vorhandensein der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe detektiert.
Die Verwendung von Kits zur Durchführung der Verfahren der Erfindung wird ebenfalls bereitgestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Unter geeigneten Bedingungen wird ein Primerpaar Kopien einer Zielsequenz in der Form eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts erzeugen. Jedoch kann leider, wenn ein einzelner Strang eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts mit einer Sonde detektiert wird, das resultierende Signal auf einem Plateau stehen bleiben oder sogar haken, wenn die Konzentration der ursprünglichen Zielsequenz ansteigt. Bis zu einem bestimmten Ausmaß ist dieses Phänomen widersprüchlich, da das Ansteigen der Konzentration der ursprünglichen Zielsequenz eine größere Konzentration des Endprodukts ergeben sollte und deshalb ein größeres Signal detektiert werden sollte. Jedoch kann, wie oben erwähnt, das resultierende Signal auf einem Plateau stehen bleiben. Obwohl nicht an der Theorie hängengeblieben werden soll, kann der Hak-Effekt der Anwesenheit von höheren Konzentrationen von längeren Produktsträngen zuzuschreiben sein, wobei Produktstrang Re-Annealing zum Ausschluß von Sonden/Zielstrang-Annealing führt. Die Anmelder haben überraschend und unerwartet entdeckt, daß das Plateau- oder Hak-Phänomen abgeschwächt werden könnte, indem die Konzentration eines Primers erhöht wird, so daß sie leicht höher ist als die Konzentration des anderen Primers.
Das hierin bereitgestellte Verfahren kann auf jede Amplifikationsreaktion angewendet werden, wo ein Paar von Primer-Sequenzen verwendet wird, um doppelsträngige Amplifikationsprodukte zu erzeugen, und wo nur ein Strang der doppelsträngigen Produkte detektiert wird. Das Verfahren umfaßt einen Schritt, wo eine Amplifikationsmischung gebildet wird. Die Amplifikationsmischung wird im allgemeinen folgendes umfassen:
(i) eine Testprobe, (ii) Amplifikationsreagenzien und (iii) einen ersten und zweiten Primer (kollektiv bezeichnet als ein "Primerpaar"). Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Testprobe" irgendetwas, von dem vermutet wird, daß es eine Zielsequenz enthält. Die Testprobe ist, oder kann abgeleitet sein von irgendeiner biologischen Quelle, wie zum Beispiel Blut, Augenlinsenflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Milch, Aszitesflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Gewebe, Fermentationsbrühen, Zellkulturen und dergleichen. Die Testprobe kann direkt wie von der Quelle erhalten verwendet werden, oder nach einer Vorbehandlung, um den Charakter der Probe zu modifizieren. Somit kann die Testprobe vor der Verwendung vorbehandelt sein, durch zum Beispiel Herstellen von Plasma aus Blut, Zerstören von Zellen oder viralen Partikeln, Herstellen von Flüssigkeiten aus festen Materialien, Verdünnen von viskosen Flüssigkeiten, Filtern von Flüssigkeiten, Destillieren von Flüssigkeiten, Konzentrieren von Flüssigkeiten, Inaktivieren von störenden Komponenten, Hinzufügen von Reagenzien, Reinigen von Nukleinsäuren und dergleichen. Die "Zielsequenz", die in der Testprobe vorhanden sein kann, ist eine Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert, detektiert oder amplifiziert und detektiert wird. Zusätzlich werden, während der Ausdruck "Zielsequenz" sich manchmal auf einzelnsträngig bezieht, diejenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, erkennen, daß die Zielsequenz tatsächlich doppelsträngig sein kann.
Der Ausdruck "Amplifikationsreaktionsreagenzien", wie hierin verwendet, bedeutet Reagenzien, welche wohl bekannt sind für ihre Verwendung in Nukleinsäureamplifikationsreaktionen, und er kann folgendes einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt: ein Enzym oder Enzyme, die separat oder individuell DNA Polymerase- und/oder reverse Transkriptaseaktivität haben; Enzymcofaktoren, wie zum Beispiel Magnesium oder Mangan; Salze; Nikotinamidadenindinukleotid (NAD); Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), wie zum Beispiel Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintriphosphat, Desoxycytodintriphosphat und Thymidintriphosphat; und einen geeigneten Puffer.
