DE60029961T2

DE60029961T2 - Verankerte strangverdrängungs-amplifizierung auf einem elektronisch adressierbaren mikrochip

Info

Publication number: DE60029961T2
Application number: DE60029961T
Authority: DE
Inventors: I. Michael LaJolla NERENBERG; F. Carl San Diego EDMAN; P. Lorelei LaMesa WESTIN; L. Lana Del Mar FENG; C. Geoffrey Carlsbad LANDIS; G. Ronald Coronado SOSNOWSKI; J. John San Diego CARRINO; Terrance George Chapel Hill WALKER; Catherine A. Apex SPARGO
Original assignee: NANOGEN BECTON DICKINSON PARTN; Nanogen Becton Dickinson Partnership
Current assignee: NANOGEN BECTON DICKINSON PARTN; Nanogen Becton Dickinson Partnership
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: WO2000060919A3; JP2003510012A; EP1192720A4; WO2000060919A2; EP1192720A2; ATE335848T1; WO2000060919B1; DE60029961D1; US20030219804A1; US6531302B1; EP1192720B1; CA2369148A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen, Verfahren und Substanzzusammensetzungen zum Durchführen aktiver Multi-Step- und Mehrfach-Sequenzseparierung/-aufspaltung, Amplifizierung und diagnostischer Analyse von Nukleinsäuren. Im Allgemeinen betrifft sie Vorrichtungen, Verfahren und Substanzzusammensetzungen zur Amplifizierung und Analyse von Nukleinsäuresequenzen in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren, Vorrichtungen und Substanzzusammensetzungen zum Amplifizieren und Analysieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von neuartiger verankerter Strangverdrängungsamplifizierung in Kombination mit bioelektronischer Mikrochip-Technologie. Die Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung sind für eine Reihe von Anwendungen nützlich, einschließlich z.B. Krankheitsdiagnostik (infektiöse und andere), genetische Analyse, landwirtschaftliche Anwendungen und Umweltanwendungen, Drogennachweis, Genom-verändernde Pharmazeutika und Überwachung und Analyse von Lebensmitteln und/oder Wasser.
Hintergrund der Erfindung
Die folgende Beschreibung stellt eine Zusammenfassung von Informationen bereit, die für die vorliegende Erfindung relevant sind. Dies bedeutet weder, dass irgendeine darin gegebene Information dem Stand der Technik der hiermit beanspruchten Erfindung zuzurechnen ist, noch dass irgendeine der Veröffentlichungen, auf die spezifisch oder implizit Bezug genommen wird, dem Stand der Technik dieser Erfindung zuzurechnen ist.
Definitionen
Die folgenden Beschreibungen der hierin enthaltenen Erfindungen nutzen eine Vielzahl an technischen Begriffen, die spezifisch für das Gebiet der Erfindung sind. Im Allgemeinen sind diese Begriffe dem Fachmann bekannt und werden ferner wie folgt beschrieben:
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Probe" auf eine Substanz, die auf die Anwesenheit einer interessierenden Nukleinsäure oder mehrerer interessierender Nukleinsäuren getestet wird. Die interessierende Nukleinsäure oder die interessierenden Nukleinsäuren können in einer Mischung anderer Nukleinsäuren vorliegen. Eine Probe, die die interessierenden Nukleinsäuren enthält, kann auf verschiedene Weisen gewonnen werden. Es ist vorstellbar, dass die folgenden Proben darstellen können: Zelllysate, gereinigte genomische DNA, Körperflüssigkeiten von einem Menschen oder einem Tier, klinische Proben, Lebensmittelproben etc.
Wie hierin verwendet, werden „Zielnukleinsäure" und „Zielsequenz" austauschbar verwendet. Beide Begriffe beziehen sich auf eine Nukleinsäuresequenz, deren Anwesenheit oder Abwesenheit detektiert werden soll. Zielnukleinsäure kann als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen und, wenn sie als Doppelstrang vorliegt, kann sie vor ihrem Nachweis zur Einzelstrangform denaturiert werden unter Verwendung von Verfahren, wie sie hierin beschrieben werden, oder mittels anderer bekannter Verfahren. Zusätzlich kann die Zielnukleinsäure als Nukleinsäure beliebiger Form vorliegen, besonders als DNA oder RNA.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Amplifizierung" auf die Zunahme der Anzahl an Kopien einer bestimmten interessierenden Zielnukleinsäure, wobei genannte Kopien ebenso als „Amplicons" oder „Amplifizierungsprodukte" bezeichnet werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Amplifizierungsbestandteile" auf die Reaktionsmaterialen wie Enzyme, Puffer und Nukleinsäuren, die zur Durchführung einer Amplifizierungsreaktion zum Bilden von Amplicons oder Amplifizierungsprodukten einer interessierenden Zielnukleinsäure notwendig sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Mehrfach-Amplifizierung" auf die Amplifizierung von mehr als einer interessierenden Nukleinsäure. Zum Beispiel kann er sich auf die Amplifizierung von multiplen Sequenzen der gleichen Probe beziehen oder auf die Amplifizierung von einer von mehreren Sequenzen einer Probe, wie in U.S. Patent Nr. 5,422,252 und U.S. Patent Nr. 5,470,723 beschrieben. Der Begriff bezieht sich ebenfalls auf die Amplifizierung von einer Sequenz oder mehr Sequenzen in multiplen Proben, die entweder gleichzeitig oder schrittweise durchgeführt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Oligonukleotid" auf ein Molekül, das zwei Desoxyribonukleotide oder zwei Ribonukleotide oder mehr Desoxyribonukleotide oder mehr Ribonukleotide aufweist, vorzugsweise mehr als drei. Die Länge eines Oligonukleotids hängt davon ab, wie es verwendet werden soll. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder durch Klonen gewonnen werden. Oligonukleotide können ferner Protein-Nukleinsäuren (PNAs) umfassen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Sonde" auf eine bekannte Sequenz einer Nukleinsäure, die selektiv an eine Zielnukleinsäure binden kann. Insbesondere bezieht sich „Sonde" auf ein Oligonukleotid, das so gestaltet ist, dass es in ausreichendem Maße zu einer Sequenz eines Stranges einer Nukleinsäure, die nachgewiesen werden soll, komplementär ist, so dass die Sonde und der Nukleinsäurestrang unter ausgesuchten stringenten Bedingungen hybridisieren. Spezifische Typen von Oligonukleotid-Sonden werden in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung verwendet. Zum Beispiel beschreibt eine „Ligationssonde" einen Sondentyp, der so gestaltet ist, dass er sowohl an eine interessierende Zielnukleinsäure als auch an eine Amplifizierungssonde bindet. Zusätzlich bezieht sich eine „ligierte Sonde" oder ein „ligiertes Sondentemplate" auf das Endprodukt einer Ligationsreaktion zwischen einem Paar an Ligationssonden.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Primermolekül" und „Primer" gleichwertig verwendet. Ein Primer ist ein Nukleinsäuremolekül mit einem 3'-Ende, das entweder „blockiert" ist und nicht kovalent an zusätzliche Nukleinsäuren gebunden werden kann oder dass nicht blockiert ist und eine chemische Gruppe an seinem 3'-Ende besitzt, die Verlängerung der Nukleinsäurekette zulässt, wie sie durch DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase katalysiert wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Amplifizierungsprimer" auf einen Oligonukleotidprimer, der zur Amplifizierung einer Ziel-Nukleinsäuresequenz verwendet wird.
Der Begriff „Primerverlängerung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die mittels DNA-Polymerase induzierte Verlängerung einer Nukleinsäurekette, die von einer freien Drei-Strich-(3'-)Hydroxylgruppe ausgeht, wobei ein Strang an Nukleinsäure gebildet wird, der komplementär zu einem gegenüberliegenden Strang ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Amplicon" auf das Produkt einer Amplifizierungsreaktion. Ein Amplicon kann amplifizierte Nukleinsäuren enthalten, wenn beide verwendeten Primer an eine Zielsequenz hybridisieren. Ein Amplicon darf keine amplifizierte(n) Nukleinsäuren enthalten, wenn einer der verwendeten Primer nicht an eine Zielsequenz hybridisiert. Folglich wird hierin der Begriff allgemein verwendet und impliziert nicht das Vorhandensein amplifizierter Nukleinsäuren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „elektronisch adressierbar" auf eine Fähigkeit eines Mikrochips, Materialien wie Nukleinsäuren und Enzyme und andere Amplifizierungsbestandteile mittels elektronischen Beeinflussens der Bindungsstellen des Chips von einer Position zu einer anderen Position auf dem Mikrochip zu dirigieren. „Elektronisches Beeinflussen" soll bedeuten, dass die elektrische Ladung an einer Bindungsstelle oder einer anderen Position auf dem Mikrochip zwischen einer positiven Nettoladung und einer negativen Nettoladung verändert werden kann, so dass geladene Moleküle, die in Lösung vorliegen und im Kontakt zu dem Mikrochip stehen, an eine Position auf dem Mikrochip heran oder von ihr weg dirigiert werden können oder von einer Position zu einer anderen Position dirigiert werden können.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungsstelle" auf eine spezifische Position auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip, wobei elektronisches Beeinflussen initiiert wird und wobei Moleküle wie Nukleinsäuresonden und Zielmoleküle mittels solchen Beeinflussens angezogen oder adressiert werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „verankert" auf das Immobilisieren mittels Bindens eines Moleküls, wie einer Primernukleinsäure, die in einer SDA-Reaktion verwendet wird, oder einer Nukleinsäuresonde, die zum Binden einer Zielnukleinsäure verwendet wird, an eine bestimmte Position auf einem Mikrochip.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „verzweigtes Primerpaar" auf ein Paar von Oligonukleotiden, die als Primer in einer Amplifizierungsreaktion verwendet werden können und die miteinander durch eine chemische Einheit verbunden sind, so dass die Oligonukleotide für Hybridisierung zugänglich sind und als Amplifizierungsprimer verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Primer-Bindungssonde" auf Oligonukleotide, die verwendet werden, um an ausgewählte Zielnukleinsäuren zu hybridisieren, und die als Verankerungsplattform für derartige Nukleinsäuren an einer Bindungsstelle dienen. Des Weiteren können solche Oligonukleotide als Amplifizierungsprimer zur Amplifizierung genannter Zielnukleinsäuren dienen.
Wie hierin verwendet, werden „Hybridisierung" und „Bindung" gleichwertig verwendet und beziehen sich auf die nicht-kovalente Bindung oder die „Basenpaarung" komplementärer Nukleinsäuresequenzen aneinander. Ob eine bestimmte Sonde basengepaart mit einer Polynukleotidsequenz bleibt oder nicht, hängt von dem Grad der Komplementarität, der Länge der Sonde und der Stringenz der Bindungsbedingungen ab. Je höher die Stringenz, desto höher muss der Grad der Komplementarität sein und/oder desto länger muss die Sonde sein, so dass die Bindung oder die Basenpaarung stabil bleiben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Stringenz" auf eine Kombination von Bedingungen, denen Nukleinsäuren unterworfen sind, die doppelstrangige Nukleinsäure in ihre Einzelstrang-Komponenten dissoziieren lassen, wie pH-Extrema, hohe Temperatur und hohe Salzkonzentration. Der Begriff „starke Stringenz" bezieht sich auf Hybridisierungsbedingungen, die ausreichend zwingend oder restriktiv sind, so dass nur spezifische Basenpaarung auftritt. Die Spezifität sollte ausreichen, dass einzigartige Sequenzen unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde oder nahe verwandter Sequenzen unter Standard-Southern-Hybridisierungsprotokollen (wie in J. Mol. Biol. 98: 503 (1975) beschrieben) nachgewiesen werden können.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Endonuklease" auf Enzyme (z.B. Restriktionsendonukleasen etc.), die DNA an Stellen innerhalb des DNA-Moleküls schneiden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease" auf eine spezifische Sequenz von Nukleotiden in einer doppelstrangigen DNA, die von einer DNA-Restriktionsendonuklease erkannt wird und an der diese enzymatisch wirkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Einschneiden" auf das Schneiden eines einzelnen Stranges einer doppelstrangigen Nukleinsäure, indem die Bindung zwischen zwei Nukleotiden aufgebrochen wird, so dass das 5'-Nukleotid eine freie 3'-Hydroxylgruppe aufweist und das 3'-Nukleotid eine 5'-Phosphatgruppe aufweist. Es ist bevorzugt, dass das Einschneiden mittels einer Restriktionsendonuklease vorgenommen wird und dass diese Restriktionsendonuklease das Einschneiden von doppelstrangiger Nukleinsäure an der richtigen Position innerhalb der Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease katalysiert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „modifiziertes Nukleotid" auf Nukleotide oder Nukleotid-Triphosphate, die in Zusammensetzung und/oder Struktur von natürlichem Nukleotid und natürlichen Nukleotid-Triphosphaten abweicht. Es ist bevorzugt, dass das hierin verwendete modifizierte Nukleotid oder die hierin verwendeten modifizierten Nukleotid-Triphosphate in einer Weise modifiziert sind, dass, wenn die Modifizierungen auf einem Strang einer doppelstrangigen Nukleinsäure vorhanden sind, wo eine Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease ist, das modifizierte Nukleotid oder die modifizierten Nukleotid-Triphosphate den modifizierten Strang gegen Spaltung durch Restriktionsenzyme schützen. Folglich bevorzugt das Vorhandensein von modifizierten Nukleotiden oder modifizierten Nukleotid-Triphosphaten das Einschneiden gegenüber der Spaltung der doppelstrangigen Nukleinsäure.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „DNA-Polymerase" auf Enzyme, die fähig sind, Nukleotide an das 3'-Hydroxylende einer Nukleinsäure in einer 5'→3'-Richtung anzuhängen, wobei eine Nukleinsäuresequenz synthetisiert wird. Beispiele für DNA-Polymerasen, die in Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, umfassen E. coli DNA-Polymerase I, das große proteolytische Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, allgemein bekannt als „Klenow"-Polymerase, „Taq"-Polymerase, T7-Polymerase, Bst-DNA-Polymerase, T4-Polymerase, T5-Polymerase, Reverse Transkriptase, exo-BCA-Polymerase etc.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „verdrängt" auf das Entfernen eines Moleküls aus der nächsten Nachbarschaft eines anderen Moleküls. In Verbindung mit doppelstrangigen Oligonukleotiden und/oder doppelstrangigen Nukleinsäuren, bezieht sich der Begriff auf das Umwandeln des doppelstrangigen Nukleinsäuremoleküls in Einzelstrang-Moleküle, i.e. ein Strang wird von dem anderen Strang verdrängt. Verdrängung eines Stranges einer doppelstrangigen Nukleinsäure kann auftreten, wenn eine Restriktionsendonuklease die doppelstrangige Nukleinsäure einschneidet, wobei eine freie 3'-Hydroxylgruppe entsteht, die von DNA-Polymerase verwendet wird, um die Synthese eines neuen Stranges von Nukleinsäure zu katalysieren. Alternativ dazu kann eine Nukleinsäure von einer anderen Nukleinsäure durch die Wirkung von elektronischer Beeinflussung eines elektrisch adressierbaren Mikrochips verdrängt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Ligase" auf ein Enzym, das die Fähigkeit aufweist, die 3'-Hydroxylgruppe eines Nukleotids an die 5'-Phosphatgruppe eines zweiten Nukleotids kovalent zu binden. Beispiele für Ligasen umfassen E. coli DNA-Ligase, T4 DNA-Ligase etc.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Ligieren" auf das kovalente Verbinden zweier Nukleinsäuremoleküle, so dass ein einzelnes Nukleinsäuremolekül gebildet wird. Dies wird typischerweise mittels Behandlung mit einer Ligase durchgeführt, die die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'-Ende einer Sequenz und dem 3'-Ende der anderen Sequenz katalysiert. Jedoch soll im Kontext der Erfindung der Begriff „Ligieren" ebenso andere Verfahren zur Verbindung solcher Sequenzen, z.B. mit chemischen Mitteln, einschließen.
Der Begriff „Anheften", wie hierin verwendet, bezieht sich im Allgemeinen auf das Verbinden einer Einheit mit einer anderen Einheit. Zum Beispiel können Oligomere und Primer an der Oberfläche einer Bindungsstelle angeheftet werden. In Bezug auf Mechanismen zum Anheften umfassen betrachtete Verfahren solche Mittel zum Anheften wie Ligieren, nicht-kovalente Bindung, Binden von Biotineinheiten wie biotinylierte Primer, biotinylierte Amplicons und biotinylierte Sonden an Streptavidin, etc.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „benachbart" in Bezug auf Nukleinsäuremoleküle verwendet, die in großer Nähe zueinander vorliegen. Der Begriff bezieht sich ebenso auf eine ausreichende Nähe zweier Nukleinsäuremoleküle, das 5'-Ende einer Nukleinsäure in direkte Nachbarschaft des 3'-Endes einer zweiten Nukleinsäure zu bringen, so dass beide mittels eines Ligaseenzyms ligiert werden können.
Der Begriff „allelspezifisch", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nachweis, Amplifizierung oder Oligonukleotid-Hybridisierung eines Allels eines Gens, ohne substanziellen Nachweis, Amplifizierung oder Oligonukleotid-Hybridisierung anderer Allele desselben Gens.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Drei-Strich" oder „3'" auf eine spezifische Orientierung bezüglich einer Nukleinsäure. Nukleinsäuren weisen eine bestimmte chemische Orientierung derart auf, dass ihre zwei Enden als entweder Fünf-Strich (5') oder als Drei-Strich (3') unterschieden werden. Das 3'-Ende einer Nukleinsäure weist eine freie Hydroxylgruppe auf, die mit dem 3'-Kohlenstoff des terminalen Pentosezuckers verbunden ist. Das 5'-Ende einer Nukleinsäure weist eine freie Hydroxylgruppe oder eine freie Phosphatgruppe auf, die mit dem 5'-Kohlenstoff des terminalen Pentosezuckers verbunden ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Term „freie Drei-Strich (3')-Hydroxylgruppe" auf die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe, die am 3'-Ende eines Strangs aus Nukleinsäure positioniert ist. Der Term bezieht sich ebenso auf den Fakt, dass die freie Hydroxylgruppe funktional derart gestaltet ist, dass sie fähig ist, Synthese neuer Nukleinsäure zu unterstützen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Term „Fünf-Strich-Überhang" auf ein doppelstrangiges Nukleinsäuremolekül, das keine stumpfen Enden aufweist, so dass die Enden der beiden Stränge in ihrer Länge nicht gleichmäßig ausgedehnt sind und so dass das 5'-Ende des einen Strangs länger ausgedehnt ist als das 3'-Ende des gegenüberliegenden komplementären Strangs. Es ist möglich, dass ein lineares Nukleinsäuremolekül keinen 5'-Überhang aufweist, einen 5'-Überhang oder zwei 5'-Überhänge. Die Bedeutung eines 5'-Überhangs ist die, dass er einen Bereich darstellt, in dem eine 3'-Hydroxylgruppe auf einem Strang vorhanden ist und in dem eine Sequenz einzelstrangiger Nukleinsäure auf dem gegenüberliegenden Strang vorhanden ist. Eine DNA-Polymerase kann einen Nukleinsäurestrang synthetisieren, der zu dem einzelstrangigen Bereich der Nukleinsäure komplementär ist, wobei sie bei der freien 3'-Hydroxylgruppe des unterbrochenen Strangs beginnt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Bumper Primer" auf einen Primer, der verwendet wird, so dass Produkte der Primerverlängerung in der SDA-Reaktion verdrängt werden. Der Bumper-Primer lagert sich an eine Zielsequenz aufwärts des Amplifikationsprimer an, so dass die Verlängerung des Bumper-Primer den abwärts gelegenen Amplifizierungsprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „nachgewiesen" und „Nachweis" austauschbar verwendet und beziehen sich auf das Erkennen von Anwesenheit oder Abwesenheit einer Zielnukleinsäure oder von amplifizierten Nukleinsäureprodukten davon.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Markierung" auf eine chemische Einheit, die die Fähigkeit aufweist, ein Amplifizierungsprodukt nachzuweisen. Zum Beispiel kann eine Markierung an einer Nukleinsäure ein radioaktives Isotop wie ³²P aufweisen oder ein nicht-radioaktives Molekül wie kovalent oder nicht-kovalent angeheftete Chromophore/Farbstoff, fluoreszierende Einheiten, Enzyme, Antigene, Gruppen mit spezifischer Reaktivität, chemilumineszente Einheiten und elektrochemisch nachweisbare Einheiten.
Die oben genannten Definitionen sollten nicht so verstanden werden, dass sie den Anwendungsbereich der Erfindung begrenzen. Vielmehr sollten sie verwendet werden, um die Sprache der Beschreibung und, wo angemessen, die Sprache der Ansprüche zu interpretieren. Diese Begriffe können auch im Kontext der Beschreibung der Erfindung vollständiger verstanden werden. Wenn ein Begriff in der Beschreibung oder den Ansprüchen enthalten ist, der nicht oben definiert ist, oder der nicht mit Hilfe seines Kontexts interpretiert werden kann, dann sollte er so ausgelegt werden, dass er die gleiche Bedeutung hat, wie der Fachmann ihn versteht.
Stand der Technik
Das Ermitteln der Nukleinsäuresequenz von Genen ist in vielen Situationen wichtig. Zum Beispiel werden viele Krankheiten durch eine Mutation in einer Gensequenz im Vergleich mit dem normalen Gen hervorgerufen oder davon begeleitet. Derartige Mutation kann mit der Substitution von nur einer Base durch eine andere Base, genannt eine „Punktmutation", verbunden sein. In manchen Fällen können Punktmutationen schwerwiegende klinische Krankheitssymptome verursachen, indem eine Änderung in der Aminosäuresequenz des Proteins kodiert wird, für das das Gen kodiert. Zum Beispiel resultiert Sichelzellanämie aus einer solchen Punktmutation.
Andere Krankheiten sind mit der Zunahme oder der Abnahme der Kopienzahl von Genen verbunden. Folglich ist nicht nur der Nachweis der Anwesenheit oder der Abwesenheit von Änderungen in einer Sequenz wichtig, sondern ebenso kann die Quantität solcher Sequenzen in einer Probe in der Diagnose einer Krankheit oder in der Ermittlung des Risikos einer sich entwickelnden Krankheit verwendet werden. Ferner haben sich Variationen in Gensequenzen von sowohl prokaryotischen Organismen als auch eukaryotischen Organismen als von unschätzbarem Wert zur Identifizierung von Quellen genetischen Materials herausgestellt (z.B. bei der Unterscheidung eines Menschen von einem anderen oder der Identifizierung einer DNA-Quelle mittels Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)).
Bestimmte, durch Mikroorganismen oder Viren hervorgerufene Infektionen können ebenfalls mittels des Nachweises von für den infektiösen Organismus eigentümlichen Nukleinsäuresequenzen diagnostiziert werden. Nachweis von aus Viren, Parasiten und anderen Mikroorganismen gewonnenen Nukleinsäuresequenzen ist ebenfalls wichtig, wo die Sicherheit verschiedener Produkte von Bedeutung ist, z.B. im medizinischen Bereich, in dem Blutspenden, Blutprodukte und Organe, als auch die Sicherheit von Essens- und Wasserversorgung wichtig für die öffentlich Gesundheit sind.
Folglich stellt die Identifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen mittels der Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe und Nachweis der gesuchten Sequenzen einen Mechanismus bereit, wodurch man die Anwesenheit einer Krankheit, eines Organismus oder eines Individuums ermitteln kann. Im Allgemeinen wird ein solcher Nachweis durch die Verwendung einer synthetisierten Nukleinsäure-„Sonden"-Sequenz, die teilweise zu der interessierenden Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist, durchgeführt.
Obwohl es wünschenswert ist, die Anwesenheit von Nukleinsäuren nachzuweisen, wie oben beschrieben, ist es oft der Fall, dass die Suche nach Nukleinsäuresequenzen in Probenquellen durchgeführt wird, in denen diese in sehr kleiner Zahl vorliegen (z.B. weniger als 10⁷). Die Bedingung kleiner Zahl an Zielmolekülen erfordert, dass Labortechniken durchgeführt werden, so dass die Zahl an Zielsequenzen amplifiziert wird, so dass sie nachgewiesen werden können. Es gibt viele allgemein bekannte Verfahren zur Amplifizierung von Zielsequenzen, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), die Strangverdrängungs-Amplifizierung (SDA) und die Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifizierung (NASBA), um einige zu nennen. Diese Verfahren werden allgemein beschrieben in den folgenden Quellen: (PCR) U.S. Patent Nr. 4,683,195, Nr. 4,683,202 und Nr. 4,800,159; (LCR) EP Anmeldung Nr. 320,308, veröffentlicht am 14. Juni 1989; (SDA) U.S. Patent Nr. 5,270,184 und Nr. 5,455,166 und „Empirical Aspects of Strand Displacement Amplification" von G. T. Walker in PCR Methods and Applications, 3 (1): 1–6 (1993), Cold Spring Harbor Laboratory Press; und (NASBA) "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA^TM)" von L. Malek et al., Ch. 36 in Methods in Molecular Biology, Vo. 28: Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, 1994 Ed. P. G. Isaac, Human Press, Inc., Totowa, NJ.
In Bezug auf das Analysieren und/oder das Identifizieren amplifizierter Produkte von Zielnukleinsäuren, i.e. „Amplicons", wurden typischerweise andere allgemein bekannte Techniken verwendet, einschließlich Größenvergleich, relative Migrationsanalyse (z.B. Southernblot-Analyse) und Hybridisierungsanalyse. Größenvergleich oder relative Migrationsanalyse sind jedoch nicht optimal, weil sie unerwünscht langsam und ungenau sind. Zusätzlich ist Hybridisierungsanalyse, obwohl Hybridisierungsanalyse viele Vorteile gegenüber diesen Verfahren aufweist, weder schnell noch empfindlich im Vergleich zu den Lehren der vorliegenden Erfindung.
In Bezug auf PCR-Technologie ist PCR, da thermisches Zyklisieren erforderlich ist, nicht optimal in der Verwendung in mikroelektronischer Umgebung, weil die Wärmefluktuationen, die durch das thermische Zyklisieren hervorgerufen werden, nachteilig für die Bindungsstellen sind, die auf der Oberfläche eines Mikrochips angeordnet sind. Thermisches Zyklisieren ruft ebenfalls andere Schwierigkeiten hervor, einschließlich des Erfordernisses komplexer Instrumentalausstattung (z.B. um einheitliches Heizen zu gewährleisten etc.) und inakzeptabler Zeitspannen zur Vervollständigung der Analyse (da jeder Schritt sequentiell erfolgen muss).
Im Gegensatz zu PCR ist die SDA-Technik in mikroelektronischer Umgebung sehr nützlich, da sie einige der oben beschriebenen unerwünschten Eigenschaften der PCR überwindet, z.B. ist es ein isothermes Verfahren und der Amplifizierungsvorgang ist asynchron und deshalb schneller. Obwohl die Verwendung von SDA Vorteile gegenüber PCR aufweist, weisen SDA-Schemata, wie sie gegenwärtig praktiziert werden, typischerweise die Verwendung von auf Lösungen basierenden Amplifizierungsprotokollen auf (die z.B. in dem oben genannten U.S. Patent Nr. 5,455,166 veröffentlicht sind). Kürzlich eingeführte Änderungen der SDA-Technik haben die Technik dahin vorangebracht, die Zahl der individuell gestalteten Primer für die Amplifizierung zu minimieren, wie in U.S. Patent Nr. 5,624,825 beschrieben. Jedoch profitieren solche Vorteile nicht von Verstärkungen, wie sie in der vorliegenden Erfindung der elektronisch kontrollierten Hybridisierung realisiert sind.
Andere Amplifizierungsvorgänge beinhalten die Verwendung von Sonden, die an einen festen Träger gebunden sind. Solche Prozeduren haben jedoch keinen erkennbaren Vorteil in den Stand der Technik gebracht im Vergleich zu der „verankerten" SDA, wie sie hierin vorgestellt wird und die in Verbindung mit einem elektronisch adressierbaren Mikrochip durchgeführt wird. Zum Beispiel schließt U.S. Patent Nr. 5,380,489 ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuren und zum Nachweis von Zielnukleinsäuren ein, wobei ein adhäsives Element verwendet wird, um Bindungssonden zu befestigen, so dass Zielmoleküle leichter gebunden und nachgewiesen werden können. Dieses Verfahren richtet sich nicht auf das Problem gleichzeitiger Amplifizierung, Bindung und Nachweis, wie es die vorliegende Erfindung tut. In einem weiteren Beispiel veröffentlicht U.S. Patent Nr. 5,474,895 Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung eines auf einem Styropor-Träger basierenden Sandwichtests. Solch ein Verfahren beinhaltet wiederum lediglich passive Hybridisierung, gefolgt von anschließendem Nachweis, im Anschluss an eine zweite passive Hybridisierung einer Sonde.
Mikrochip-Matrizen wurden ebenfalls in Verbindung mit Nukleinsäureamplifizierung und -nachweis verwendet. Zum Beispiel wurden miniaturisierte Vorrichtungen erfolgreich für die Expressionsüberwachung entwickelt. Siehe z.B. M. Schena et al., 270 Science 467–470 (1995), M. Schena et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10614–619 (1996), J. DeRisi et al., 14 Nat. Genet. 457–60 (1996), R. A. Heller et al., 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2150–55 (1997), und J. DeRisi et al., 278 Science 680–86 (1997). Ebenso wurden miniaturisierte Vorrichtungen erfolgreich zur Analyse bei Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) innerhalb eines Amplicons entwickelt. Siehe z.B. Z. Guo et al., 15 Nat. Biotechnol. 331–35 (1997) und E. Southern, 12 Trends Genet. 110–15 (1996). Diese Vorrichtungen bieten die Möglichkeit, die Spezifität der Hybridisierung mit der Geschwindigkeit und der Empfindlichkeit von Mikrochip-Technologie zu verbinden. Jedoch hat keine erfolgreich eine geeignete miniaturisierte Vorrichtung für die vorliegenden Zwecke bereitgestellt.
Zum Beispiel war, obwohl Mikrovorrichtungen zur gleichzeitigen Analyse multipler Amplicons (i.e. Mehrfach-Analyse) verwendet wurden, derartige Mehrfach-Analyse nur möglich, wenn Hybridisierungsbedingungen kompatibel für alle getesteten Amplicons waren. Dieser Nachteil kann teilweise kompensiert werden durch sorgfältiges Gestalten der Bindungssonde, durch die Verwendung sehr langer Bindungsstellen (z.B. cDNA zur Expressionsüberwachung) (siehe z.B. R. A. Heller et al., (1997) supra, und M. Schena et al., (1995) supra) oder durch extensive Redundanz und Überlappen von kürzeren Bindungs-Oligonukleotidsequenzen. Jedoch haben diese Erwägungen zusammengefasst der Verwendung der meisten Mikrochip-Vorrichtungen Grenzen gesetzt. Ferner führen hohe Redundanzlevel, wie die bei kurzen Oligonukleotid-Bindungssequenzen verwendeten, zu der Notwendigkeit großer Anordnungen und komplexer Informatikprogramme, um die gewonnenen Daten auszuwerten, und immer noch können sich bestimmte Sequenz-spezifische Bereiche als schwierig zu analysieren erweisen. Alternativ dazu erlaubt die Verwendung langer Bindungs-Oligonukleotide die Verwendung von einheitlich erhöhten Hybridisierungstemperaturen. Jedoch schließt die Verwendung langer Bindungssonden und erhöhter Hybridisierungstemperaturen (z.B. im Bereich von 45 bis 75°C) die Analyse von Fehlpaarung einzelner Basenpaare hochgradig verwandter Sequenzen weitestgehend aus.
Außerdem wurde ein weiterer Nachteil von konventionellen Mikrochips offensichtlich (z.B. jene veröffentlicht in U.S. Patent Nr. 5,202,231 und Nr. 5,545,531, sowie in E. Southern et al., Genomics 13, 1008–1017 (1992); M. Schena et al., Science 279, 476–470 (1995); M. Chee et al., Science 274, 610–614 (1996); und D. J. Lockhart et al., Nature Biotechnology 14, 1675–1680 (1996)), darin dass sie von passiver Hybridisierung abhängen und von auf Lösung basierender Amplifizierung vor der Bindung amplifizierter Produkte auf den Mikrochips.
Ferner sind viele dieser Vorrichtungen nicht befähigt, die Amplifizierung von Zielmolekülen multipler Proben gleichzeitig zu analysieren und/oder nachzuweisen. In makroskopischen Vorrichtungen wird dieses letztere Problem üblicherweise gehandhabt mittels „Dot Blot" (Punktabdruck)-Formaten, in denen einzelne Proben bestimmte geometrische Positionen besetzen, mit minimaler Kontamination zwischen den Proben. Im Gegensatz dazu erfordert bei den meisten Mikrochips das Problem des Nachweises und der Analyse für gewöhnlich teure und komplexe Abscheidungstechnologie für Nukleinsäuren, ähnlich der makroskopischen Abscheidung beim Dot Blot, aber in einem mikroskopischen Maßstab.
In einer weiteren kürzlich veröffentlichten Anmeldung (PCT WO 96/01836) wurden elektronische Mikrochips in Verbindung mit Nukleinsäure-Amplifizierung des PCR-Typs verwendet. Jedoch war ein Amplifizierungssystem, das die gleichzeitige Verwendung von Amplifikationsenzymen und Restriktionsenzymen zur Steigerung der Zahl an Zielamplicons an einer spezifischen Bindungsstelle weder bedacht noch möglich in diesem System. Vielmehr wurde Restriktionsabbau von gebundenen Nukleinsäurearten betrachtet in Verbindung mit der Entfernung von doppelstrangigen Nukleinsäurearten von Bindungsstellen im Anschluss an Amplifizierungsvorgänge des PCR-Typs mit Nachweis von Zielarten, die nach enzymatischer Spaltung auftreten. Ferner stellte dieses System verankerte Amplifikationsprimer bereit, die komplementär zu nur einem Strang einer Zielnukleinsäure ist, die in einer PCR-Reaktion funktionsfähig waren.
Wie andere auf Mikrochip basierende Plattformen für Amplifizierung und Nachweis, ist die in der PCT WO 96/01836 erläuterte Erfindung substanziell begrenzt im Vergleich mit der hierin veröffentlichten SDA auf elektronisch adressierbaren Mikrochips, da die Amplifizierung des PCR-Typs von Zielarten, die in jener Publikation erläutert ist, wiederholte Unterbrechung von doppelstrangigen Arten sowie das Funktionieren von in Lösung vorliegenden Reverse-Primern erfordert. Solch eine Situation führt zu der Reduzierung von effizienter Amplifizierung aufgrund von Primer-Primer-Wechselwirkungen, während die Verwendung von Restriktionsenzymen aufgrund von Fluktuationen/Änderungen der Bedingungen der Reaktionspuffer gehemmt ist.
Schließlich waren andere Aspekte der Amplifizierung und des Nachweises von Nukleinsäuren problematisch und/oder nicht optimal. Ein solches Problem war der Verlust an Spezifität bei der Restriktionsendonuklease-Spaltung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsenzymen. Zum Beispiel ist es bekannt, dass manche Restriktionsendonukleasen mit steigendem osmotischem Druck oder reduzierter Wasseraktivität dis Spezifität für ihre DNA-Erkennungssequenz verlieren. C. R. Robinson et al., J. Mol. Biol. 234: 302–306 (1993). Mit reduzierter Wasseraktivität werden die Restriktionsendonukleasen die DNA an Erkennungssequenzen spalten, die um ein Basenpaar verschoben sind gegenüber der normalen Erkennungsstelle. Die Restriktionsstellen, die um ein Basenpaar verschoben sind, nennt man „Stern"-Stellen und die Erkennung und Spaltung der Endonukleasen dieser Sternstellen werden „Stern"-Aktivität genannt.
Robinson et al. fanden heraus, dass gebundenes Wasser bei der Sequenzspezifität der EcoRI-DNA-Spaltung beteiligt ist (Biochemistry 33 (13): 3787–3793 (1994)), und fanden ferner heraus, dass Steigerung des hydrostatischen Drucks mittels Durchführen der Reaktionen bei von 0 auf 100 atm erhöhtem Druck die durch osmotischen Druck hervorgerufene Sternaktivität hemmte und endgültig beseitigte, und zwar bei EcoRI, PvuII und BamHI, aber nicht für EcoRV. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3444–3448 (1995)). Ein wiederkehrendes Problem mit SDA, die auf Restriktionsendonukleasen beruht, ist die Häufigkeit, mit der Nicht-Zielsequenzen auf eine Primer-unabhängige Weise aufgrund von Sternaktivität amplifiziert werden. Folglich gib es eine Notwendigkeit, in SDA-Reaktionen Sternaktivität zu reduzieren oder zu beseitigen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen wir die Eliminierung solcher Sternaktivität in SDA-Reaktionen bereit, mittels Anwendens eines Hochdruck-SDA-Verfahrens.