Die ersten und zweiten Primer sind typischerweise Nukleinsäuresesequenzen, üblicherweise DNA oder RNA. Die Länge der Primer ist nicht entscheidend, aber Primersequenzen sind üblicherweise ungefähr 10 bis ungefähr 100 Nukleotide lang, vorzugsweise von ungefähr 15-35 Nukleotide lang, und sie haben eine definierte Basensequenz, die geeignet ist für die Hybridisierung an die gewünschte Zielsequenz. Primerpaare werden üblicherweise so gewählt, daß sie an die Zielsequenz angrenzen, wie es im Fachgebiet wohl bekannt ist. Zusätzlich wird der erste Primer zu der Amplifikationsmischung hinzugefügt, so daß seine Konzentration zwischen 15 Molprozent bis 250 Molprozent größer ist und vorzugsweise 20 Molprozent bis 150 Molprozent größer, als die Konzentration des zweiten Primers. Natürlich kann der erste Primer bei Konzentrationen von 100 Molprozent, 500 Molprozent und bis zu und mehr als 1000 Molprozent größer als die Konzentration des zweiten Primers verwendet werden, aber da die Konzentration von einem Primer gegenüber dem anderen ansteigt, können die Reagenzienkosten und/oder das nicht spezifische Priming ein begrenzender Faktor werden. In jedem Fall wird der Primer, nach Hybridisierung eines Primers an eine Zielsequenz, verlängert, um ein Komplement der Sequenz zu erzeugen, an welche der Primer hybridisiert wird.
Primer-Sequenzen können aus natürlichen oder synthetischen Quellen sein und sie können routinemäßig synthetisiert werden unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die derzeit erhältlich sind. Zum Beispiel können Primer syntetisiert werden unter Verwendung von konventioneller Nukleotidphosphoramiditchemie und Instrumenten, die erhältlich sind von Perkin Elmer/Applied Biosystems, Div., (Foster City, CA) oder Perceptive Biosystems, Inc., (Framingham, MA). Wenn gewünscht, kann ein Primer markiert werden unter Verwendung von Methodiken, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben in U.S. Patent Anmeldungen mit den Nummern 5,464,746; 5,424,414 und 4,948,882.
Nachdem die Amplifikationsmischung gebildet wurde, wird die Zielnukleinsäure amplifiziert, indem die Reaktionsmischung "Amplifikationsbedingungen" unterworfen wird, welches Bedingungen sind, die die Amplifikation der Zielsequenz fördern. Amplifikationsbedingungen sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt und umfassen im allgemeinen Bedingungen, die die Dissoziation einer doppelsträngigen Zielsequenz, das Annealing der Primersequenzen an die einzelnen Stränge der Zielsequenz, und die Verlängerung der Primersequenzen fördern, um dadurch Kopien der Zielsequenzen zu bilden. Die Kopien der Zielsequenz werden dann aus dem Ziel herausgetrennt (dissoziiert) und zusätzliche Primersequenzen werden sowohl an die ursprüngliche Zielsequenz als auch an Kopien der Zielsequenz angeschmolzen, um dabei eine neue Runde der Amplifikation der Zielsequenz zu starten. Solche Amplifikationsbedingungen sind wohl bekannt und wurden beschrieben in U.S. Patenten 4,683,202 und 4,683,195 .
Thermische Kreislaufführung (Zyklisierung) ist ein bevorzugtes und wohl bekanntes Verfahren zur Erzeugung von Amplifikationsbedingungen. Die Zahl der Male, welche eine Amplifikationsmischung zyklisiert wird, ist eine Sache der Auswahl für jemanden, der im Fachgebiet bewandert ist, und typischerweise wird eine Reaktionsmischung zwischen 2 und 200 mal, und typischer zwischen 20 und 40 mal zyklisiert.
Nach der Zyklisierung (Kreislaufführung), können vielfache Kopien der Zielsequenz vorhanden sein. Die erzeugte(n) Sequenz (en) durch den ersten Primer ist die Sequenz, welche detektiert wird, um das Vorhandensein der Zielsequenz in der Testprobe anzuzeigen, und diese durch den ersten Primer synthetisierte Sequenz wird hierin verschiedenartig als die "primäre Sequenz" bezeichnet. Jedes Verfahren zur Detektion eines einzelnen Stranges eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können Sequenzierung, Gelelekrophorese, Gelshiftassays, Lösungshybridisierungsassays, "TagMan^TM", ähnliche Assays, und ähnliche Formate verwendet werden, um die primäre Sequenz zu detektieren.
Gemäß einer bevorzugten Detektionsausführungsform wird eine Hybridisierungssonde verwendet, um die primäre Sequenz zu detektieren, besonders wenn die Sonde in relativ geringen Konzentrationen vorliegt. Sondensequenzen hybridisieren an die primäre Sequenz, um einen Hybridkomplex zu bilden. Vorzugsweise hybridisieren Sonden an die primäre Sequenz in einer Region, die innerhalb in Bezug auf den Primer liegt. Die Bildung eines Hybridkomplexes zwischen der primären Sequenz und der Sonde kann erreicht werden indem jegliche doppelsträngige Zielsequenzen unter Dissoziationsbedingungen gesetzt werden, gefolgt von dem Aussetzen von jeglichen resultierenden einzelsträngigen Sequenzen gegenüber Hybridisationsbedingungen in der Anwesenheit einer Sonde. Der Ausdruck "Dissoziationsbedingungen" ist allgemein definiert als Bedingungen, welche die Dissoziation von doppelsträngiger Nukleinsäure zu der einzelsträngigen Form fördern. Diese Bedingungen können hohe Temperatur und/oder niedrige Innenstärke einschließen. Der Ausdruck "Hybridisationsbedingungen" ist allgemein definiert als Bedingungen, welche die Kernbildung und das Annealing (Anschmelzen) von komplementären Nukleinsäuresequenzen fördern. Es ist im Fachgebiet wohl bekannt, daß ein solches Annealing und eine solche Hybridisierung in einer eher vorhersagbaren Art und Weise abhängig ist von verschiedenen Parametern, einschließlich der Temperatur, der Innenstärke, der Sequenzlänge und dem G:C Gehalt der Sequenzen. Für jeden gegebenen Satz an Sequenzen kann die Schmelztemperatur, oder Tm, geschätzt werden durch irgendeines von verschiedenen bekannten Verfahren. Typische Hybridisierungsbedingungen schließen Temperaturen ein, welche leicht unterhalb der Schmelztemperatur eines gegebenen Satzes von Nukleinsäuresequenzen liegen. Die Innenstärke oder "Salz"-Konzentration beeinflußt auch die Schmelztemperatur, da kleine Kationen dazu tendieren, die Bildung von Doppelsträngen zu stabilisieren, indem die negative Ladung auf dem Phosphodiestergerüst abgeschirmt wird. Typische Salzkonzentrationen hängen ab von der Natur und der Valenz des Kations, aber sie werden von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, leicht verstanden. In ähnlicher Weise sind der hohe G:C Gehalt und die erhöhten Sequenzlängen auch dafür bekannt, die Doppelstrangbildung zu stabilisieren, weil G:C Paarungen 3 Wasserstoffbindungen einschließen, wohingegen A:T Paare nur zwei haben, und weil längere Sequenzen mehr Wasserstoffbindungen haben, die die Stränge zusammenhalten. Somit beeinflussen ein hoher G:C Gehalt und eine längere Sequenzlänge das, was "Hybridisierungsbedingungen" einschließen wird. Basierend auf dem vorhergehenden liegt die Bestimmung der geeigneten "Hybridisierungsbedingungen" für einen speziellen Satz an Nukleinsäuresequenzen wohl innerhalb des gewöhnlichen Könnens im Fachgebiet. U.S. Patent Anmeldung mit der Seriennummer 08/514704, eingereicht am 14. August 1995, beschreibt beispielhaft ein Verfahren zur Detektion von amplifizierten Zielsequenzen mit einer Sonde.
Sonden sind auch Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäureanalogsequenzen, wie zum Beispiel DNA, RNA, Peptidnukleinsäuren, Morpholinonukleinsäuren, die synthetisiert und markiert werden können in derselben Art und Weise, in welcher Primer-Sequenzen synthetisiert und markiert werden, wie oben angegeben. Die Auswahl der verwendeten Marker auf einem markierten Primer oder einer Sonde ist eine Sache der Wahl für diejenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, und der Ausdruck "Marker", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül oder eine Einheit, die eine Eigenschaft oder Charakteristik hat, welche in der Lage ist detektiert zu werden. Ein Marker kann direkt detektierbar sein, wie zum Beispiel mit Radioisotopen, Fluorophoren, Chemiluminophoren, Enzymen, kolloidalen Partikeln, fluoreszierenden Mikropartikeln, FREI Paaren und dergleichen. Alternativ kann ein Marker indirekt detektierbar sein, wie zum Beispiel mit spezischen Bindungsgliedern. Es wird verstanden werden, daß direkt detektierbare Marker zusätzliche Komponenten erfordern können, wie zum Beispiel Substrate, Triggerreagenzien, Licht und dergleichen, um eine Detektion des Markers zu ermöglichen. Wenn indirekte Marker für die Detektion verwendet werden, werden sie typischerweise in Kombination mit einem Konjugat verwendet, wie unten weiter besprochen werden wird.