Zusätzlich zur Verbesserung der SDA-Technologie durch Eliminieren der Sternaktivität stellen wir ebenso verschiedene andere Verbesserungen bei dem Nachweis von Nukleinsäuren bereit, unter Verwendung von SDA in Verbindung mit einem bioelektronischen Mikrochip. Zum Beispiel können Amplifizierung und Trennung von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Ligations-abhängiger SDA durchgeführt werden. Im Gegensatz zu bekannten Ligations-abhängigen Amplifizierungsprozessen gemäß dem Stand der Technik, die erfordern, dass die Amplifizierungsprodukte mittels eines Bindungsschrittes von dem Startmaterial getrennt werden, oder die erfordern, dass freie Ligationssonden vor der Ligation von gebundenen Sonden getrennt werden, beseitigt die vorliegende Erfindung die Notwendigkeit, getrennte Isolierungsschritte durchzuführen. Ferner verbessert die vorliegende Erfindung den SDA-Amplifizierungsprozess mittels Eliminierens der Notwendigkeit von Bumper-Primern, wie sie gemäß dem Stand der Technik verwendet wurden. Zum Beispiel weisen typische Ligations-abhängige Amplifizierungsprozesse Bindungsschritte mittels Markierens eines der während der Amplifizierung verwendeten Primer auf. Trennung kann vor Ligation auftreten, so dass Template-unabhängige Ligation der Primer vermieden wird, oder Trennung kann im Anschluss an Ligation auftreten, so dass Ziel-DNA-Amplicons von nicht-markierter/nicht-amplifizierter DNA isoliert wird. Ziel-DNA-Amplicons, die diese Markierung enthalten, werden von der nicht-markierten/nicht-amplifizierten DNA getrennt. Diese Trennung erfordert einen separaten Schritt im Anschluss an Amplifizierung. Diese separate Behandlung der Probe erhöht die Komplexität des Verfahrens und macht es dadurch weniger nützlich als eine einfache Alternative zu anderen gegenwärtigen DNA-Amplifizierungsverfahren wie PCR. Diese separate Behandlung einer Probe verhindert ebenso Automatisierung des Amplifizierungsverfahrens. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Ligations-abhängiges SDA-Verfahren bereitgestellt, das derartige zusätzliche Schritte beseitigt, wodurch Automatisierung von Amplifizierung und von Nachweis von Zielnukleinsäuren erleichtert wird.
In anderen Ausführungsformen haben wir zusätzliche Verbesserungen in der Technologie zur Amplifizierung und zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitgestellt unter Verwendung von SDA und elektronisch adressierbaren Mikrochips, wobei die Verbesserungen allgemein zeigen, dass ein Bedürfnis nach Vorrichtungen, Verfahren und Substanzzusammensetzungen für effizientes und optimales Amplifizieren, Nachweisen und Analysieren von interessierenden Zielnukleinsäuresequenzen bestehen bleibt.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft insgesamt Vorrichtungen, Verfahren und Substanzzusammensetzungen für die Mehrfach-Amplifizierung, den Nachweis und die Analyse von Nukleinsäuresequenzen, wobei die Amplifizierung, der Nachweis und die Analyse optimal vervollständigt wird mittels Verwendens von SDA in Kombination mit bioelektronischer Mikrochip-Technologie. Die Erfindung stellt sowohl verschiedene effiziente und optimale Verfahren zum Amplifizieren von interessierenden Zielnukleinsäuren bereit, als auch Verfahren zum Analysieren von resultierenden Amplicons. Zusätzlich ermöglicht die Erfindung das Amplifizieren und die Analyse (entweder nacheinander oder gleichzeitig) von multiplen Proben, die Zielnukleinsäuren enthalten, auf einem einzelnen offenen bioelektronischen Mikrochip.
In einem Aspekt dieser Erfindung besteht die Mikrochip-Vorrichtung aus einer elektronisch kontrollierten Mikroelektrodenanordnung. Siehe PCT-Anmeldung WO 96/01836. Im Gegensatz zu der passiven Hybridisierungsumgebung der meisten anderen Mikrochip-Vorrichtungen bieten die elektronischen Mikrochip-Vorrichtungen (oder aktiven Mikroarray-Vorrichtungen) der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit, Nukleinsäuren zu bestimmten Positionen auf der Oberfläche der Mikroelektrodenanordnung aktiv hin zu transportieren oder elektronisch zu adressieren und die adressierten Nukleinsäuren an diesen Positionen entweder an die Oberfläche des Mikrochips an spezifischen, als „Bindungsstellen" bezeichneten Positionen oder an Nukleinsäuren zu binden, die vorher an diese Stellen gebunden wurden. Siehe R. Sosnowski et al., 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119–123 (1997), und C. Edman et al., 25 Nucleic Acids Res. 4907–14 (1997). Das Verwenden dieser aktiven Mikroarrays umgeht viele der Einschränkungen, die bei passiven Mikrovorrichtungen auftreten.
Die aktiven Mikrochiparrays der vorliegenden Erfindung überwinden die Größenabhängigkeit von Bindungs-Oligonukleotiden und die Komplexitätsanforderungen von passiven Mikrovorrichtungen. Außerdem erlauben die Mikrochiparrays der vorliegenden Erfindung Analysen multipler unabhängiger Proben auf der gleichen offenen Oberfläche des Mikroarrays mittels selektiven und unabhängigen Adressierens verschiedener Proben, die interessierende Nukleinsäuren enthalten, an verschiedenen Mikroelektroden-Positionen. In anderen Worten erlauben sie gleichzeitige multiple Probenbearbeitung auf einem offenen Array. Wie oben erwähnt, sind traditionelle Verfahren zum Nukleinsäurenachweis durch die oft langen Amplifizierungs- und Hybridisierungszeiten eingeschränkt, die notwendig sind, um auflösbare Signale zu erhalten. Eine zusätzliche Einschränkung solcher Verfahren ist das Unvermögen, Mehrfach-Hybridisierungsvorgänge auf ihren analytischen Oberflächen durchzuführen, wodurch die erreichbare Information in jedem einzelnen Test eingeschränkt ist. Beide dieser Einschränkungen werden in der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung aktiver mikroelektronischer Arrays überwunden, die befähigt sind, DNA an spezifische Positionen auf des Arrays selektiv zu adressieren und an ihnen aufzukonzentrieren. Eine weitere Stärke dieser Vorrichtungen ist die Fähigkeit, elektronische Hybridisierung und Denaturierung durchzuführen, so dass Einzelbasen-Polymorphismus benachteiligt wird. Folglich zeigen diese aktiven Mikroelektroden-Arrays die Flexibilität, mit einer großen Vielfalt an Aufgaben auf einer gemeinsamen Plattform umzugehen, jenseits derer, die andere Mikrovorrichtungen bieten.
Die vorliegende Erfindung verwendet bevorzugt ein Amplifizierungsverfahren, das sich von traditioneller PCR unterscheidet. Speziell verwendet die vorliegende Erfindung Strangverdrängungs-Amplifizierung (SDA). SDA ist ein Amplifizierungsverfahren, das ausreichende Sensitivität und Robustheit aufweist, so dass schnell (z.B. in etwa 15–45 Minuten) und exponentiell eine kleine Anzahl an Zielmolekülen über einem komplexen Hintergrund amplifiziert werden. Siehe z.B. C. Spargo et al., 10 Molecular and Cellular Probes 247–56 (1996). Im Gegensatz zu PCR ist SDA eine isotherme Technik, die einfachere Temperaturkontrolle und damit zusammenhängende Geräteausstattung erfordert. SDA ist besser kompatibel mit einem zusammengefassten Amplifizierungs-Hybridisierungs-Nachweissystem (i.e. ein System, in dem alle Schritte in einem Ort zusammengefasst sind, z.B. auf einem Mikroarray-Chip) zur schnellen Analyse von Nukleinsäuren. Dies ist primär auf die Tatsache zurückzuführen, dass SDA keine Bedingungen erfordert (z.B. thermisches Zyklisieren), die nachteilig für das Mikroarray eines elektronisch adressierbaren Mikrochips sein könnten.
Die Effizienz von Amplifizierungsreaktionen bei passiver Hybridisierung, bei der Sonden, die so gestaltet sind, dass sie Ziel-Nukleinsäuremoleküle und Amplicon-Nukleinsäuremoleküle binden, an der Oberfläche des Mikroarrays verankert sind, ist während der Eingangsphasen der Amplifizierung aufgrund der niedrigen Frequenz der Hybridisierung von Ziel-Nukleinsäurearten an den entsprechenden Primern, die auf der bindenden Oberfläche positioniert sind, eingeschränkt. Typischerweise erfordert dieser Vorgang Stunden, selbst bei reduzierten Lösungsvolumina. Jedoch ist die Effizienz dieses Vorgangs dramatisch erhöht durch elektronisches Aufkonzentrieren (i.e. Adressieren) der Nukleinsäuren in der Nähe von „verankerten" Primern, wobei die Frequenz von Begegnungen zwischen den Zielnukleinsäuren in der Lösungsphase und den verankerten Primern erhöht wird. Während frühere Ansätze PCR in Verbindung nur einem der zwei für PCR-Amplifizierung notwendigen Amplifizierungsprimern verwendeten, der an einer spezifischen Stelle auf dem Mikroarray verankert war, beabsichtigt die vorliegende Erfindung, dass beide für SDA notwendigen Amplifizierungsprimer an einer bestimmten Bindungsstelle auf dem Mikroarray verankert sind. Folglich sind in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch elektronisches Aufkonzentrieren und Hybridisieren der Zielnukleinsäuren an der Oberfläche des Mikrochips (i.e. Bindungsstellen) vor dem Hinzufügen von Amplifizierungs-Reaktionspuffern, -Enzymen und -Nukleotiden etc. „verankerte" Amplifizierungsreaktionen deutlich bevorzugt, so wie „verankerte SDA", wie unten beschrieben. Das rasche Aufkonzentrieren und anschließende spezifische Hybridisieren von Template-Nukleinsäuremolekülen an ihre komplementären verankerten Hybridisierungsprimer gestattet es, die Oberfläche des Arrays zu spülen, wobei unerwünschte und möglicherweise störende Nicht-Zielnukleinsäuren aus der Reaktionsumgebung zu entfernen.
Das Verwenden von elektronischem Adressieren von Zielnukleinsäuren an spezifische Positionen auf des Mikroarrays weist mindestens drei weitere Vorteile auf gegenüber früheren passiven Hybridisierungstechnologien. Erstens ist die Gesamtzeit und Gesamteffizienz des Hybridisierungsvorgangs dramatisch verbessert, da ein wesentlicher, die Rate begrenzender Schritt (der für das Template notwendigen Zeit, die verankerten Primer zu finden) aus der Gesamt-Reaktionsrate entfernt ist. Ebenso bewirkt das Verwenden von elektronischem Adressieren, dass Zielnukleinsäuren elektronisch aufkonzentriert werden, so dass Hybridisieren der Zielarten an die verankerten Amplifizierungssonden die Zahl der Zielmoleküle an den ausgewählten Stellen erhöht im Vergleich zu der Zahl an Zielmolekülen, die an jeder beliebiger Stelle auf einem nicht-elektronischen, passiven Hybridisierungs-Mikroarray in einem entsprechenden Zeitraum gefunden würden. Das Ergebnis ist, dass die absolute Anzahl an Startermolekülen für den Amplifizierungsprozess dramatisch erhöht ist, woraus eine Verbesserung in sowohl der Gesamtausbeute an Amplifizierungsprodukten als auch der Sensitivität für niedrigere Zahlen an Starter-Templates resultiert.
Der zweite Vorteil ist, dass einzelne Zielnukleinsäuren an spezifischen Positionen auf der Arrayoberfläche aufgetragen werden können, wodurch ermöglicht wird, multiple, verschiedene Nukleinsäureproben gleichzeitig auf einer Matrix zu amplifizieren. Alternativ dazu kann eine Nukleinsäureprobe an mehrere verschiedene Positionen adressiert werden, von denen jede spezifische Sätze an Amplifizierungsprimern enthält, so dass multiple verschiedene Amplifizierungsreaktionen einer einzelnen Probe gleichzeitig durchgeführt werden können. Wie oben erwähnt, unterstützt die Möglichkeit, unnötige und unhybridisierte DNA aus der Reaktionsmischung zu entfernen, diesen Prozess signifikant.
Ein dritter Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Anschluss an eine Amplifizierungsreaktion die Amplicons, die an eine spezifische Stelle auf dem Array adressiert und gebunden wurden, dann auf eine Weise mit Stellenspezifität für nachfolgende Analyse zur Verfügung stehen, wie mittels (1) der Zugabe von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden oder (2) der Hybridisierung von Oligonukleotiden am Ende der Reaktion mittels Denaturierung des amplifizierten Materials, gefolgt von Hybridisierung mit einem entsprechenden Reporter-Oligonukleotid, das Spezifität für das gebundene Amplicon aufweist.
Wie hierin beschrieben, wird die Fähigkeit des elektronischen Adressierens, das in Verbindung mit der Kombination eines elektronisch adressierbaren Mikrochips und SDA verwendet wird, so dass die oben beschriebenen Einschränkungen früherer Verfahren überwunden werden, in zwei Beispielen von Amplicon-Analyse gezeigt. Als erstes, wie unten genauer beschrieben, Verwendung eines allgemeinen stark konservierten Lokus (z.B. 16S rRNA), der bei vielen Bakterienarten zu finden ist, kann in multiplen vergleichenden Analysen von Einzelproben eingesetzt werden, so dass verschiedene Bakterientypen identifiziert werden. Als zweites, ebenfalls unten genauer beschrieben, wird das elektronische Mikroarray der vorliegenden Erfindung zur gleichzeitigen Analyse multipler Proben einzelner Patienten verwendet, die auf Anwesenheit der humanen Faktor V-Leiden (R506Q)-Genmutation getestet wird. Das humane Faktor V-Leiden (R506Q)-Gen indiziert eine Veranlagung zum Widerstand gegen aktiviertes Protein C und zur Venenthrombose. Dieses Beispiel zeigt erfolgreiche gleichzeitige Probenanalyse von multiplen Patienten. Das in dieser Analyse multipler Patientenproben verwendete Testmaterial eröffnet einen anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung, nämlich ein Allel-spezifisches Amplifizierungsverfahren unter Verwendung von SDA, das ebenfalls unten genauer beschrieben wird.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen verschiedene neue Amplifizierungsverfahren. Solche neuen SDA-Verfahren der vorliegenden Erfindung sind nützlich, um Amplicons für verschiedene Analysen bereitzustellen. Zum Beispiel sind manche der hierin beschriebenen SDA-Verfahren nützlich, um Amplifizierungsbedingungen zu optimieren, so dass Amplifizierung auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip-Array durchgeführt wird. Andere SDA-Verfahren sind nützlich, um Amplicons bereitzustellen, die besonders geeignet sind für die Verwendung auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip-Array. Wieder andere SDA-Verfahren sind nützlich, um Analysebedingungen für eine auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip-Array durchgeführten Analyse zu optimieren.
Eine Ausführungsform eines SDA-Verfahrens der vorliegenden Erfindung weist insbesondere ein Allel-spezifisches SDA-Verfahren auf. Das Verfahren amplifiziert vorzugsweise selektiv nur die Stränge, die ein spezifisches Allel aufweisen. Das Verfahren nutzt vorzugsweise Amplifizierungsprimer, die derart gestaltet sind, dass ihr 3'-Ende zu der Nukleotidsequenz des gewünschten Allels komplementär ist. Der Primer kann ebenso vorzugsweise eine Biotineinheit an seinem 5'-Ende aufweisen, so dass ein einfacher Mechanismus bereitgestellt wird zum Binden des Amplicons und/oder der Zielnukleinsäure an einer Bindungsstelle, entweder vor der Amplifizierung oder nach der Amplifizierung im Anschluss an das elektronische Adressieren. Zusätzlich wird, in einer weiteren Allel-spezifischen Ausführungsform, ein Verfahren zum Analysieren hinsichtlich des Vorhandenseins von Allelen eines gegebenen Gens multipler Proben bereitgestellt, die Nukleinsäuren enthalten, welches aufweist: Amplifizieren der Nukleinsäuren in jeder Probe mittels „Zwei-Strang"-SDA zum Herstellen von Amplicons, wobei die erste Amplifizierung Primer nutzt, die für ein erstes Allel spezifisch sind, und die zweite Amplifizierung Primer nutzt, die für ein zweites Allel spezifisch sind, elektronisches Adressieren der Amplicons auf einem Mikroarray, Hybridisieren einer Reportersonde oder mehrer Reportersonden an die gebundenen Amplicons und Nachweisen des Vorhandenseins und der Position der Reportersonden auf dem Mikroarray.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine einzigartige Kombination von SDA und gleichzeitigem Nachweis von Amplifizierungsprodukten auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird SDA an der Oberfläche einer bestimmten Position auf einem elektronischen Mikrochip durchgeführt, wobei sowohl der Upstream(Aufwärts-)-Primer als auch der Downstream(Abwärts-)-Primer, die für die Amplifizierung notwendig sind, an der gleichen bestimmten Bindungsstelle auf einem Mikroarray verankert sind. In einer solchen Ausführungsform liegen die Primer gepaart vor unter Verwendung einer einzigartigen verzweigten Einheit, die an der Oberfläche des Mikrochips „verankert" ist. Diese Gestaltung eines verzweigten Primerpaars stellt dicht aneinander angeordnete Primer bereit, die einen definierten Abstand zueinander und eine definierte Position zueinander aufweisen. Diese Anordnung stellt ferner ein Mittel bereit, mittels dessen die Rate der SDA kontrolliert werden kann. Außerdem können, in Kombination mit anderen Elementen der Erfindung, einzelstrangige Amplifazierungsprodukte, die an der Position des Primerpaars hergestellt werden, leicht und schnell für weitere SDA an den gleichen vorgesehenen Bindungsstellen oder benachbarten vorgesehenen Bindungsstellen adressiert und gebunden werden mittels ungenutzter verzweigter Primerpaare auf dem elektronische Mikrochip.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist jeder Primer der oben genannten Primerpaare ferner eine Nukleinsäuresequenz auf, die für einen Strang einer Endonuklease-Restriktionsstelle kodiert, die in 5'-Richtung einer Nukleinsäuresequenz positioniert ist, deren Nukleinsäuresequenz komplementär zu einem Zielmolekül ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Sequenzen der Restriktionsstellen in den Primern unverändert hinsichtlich dessen vor, dass das Nukleinsäure-Rückgrat ein natürliches Phosphat-Rückgrat aufweist, das mittels Aktivität des Restriktionsenzyms spaltbar ist. Zusätzlich können die für SDA nützlichen Restriktionsstellen irgendeine, typischerweise in SDA-Verfahren verwendete Restriktionsstelle sein, wie in den hierin aufgenommenen Referenzen veröffentlicht, wie HincII, HindII, BsoBI, AvaI, Fnu4HI, Tthl11I und NciI. Andere Endonukleasen können ebenso in diesem Verfahren verwendet werden, inklusive BstXI, BsmI, BsrI, BsaI, NlaV, NspI, PflMI, HphI, AlwI, FokI, AccI, TthIIII, MraI, MwoI, BsrBI, BstNI, BstOI und BsmAI. Zusätzlich muss das Enzym nicht thermophil sein. Außerdem ist es eine weitere bevorzugte Ausführungsform, dass das doppelstrangige SDA-Amplifizierungsprodukt, das während der Primerverlängerung hergestellt wurde, hemimethyliert oder hemiphosphorothioliert wird (oder andere, dem Fachmann bekannte hemimodifizierte Form), so dass das doppelstrangige SDA-Amplifizierungsprodukt richtig an der Primer-Restriktionsstelle für die normale SDA-Amplifizierung eingeschnitten werden kann. Zum Beispiel sollte das substituierte Desoxynukleosidtriphosphat derart modifiziert sein, dass es die Spaltung in dem Strang hemmt, der die substituierten Desoxynukleotide enthält, jedoch nicht die Spaltung des anderen Stranges hemmt. Beispiele für derartige substituierte Desoxynukleosidtriphosphate umfassen 2'-Desoxyadenosin 5'-O-(1-Thiotriphosphat), 5-Methyldesoxycytidin 5'-Triphsophat, 2'-Desoxyuridin 5'-Triphsophat und 7-Desaza-2'-Desoxyguanosin 5'-Triphosphat.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann eine Restriktionsstelle in dem SDA-Verfahren verwendet werden, das nicht erfordert, dass das Nukleinsäurerückgrat der Restriktionsstelle wie oben beschrieben modifiziert ist. Zum Beispiel kann BstNBI in Verbindung mit seiner Restriktionsstelle verwendet werden, um die Nukleinsäure einzuschneiden, da es nicht eine Modifizierung erfordert, um Einzelstrang-Einschnitte zu erhalten. Stattdessen führt BstNBI Einzelstrang-Einschnitte als eine natürliche Aktivität durch.
Die zu der Zielsequenz komplementären Nukleinsäureabschnitte des Primerpaars können beliebige geeignete Länge haben, die Hybridisierung unter Temperatur- und Pufferbedingungen gestatten, die für ein richtiges Funktionieren von SDA auf dem Mikrochip geeignet sind. Typischerweise weisen die Zielsequenzen des Primerpaars eine Sequenz auf, die zu Bereichen der Zielnukleinsäuren komplementär ist, die irgendwo zwischen 60 und 120 Basen je nach Fall aufwärts oder abwärts voneinander entfernt sind. In allen Fällen ist jeder Primer des Primerpaars komplementär zu einem anderen Strang (i.e. dem Plus-Strang oder dem Minus-Strang) der Zielsequenz. Zusätzlich kann, wenn das Primerpaar auf einer verzweigten Einheit ist, die Entfernung zwischen den Primern auf der verzweigten verbindenden Einheit durch molekulare Abstandhalter-Elemente eingestellt werden, so dass die Effizienz der SDA-Reaktion optimal verstärkt wird. Solche Abstandshalter-Elemente können Polyethylenglykol-Polymere umfassen, Polyaminosäuren oder Nukleinsäuren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die distanzierten Primer an ihren jeweiligen 5'-Enden an einer verzweigten Molekularstruktur befestigt sein (z.B. einer „Y"-förmigen Struktur). Die verzweigte Struktur selbst ist wiederum an bestimmten Bindungskissenstellen auf dem Mikrochip mittels eines freien Astes des Ys verankert. Chemie zur Befestigung auf der Mikrochip-Oberfläche kann mittels Streptavidin/Biotin-Kopplung gemäß dem Stand der Technik durchgeführt werden. Alternativ dazu kann die Chemie zur Befestigung der vergleichbaren Chemie enthalten, die in irgendeiner der US Patente Nr. 5,668,258, Nr. 5,668,257, Nr. 5,677,431, Nr. 5,648,470, Nr. 5,623,055, Nr. 5,594,151 und Nr. 5,594,111 veröffentlicht wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die verzweigten Moleküle aus an Aminosäuren befestigten Nukleinsäuren gebildet. In einer anderen alternativen Ausführungsform sind die verzweigten Moleküle mittels Anlagerung verschiedener Distanzmoleküle, wie Polyethylenglykol-Polymeren, Polyaminosäuren oder Nukleinsäuren zwischen die Nukleinsäure-Primer und einer bifunktional verzweigten Aminosäure (z.B. Lysin).
In wiederum einer anderen Ausführungsform müssen die verankerten SDA-Amplifizierungsprimer nicht verzweigt sein, sondern stattdessen lediglich einzeln an der Bindungsstelle in dichter Nähe zueinander verankert sein. Befestigungschemie kann wie oben beschrieben durchgeführt werden.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die Amplifizierung von Zielnukleinsäuren ausschließlich an der Stelle eines verankerten Primerpaars durchgeführt, wobei die Ungenauigkeiten der Amplifizierungsrate vermieden werden, die gewöhnlich mit auf Lösung basierender Amplifizierung verknüpft sind. Insbesondere ist, im Vergleich zu auf Lösung basierender Amplifizierung, die Amplifizierung von multiplen Zielen oder die Mehrfach-Amplifizierung wesentlich verbessert. Es ist wahrscheinlich, dass diese Verbesserung zurückzuführen ist auf das Vermeiden von Konkurrenz zwischen Primern und/oder Vermeiden von Primer-Primer-Wechselwirkungen, die das Binden an die Zielstellen hemmt. Amplifizierung ist auf eine Position konzentriert mittels des kombinierten Einflusses von elektronischem Adressieren von Zielmolekülen und SDA-Produkten an SDA-Bindungskissenstellen und durch die Tatsache, dass die Primer, die Amplifizierung ermöglichen (i.e. die verzweigten oder unverzweigten Primerpaare) an einer festen Position verankert sind.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die Zielnukleinsäure vor der Amplifizierung elektronisch an die spezifische Stelle auf dem Mikrochip adressiert. Dieser Aspekt ist der passiven Hybridisierungstechnologie in mehreren Hinsichten voraus. Erstens weisen die Zielmoleküle einen bevorzugten Vorteil auf, das Primerpaar zu kontaktieren, das so gestaltet ist, dass es das Zielmolekül bindet, da Nukleinsäuren in einer Probenlösung, die Arten von Zielnukleinsäuren enthält, elektronisch an spezifische Stellen auf dem Mikrochip adressiert sind. Zweitens müssen während des Vorganges einzelstrangige Nukleinsäure-Zielmoleküle hergestellt werden, wobei die Bedingungen in der Probenlösung, die Bilden von einzelstrangigen Arten gestatten, nur einmal statt wiederholt vervollständigt werden müssen, wie es normalerweise bei PCR und auf Lösung basierender Amplifizierung der Fall ist. Drittens können das elektronische Adressieren und das Anlagern der Zielarten an spezifischen Bindungsstellen auf dem Chip bei niedriger Salzkonzentration durchgeführt werden, eine Situation, die wesentlich ist im Vergleich zur klassischen passiven Hybridisierungstechnologie. Niedrige Salzkonzentrationen (und elektronisches Adressieren) verstärken die Hybridisierung von einzelstrangigen Zielarten an Bindungsprimern, da solche Bedingungen helfen, das erneute Anlagern von Zielnukleinsäure-Strängen an ihre jeweiligen komplementären Stränge zu reduzieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellen die Verfahren der verankerten SDA der vorliegenden Erfindung verbesserte Effizienz bereit, da nur ein Ziel-spezifischer „Bumper"-Primer erforderlich ist, so dass das Zielmolekül an einer Position auf dem Ziel gebunden ist, die in 5'-Richtung der Ziel-Bindungsposition von einem verankerten Primer oder von dem anderen verankerten Primer liegt. Eine andere Ausführungsform kann zwei Bumper-Primer aufweisen (wie in gewöhnlicher SDA), jedoch ist Einbeziehen von zwei Primern nicht notwendig. Eher erleichtert die Verwendung von zwei Bumper-Primern lediglich den Beginn des Primerns aus jedweder Richtung an jedwedem Paar an Primer- Bindungssonden, in Abhängigkeit davon, welcher der beiden Stränge an Zielnukleinsäure zuerst von dem verzweigten Primerpaar gebunden wird. Einbeziehen von zwei Bumper-Primern kann die Rate der Ampliconbildung weiter erhöhen.
In wiederum einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäuresequenz (und ihres komplementären Strangs) in einer Probe unter Verwendung von SDA unter erhöhtem Druck bereitgestellt. Durch Erhöhen des Drucks ist die Effizienz der Amplifizierung erhöht, da die Spezifität der Restriktionsendonuklease für ihre Zielsequenz erhöht ist. Das Verfahren weist die Schritte auf, 1.) Isolieren von Nukleinsäuren, von denen angenommen wird, dass sie die Zielsequenz einer Probe enthalten, 2.) Herstellen von einzelstrangigen Fragmenten der Zielsequenzen, 3.) Zugeben einer Mischung, die (a) eine Nukleinsäure-Polymerase enthält, (b) Desoxynukleosidtriphosphate, ein phosphorothioliertes dNTP, Endonuklease und (c) mindestens einen Primer, der (i) zu einem Bereich komplementär ist, der manchmal an einem Teil oder entlang einem Teil des Ziels nahe dem 3'-Ende eines Zielfragments ist, und (ii) ferner an seinem 5'-Ende eine Sequenz aufweist, die eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease darstellt, und 4.) der Mischung erlauben, unter erhöhtem Druck für einen Zeitraum zu reagieren, der ausreichend lang ist, Amplifizierungsprodukte herzustellen. Wenn die Ziel-Nukleinsäurefragmente doppelstrangige Nukleinsäuren aufweisen, umfasst das Verfahren ferner Denaturieren der Nukleinsäurefragmente, so dass einzelstrangige Zielsequenzen gebildet werden. Wenn die Nukleinsäuren RNA aufweisen, ist es vorzuziehen, erst Reverse Transkriptase zu verwenden, so dass RNA in DNA umgewandelt wird, obwohl RNA spezifisch in allen Ausführungsformen der Erfindung eingeschlossen ist.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein SDA-Verfahren in Verbindung mit einem elektronischen Mikrochip bereitgestellt, wobei die SDA-Reaktion auf Ligation basiert. In dieser Ausführungsform werden zwei Sätze an Primern verwendet, wobei ein Satz an Primern so gestaltet ist, dass die Primer in Nachbarschaft zueinander an einen Strang einer Zielsequenz binden, während jeder der Primer des zweiten Satzes so gestaltet sind, dass sie an einen Bereich eines der Primer des ersten Satzes an Primern binden, während der jeweils andere der zweiten Primer komplementär zu einem Bereich des jeweils anderen des ersten Satzes an Primern ist (i.e. gleich der Zielstrangsequenz). Wenn diese Ausführungsform verwendet wird, ist es offensichtlich, dass SDA ohne Beteiligung von Bumper-Primern durchgeführt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform kann einer der zwei Sätze an Primern wie hierin beschrieben „verankert" sein.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein auf Ligation basierendes SDA-Verfahren bereitgestellt, bei dem das Verfahren nicht durch einen elektronischen Mikrochip unterstützt wird. In dieser Ausführungsform ist es unter anderem nicht notwendig, irgendwelche Primer zu „verankern", welches eine Prozedur ist, die das Separieren von Primersätzen während der Mehrfach-Amplifizierung unterstützt, da die Primer universal sind – es gibt keine Notwendigkeit, Zielsequenzen an die „korrekten" Primer zu adressieren.
In einer bestimmten Ausführungsform des auf Ligation basierenden SDA-Verfahrens muss der Sondensatz, der so gestaltet ist, dass er sich an eine Zielsequenz anlagert, so ligiert werden, dass ein „ligiertes Sondentemplate" gebildet wird, wobei dieses Template fähig ist, SDA zu unterstützen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform nutzt die auf Ligation basierende Reaktion ein Paar an Amplifizierungsprimern (i.e. der oben erwähnte zweite Satz an Primern), die universell anwendbar auf Amplifizierung aller Zielmoleküle in einem Mehrfachtest sind, wobei diese wiederum verminderte Nicht-Ziel-Amplifizierung sowie aufgrund der Abwesenheit von Bumper-Primern verminderte konkurrierende Wechselwirkungen bereitstellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das ligierte Sondentemplate so modifiziert, dass es während anfänglicher Schritte der SDA-Reaktion nicht von seinem 3'-Ende aus verlängert werden kann. Das Modifizieren der relevanten Ligationssonde verhindert das Bilden einer doppelstrangigen Nukleinsäure, deren 3'-Ende durch Restriktionsendonuklease gespalten werden kann aufgrund von Bildung einer Stelle, die eine spaltbare Restriktionsstelle wäre, wie es unten genauer beschrieben wird. Diese Modifizierung verhindert ebenso Amplifizierung von ligiertem Sondentemplate, die aus der Zielsequenz-unabhängigen Ligation der Ligationssonden resultieren kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des auf Ligation basierenden SDA-Verfahrens ist das Paar an Sonden, das genutzt wird, um eine interessierende Zielnukleinsäure zu adressieren und ein Sondentemplate für die Ligation herzustellen, bifunktional darin, dass jede Sonde des Paares eine Zielbindungssequenz enthält und eine Bindungssequenz für den „Amplifizierungsprimer" (i.e. den oben erwähnten zweiten Satz an Primern). Die für das Binden des Ziels spezifischen Sequenzen werden so ausgewählt, dass sie komplementär zu benachbarten Sequenzen von Ziel-DNA sind. Die Bereiche der Primer des Sondentemplates für die Ligation, die in der Amplifizierung verwendete Nukleinsäuresequenz aufweisen, sind so ausgewählt, dass ein einzelner Satz an Amplifizierungsprimern für alle interessierenden Zielarten während SDA verwendet werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform bindet ein erster Amplifizierungsprimer an das ligierte Sondentemplate an das 3'-Ende des ligierten Sondentemplates, so dass zwei 5'-Überhänge hergestellt werden. Siehe 23(a). Doppelstrangige Nukleinsäuren mit 5'-Überhängen sind normalerweise fähig, Nukleinsäuresynthese vom 3'-Ende des unterbrochenen Strangs mittels einer DNA-Polymerase zu unterstützen. Wie dem Fachmann bekannt ist, funktioniert DNA-Polymerase, indem die Länge eines Strangs einer Nukleinsäure durch Einfügen von Basen in den Strang verlängert wird, die dem gegenüberliegenden Strang komplementär sind.
Jedoch wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform Nukleinsäuresynthese vom 3'-Ende des ligierten Sondentemplates verhindert aufgrund dessen, dass das 3'-Ende eine Modifizierung aufweist, die eine Verlängerung verhindert. Der Fachmann versteht, dass diese Modifizierung viele Formen annehmen kann, die einschließen, aber nicht begrenzt sind auf: Herstellen einer Fehlpaarung der 3'-Basen zwischen der ligierten Sonde und dem Amplifizierungsprimer; Verwenden eines 3'-Didesoxy-Nukleotids; oder Modifizieren der chemischen Einheit, die an dem 3'-Kohlenstoff des Pentosezuckers des Nukleinsäure-Rückgrats vorhanden ist mittels, z.B., Ersetzen der freien 3'-Hydroxylgruppe durch eine Phosphatgruppe, eine Biotineinheit oder mittels Hinzufügens anderer hemmender Gruppen, die dem Fachmann bekannt sind. (Siehe U.S. Patente Nr. 5,516,663 und Nr. 5,573,907 und Nr. 5,792,607, die verschiedene Reagenzien diskutieren, die verwendet werden können, um Enden der Ligationssonden zu modifizieren, um Ziel-unabhängige Ligation zu verhindern). Diese Modifizierung verhindert das Bilden einer doppelstrangigen Nukleinsäure, die bei dem auf Ligation basierenden Amplifizierungsvorgang falsch durch Endonuklease eingeschnitten werden könnte. Diese Modifizierung verhindert ebenso Amplifizieren ligierter Sondentemplates, das aus der Zielsequenz-unabhängigen Ligation der Ligationssonden resultieren kann und verhindert 3'-Verlängerung, wenn die ligierte Sonde an einen Primer gebunden ist. Diese Modifizierung erlaubt ebenso, die Ligationsreaktionen und Amplifizierungsreaktionen ohne einen zusätzlichen Bindungsschritt durchzuführen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Ligationssonden so gestaltet, dass sie Sequenzen enthalten, die für Restriktionsstellen für Endonukleasen kodieren, so dass diese Stellen nahe den 5'-Enden und den 3'-Enden der ligierten Sondentemplates positioniert sind. Die in der Reaktionsmischung vorhandene Restriktionsendonuklease kann die doppelstrangige Nukleinsäure einschneiden, so dass SDA durchgeführt werden kann. Einschneiden der DNA tritt eher auf als Spalten, da der Strang, der zu dem 5'-Ende der ligierten Sonde komplementär ist, während der SDA synthetisiert wird unter Verwendung von Nukleotiden, die ein modifiziertes Nukleotid enthalten (z.B. dATPαS oder dCTPαS).
In einer weiteren Ausführungsform können die Amplicons, die bei der auf Ligation basierenden SDA gebildet werden, im Anschluss an ihre jeweilige Bildung an Bindungsstellen adressiert werden (entweder wird ihre Amplifizierung durch SDA in Lösung herbeigeführt oder direkt an den Bindungsstellen mittels Primern, die vor der Amplifizierung an die Bindungsstellen adressiert werden, wie hierin beschrieben).
In wiederum einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind verschiedene Mittel verfügbar, mittels derer das Vorhandensein von Zielnukleinsäuren in einer Probe nachgewiesen werden kann, aufgrund der kombinierten Anwendung des elektronisch adressierbaren Chips und verankerter SDA. Zum Beispiel können in einer bevorzugten Ausführungsform Amplicons, die an Bindungsstellen adressiert sind, direkt mittels Fluoreszenz nachgewiesen werden, i.e. ein Fluorofarbstoff kann in dem Puffer enthalten sein, so dass der Nachweis gleichzeitig mit der Herstellung der Amplicons erfolgt. Zu Beispielen solcher fluoreszierender Bestandteile gehören Bodipy-Derivate, Cy-Derivate, Fluoreszein-Derivate und Rhodamin-Derivate, die alle dem Fachmann bekannt sind. Alternativ dazu kann der Nachweis von Nukleinsäuren an Bindungsstellen direkt durch Verwendung von Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz durchgeführt werden. Chemilumineszenz weist die Verwendung eines Enzyms auf, das mit einem Reporter-Oligonukleotid verbunden ist, das, wenn es mit einem geeigneten Substrat aktiviert wird, ein Lumineszenzsignal abstrahlt. Zu den Beispielen solcher Enzyme gehören Meerrettich-Peroxidase und alkalische Phosphatase, die beide dem Fachmann bekannt sind. Elektrochemilumineszenz (ECL) ist ein hochgradig empfindlicher Prozess (200 fmol/L) mit einem dynamischen Bereich von über sechs Größenordnungen. In diesem System werden reaktive Arten aus stabilen Vorläufern an der Oberfläche einer Elektrode hergestellt. Diese Vorläufer reagieren miteinander, so dass der angeregte Zustand der an dem DNA-Strang befestigten Markierung gebildet wird. Der angeregte Zustand fällt zurück auf den Grundzustand durch einen normalen Fluoreszenzmechanismus, wobei ein Photon der Wellenlänge 620 nm emittiert wird.
Die unter Verwendung der hierin veröffentlichten Primer hergestellten Amplifizierungsprodukte können ebenso mittels einer charakteristischen Größe, z.B. auf mit Ethidiumbromid angefärbten Polyacrylamid- oder Agarose-Gelen nachgewiesen werden. Alternativ dazu können amplifizierte Zielsequenzen mittels einer Testsonde nachgewiesen werden, die aus einem Oligonukleotid besteht, das mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist. In einer Ausführungsform kann mindestens eine markierte Testsonde zum Nachweisen amplifizierter Zielsequenzen verwendet werden mittels Hybridisierung (eine Nachweissonde), mittels Hybridisierung und Verlängerung, wie von Walker et al. (in 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691–1696) beschrieben (ein Nachweisprimer) oder mittels Hybridisierung, Verlängerung und Umwandlung zur doppelstrangigen Form, wie in EP 0678582 beschrieben (ein Signalprimer). Vorzugsweise ist die Testsonde ausgewählt, so dass sie an eine Sequenz in dem Ziel hybridisiert, die zwischen den Amplifizierungsprimern liegt, i.e. es sollte eine interne Testsonde sein. Alternativ dazu kann ein Amplifizierungsprimer oder die Zielbindungssequenz davon als die Testsonde verwendet werden.