Sonden können in einer Vielzahl von Arten verwendet werden, die im Fachgebiet bekannt sind, um die primäre Sequenz zu detektieren. Zum Beispiel können die Sonde, der Primer oder die Sonde und der Primer markiert werden und/oder auf festen Trägermaterialien immobilisiert werden, um die Anwesenheit der primären Sequenz zu detektieren. Einfangreagenzien können auch verwendet werden, um bei der Detektion einer primären Sequenz zu helfen. Ein "Einfangreagenz", wie hierin verwendet, bedeutet ein spezifisches Bindungsglied, das an ein festes Trägermaterial angeheftet ist. "Spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bedeutet ein Glied eines spezifischen Bindungspaars, d. h. zwei unterschiedliche Moleküle, wo eines der Moleküle durch beispielsweise chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das andere Molekül bindet. Zusätzlich zu Antigen und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren schließen andere spezifische Bindungspaare ein, sollen aber nicht beschränkt sein auf Avidin und Biotin; komplementäre Nukleotidsequenzen; Haptene und Antikörper spezifisch für Haptene, wie zum Beispiel Carbazol und Adamantan, beschrieben in U.S. Patent Nrn. 5,424,414 bzw. U.S. Patent Nr. 5,464,746 ; und dergleichen.
Ein "festes Trägermaterial" bezieht sich auf irgendein Material, das unlöslich ist, oder das unlöslich gemacht werden kann durch eine nachfolgende Reaktion. Feste Trägermaterialien können somit Latex, Plastik, derivatisiertes Plastik, magnetisches oder nicht magnetisches Metall, Glas, Silikon oder dergleichen sein. Eine große Anordnung von festen Trägermaterialkonfigurationen sind ebenfalls wohl bekannt und schließen ein, sollen aber nicht beschränkt sein auf Oberflächen von Teströhrchen, Mikrotiterauskerbungen, Blätter, Kügelchen, Mikropartikel, Chips und andere Konfigurationen, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt sind.
Gemäß einer Ausführungsform zur Detektion einer primären Sequenz unter Verwendung einer Sonde, kann die Sonde auf ein festes Trägermaterial immobilisiert werden, um ein Einfangreagenz zu bilden. Die primäre Sequenz kann mit dem so gebildeten Einfangreagenz unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden, um einen Hybridkomplex zu bilden und dabei die primäre Sequenz einzufangen, und wenn gewünscht, sie von anderen Amplifikationsreaktanden und Produkten abzutrennen. Ein Signal von einem Marker, angeheftet an die primäre Sequenz, kann dann detektiert werden als ein Anzeichen für das Vorhandensein der primären Sequenz auf dem Einfangreagenz und deshalb in der Testprobe.
Als eine weitere Alternative können der erste Primer und die Sonde markiert werden und die primäre Sequenz kann abgetrennt und detektiert werden unter Verwendung solcher Marker. Zum Beispiel können beide Marker einer solchen Konfiguration spezifische Bindungsglieder sein. Daher wird, nach Bildung eines Hybridkomplexes, der Komplex zweifach markiert sein. Ein Marker kann an ein spezifisches Bindungsglied auf einem Einfangreagenz binden, welches die Trennung des Hybridkomplexes erlaubt, und der andere Marker kann verwendet werden, um ein Konjugat zu binden, welches verwendet werden kann, um das Vorhandensein des Hybridkomplexes auf dem Einfangreagenz zu detektieren. Der Ausdruck "Konjugat", wie hierin verwendet, bedeutet ein spezifisches Bindungsglied, das an einen direkt detektierbaren Marker angeheftet oder gekoppelt wurde. Kopplungs-Chemien für die Synthetisierung eines Konjugats sind im Fachgebiet wohl bekannt und können zum Beispiel jedes chemische Mittel und/oder physikalische Mittel einschließen, welches die spezifische Bindungseigenschaft des spezifischen Bindungsglieds oder die detektierbare Eigenschaft des Markers nicht zerstört.
Beispiele
Die folgenden Beispiele demonstrieren die Detektion von HIV Nukleinsäure unter Verwendung der DNA Oligomerprimer und Sonden, die hierin bereitgestellt werden. Diese DNA Primer und Sonden sind identifiziert als Sequenzidentifikationsnr. 2, Sequenzidentifikationsnr. 3 und Sequenzidentifikationsnr. 4, und sie sind spezifisch für eine Region in dem Pol-Gen von HIV. Ein Abschnitt einer repräsentativen Polsequenz von HIV-1 (Subtyp B, Strang MN) wird hierin bezeichnet als Sequenzidentifikationsnr. 1. Diese Primer und Sonden sind Konsensussequenzen, abgeleitet aus der Analyse der Polregion von 31 HIV-1 Isolaten, welche Subtypen A bis F und O von HIV-1 darstellen.
In den folgenden Beispielen werden Sequenzidentifikationsnr. 2 und Sequenzidentifikationsnr. 3 als Konsensusamplifikationsprimer spezifisch für die Polregion von HIV-1 verwendet. Sequenzidentifikationsnr. 4 wird als eine Konsensus interne Hybridisierungssonde für das HIV-1 Polamplifikationsprodukt verwendet.
Beispiel 1
Herstellung von HIV Primern und Sonden