Die nachweisbare Markierung der Testsonde ist eine Einheit, die entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann als ein Hinweis auf das Vorhandensein der Zielnukleinsäure. Für den direkten Nachweis der Markierung können die Testsonden mit einem Radioisotop versehen sein und mittels Autoradiographie nachgewiesen werden oder mit einer fluoreszierenden Einheit versehen sein und mittels Fluoreszenz nachgewiesen werden, gemäß dem Stand der Technik. Alternativ dazu können die Testsonden indirekt nachgewiesen werden mittels Anbringens einer Markierung, die zusätzliche Reagenzien erfordert, so dass sie nachweisbar wird. Zu den indirekt nachweisbaren Markierungen gehören z.B. chemilumineszente Agenzien, Enzyme, die sichtbare Reaktionsprodukte herstellen, und Liganden (z.B. Haptene, Antikörper oder Antigene), die mittels Bindens an markierte spezifische Bindungspartner (z.B. Antikörper oder Antigene/Haptene) nachgewiesen werden können. Liganden sind ebenso nützlich zur Immobilisierung der Liganden-markierten Oligonukleotide (der Bindungssonde) auf einer festen Unterlage, so dass ihr Nachweis erleichtert wird. Zu den besonders nützlichen Markierungen gehören Biotin (nachweisbar mittels Bindens an markiertes Avidin oder Streptavidin) und Enzyme wie Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase (nachweisbar mittels Hinzufügens von Enzymsubstraten, so dass farbige Reaktionsprodukte hergestellt werden). Verfahren zum Hinzufügen solcher Markierungen zu oder zum Einbauen solcher Markierungen in Oligonukleotide sind gemäß dem Stand der Technik bekannt und jedes dieser Verfahren ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Zu den Beispielen der spezifischen Nachweisverfahren, die verwendet werden können, gehört ein Chemilumineszenz-Verfahren, in dem amplifizierte Produkte unter Verwendung einer biotinylierten Bindungssonde und einer Enzym-konjugierten Nachweissonde nachgewiesen werden, wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,470,723. Nach Hybridisierung dieser zwei Testsonden an verschiedene Stellen in dem Testbereich der Zielsequenz (zwischen den Bindungsstellen der beiden Amplifizierungsprimer) wird der Komplex auf einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiter-Platte mittels der Bindungssonde gebunden und das Chemilumineszenzsignal wird entwickelt und in einem Luminometer gelesen. Als eine andere Alternative zum Nachweis von Amplifizierungsprodukten kann ein Signalprimer in die SDA-Reaktion einbezogen werden, wie in EP 0678582 beschrieben. In dieser Ausführungsform werden markierte zweite Amplifizierungsprodukte während der SDA in einer von Zielamplifizierung abhängigen Weise hergestellt und können als ein Indiz für Zielamplifizierung mittels der angehängten Markierungen nachgewiesen werden.
In einem weiteren alternativen Nachweisverfahren kann ein Ziel-spezifischer Primer (i.e. ein Zielsignal-Primer, der ein Primer ist, der nicht ein Bumper-Primer oder ein verankerter Primer ist), der so gestaltet ist, dass er sich an die Zielsequenz anheftet an einer Position, die verschieden ist von den Stellen für den verankerten Primer oder den Bumper-Primer, in das schrittweise Amplifizierungsverfahren aufgenommen werden. Dieser Signalprimer kann mit einem Signalmolekül markiert sein, das wiederum zum Nachweis eines Verlängerungsproduktes verwendet werden kann, das bei der Verlängerung des Signalprimers während SDA gebildet wurde. Zum Beispiel kann eine solche Markierung Biotin aufweisen, das an eine Position auf dem Mikrochip gebunden werden kann, die Streptavidin enthält, wobei diese Bindung mittels Vorhandenseins eines Fluorfarbstoffes nachgewiesen werden kann.
In wieder einem anderen Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung eines Verlängerungsprodukts oder Amplicons des Signalprimers ein Mittel bereit, mittels dessen das molare Verhältnis eines Zielamplicon-Strangs zu dem anderen hergestellt werden kann, so dass einzelstrangige amplifizierte Arten der Zielsequenz für die Bindung mittels Bindungssonden, die an spezifischen Stellen auf dem Mikrochip positioniert sind, bewahrt werden können. In anderen Worten ermöglicht der Signalprimer „asymmetrische SDA". Außerdem können die amplifizierten Amplicons der Signalprimer elektronisch an zweite Bindungsstellen adressiert werden, was die weitere Reduzierung des Hintergrundsignals zugunsten erhöhten Nachweises erleichtert.
Für kommerzielle Zwecke können Amplifizierungsprimer für spezifischen Nachweis und zur Identifizierung von Nukleinsäuren in Form eines Kits zusammengepackt werden. Typischerweise enthält ein solcher Kit mindestens ein Paar an Amplifizierungsprimern. Reagenzien zur Durchführung einer Nukleinsäure-Amplifizierungsreaktion können ebenso mit den Ziel-spezifischen Amplifizierungsprimern enthalten sein, z.B. Puffer, zusätzliche Primer, Nukleotid-Triphosphate, Enzyme etc. Die Bestandteile des Kits werden zusammen in einen gewöhnlichen Behälter gepackt und enthalten wahlweise Instruktionen zur Durchführung einer spezifischen Ausführungsform der erfinderischen Verfahren. Andere mögliche Komponenten können ebenso in dem Kit enthalten sein, z.B. ein Oligonukleotid, das mit einer Markierung versehen ist, die für die Verwendung als eine Testsonde geeignet ist, und/oder Reagenzien oder Mittel zum Nachweis der Markierung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Akte dieses Patents enthält mindestens eine in Farbe ausgeführte Zeichnung. Kopien dieses Patents mit Farbzeichnung(en) werden durch das Patent- und Gebrauchsmusteramt auf Nachfrage und Zahlung der notwendigen Gebühr bereitgestellt.
1A zeigt eine Querschnittansicht einer Ausführungsform des bioelektronischen Chips der vorliegenden Erfindung.
1B zeigt eine perspektivische Ansicht des bioelektronischen Chips aus 1A.
2A zeigt eine schematische Darstellung eines bakteriellen 16S rRNA-Gens, das divergente Bereiche aufweist (die pro Bakterienstamm unterschiedliche Sequenz aufweisen), die auf beiden Seiten von konservierten Bereichen (die in jedem Bakterienstamm die gleiche Sequenz aufweisen) flankiert ist. BBs und Bba repräsentieren bakterielle Sense- bzw. Antisense-Bumper-Primer. Bas und Baa repräsentieren bakterielle Sense- bzw. Antisense-Amplifizierungsprimer. Eine Identifizierung der getesteten Bakterienstämme erscheint in dem Sequenzverzeichnis.
2B zeigt das Ergebnis der von 16S rRNA kodierten SDA-Amplifizierungsprodukten, die auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1%igen Agarose-Gel analysiert wurden, das spezifische Amplifizierung der divergenten Bereiche jedes Stammes zeigt.
2C zeigt einen Aspekt eines Sandwich-Testformats, das zur Hybridisierung von Nukleinsäuren auf Mikromatrizen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wobei das Testformat eine universelle Bindungssonde und einen Sequenz-spezifischen Reporter nutzt.
2D zeigt ein Sandwich-Testformat, das zur Hybridisierung von Nukleinsäuren auf Mikroarrays der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wobei das Testformat eine Sequenz-spezifische Bindungssonde und einen universellen Reporter nutzt.
3A zeigt Salmonella-spezifische, BTR-markierte Reporter, die für passive Hybridisierung von SDA-Amplicons auf einem Mikroarray verwendet wurden, wobei die Bindungsstellen des Mikroarrays als eine Kontrolle für nicht-spezifisches Binden des Reporter-Oligonukleotids an die Bindungssonde oder der Permeationsschicht selber eine Stelle aufweisen, die Bindungssonden aufweist, aber kein Ziel (+C/–T) und eine Stelle, die weder Bindungsstelle noch Ziel aufweist (C–/T–).
3B zeigt einen Vergleich der relativen Fluoreszenzausbeute für jedes Bakterium, nachdem SDA-Amplicons hergestellt wurden und elektronisch an individuelle Stellen auf einem Mikroarray adressiert wurden unter Verwendung von universellen Bindungssonden, und nachdem Sequenz-spezifische, Btr-markierte Reportersonden (die in dem divergenten Bereich des 16S rRNA-Gens gestaltet wurden) passiv hybridisiert wurden, so dass verschiedene Bakterienstämme unterschieden wurden.
3C zeigt einen Vergleich der relativen Fluoreszenzausbeute für jedes Bakterium, nachdem SDA-Amplicons hergestellt wurden und elektronisch an individuelle Stellen auf eines Mikroarrays adressiert wurden unter Verwendung von Sequenz-spezifischen Bindungssonden, und nachdem universelle Btr-markierte Reportersonden (die in dem konservierten Bereich des 16S rRNA-Gens gestaltet wurden) passiv an das gebundene Material hybridisiert wurden.
4A zeigt eine Analyse eines Polyacrylamid-Gels der Allel-spezifschen Reaktionen von fünf Patientenproben, die jeweils auf die Faktor V-Leiden-Mutation analysiert wurden, wobei jede genomische DNA-Probe zweifach mit Allel-spezifischer SDA amplifiziert wurde unter Verwendung von entweder dem normalen Genotyp (Faktor V R506), W oder der Leiden-Mutation (Faktor V Q506), M.
4B zeigt ein Histogramm, das die vorhandene Fluoreszenz an jeder adressierten Stelle auf der Matrix der Allel-spezifischen Reaktionen von drei der fünf Patientenproben aus 4A vergleicht.
5A zeigt ein Diagramm eines ersten Schemas, zu Nachweiszwecken eine fluoreszierende Art in eine Amplifizierungsreaktion aufzunehmen.
5B zeigt ein Diagramm eines zweiten Schemas, zu Nachweiszwecken eine fluoreszierende Art in eine Amplifizierungsreaktion aufzunehmen.
6A zeigt eine Fluoroskop-Analyse eines Mikrochips, bei dem als Kontrolle das SDA-Template abwesend war.
6B zeigt eine Fluoroskop-Analyse eines Mikrochips, bei dem als Kontrolle BsoBI nicht in der Reaktion vorhanden war.
6C zeigt eine Fluoroskop-Analyse eines Mikrochips, bei dem das SDA-Template über Nacht passiv hybridisiert worden war.
7 zeigt das Bild der mittleren Fluoreszenz der Fluoroskop-Analyse der 6A–6C.
8 zeigt eine Fluoroskop-Analyse eines Mikrochips, bei dem das SDA-Template elektronisch adressiert wurde.
9 zeigt die Titration der Faktor V-PCR in dem SDA-Template aus 8.
10(a) zeigt das Gelprodukt einer NASBA-Amplifizierung.
10(b) zeigt die Fluoroskop-Analyse eines Sandwich-Testergebnisses eines NASBA-Tax-Plasmids nach elektronischem Adressieren an einem Mikroarray.
11 zeigt eine Titrationskurve von nicht-spaltbaren SDA-Primern in verankerter Faktor V-SDA.
12 zeigt eine schematische Darstellung der verankerten Primer, wobei Aspekte der Gestaltung der verzweigten Primer dargestellt sind.
13 zeigt eine schematische Darstellung, in der das schrittweise Verfahren der Amplicon-Herstellung aus Ziel-Nukleinsäuresequenzen an einer Stelle mit verzweigtem Primerpaar dargestellt ist.
14 zeigt eine schematische Darstellung, die das Wesen der Verwendung eines Signalprimer darstellt, mit dem asymmetrische Verteilungen von Nukleinsäure-Ampliconketten derart hergestellt werden, dass die Amplicons mit Signal zum Signalnachweis elektronisch an ein Bindungskissen adressiert werden.
15 zeigt ein schematisches Diagramm, das verankerte, nicht-verzweigte SDA-Zielprimer darstellt.
16 zeigt eine Darstellung des Layouts eines Mikrochip-Kissens mit den Positionen auf dem Kissen, an die die verschiedenen gestesteten Zielarten adressiert waren, wie in Beispiel 7 erklärt.
17 zeigt ein photographisches Bild einer Kontroll-SDA-Reaktion, wobei keine Ziel-Nukleinsäure vorhanden war.
18 zeigt ein photographisches Bild einer spezifischen Position von mittels SDA amplifiziertem Faktor V-Ziel in der Gegenwart von multiplen Zielarten, wobei nur SDA-Bindungsprimerpaare verwendet wurden, die spezifisch für Faktor V sind, die vorher an lediglich diese vier Bindungsstellen adressiert worden waren.
19 zeigt ein photographisches Bild einer spezifischen Position von mittels SDA amplifiziertem Faktor V- und Chlamydia-Zielen, die in der Gegenwart von multiplen Zielarten und SDA-Bindungsprimerpaaren, die spezifisch für Faktor V und Chlamydia sind, amplifiziert wurden und die vorher an spezifische Bindungsstellen adressiert worden waren.
20 zeigt ein photographisches Bild einer spezifischen Position von mittels SDA amplifiziertem Faktor V-, Chlamydia- und Hämochromatose-Genzielen, die in der Gegenwart von multiplen Zielarten und SDA-Bindungsprimerpaaren, die spezifisch für Faktor V, Chlamydia und Hämochromatose sind, amplifiziert wurden und die vorher an spezifische Bindungsstellen adressiert worden waren.
21 zeigt ein PAGE-Gel, das Ergebnisse einer auf Lösung basierenden Mehrfach-SDA-Reaktion für Faktor V-, Chlamydia- und Hämochromatose-Genzielen darstellt. Die Minus-Bahn gibt an, dass keine Template-DNA vorhanden war, während die Plus-Bahn das Hinzufügen von Template-DNA wiedergibt.
22 zeigt ein Diagramm, in dem eine vorgeschlagene Reaktionsfolge für die Synthese eines verzweigten SDA-Primerpaares dargestellt ist.
23(a–c) zeigen einen Reaktionsweg für die Ligations-abhängige Amplifizierung einer Ziel-Nukleinsäuresequenz.
23(d) zeigt die Ligationssonden und Amplifizierungsprimer, die zum Nachweis des Salmonella spaQ-Gens verwendet würden, das in einer Probe vorhanden ist, unter Verwendung des in 23(a–c) dargestellten Verfahrens.
24 zeigt ein Diagramm, in dem die spezifische Amplifizierung unter Verwendung des Aspektes der Exonuklease-abhängigen SDA dieser Erfindung dargestellt ist, wie in Beispiel 10 beschrieben, in Verbindung mit einer Mikroelektroden-Matrix, die Bindungssonden für fünf bakterielle Gene aufweist, die vorher an bestimmten Positionen angeordnet wurden.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Vorrichtungen, Verfahren und Substanzzusammensetzungen zur Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen in einer Probe und zur Analyse dieser Sequenzen. Die Amplifizierung und die Analyse werden optimal durchgeführt mittels SDA und bioelektronischer Mikrochip-Technologie.
BEISPIEL 1
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird eine Mikrochip-Vorrichtung bereitgestellt, die ein elektronisch kontrolliertes Mikroelektroden-Array zur Analyse von interessierenden Zielnukleinsäuren aufweist. Im Gegensatz zu der einheitlichen Umgebung einer Hybridisierungsreaktion und der in anderen Mikrochip-Vorrichtungen verwendeten passiven Hybridisierung bieten die auf Mikrochip basierenden elektronischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit, Zielnukleinsäuren und/oder Primernukleinsäuren zu Bindungssonden an bestimmten Positionen auf der Oberfläche der Mikroelektroden-Matrix aktiv zu transportieren und daran zu hybridisieren.
Nun bezugnehmend auf 1A und 1B wird eine vereinfachte Version des in dieser Erfindung ausgeführten, elektronisch adressierbaren, auf Mikrochip basierenden Hybridisierungssystems illustriert. Im Allgemeinen trägt ein Substrat 10 ein Array von elektronisch adressierbaren Mikro-Positionen 12, die beliebige geometrische Form wie quadratisch oder kreisförmig annehmen können. Zur Erleichterung der Erklärung wurden die verschiedenen Mikropositionen in 1A mit 12A, 12B, 12C und 12D bezeichnet. Eine Permeationsschicht 14 ist über den Elektroden 12 abgeschieden und kann sich über die gesamte Vorrichtungsoberfläche ausbreiten. Die Permeationsschicht 14 erlaubt Transport von relativ kleinen geladenen Einheiten durch sie, aber begrenzt die Mobilität von großen geladenen Einheiten wie Nukleinsäuren, so dass die großen geladenen Einheiten davon abgehalten werden, leicht direkt die Elektroden 12 zu kontaktieren, die unter der Permeationsschicht einer Bindungsstelle positioniert sind. Die durchlässige Schicht 14 reduziert ebenso den elektrochemischen Abbau, der bei direktem Kontakt mit den Elektroden 12 auftreten könnte. Elektrochemischer Abbau ist manchmal durch sowohl Bildung von reaktiven radikalen Arten und extremen pH-Werten an der Elektrodenoberfläche während der elektrolytischen Reaktion induziert. Die Permeationsschicht 14 dient ferner dazu, die starke, unspezifische Adsorption von Nukleinsäuren an Elektrodenoberflächen zu minimieren. Bindungsbereiche oder Bindungsstellen 16 sind auf der Permeationsschicht 14 angeordnet und stellen spezifische Bindungsstellen für Zielmaterialien bereit. Die Bindungsstellen 16 in 1A sind mit 16A, 16B, 16C und 16D bezeichnet, so dass sie, in dieser Reihenfolge, den Bezeichnungen der Elektroden 12A–12D entsprechen.
Der zentrale Bereich des Mikrochips enthält das Reservoir 18, in das Proben-Nukleinsäuren über dem Bereich aufgetragen werden, der die Mehrzahl der Bindungsstellen 16 enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform können geladene Moleküle 20, wie geladene Ziel-Nukleinsäuren oder geladene Sonden-Nukleinsäuren, die im Reservoir 18 positioniert sind, zu jedweder spezifischen Mikroposition 12 transportiert werden. Wenn sie aktiviert ist, generiert eine Mikroposition 12 das freie Feld, in dem der elektrophoretische Transport jedes geladenen Moleküls 20 (z.B. Sonde, Zielnukleinsäuren oder Amplicons) zu der Elektrode 12A hin erfolgt. Als ein weiteres Beispiel führt das Adressieren der Elektrode 12A mit einer positiven Vorspannung und Elektrode 12D mit einer negativen Vorspannung zu elektrophoretischen Kraftlinien 22, die zwischen Elektrode 12A und Elektrode 12D verlaufen, und verursacht ferner den Transport von geladenen Molekülen 20, die eine negative Nettoladung aufweisen, zu der positiven Elektrode 12A hin. Geladene Materialien 20, die eine positive Nettoladung aufweisen, bewegen sich aufgrund der elektrophoretischen Kraft hin zu der negativ geladenen Elektrode 12D. Wenn die Moleküle mit negativer Nettoladung 20 die Bindungsstellen 16A oberhalb der Permeationsschicht als ein Ergebnis ihrer Bewegung aufgrund der elektrophoretischen Kraft kontaktiert, werden die geladenen Moleküle 20 an die Bindungsstellen der Bindungsschicht 16A gebunden. Bindung kann, wie unten diskutiert, aufgrund vielerlei Verfahren erfolgen, einschließlich Bindung mittels Hybridisierung eines geladenen Zielmoleküls 20 an eine komplementäre Nukleinsäuren-Sonde, die an der Bindungsstelle 16 verankert ist.