A. HIV Primer Konsensusprimer wurden entwickelt, um die HIV Polzielsequenz von allen bekannten HIV-1 Subtypen durch Oligonukleotidhybridisierungs PCR zu detektieren. Diese Primer waren Sequenzidentifikationsnr. 2 und Sequenzidentifikationsnr. 3. Primersequenzen wurden synthetisiert unter Verwendung von Standardoligonukleotidsynthesemethodik, und Sequenzidentifikationsnr. 3 wurde haptenisiert mit Carbazol an dem 5' Ende unter Verwendung von Standardcyanoethylphosphoramiditkopplungschemie wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,424,414 .
B. HIV Sonden Die Konsensussonde, bezeichnet als Sequenzidentifikationsnr. 4, wurde entwickelt, um mit der amplifizierten HIV Polzielsequenz durch Oligonukleotidhybridisierung zu hybridisieren. Die Sondensequenz wurde synthetisiert unter Verwendung von Standardoligonukleotidsynthesemethodik und haptenisiert mit 2 Adamantanen an dem 5' Ende unter Verwendung von Standardcyanoethylphosphoramiditkopplungschemie, wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,464,746 , und mit Phosphat an dem 3' Ende blockiert.

Beispiel 2
Detektion von HIV durch Variieren der unmarkierten Primerkonzentration
HIV RNA wurde von einer bekannten Anzahl von Virionen isoliert (Advanced Biothechnologies In., Columbia, MD) unter Verwendung von RNAzol B RNA Isolierungslösungsmittel (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX), extrahiert mit Chloroform/Isopropanol und mit Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in RNase-freiem Wasser resuspendiert (5' - 3', Boulder CO). Zehnfache Verdünnungen dieser HIV RNA wurden dann hergestellt bei Konzentrationen von 10⁶ bis 10¹ RNA Molekülen/25 μl unter Verwendung eines Verdünnungsmittels, das 2 ng/μl von ribosomaler RNA enthielt (rRNA; Boehringer-Mannheim, Indianapolis IN).
Verdünnungen der HIV RNA (ausgenommen 10⁴) wurden revers transkribiert, PCR amplifiziert und detektiert unter Verwendung von Sequenzidentifikationsnrn. 2 und 3 als Primer mit Sequenzidentifikationsnr. 4 als die HIV Sonde. RT-PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 1X EZ Puffer, 2,5 mM Manganchlorid, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP und dCTP), anwesend bei einer Endkonzentration von 0,15 mM jeweils, und rekombinante Thermus thermophilus Polymerase bei einer Konzentration von 5 Einheiten/Reaktion. Der markierte Primer (Sequenzidentifikationsnr. 3) wurde verwendet bei einer Konzentration von 50 nM und die unmarkierte Primerkonzentration wurde in verschiedenen Reaktionen für jeden Satz an HIV RNA Verdünnungen variiert, unter Verwendung von Konzentrationen von 25, 37,5, 50 oder 62,5 nM. Die Sonde, welche wie oben angegeben markiert wurde, und die letztlich mit dem Produkt des markierten Primers hybridisiert vor der Detektion des resultierenden Hybridkomplexes, wurde verwendet bei einer Konzentration von 10 nM. Die zehnfachen Verdünnungen von HIV RNA in einem Probenvolumen von 25 μl wurden zu 175 μl, welche die obigen Mischungen enthielten, hinzugefügt, für ein Gesamtreaktionsvolumen von 0,2 ml. Die negative Kontrolle war zusammengesetzt aus 50 ng von rRNA/Reaktion. Alle Reaktionen wurden doppelt durchgeführt.
Die Reaktionsmischungen wurden revers transkribiert und amplifiziert in einem Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler. Die Reaktionsmischungen wurden zuerst bei 62°C für 30 Minuten inkubiert, um die RNA revers zu transkribieren, gefolgt von 2 Minuten bei 94°C. Die PCR Amplifikation wurde dann iniziiert durch ein Tochdown oder Step-down Protokoll, um bei der Strenge (Stringenz) der Reaktion in den frühen Stadien der Amplifikation zu helfen. Dies verwendete 8 Zyklen wie folgt: 1 Zyklus bei 94°C für 30 Sekunden, dann 70°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 69°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 68°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 67°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 66°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 65°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 64°C für 80 Sekunden, gefolgt von 1 Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, dann 63°C für 80 Sekunden. Eine weitere Amplifikation wurde dann erzielt mit 35 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, dann 62°C für 80 Sekunden. Nachdem die Reaktionsmischungen thermisch zyklisiert wurden, wurden alle Duplikate gepoolt und durch Pipettieren gemischt, um jegliche Variation aufgrund der Kreislaufführung (Zyklisierung) zu eliminieren. Die Mischungen wurden dann aufgetrennt und für 5 Minuten bei 97°C denaturiert. Danach wurde eine Sondenoligohybridisierung erzielt durch Absenken der Temperatur auf 15°C für 5 Minuten. Die Temperatur wurde dann auf 4°C erniedrigt und die Proben wurden bei 4°C gehalten bis zur Detektion der Reaktionsprodukte.
Die Reaktionsprodukte wurden detektiert auf dem Abbott LCx^® System (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Eine Suspension von anti-Carbazolantikörper beschichteten Mirkopartikeln bei 0,06% Feststoffen und einem anti-Adamantanantikörper/alkalische Phosphatasekonjugat) welche alle kommerziell erhältlich sind von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) wurde verwendet zusammen mit dem LCx^®, um das amplifizierte Produkt/Sondenhybrid einzufangen und zu detektieren. Das verwendete Enzymsubstrat war Methyl- Umbelliferylphosphat (MUP), wobei die Geschwindigkeit der Umwandlung von MUP zu MU als Zählungen/Sekunde/Sekunde (c/s/s) gemessen und aufgezeichnet wurde.