Elektronisch adressierbare Mikrochip-Arrays der vorliegenden Erfindung überwinden die Größenbegrenzung von Bindungssonden-Oligonukleotiden und die Komplexitätsanforderungen von passiven Mikrochip-Vorrichtungen. Der adressierbare Mikrochip reduziert auch beträchtlich die Notwendigkeit, zumindest teilweise, von Strangseparierung, aufgrund der Verwendung einer schwach ionischen Umgebung im aktuellen System, die die Bildung von doppelstrangiger Nukleinsäure, die vor der Bindung in Lösung vorliegt, und Amplifizierung der Nukleinsäure an einer Bindungsstelle hemmt. Zusätzlich gestatten die Mikrochip-Arrays der vorliegenden Erfindung multiple unabhängige Probenanalyse (i.e. Mehrfach-Probenanalyse) auf der gleichen offenen Mikroarray-Oberfläche mittels selektiven und unabhängigen Adressierens verschiedener Nukleinsäureproben an verschieden Mikroelektroden-Positionen. In anderen Worten gestatten sie parallele multiple Probenbearbeitung auf einem offenen Array. Wie unten im Detail beschrieben, wird die Fähigkeit des elektronischen Adressierens, die oben beschriebenen Einschränkungen der Verfahren passiven Hybridisierens zu überwinden, in den folgenden beiden Beispielen A und B gezeigt.
Beispiel A – Parallele Analyse von einzelnen Zielnukleinsäuren in einer Probe
In einem ersten Beispiel wurde eine parallele Analyse der Bindung und des Nachweises einer einzelnen Nukleinsäure in einer Testprobe unter Verwendung eines gemeinsamen Lokus (16S rRNA), den verschiedene Bakterienstämme teilen, durchgeführt. Multiple vergleichende Analysen von einzelnen Proben wurden zur Identifizierung verschiedener Bakterientypen durchgeführt.
Die Anforderungen der Sekundärstruktur der ribosomalen 16S-RNA-Untereinheit erfordert hoch konservierte Nukleinsäuresequenzen in dem 16S rRNA-Gen. Folglich liegt eine begrenzte Divergenz der Sequenz in diesem Gen zwischen verschiedenen Bakterienstämmen vor. Trotz der insgesamt hohen Sequenz-Konservierung gibt es innerhalb des 16S rRNA-Gens Nester von Mikro-Heterogenitäten, die zur Unterscheidung zwischen nah verwandten Bakterienstämmen ausgenutzt werden können. Siehe z.B. C. Woese, 51 Microbiol. Revs. 221–271 (1987).
Die Einrahmung dieser Mikro-Heterogenitäten von konservierten Sequenzen stellt Möglichkeiten bereit, viele Primer für Konsensus-Amplifizierung (i.e. einheitliche Amplifizierung unter Verwendung der gleichen Primer unabhängig von dem Stamm) für fast alle Bakterienstämme, die die konservierten Sequenzen enthalten, zu gestalten. Wie in 2A dargestellt, wurden SDA-Primer in den konservierten Bereichen, die den polymorphen Bereich einrahmen, gestaltet und in SDA-Reaktionen verwendet. Die resultierenden Amplicons enthielten die verschiedenen Sequenzen der „Domänen mit Mikro-Heterogenität" des 16S rRNA-Gens. Diese wurden mittels verschiedener Verfahren analysiert.
Wie unten gezeigt, können Konsensus-SDA-Primer zum Herstellen von Stamm-spezifischen Amplicons verwendet werden, die wiederum sogleich mittels Hybridisierung auf aktiven mikroelektronischen Arrays analysiert werden können. In ähnlichen Studien wurde berichtet, dass PCR als ein Mittel der Zielamplifizierung verwendet wurde. Siehe z.B. D. Linton et al., 35 J. Clin. Microbiol. 2568–72 (1997), M. Hughes et al., 35 J. Clin. Microbiol. 2464–71 (1997). Die vorliegende Erfindung jedoch verwendet einen Sandwich-Test, in dem eine einzelstrangige Bindungssonde elektronisch auf dem Array abgeschieden wird, die zum Binden eines Strangs eines geladenen Moleküls wie einer Zielnukleinsäure oder ihres Amplicons dient. In einer bevorzugten Ausführungsform können eine Vielzahl an Molekülen wie Nukleinsäure-Bindungssonden elektronisch auf verschiedenen Kissen der Matrix abgeschieden werden. Im Anschluss an das Binden des geladenen Moleküls an die Bindungsstellen kann das gebundene Molekül mittels einer markierten Reportersonde, die an das gebundene Molekül bindet, nachgewiesen werden.
Wie schematisch in 2A dargestellt, weist das 16S rRNA-Gen nahe seinem 3'-Ende einen Oligonukleotidbereich auf, der sich über mehr als zwanzig benachbarte Nukleotide der polymorphen Sequenz 24 erstreckt, die auf beiden Seiten von konservierten Sequenzen 26 eingerahmt ist. Die einzigartigen Sequenzen 24 jedes Bakterienstammes, die hierin in dem Sequenzverzeichnis spezifiziert sind, wurden in einer SDA-Reaktion in dem elektronisch adressierbaren Mikrochip genutzt, so dass gezeigt wurde, dass es möglich ist, zwischen verschiedenen Bakterienstämmen zu unterscheiden, indem diese polymorphen Sequenzen und ihre jeweiligen Amplicons an spezifische Bindungsstellen gebunden werden. Genauer gesagt wurden Primer gestaltet, die Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die zu der hoch konservierten Schleife III-Struktur der kleinen Untereinheit der bakteriellen ribosomalen RNA 26 komplementär sind. Eine 3'-Base, die zu einem Stamm-spezifischen Allel komplementär ist, oder eine Punktmutation in der Sequenz wurden ebenso gestaltet und hergestellt. Wie in 2A gezeigt, erleichtert diese Primer-Konfiguration die Gestaltung von sowohl SDA-Amplifizierungs-Primern als auch Bumper-Primern für jedwede bestimmte Gruppe von Organismen, die die gleichen konservierten Nukleinsäuresequenzen aufweisen. Primer können auch so hergestellt werden, dass sie „universell" zur Nutzung in SDA sind, so dass Organismen einer Gruppe nachgewiesen werden.
In einem spezifischen Beispiel wurde genomische DNA aus Bakterien (E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Shigella dysinteriae und/oder Campylobacter jejuni) amplifiziert. Der gleiche Satz an 16S rRNA-kodierenden „Konsensus"-Primern (unten genauer beschrieben) wurde in jeder SDA-Reaktion verwendet. Die Produkte der SDA-Reaktionen wurden auf einem 2%igen Agarose-Gel analysiert, so dass die Effizienzen der Amplifizierung zwischen verschiedenen Bakterienstämmen verglichen werden können. Das resultierende Gel ist in 2B dargestellt, wobei ähnliche Pegel an Amplifizierungseffizienz jeweils für E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium und Shigella dysinteriae wie auch in anderen Experimenten, in denen genomische DNA von Campylobacter jejuni (Daten nicht dargestellt) verwendet wurde, erzielt wurden. Tabelle 1, unten, zeigt die Olignukleotidsequenzen, die zur Amplifizierung und zur Mikromatrix-Analyse dieser Bakterienstämme verwendet wurden.
Zwei verschiedene Ansätze wurden zur Analyse der Amplifizierungsprodukte verwendet. Ein erster Analyseansatz verwendete eine gemeinsame oder universelle Bindungssonde und einen Sequenz-spezifischen Reporter (i.e. universelle Bindung/spezifischer Reporter-Verfahren). Ein zweiter Analyseansatz verwendete diskriminierende Bindungsprimer und einen universellen Reporter (i.e. ein spezifische Bindung/universeller Reporter-Verfahren). Wie in 2C und 2D dargestellt, wurden universelle Bindungssonden 28 und universelle Reporter 32 so gestaltet, dass sie mindestens einen Bereich von einem der konservierten Bereiche 26 (2A) des Gens überspannt. Wie ebenfalls in 2C und 2D dargestellt, wurden Sequenz-spezifische Bindungssonden 35 und Sequenz-spezifische Reporter 34 so gestaltet, dass sie mindestens einen Bereich des polymorphen Bereichs 24 überspannen (2A).
Wenn die universelle Bindungssonde 28 zum Binden von Nukleinsäuren verwendet wurde, wurde der Anfangsschritt der Hybridisierung zwischen einer Zielnukleinsäure und einer universellen Bindungssonde aus verschiedenen Gründen elektronisch durchgeführt. Erstens beschleunigt elektronisches Hybridisieren die Kinetik der Hybridisierung beträchtlich, was wichtig ist, wenn mit geringen Konzentrationen an Material, wie ein stark verdünntes Ziel oder Amplicon, gearbeitet wird. Zweitens bleiben Ziele und Amplicons wegen der extrem geringen Ionenstärke des verwendeten Puffersystems einzelstrangig, wodurch Bindung mittels Sonden erleichtert wird und viel geringere Konkurrenz von dem komplementären Strang des Ziels oder des Amplicons und folglich höherer spezifischer Nettobindung der Nukleinsäure an die Bindungssonde. Demzufolge gestattet elektronisches Hybridisieren einen viel höheren Pegel an an den Stellen der Bindungssonde hybridisierenden Nukleinsäuren, woraus eine höhere Nachweis- und Unterscheidungsempfindlichkeit resultiert.
In jedem Fall dieses Beispiels war die Reporter-Hybridisierung passiv, i.e. sie wurde bei erhöhten Salzkonzentrationen und erhöhten Temperaturen ohne die Unterstützung von Elektronik durchgeführt, obwohl Elektronik verwendet werden könnte. In diesem bestimmten Beispiel war nur ein geringer praktischer kinetischer Vorteil durch die Verwendung von elektronischen Hybridisierungsbedingungen zu erzielen, da die Konzentration der einzelstrangigen markierten Oligonukleotide so hoch war. Jedoch kann unter anderen Bedingungen die Verwendung von Elektronik während der Reporter-Hybridisierung von Vorteil sein.
Wie in 3A dargestellt, wurden Amplicons an die Bindungsstellen auf dem Mikrochip adressiert und mittels eines fluoreszierenden Reportermoleküls nachgewiesen (wie unten beschrieben). Die relative Fluoreszenz an den Bindungsstellen, an die die in 2A diskutierten Amplifizierungsprodukte von bakterieller 16S rRNA hybridisiert waren, war stark unterschiedlich (i.e. ein Polymorphismus-spezifischer Salmonella-Reporter, ein Polymorphismus-spezifischer Shigella-Reporter und ein Polymorphismus-spezifischer Campylobacter-Reporter). In diesen Experimenten wurden universelle Bindungssonden („S") zuerst an den Mikrochip adressiert, zusammen mit einer nicht-spezifischen Bindungssonde („NS") als Kontrolle. Amplicons von jeder für einen (Bakterien-)Stamm spezifischen SDA-Reaktion wurden dann an die jeweilige entsprechende Reihe adressiert und mit einer spezifischen Reportersonde passiv hybridisiert. 3A zeigt die Ergebnisse für einen Salmonella-spezifischen Reporter. Als Kontrolle für nicht-spezifisches Binden der Reportersonde an die Permeationsschicht wurde auch eine ohne-Binden/ohne-Ziel-Kontrolle durchgeführt (–C/–T). Wie dargestellt, erbrachte lediglich die an das Salmonella-Amplicon adressierten Bindungsstellen ein positives Signal. Wie in 3B dargestellt, wurden nicht nur hohe Unterscheidungsverhältnisse für Salmonella erzielt, wie in 3A gezeigt, sondern hohe Unterscheidungsverhältnisse wurden auch zwischen den verschiedenen anderen bakteriellen Zielen gesehen. (Daten der Fluoreszenzabbildung nicht dargestellt.)
Wenn Sequenz-spezifische Bindungssonden 35 zum Binden von Nukleinsäuren verwendet wurden, wurde der Anfangsschritt der Hybridisierung zwischen Ziel und Bindungssonde ebenfalls elektronisch durchgeführt. Wie in dem Beispiel universeller Bindung oben, wurde die Reporter-Sequenz so gestaltet, dass sie einen konservierten Bereich des 16s rRNA-Amplicons 26 erkannte. Wie in 3C dargestellt, stellte dieser Ansatz sogar höhere Unterscheidungsverhältnisse zwischen den richtigen Paarungen und den Fehlpaarungen bereit.
Beispiel B – Gleichzeitige Analyse multipler Zielnukleinsäuren
In einem zweiten Beispiel wurde Mehrfach-Ampliconanalyse auf dem elektronischen Mikroarray der vorliegenden Erfindung durchgeführt. In diesem Beispiel wurden Zielnukleinsäuren aus multiplen Patientenproben nacheinander an die Bindungsstellen adressiert, um die Anwesenheit des humanen Faktor V-Leiden (R506Q)-Gens (das eine Veranlagung zum Widerstand gegen aktiviertes Protein C und zur Venenthrombose anzeigt) nachzuweisen. In diesem Beispiel wurden Bindungssonden so gestaltet, dass sie spezifisch für Allele des R506Q-Gens sind, wobei ein Verfahren bereitgestellt wurde, Allel-spezifische SDA nachzuweisen.
Wie hierin erklärt, können multiple Proben analysiert werden, da jede Bindungsstelle auf der offenen Mikromatrix einzeln elektronisch kontrolliert werden kann. Im Anschluss an die Amplifizierung und das Positions-spezifische Adressieren der Amplifizierungsreaktion jeder Probe wurde die Matrix auf eine Weise mit Stellenspezifität auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit von adressierten Amplicons bewertet. Das Testsystem untersuchte die Anwesenheit oder die Abwesenheit der humanen Faktor V-Leiden-Mutation in mehreren Blutproben. Sieh X. Liu et al., 4 Mol. Pathol. 191–197 (1995). Die Leiden-Mutation ist eine einzelne Punktmutation an der Stelle der Protein C-Spaltung des Faktor V-Gens. Wenn diese Mutation eine homozygote Anwesenheit in einem Patient aufweist, führt sie zum Widerstand gegen aktiviertes Protein C und zu einer Veranlagung für tiefe Venenthrombose. Siehe z.B. R. Bertina et al., 369 Nature 64–67 (1994).
Zur Unterstützung der Unterscheidung wurde ein Allel-spezifischer SDA-Test entwickelt. Die Allel-spezifische SDA wurde so gestaltet, dass sie selektiv entweder das normale Faktor V-Leiden-Allel oder das Faktor V-Leiden-Allel der Mutante amplifiziert. Die SDA-Amplifizierungsprimer in der Antisense-Richtung wurden so gestaltet, dass ihre 3'- Enden komplementär zu entweder der normalen Nukleotidbase G oder der Nukleotidbase A der Leiden-Punktmutation ist, die in dem Sense-Strang von Exon 10 vorhanden ist. Tabelle I, unten, zeigt die für die Amplifizierung und die Mikromatrix-Analyse des Faktor V-Gens verwendeten Oligonukleotide. Der entsprechende Sense-Primer war in allen Reaktionen der gleiche. Jedoch wurde der Sense-Primer mittels Einbau einer Biotineinheit an seinem 5'-Ende modifiziert, so dass ein einfacher Mechanismus zum Binden jeglicher Amplicons auf der Matrix im Anschluss an das elektronische Adressieren bereitgestellt wird. Tabelle I

Fußnote 1: Beim Amplifizieren der Primer werden BsoBI-Erkennungsstellen in Fettdruck dargestellt, genomisch homologe Bereiche sind unterstrichen und Faktor V-Allel-spezifische 3'-Enden sind in kursivem Fettdruck dargestellt. Die Bezeichnung „bio" bezeichnet eine Biotin-Verbindung und „btr" bezeichnet eine fluoreszierende BODIPY-Texas Rot-Verbindung. FVR stellt den Reporter für Faktor V dar, FVAs bezeichnet den Sense-Strang für die Amplifizierung, während FVAwt und FVAm die Amplifizierungsprimer für den Wildtyp bzw. die Mutante bezeichnet. FVBs und FVBa bezeichnen die Sense-Bumper-Primer und die Antisense-Bumper-Primer für Faktor V.
Fußnote 2: Die bakterielle 16S-Sequenz wurde erhalten von GenBank, die Sequenz des humanen Faktor V bezieht sich auf die GenBank-Zugriffsnummer L32764.

In dieser Mehrfach-Studie des Faktor V-Gens wurden Kopien von vier klinischen DNA-Proben analysiert, ohne vorherige Kenntnis des Status der Faktor V-Leiden-Mutation des Patienten. Zwei Allel-spezifische SDA-Reaktionen wurden zur Untersuchung des jeweiligen Genotyps des Patienten pro Probe durchgeführt (die entweder normale Primer oder Mutanten-Primer enthielt). Die Amplifizierungen wurden gleichzeitig durchgeführt. Die Ergebnisse der PAGE von fünf dieser paarweisen Reaktionen sind in 4A dargestellt, wobei gezeigt wurde, dass die Allel-spezifischen Amplifizierungsreaktionen unter diesen Bedingungen hoch spezifisch sind. Das heißt, die selektive Abwesenheit sichtbarer Mutanten-Amplicons oder Amplicons normalen Typs weist darauf hin, dass die Amplifizierungsreaktion empfindlich auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit der Faktor V-Leiden-Mutation dieser Individuen ist.
Alle Amplicon-Reaktionen wurden einheitlich behandelt und nacheinander an spezifische Positionen auf der Mikromatrix adressiert, ungeachtet der Anwesenheit oder der Abwesenheit amplifizierten Materials, wie mittels Gelanalyse ermittelt. Repräsentative Ergebnisse aus drei DNA-Patientenproben sind in 4B dargestellt. Diese Proben wurden in Kopie adressiert. Die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Fluoreszenzsignals von einem hybridisierten Reporter-Oligonukleotid, das zu einem konservierten Bereich auf dem Zielamplicon komplementär ist (i.e. eine „universelle" Reportersonde), weist auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit von Faktor V-Amplicons hin. Wie erkennbar ist, korreliert das Fluoreszenzsignal gut mit den Ergebnissen des Gels, die in 4A dargestellt sind.
Wie in 4A dargestellt, waren positive Signale mehrfach größer als Hintergrundsignale. Im Allgemeinen war das echte Mutantensignal niedriger als das der Wildtyp-Amplicons (wie in 4B dargestellt). Die Stellen wurden einfach bewertet, indem die Kriterien für ein positives Signal als mindestens zweifach über der an nicht-adressierten Bindungsstellen vorhandenen Hintergrundfluoreszenz gesetzt wurden. Wie unten in Tabelle II gezeigt, lag vollständige Korrelation zwischen der Anwesenheit von amplifiziertem Material in der Gelanalyse und der Anwesenheit starker oder mittlerer Fluoreszenzsignale auf dem Array vor.
Die Stärke des Fluoreszenzsignals gab annähernd die sichtbare Menge an amplifiziertem Material wieder. Dies war besonders auffallend in den Proben mit einer scheinbar weniger effizienten Amplifizierungsreaktion, wie sie mit der DNA aus Patient 961a in 4A und 4B sichtbar war. Kurzum, diese Ergebnisse zeigen, dass Analyse multipler Proben mittels serieller Anwendung von Proben gefolgt von Nachweis mit einzelnen Reportern unter Verwendung eines mikroelektronischen Arrays funktioniert und zeigt, dass dieses Verfahren dazu dienen kann, andere Analyseformen in den gleichen oder ähnlichen Analysen zu ergänzen oder zu ersetzen, z.B. die Gelelektrophorese.
Da diese Proben ohne Kenntnis ihres Mutationsstatus analysiert wurden, war es von Interesse herauszufinden, ob die scheinbare Allelspezifität der Amplifizierungsreaktion tatsächlich mit dem klinischen Status übereinstimmte. Wie unten in Tabelle II gezeigt, stimmte die Selektivität der Allel-spezifischen Amplifizierungsreaktion vollständig mit dem Status der Faktor V-Leiden-Mutation der jeweiligen Probe überein, wie mittels PCR und MnII-Restriktionsstellen-Analyse festgestellt wurde. (R. Press, unveröffentlichte Beobachtungen). Folglich stellt die Analyse der Bildung von Ampliconprodukten auf einem elektronisch adressierbaren Array, kombiniert mit Allel-spezifischer SDA ein nützliches Verfahren zum Nachweis genetischer Punktmutationen in multiplen Patientenproben dar. Tabelle II

Fußnote 1: „X" bedeutet positiv, „O" bedeutet negativ.
Fußnote 2: Der Genotyp wurde mittels PCR-RFLP mit Restriktionsenzym Mln-1 mittels dem Fachmann bekannten Verfahren ermittelt.

Experimentelles Protokoll, das für oben beschriebene Daten verwendet wurde
Materialien – Desoxynukleosid 5'-Triphosphate (sGTP, dATP, TTP) wurden bezogen von Pharmacia, Alameda, California. 2'Desoxycytosin 5'-O-(1-Thiophosphat) (dCTPαS), BsoBI-Restriktions-Endonuklease und Bst-Polymerase wurden geliefert von Becton Dickinson, Sparks, Maryland. Oligonukleotide wurden synthetisiert von Oligos, Etc., Wilsonville, Oregon.
SDA-Amplifizierung – In den Amplifizierungsreaktionen wurde entweder 1 μg genomischer DNA (16S) oder 0,1 μg genomischer DNA (Faktor V) in einem Volumen von 30 μL verwendet. Amplifizierungsbedingungen und Konzentrationen wurden angepasst, ausgehend von den vorher veröffentlichten (siehe C. Spargo et al., 10 Molecular and Cellular Probes 247–256 (1996)), mit den folgenden Änderungen: Die an 5'→3'-Exonukleaseaktivität arme Polymerase Bst ersetzte die exo-BCA-Polymerase, wie veröffentlicht und verwendet in M. A. Milla et al., Biotechniques v24, p392–396, März 1998, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Für 16S-Amplifizierung wurden 25 U/Reaktion (Bst) und 60 U/Reaktion (BsoBI) verwendet. Die für die Amplifizierungsreaktion verwendeten Oligonukleotide sind oben in Tabelle I gezeigt. Die Ansätze ließ man für 30 Minuten bei 60°C reagieren, wurden dann mittels Zugabe von 10 μL einer 100 mM EDTA-Lösung gestoppt und anschließend bei –20°C aufbewahrt.
Gel-Elektrophorese – Die Amplifizierungsreaktionen wurden unter Verwendung von Standardprotokollen mit entweder 1%igem Agarose-Gel oder mit 6%igen Polyacrylamid-Minigelen (Novex, San Diego, California) analysiert, gefolgt von Ethidiumbromid-Färbung. Bilder wurden mit Hilfe eines AlphaInotech Chemimager (San Leandro, California) gemacht.
Elektronische Mikroarray-Analyse – Die mikroelektronische Arrayanordnung wurde vorher beschrieben. Siehe R. Sosnowski et al., 94 J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119–123 (1997). Für das elektronische Adressieren von Bindungs-Oligonukleotiden (Biotin-GGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTC, Genbank locus 988–1014 bp (SEQ ID Nr. 15) und die Hybridisierung von Amplicons (16S) oder Reporter-Oligonukleotiden (Faktor V) wurden Bedingungen verwendet, die anderswo beschrieben sind. Siehe R. Sosnowski, wie oben und C. Edman et al., 25 J. Nucleic Acids Res. 4907–4914 (1997). Kurz gefasst wurden die unfertigen Amplifizierungsreaktionen entweder für zwei Minuten durch G6-Säulen geschleudert (Biorad, Hercules, California), die mit destilliertem Wasser vorher äquilibriert worden waren oder in Multiwell-Platten (Millipore, Bedford, Massachusetts) für mehr als oder annähernd 5 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert wurden. Die vorbereiteten Proben wurden dann in einem 1:1-Verhältnis mit 100 mM Histidin gemischt und für fünf Minuten auf 95°C erhitzt, bevor sie elektronisch adressiert wurden. Zur Analyse von 16S-Amplicons wurde das elektronische Hybridisieren der Amplicons durchgeführt, gefolgt von Hybridisierung in 6 × SSC eines Fluoreszenz-markierten Oligonukleotid-Reporters, der zu einer spezifischen bakteriellen Sequenz komplementär ist. Spezifische Nukleotidsequenzen sind oben in Tabelle I gezeigt. Passive Hybridisierung ließ man für 30 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Die Mikrochips wurden 5- bis 8-mal gewaschen unter Verwendung von 0,1 × STE/1% SDS, gefolgt von 1 × STE. Ähnliche Bedingungen wurden für das oben genannte Einzelziel-Experiment verwendet, wobei die für bakterielle 16S-rRna Sequenz-spezifischen Biotin-Bindungsstellen und ein allgemeiner Btr-markierter Reporter für den Nachweis verwendet wurden. Zur Analyse der Faktor V-Amplicons wurde ein Fluoreszenz-markiertes Oligonukleotid (Btr-CTGTATTCCTCGCCTGTC, SEQ ID Nr. 10) wurde zu 6 × SSC hinzugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur hybridisieren gelassen. Die Matrix wurde dann in 0,1 × STE/1% SDS, gefolgt von 1 × STE gewaschen.
BEISPIEL 2
Hinsichtlich des Aspektes der elektronischen Amplifizierung der vorliegenden Erfindung wird eine Zielnukleinsäure elektronisch in der Nähe verankerter Primer aufkonzentriert, die auf einer Bindungsstelle positioniert sind und in einem SDA-Verfahren oder einem anderen Amplifizierungsverfahren verwendet werden. Die Zielnukleinsäure kann elektronisch aufkonzentriert werden und an Bindungsmoleküle (z.B. Bindungssonden) auf der Oberfläche der Bindungsstellen des Mikrochips hybridisiert werden, bevor die Reaktionsbestandteile der SDA (i.e. Enzyme, Nukleotide etc.) hinzugefügt werden, wobei die Effizienz erhöht wird und die für die Hybridisierung der Zielnukleinsäure an die verankerten Bindungsprimer auf den Bindungsstellen notwendige Zeit verkürzt wird. Hybridisieren der Zielnukleinsäure an spezifische Positionen auf dem Mikroarray vor der Zugabe der SDA-Reaktionsbestandteile erlaubt auch, die Arrayoberfläche zu waschen, so dass unerwünschte und möglicherweise störende Nicht-Zielnukleinsäuren aus der Reaktionsumgebung entfernt werden. Folglich können Amplifizierungsreaktionen, wie die verankerte SDA, stark von der Verwendung eines elektronisch adressierbaren Mikromatrix-Systems profitieren.
Die Bestandteile der Amplifizierungsreaktion selber (ohne Template und Amplifizierungsprimer) werden hinzugefügt und der Amplifizierungsansatz wird reagieren gelassen. Es gibt mindestens drei Vorteile der Verwendung des elektronischen Adressierens von Template-Molekülen. Der erste ist, dass die Gesamtzeit und die Effizienz des Amplifizierungsvorgangs dramatisch verbessert wird, da ein hauptsächlich Zeit-begrenzender Schritt (der der für das Template notwendigen Zeit, die verankerten Primer zu finden) aus der gesamten Reaktionszeit entfernt wird. Ebenso erhöht die Verwendung des elektronischen Aufkonzentrierens und der elektronischen Hybridisierung die Zahl der Zielmoleküle an der gewählten Stelle im Vergleich mit nicht-elektronischer, passiver Hybridisierung für eine äquivalente Zeitdauer, wobei die absolute Zahl an Starter-Template-Molekülen für die Amplifizierung erhöht wird, was in einer Verbesserung sowohl der Gesamtausbeute des Amplifizierungsvorgangs als auch der Sensitivität des Systems auf eine kleinere Anzahl von Starter-Templates resultiert.
Der zweite Vorteil ist, dass diskrete Proben an Zielnukleinsäuren an spezifischen Positionen auf der Matrixoberfläche angewendet werden können, wobei multiple und verschiedene Nukleinsäuren gleichzeitig auf einer Matrix amplifiziert werden können. Alternativ dazu kann eine Nukleinsäure an mehrere verschiedene Positionen adressiert werden, von denen jede spezifische Sätze an Amplifizierungsprimern enthält, so dass multiple verschiedene Amplifizierungsreaktionen gleichzeitig von einer einzelnen Probe durchgeführt werden können. Wie oben beschrieben, unterstützt die Möglichkeit, unnötige oder unhybridisierte Nukleinsäuren aus der Reaktionsmischung zu entfernen, wesentlich diesen Vorgang.
Ein dritter Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Anschluss an die Amplifizierungsreaktion die gebundenen Amplicons auf eine Stellen-spezifische Weise für anschließende Analysen verfügbar sind, entweder mittels Zugabe von fluoreszierend markierten Nukleotiden oder mittels Einbau von markierten Oligonukleotiden während des Verlaufs der Amplifizierungsreaktion oder mittels Hybridisierung mit einem geeigneten Reporter-Oligonukleotid am Ende der Reaktion mittels Denaturierung der Amplicons, die an die Bindungsstellen gebunden sind.
In einem Beispiel dieser das elektronische Adressieren betreffenden Ausführungsform wurde ein experimentelles Protokoll gestaltet, die Sensitivität der verankerten Faktor V-SDA zu verstärken, indem die elektronische Hybridisierung von Faktor V-kodierenden Template-Nukleinsäure an verankerte SDA-Primer (SEQ ID Nr. 20 und Nr. 21) auf einem Mikrochip-Array verwendet wird. Die SDA-Primer waren an ihren jeweiligen 5'-Enden biotinyliert. Diese Primer enthielten auch eine Spaltstelle für BsoBI-Enzym. Die Reaktionsmischung enthielt die Bumper-Primer (SEQ ID Nr. 22 und Nr. 23) für SDA. Das Mikrochip-Array wurde vorbereitet, indem die Streptavidin-Agarose-Schicht von den äußeren Elektroden des Mikrochips abgekratzt wurde. Die Kanten des Chips wurden mit Rain-X wasserfest gemacht und die Oberfläche wurde mit einem Applikator für Baumwolltupfer sauberpoliert. Die Matrix wurde mit Milli-Q-Wasser für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Lösungen wurden für das elektronische Adressieren auf dem Mikrochip vorbereitet. SDA-Primer in 1 μM in 50 mM Histidinpuffer, 1 μM biotinylierte T12-Btr-Oligonukleotid in 50 mM Histidinpuffer und 50 mM Histidin-Waschpuffer wurde vorbereitet. Die Mikrochips wurden mit 50 mM Histidinpuffer gewaschen und biotinylierte T12-Btr-Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines Standard-A/C-Protokolls (800 nA für 25 Sekunden) zur Kontrolle des Qualität der Streptavidin-Mikrochips an ausgewählte Bindungsstellen adressiert. Die SDA-Primer wurden wie dargestellt unter Verwendung des Standard-A/C-Protokolls an ausgewählte Bindungsstellen adressiert.
Für die Experimente mit elektronischer Hybridisierung (im Gegensatz zur passiven Hybridisierung) wurden doppelstrangige PCR-Nukleinsäure-Templates erst bei 95°C denaturiert und ein gleiches Volumen an 100 mM Histidinpuffer wurde zu dem Template hinzugefügt. Die Template-Mischung wurde dann unter Verwendung eines Standard-A/C-Protokolls für Hybridisierung (1,6 μA, 60 Sekunden) elektronisch an die Bindungs-SDA-Primer hybridisiert.
Für die Experimente mit passiver Hybridisierung wurden asymmetrische PCR-Nukleinsäure-Templates erst bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Die Lösung wurde dann mit einer 20 × SSC-Vorratslösung (3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat) auf eine 4 × SSC-Konzentration gebracht und 20 μL der Mischung wurde auf einen Mikrochip (der vorher mit SDA-Primern elektronisch adressiert wurde) pipettiert und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Mikrochip-Matrizen 2× mit Wasser gewaschen und mit 1 mg/mL BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so dass irgendwelche nicht-spezifischen Bindungsstellen blockiert waren. Die Mikrochips wurden nochmals mit Wasser gewaschen (2×) und bei 60°C für 5 Minuten vorgewärmt. Alle SDA-Lösungen wurden ebenfalls bei 60°C für 5 Minuten vorgewärmt. Nach dem Vorwärmen wurde das Wasser von den Mikrochips entfernt und mit 10 μL SDA-Reaktionsmischung (40 mM K₂HPO₄ pH 7,6, jeweils 1,6 mM dCTPαS, dTTP, dATP und dGTP, 8,3 mM MgCl₂, 1,3 Units BsoBI und 0,5 Units Bst-Polymerase) für 30 Minuten bei 60°C in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt, indem der Überstand von der Mikrochip-Oberfläche entfernt wurde und in ein Eppendorf-Röhrchen, das 2 μL einer 100 mM EDTA-Lösung enthielt, überführt wurde.
Nach der SDA-Reaktion wurden die Mikrochips 3× mit 0,5 × SSC, pH 7,2 gewaschen. Die SDA-Produkte wurden dann auf dem Mikrochip in situ denaturiert mittels Zugabe von 0,5 × SSC, pH 12,0 für 4 Minuten, wobei der Mikrochip nach jeder Minute mit zusätzlichem Puffer gewaschen wurde. Die Mikrochips wurden dann mindestens dreimal mit 0,5 × SSC, pH 7,2 gewaschen, dann mindestens dreimal mit 4 × SSC, pH 7,2. Die Mikrochips wurden mit einer 1 μM Mischung von Btr-markierten Reporter-Oligonukleotiden (wie SEQ ID Nr. 24 oder Nr. 44) in 4 × SSC für 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, extensiv mit 4 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen, dann abgebildet.
Für die passive Hybridisierung des Faktor V-Templates auf Mikrochips, die mit Faktor V-SDA-Primern an verschiedenen Stellen adressiert sind, wurden die Mikrochips mit 1 μM von entweder Faktor V-SDA-Primern oder, als Negativkontrolle für die SDA-Reaktion, Faktor V-SDA-Primern, denen eine BsoBI-Stelle fehlte, adressiert. Da der negativen Kontrolle eine BsoBI-Stelle fehlt, kann die Reaktion lediglich aus einer Primerverlängerung nach Binden eines Templates bestehen, jedoch nicht aus SDA-Amplifizierung. Diese Reaktion kontrolliert sowohl die Anwesenheit von nicht-spezifischem Binden, als auch die Herstellung von nicht-spezifischen Amplifizierungsprodukten, mit denen die Reporter-Oligonukleotide reagieren können. Eine Kontrolle ohne Template war ebenfalls vorhanden. Diese Mikrochips wurden dann fluoroskopisch auf Faktor V-Amplicons analysiert, die die fluoroskopisch markierten Btr-Reporter-Oligonukleotide aufweisen. SDA-Produkte wurden lediglich in dem Mikrochip gesehen, bei dem das SDA-Template passiv über Nacht hybridisiert wurde (6C). Keine Produkte wurden gesehen in dem Kontroll-Mikrochip ohne Template (6A) oder in dem Mikrochip (6B), bei dem BsoBI nicht in die Reaktion eingeschlossen war (eine weitere Negativ-Kontrolle für die SDA-Reaktion). In dem Mikrochip, der passiv hybridisiert war (6C), wurden die SDA-Produkte nur in dem Bereich gesehen, in dem die SDA-Primer adressiert waren, nicht in dem Quadranten des Arrays, in dem der nicht-spaltbare SDA-Primer verwendet wurde, was wiederum bestätigt, dass das nachgewiesene Produkt spezifisch ist und mittels eines auf SDA basierenden Vorgangs getrieben wird. Der Nachteil dieses Tests ist, dass die Bilder, die nach der SDA-Reaktion gesehen wurden, sehr schwach waren, wobei sie MFI-Werte (Mean Fluorescence Image, Mittlere Fluoreszenzausbeute) von 14 bei einer Integrationszeit von 1 s für unverdünnte Templatepegel aufwiesen (7).
Für die elektronische Hybridisierung von Faktor V-Template an verankerte SDA-Primer auf einem Mikrochip wurden die Experimente in einer gleichen Weise durchgeführt wie für die passive Hybridisierung, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierung des Templates mittels elektronischen Adressierens erleichtert wurde. Zusätzlich wurde das Template einer Verdünnungsreihe unterzogen. Als eine Kontrolle wurde passive Hybridisierung des Faktor V-Templates durchgeführt und führte zu einer sehr schwachen Zunahme (etwa 1 MFI-Einheit) über dem Hintergrundsignal in der SDA-Reaktion. Wiederum war kein Signal in dem Quadranten des nicht-spaltbaren Primer zu sehen, was auf die Notwendigkeit von SDA-geführter Amplifizierung in diesem System hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte der Mikrochip, der elektronisch hybridisiert wurde, ein Signal in dem Quadranten mit SDA-Primer (8) und zeigte ein signifikantes Signal in allen getesteten Verdünnungen (9). Sogar bei einer Verdünnung von 1:100 der Faktor V-Templates war das Signal immer noch sehr stark, bei etwa 19,4 MFI/s. Mit der Voraussetzung, dass das MFI-Signal bei einer Verdünnung von 1:100 des elektronisch adressierbaren Mikrochips 19,4-mal höher war als das Signal von einem passiv hybridisierten Chip in diesem Experiment (und 1,4-mal höher als in dem Experiment mit passiver Hybridisierung, wie oben, als das Template nicht verdünnt war), erhöhte sich die Effizienz des SDA-Tests um etwa 140 bis 1940 Prozent unter der Verwendung eines Protokolls mit elektronischer Hybridisierung. Dies zeigt, dass elektronisches Hybridisieren des Templates an auf dem Mikrochip verankerte SDA-Primer die Sensitivität des Tests ungefähr 1000-fach erhöht. Zusätzlich wurde die Zeit, die zur Durchführung des gesamten SDA-Experiments erforderlich war, um einen gesamten Arbeitstag gesenkt (im Vergleich zur passiven Hybridisierung, in der das Template zum Erreichen effizienter Bindungspegel über Nacht inkubiert werden musste).