Die Daten aus diesem Experiment sind gezeigt in Tabelle 1 und sie zeigen, daß, wenn der unmarkierte Primer bei Konzentrationen unterhalb der des markierten Primers vorhanden ist, höhere Signale bei höheren Zielkonzentrationen erreicht werden, und daß die Plateaubildung des Signals vermieden wird. Umgekehrt wird, wenn die Konzentration des unmarkierten Primers höher als, oder gleich der Konzentration des markierten Primers ist, ein "Hak-Effekt" beobachtet, worin eine höhere Zielkonzentration beginnt ein niedrigeres Signal zu ergeben. TABELLE 1

	LCx^® Geschwindigkeit (c/s/s)
	Unmarkierte Primerkonzentration
HIV RNA (Moleküle)	25 nM	37,5 nM	50 nM	62,5 nM
0	28,2	26,7	26,5	24,1
10¹	30,8	29,0	76,3	107,1
10²	39,2	78,6	190,5	299,7
10³	156,6	389,9	477,7	485,1
10⁵	1017,1	898,8	591,2	334,5
10⁶	1156,3	942,2	575,5	298,3

(Markierter Primer wurde bei einer Konzentration von 50 nM verwendet)

Dieses Experiment wurde auch durchgeführt unter Verwendung einer Denaturierungszeit von 15 Minuten anstatt von 5 Minuten, mit äquivalenten Ergebnissen.
Beispiel 3
Detektion von HIV durch Variieren der markierten Primerkonzentration

Dieselben HIV RNA Probenverdünnungen, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden revers transkribiert, PCR amplifiziert und detektiert, wie in Beispiel 2, außer daß zwei separate Zubereitungen (G und A) von unmarkiertem Primer (Sequenzidentifikationsnr. 2), beide bei 50 nM, verwendet wurden und die Konzentration des markierten Primers (Sequenzidentifikationsnr. 3) in separaten Reaktionen für jeden HIV RNA Verdünnungssatz variiert wurde, unter Verwendung von 25, 50 und 75 nM markiertem Primer. Alle Reaktionen wurden doppelt durchgeführt, mit doppelten Sätzen, die nach der Amplifikation und Sondenhybridisierung gepoolt wurden, um jegliche Variation aufgrund von Kreislaufführung zu eliminieren. Die Detektion der Reaktionsprodukte verwendete anti-Carbazolantikörper beschichtete Mirkopartikel bei 0,12% und 0,18% Feststoffen, zusätzlich zu den 0,06% Feststoffen, die in Beispiel 2 verwendet wurde. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2

	LCx^® Geschwindigkeit (c/s/s) bei 0,06% Feststoffen
	Unmarkierter Primer G			Unmarkierter Primer A
	Markierte Primerkonzentration			Markierte Primerkonzentration
HIV RNA (Molekül e)	25 nM	50 nM	75 nM	25 nM	50 nM	75 nM
0	27,9	25,8	27,0	26,1	28,3	26,7
10¹	78,5	77,4	40,2	70,6	59,2	90,6
10²	340,4	321,2	173,0	319,1	414,1	401,3
10³	391,0	553,1	574,0	179,1	561,1	750,1
10⁵	108,9	860,3	1035,5	34,1	442,7	1130,5
10⁶	47,4	903,8	1068,6	34,0	383,3	1139,8
LCx^® Geschwindigkeit (c/s/s) bei 0,12% Feststoffen
0	57,7	53,6	52,0	56,8	56,5	53,6
10¹	133,6	146,1	78,7	125,0	118,1	185,0
10²	465,0	498,9	312,5	461,1	613,0	615,0
10³	530,6	803,7	859,1	272,6	773,0	1008,3
10⁵	188,5	999,4	1272,7	69,9	581,4	1307,9
10⁶	90,3	1053,4	1289,2	67,0	512,9	1322,8
LCx^® Geschwindigkeit (c/s/s) bei 0,18% Feststoffen
0	80,9	76,0	77,4	82,5	78,5	77,1
10¹	156,9	176,9	101,4	147,3	139,6	226,0
10²	505,2	538,1	374,2	502,9	663,5	678,3
10³	568,5	830,6	911,7	326,9	830,5	1097,4
10⁵	237,2	1036,1	1296,5	98,9	617,2	1317,7
10⁶	117,9	1019,3	1321,6	93,4	544,4	1347,6

(Unmarkierte Primer G und A wurden bei einer Konzentration von 50 nM verwendet)

Die zwei unmarkierten Primerzubereitungen (G und A) führten zu leicht unterschiedlichen Werten, aber sie zeigten dieselben Gesamttrends. In allen Fällen wurde, wenn die Konzentration des unmarkierten Primers höher als oder gleich der Konzentration des markierten Primers war, ein "Hak-Effekt" wiederum gesehen, wie in Beispiel 2, worin eine hohe Zielkonzentration ein niedriges Signal ergab. Nur wenn der unmarkierte Primer bei Konzentrationen geringer als der markierte Primer vorhanden war, wurde ein lineareres Signal erzeugt, das mit der Zielkonzentration korrelierte. Unter diesen Bedingungen wurden, wie in Beispiel 2, wiederum höhere Signale bei höheren Zielkonzentrationen erreicht, und die Plateaubildung des Signals wurde vermieden.
Die Verwendung von Mirkopartikelkonzentrationen von 0,12% und 0,18% Feststoffen ergab äquivalente Ergebnisse, wobei beides zu leicht höheren Signalen führte als wenn 0,06% Feststoffe verwendet wurden. Jedoch beeinflußte die Änderung der Mirkopartikelkonzentration nicht die Gesamttrends, die gesehen wurden aufgrund des Verhältnisses von unmarkiertem zu markiertem Primer.
Beispiel 4
Detektion von HIV bei verschiedenen Primer- und Sondenkonzentrationen

Dieselben HIV RNA Probenverdünnungen, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurden revers transkribiert, PCR amplifiziert und detektiert, wie in Beispiel 3, außer daß die Konzentrationen von sowohl den Primern als auch der Sonde variiert wurden. Der unmarkierte Primer (Sequenzidentifikationsnr. 2) wurde bei Konzentrationen zwischen 100 und 250 nM, variierend in 50 nM Inkrementen, verwendet. Der markierte Primer (Sequenzidentifikationsnr. 3) wurde bei Konzentrationen zwischen 50 und 500 nM, variierend in 50 bis 100 nM Inkrementen, verwendet. Die Sonde wurde bei Konzentrationen von 10, 25 und 40 nM verwendet, mit den verschiedenen Primerkonzentrationen wie in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3

	LCx^® Geschwindigkeit (c/s/s) bei 0,12% Feststoffen
	Unmarkierter Primer (nM)/markierter Primer (nM)/Sonde (nM)
HIV RNA (Mol)	100/50/10	100/100/10	100/150/10	100/200/10	100/100/10	100/150/10	100/200/10	100/300/10
0	48,2	50,3	46,1	44,0	48,2	44,8	46,1	45,0
10¹	195,7	168,3	140,5	138,7	276,8	263,3	216,8	295,5
10²	551,8	599,3	606,5	578,3	594,6	611,1	795,0	569,1
10³	314,6	830,1	1074,2	988,0	828,8	881,9	900,7	865,8
10⁵	67,7	970,9	1200,7	1187,9	188,0	1061,0	1190,0	1020,2
10⁶	53,8	945,8	1214,1	1128,2	85,9	1021,8	1173,1	982,7
	200/150/10	200/200/10	200/250/10	200/400/10	200/200/10	200/250/10	200/300/10	200/500/10
0	42,2	44,8	43,6	40,9	45,2	44,9	48,1	39,3
10¹	377,1	192,4	136,0	163,1	111,7	262,3	149,6	181,4
10²	569,3	710,7	620,1	486,1	655,2	558,8	558,8	600,5
10³	593,7	850,2	848,7	779,7	797,7	808,3	844,9	820,4
10⁵	302,1	958,0	1080,3	888,8	734,0	963,9	1072,8	930,0
10⁶	198,6	1050,5	1161,3	913,8	463,8	1018,2	1174,2	944,9
	100/150/25	100/200/25	150/200/25	150/300/25	200/250/25	200/400/25	250/300/25	250/500/25
0	47,6	47,8	47,9	46,3	44,7	45,7	44,8	46,0
10¹	211,1	239,0	244,3	209,9	184,4	204,2	189,4	92,2
10²	929,0	618,5	484,3	638,0	713,5	643,2	1020,1	608,3
10³	1175,3	1206,0	1049,0	1167,7	977,8	1045,3	992,4	1015,4
10⁵	1619, 4	1575,2	1507, 0	1392,9	1320,6	1162,9	1204,6	1106, 8
10⁶	1620,8	1610,2	1551,3	1328,6	1412,3	1194,0	1362, 4	1152,4
	100/150/40	100/200/40	150/200/40	150/300/40	200/250/40	200/400/40	250/300/40	250/500/40
0	53,9	51,9	52,5	49,3	101,1	51,0	46,3	46,1
10¹	544,6	162,8	229,1	273,1	261,7	466,1	167,9	615,0
10²	659,5	759,0	776,8	649,8	689,9	565,1	720,9	584,1
10³	1270,0	1210,2	1189,5	1121,8	978,4	1046,9	1061,4	1057,1
10⁵	1824,8	1783,8	1666,5	1612,0	1486,8	1402,6	1311,3	1368,1
10⁶	1821,9	1751,6	1742,1	1544,9	1589,3	1397,1	1477,3	1419,6

Alle 3 Mikropartikelkonzentrationen wurden getestet, aber nur die Daten, die 0,12% Feststoffe verwendeten, sind in Tabelle 3 oben gezeigt, da diese Daten repräsentativ waren (wie in Beispiel 3) für diejenigen, die mit allen 3 Mikropartikelkonzentrationen erhalten wurden.
Wie durch dieses Beispiel gezeigt, wurde, wenn die Konzentration des unmarkierten Primers höher als, oder gleich der Konzentration des markierten Primers war, ein "Hak-Effekt" beobachtet. Wenn der markierte Primer bei höheren Konzentrationen als der unmarkierte Primer vorhanden war, zerstreute sich der Hak-Effekt. SEQUENZLISTE

Claims

Ein Verfahren zum Amplifizieren und Detektieren einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Testprobe, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bilden einer Amplifikationsmischung, die eine Testprobe, eine erste und eine zweite Primer-Sequenz, und Amplifikationsreagenzien umfasst; (b) Amplifizieren der Zielsequenz, um Kopien der Zielsequenz zu erzeugen, welche ein Amplifikationsprodukt aus dem ersten und zweiten Primer umfasst; (c) Denaturieren der Amplifikationsprodukte; und (d) Detektieren der Kopien der Zielsequenz als ein Anzeichen für die Anwesenheit der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe; worin die erste Primer-Sequenz in 15% bis 250%igem molarem Überschuss über den zweiten Primer bereitgestellt wird, eine Sonde an das denaturierte Amplifikationsprodukt von dem ersten Primer hybridisiert wird, um einen Hybridkomplex zu bilden, und der Hybridkomplex als ein Anzeichen für die Anwesenheit der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe detektiert wird.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin der erste Primer markiert ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Sonde markiert ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin der erste Primer in 20% bis 150%igem molaren Überschuß über den zweiten Primer vorliegt.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Sonde mit einem spezifischen Bindungsglied markiert ist, und der erste Primer mit einem spezifischen Bindungsglied markiert ist und der Hybridkomplex mit einem Einfangreagenz und einem Konjugat detektiert wird.
Verwendung eines Kits, das einen ersten und einen zweiten Primer umfasst, worin die erste Primerkonzentration 15% bis 250% Molprozent größer als der zweite Primer ist zur Durchführung der Verfahren von Ansprüchen 1-5.