In einem weiteren Beispiel zeigen wir, dass elektronisches Adressieren von Zielmolekülen an Bindungsstellen die Amplifizierung von DNA- oder RNA-Zielnukleinsäuren unter Verwendung der als Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifizierung (NASBA) bekannten Technik erleichtert. In diesem Verfahren werden drei verschiedene enzymatische Aktivitäten auf koordinierte Weise mit einem isothermen Amplifizierungsverfahren genutzt. In diesem elektronisch vermittelten Vorgang ist die gleichzeitige Amplifizierung oder Mehrfach-Amplifizierung verschiedener Sequenzen möglich, entweder mittels Stellen-spezifischen Adressierens und Amplifizierung oder mittels Verwendung von Sätzen multipler Primer. Ferner kann NASBA, wie es in der Erfindung angewendet wird, entweder verankerte oder in Lösung vorliegende Primer in der Amplifizierungsreaktion verwenden. In jedem Falle ist die Reaktion bei Verwendung elektronischen Adressierens des Ziels an seine jeweiligen Amplifizierungsprimer verstärkt.
In diesem Beispiel wurden Ziel-Nukleinsäuresequenzen erst elektronisch an verschiedene Positionen auf einem Mikrochip hybridisiert. Unerwünschte oder nicht-spezifisch bindende Nukleinsäuren wurden entweder mittels elektronischen Waschens oder mittels passiven (nicht-elektronischen) Waschens oder mittels einer Kombination dieser zwei entfernt. Im Anschluss an den Waschschritt wurde die Hybridisierungslösung durch einen Puffercocktail ersetzt, der Amplifizierungsprimer, Nukleotide, Magnesiumchlorid und die für die Amplifizierung notwendigen Enzyme oder enzymatischen Aktivitäten aufweist. (Diese enzymatischen Aktivitäten sind: Reverse Transkriptase-Aktivität, RNase H-Aktivität und RNA-Polymerase-Aktivität. Die Aktivitäten dieser Enzyme dienen koordiniert dazu, die isolierten Sequenzen auf eine der NASBA ähnlichen Weise zu amplifizieren.) Wenn die Amplifizierungszyklen einmal abgeschlossen waren, wurde das amplifizierte Material elektronisch isoliert oder gebunden und dann quantifiziert (i.e. nachgewiesen) mittels verschiedener Verfahren gemäß dem Stand der Technik. Im Allgemeinen kann ein derartiger Nachweis zum Beispiel unter Verwendung eines Bindungsoligonukleotids durchgeführt werden, das spezifisch für den neu synthetisierten Bereich ist, oder eines Fluoreszenz-markierten Oligonukleotids in einem „Sandwich-Test".
Jede Phase dieses Vorgangs ist im Vergleich zu bestehender Technologie erhöht. Zum Beispiel erlaubt das elektronische Adressieren der Zielsequenz, gefolgt von ihrer spezifischen Hybridisierung unter Verwendung von geeigneten Bindungsoligonukleotiden (z.B. den Primern für die Amplifizierung), die elektronische Entfernung von unerwünschter oder kontaminierender DNA oder RNA. Das Entfernen unspezifischer Nukleotide, die unspezifisches Binden und Amplifizieren verursachen kann, gestattet sowohl eine höhere Komplexität der Amplifizierungsvorgänge, die gleichzeitig auftreten, als auch spezifischere Amplifizierung. Zusätzlich können, wenn alle Primer für die Amplifizierung verankert sind, die verschiedene Zielsequenzen verwendenden Amplifizierungsvorgänge gleichzeitig an verschiedenen Positionen auf dem Chip oder der Vorrichtung auftreten, i.e. Mehrfach-Reaktionen. Die Enzyme selber können auch adressiert werden, was eine größere Präzision in der Vermittlung der Amplifizierungsvorgänge oder -stadien gestattet. Schließlich können die Produkte der Amplifizierungsreaktion ebenso an alternative Stellen adressiert werden und quantifiziert werden, was es ermöglicht, den Fortgang der Amplifizierungsreaktion zu verfolgen.
In einem repräsentativen, aber nicht einschränkenden Experiment wurde die NASBA-Amplifizierung eines HTLV 1-Plasmids in Lösung unter Verwendung von drei verschiedenen Konzentrationen des Template-Plasmids (etwa 1 ng, 1 pg und 1 fg) durchgeführt. Die Reaktion verwendete ein anfängliches Schmelzen des DNA-Templates bei 95°C, gefolgt von einem isothermen Anlagerungsschritt von 15 Minuten bei 50°C. Die Anlagerungsreaktion bestand aus 8 μL einer 2,5 × NASBA-Mischung (100 μL einer 25 mM NTP-Mischung, Pharmacia Los Nr. 60920250111; 50 μL einer 25 mM dNTP-Mischung, Pharmacia Los Nr. 6092035011; 50 μL 1 M Tris, pH 8,5; 31,25 μL 2 M KCl; 15 μL 1 M MgCl2; und 253,75 μL steriles H₂O), 1 μL einer 5 μM Konzentration eines Oligonuklotid-Primer (Nr. 885; 5'-AATTCTAA TACGACTCAC TATAGGGAGA GGTGATCTGA TGTCTGGAC AGG-3' (SEQ ID Nr. 16); und 1 μL von einer der drei Verdünnungen des HTLV 1-Plasmids (oder keines) in vier verschiedenen Röhrchen, so dass 1 ng, 1 pg, 1 fg oder 0 Endkonzentrationen erreicht werden. Enzyme, die den Denaturierungsschritt bei 95°C nicht überstehen würden, wurden zu Beginn des Amplifizierungsschritts zugegeben. Folglich wurden 1 μL von 100 mM DTT (Dithiothreitol) und dann 0,5 μL AMVRT (AMV Reverse Transkriptase von Boehringer Mannheim (Kat. Nr. 1495 062; Los Nr. 83724624-76) wurden bei dem 50°C-Schritt zugegeben. Die Reaktion wurde beendet mittels Aufheizens auf 95°C für 5 Minuten. Die Röhrchen wurden auf Eis gelegt.
Im Anschluss an die Anlagerungsreaktion wurde eine Amplifizierungsreaktion angesetzt, ebenso in vier Röhrchen, bestehend aus 10 μL 2,5 × NASBA-Mischung; 1 μL 250 mM DTT; 0,3 μL RNase H (Ribonuklease H von Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 786 349; Los Nr. 13656445-05); 2,5 μL Enzymmischung (20 u T7-Polymerase von Boehringer Mannheim, Los Nr. 83495822-31); 8 u AMVRT; 0,2 u RNase H; und 2,5 μg RNase- und DNase-freies BSA (Bovines Serum Albumin) von Pharmacia Nr. 6078914011); 6 μL Primermischung (5 μL 5 μM Primer Nr. 885; 5 μL 5 μM Primer Nr. 882: ACTTCCCAGGGTTTGGACAGAGT (SEQ ID Nr. 17); 18,75 μL 100% DMSO; und 1,25 μL H₂O); und 2 μL der geprimten DNA aus den vier Röhrchen der Anlagerungsreaktion, die jeweils in ein separates Röhrchen gefüllt wurde. Die Reaktion wurde für 60 Minuten bei 40°C inkubiert, dann auf Eis gestellt. Die Reaktionen (10 μL) wurden dann auf einem 2%igen Agarose-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt.
Die höchste Konzentration an Starter-Templateplasmid liefert die größte Menge an Produkt, während die zwei niedrigeren Konzentrationen wenig oder kein Produkt lieferten (10a). Das Produkt der 1 ng-Reaktion (das helle Band auf dem Gel) wurde aus dem Gel ausgeschnitten und dann entweder 200-fach, 500-fach oder 1000-fach in 50 mM Histidin verdünnt. Das Reaktionsprodukt der Reaktion mit 1 pg Template wurde zum Vergleich ebenfalls 200-fach verdünnt. Diese Verdünnungen der Reaktionsprodukte wurden dann elektronisch an Bindungsstellen auf einer Mikromatrix adressiert, die entweder spezifische (500 μM XL5R.bio, 5'-TTCTTTTCGGATACCCAGTCTACGTGTTTG-3' (SEQ ID Nr. 18)) oder unspezifische (ATA5.bio) vor-adressierte Bindungs-Antikörper enthielten, unter Verwendung von 500 μA konstantem Strom für 1 Minute, Wechseln des Puffers und Adressieren der nächsten Bindungsstelle ohne zu waschen. Nach dem Adressieren der Reaktionsprodukte wurden die Bindungsstellen 5× mit Histidin (50 mM) gewaschen und die Fluoreszenzausbeute an jeder Position bewertet (10b) unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten Reporter-Oligonukleotids (HTVPXs.313TR; (NH₂)-ACTTCCCAGGGTTTGGACAGAGT-3' (SEQ ID Nr. 19) 15 μL), der passiv für 15 Minuten bei 25°C hinzugefügt wurde. Nach 3 Waschungen in 1 mL 0,2 × STE/1% SDS und 5 zusätzlichen Minuten in STE/SDS wurden die Bindungsstellen gespült und ein 2 Sekunden-Bild aufgenommen. Danach wurde der Puffer nach Histidin gewechselt und die Bindungsstellen wurden nach Bahnen getrennt bei 200 μA/Kissen für 1 Minute, gewaschen und ein 2-Sekunden-Bild aufgenommen. Die Ergebnisse des elektronischen Sandwich-Tests der amplifizierten Reaktion glichen die relative Menge an eingebrachtem amplifiziertem Produkt aus, wie in 10b dargestellt.
BEISPIEL 3
In wiederum einem anderen Beispiel wird verankerte SDA ausgeführt, vorzugsweise unter Verwendung von elektronischem Adressieren der Zielnukleinsäure an die spezifische Stelle und vorzugsweise aufweisend nicht-spaltbare Oligonukleotide an spezifischen Stellen auf der Matrix in Kombination mit einem größeren Verhältnis an normalen SDA-Primern (i.e. die nicht-spaltbaren Primer enthalten nicht die erforderliche Stelle für Restriktionsendonuklease, die für SDA notwendig ist, aber sie sind in anderen Aspekten identisch zu SDA-Primern). Verankerte SDA wird dann ausgeführt unter Verwendung von elektronischem Adressieren der Zielnukleinsäuren an die spezifische Stelle, gefolgt von Amplifizierung und Reporter-Hybridisierung. Das optimale Verhältnis von nicht-spaltbaren Primern zu normalen Primern wird empirisch bestimmt und basiert auf dem von Reportermarkierungen erhaltenen Signal. Alternativ dazu können andere Stellen und/oder Funktionalitäten über diese nicht-amplifizierenden Primer eingeführt werden zum Zwecke der nachfolgenden Spaltung und Analyse oder anderen Manipulationen. Die Hauptkriterien dieser nicht-spaltbaren Primer ist, dass das 3'-Ende genügend Homologenität zu der Zielnukleinsäure oder amplifizierten Produkten davon aufweist, so dass er hybridisieren und als die Basis für die Primerverlängerung mittels Polymerase dienen kann.
In einem spezifischen Experiment für dieses Beispiel wurden verschiedene Anteile von Standard-Primern für die Faktor V-Amplifizierung mit Primern gemischt, die keine BsoBI-Stelle mehr aufwiesen. Diese Mischungen wurden an verschiedene Positionen auf der Matrix adressiert und verdünnte Faktor V-PCR-Amplicons wurden an die jeweiligen Positionen adressiert. Die gesamte Matrix wurde dann gewaschen und eine Mischung, die die Reaktionskomponenten für die SDA-Amplifizierung (außer den Amplifizierungsprimern) enthielten, wurde hinzugefügt. Die Amplifizierungsreaktion wurde für 30 Minuten bei 60°C fortschreiten gelassen, dann, im Anschluss an Denaturierung, wurden mit Bodipy-Texas-Rot markierte Reportersonden hinzugefügt und hybridisiert. Die an jeder Stelle vorhandene Fluoreszenz wurde dann quantifiziert.
Das experimentelle Protokoll, dem in diesem Experiment gefolgt wurde, war wie folgt. Erst wurden Mikrochips für das elektronische Adressieren und Hybridisierung vorbereitet, indem alle Agarose von den äußeren Elektroden abgekratzt wurde und jede Mikrochip-Oberfläche mit Rain-X behandelt wurde. Die Chips wurden dreimal mit Wasser gewaschen und in Wasser für mindestens etwa 30 Minuten stehen gelassen. Dann wurden Faktor V-SDA-Primer (i.e. SEQ ID Nr. 20 und Nr. 21) und nicht-spaltbare (NC-) Primer (i.e. SEQ ID Nr. 42 und Nr. 43) auf 2 μM Gesamtkonzentration verdünnt (von 0–100% nicht-spaltbare Primer gemischt mit SDA-Primern, siehe unten, Tabelle III) und gleiche Volumina an 100 mM Histidin wurden hinzugefügt, so dass eine 1 μM Primerlösung in 50 mM Histidinpuffer entstand. Als nächstes wurden 10 nM Btr-T12 und 1 μM ATA-5-Oligonukleotide als Kontrollen in 50 mM Histidin vorbereitet. Faktor V-Template-DNA wurde dann auf eine angemessene Konzentration verdünnt und bei 95,5°C für etwa 5 Minuten inkubiert. Ein gleiches Volumen von 100 mM Histidin wurde zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 50 mM Histidinpuffer entstand.
Tabelle III
Die Mischung aus SDA-/nicht-spaltbaren Primern wurde dann, ebenso wie die Kontrollen, elektronisch adressiert und ein Ziel wurde an jede Mikrochip-Matrix hybridisiert. Ein Bild wurde aufgenommen und die Mikrochips wurden dreimal mit Wasser gewaschen und mit 1 mg/mL BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrochips wurden dann zweimal mit Wasser gewaschen und bei 60°C für 5 Minuten in einer Feuchtkammer (i.e. einer Petrischale mit angefeuchtetem Whatman 3 MM Papier) vorinkubiert.
Eine SDA-Mischung aus 40 mM K₂HPO₄, 1,6 mM dCTPαS, 1,6 mM dTTP, 1,6 mM dCTP und 1,6 mM dGTP, 8,3 mM MgCl₂, 1,3 Einheiten BsoBI-Enzym und 0,5 Einheiten Bst-Polymerase wurde bei 60°C für 5 Minuten vorinkubiert. Wasser wurde von den Mikrochips entfernt und 10 μL der vorgewärmten SDA-Mischung wurde zu jedem Mikrochip hinzugefügt, ohne die Mikrochips abkühlen zu lassen. Die Mikrochips wurden dann bei 60°C für 30 Minuten inkubiert. Die SDA-Reaktion wurde dann gestoppt, indem die Lösung von jedem Mikrochip entfernt wurde und sie in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen wurde, das 2 μL 100 mM EDTA enthielt. Der Überstand wurde dann auf nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen analysiert.
Die Mikrochips wurden mit 0,5 × SSC-Lösung mindestens dreimal gewaschen, wobei die SSC-Lösung 75 mM NaCl aufweist und 7,5 mM NaCitrat, pH 7,2. Als nächstes wurden die Mikrochips in 0,5 × SSC-Lösung, pH 12, für 4 Minuten inkubiert, wobei die Lösung etwa jede Minute auf und ab pipettiert wurde. Jeder Mikrochip wurde mindestens dreimal mit 0,5 × SSC, pH 7,2, gewaschen, dann wieder dreimal mit 4 × SSC-Lösung. Dann wurde die passive Hybridisierung von 1 μM Reporter-Oligonukleotiden in 4 × SSC bei Raumtemperatur für 3 Minuten durchgeführt. Jeder Mikrochip wurde extensiv mit 4 × SSC gewaschen. Wenn nötig, wurde ein weiterer intensiver Waschgang mit 0,2 × SSC/1% SDS für 5 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Mikrochips wurden dann extensiv mit 0,2 × SSC gewaschen. Schließlich wurden die Mikrochips mit angemessenen Lasern und Filtern abgebildet und die an jeder Stelle vorhandene Fluoreszenz wurde quantifiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 11 dargestellt. Wie in 11 dargestellt, ergab eine optimale Konzentration von 10% nicht-spaltbarer SDA-Primer, die in der Primer-Mischung für die verankerte SDA enthalten waren, eine etwa zweifache Zunahme des spezifischen Signals über dem Wert ohne nicht-spaltbare Primer (0%). Wie erwartet sinkt die Effizienz der SDA-Reaktion mit einer Erhöhung des Verhältnisses von nicht-spaltbaren zu SDA-Primern auf Pegel, bei denen keine nachweisbare SDA-Amplifizierung zu sehen ist. Dies zeigt, dass die Zugabe von nicht-spaltbaren Primern zu der SDA-Primer-Mischung, was tatsächlich jegliches Signal, das vor der Denaturierung des doppelstrangigen Templates eingeschnitten worden sein könnte, zurückhält, die Signalintensität bei der verankerten SDA verbessert.
BEISPIEL 4
In einer weiteren Ausführungsform weist ein Amplifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung ein Allel-spezifisches Verfahren auf. Das Verfahren amplifiziert vorzugsweise selektiv lediglich die Stränge, die ein spezifisches Allel enthalten. Das Verfahren nutzt vorzugsweise Amplifizierungsprimer, die so gestaltet sind, dass ihre jeweiligen 3'-Enden Nukleotidbasen enthalten, die zu der Nukleotidsequenz des gewünschten Allels komplementär sind. Mindestens einer der Primer kann auch vorzugsweise eine Biotineinheit an seinem 5'-Ende enthalten, so dass ein einfacher Mechanismus zum Binden von Amplicons auf der Matrix im Anschluss an das elektronische Adressieren und Amplifizieren bereitgestellt wird. Im Allgemeinen wird die Spezifität des Vorgangs dieses Beispiels auf die niedrige Effizienz der Nukleinsäureketten-Verlängerung zurückgeführt, wenn das Nukleotid am 3'-Ende des Primer nicht zu der Zielsequenz komplementär ist.
In einer Abwandlung dieses Beispiels werden individuell amplifizierte Patienten-Nukleinsäureproben an bestimmten Positionen auf dem Mikroarray immobilisiert und alle Proben wurden gleichzeitig mit Gen- oder Allel-spezifischen Reportersonden untersucht. Individuelle Patientenproben werden immobilisiert, indem während der SDA Biotin in die Proben eingebaut wird. Einer der SDA-Primer wird zugefügt, der ein 5'-Biotin-Verbindungsstück enthält, das keine Stelle für Restriktionsspaltung aufweist und daher nicht spaltbar ist. Die Proben werden denaturiert und an individuelle Bindungsstellen adressiert. Ein einzelstrangiges Amplicon von jedem Patienten wird an einer individuellen Bindungsstelle immobilisiert. Sobald alle Patientenproben immobilisiert sind, werden sie alle gleichzeitig und parallel untersucht. Somit wird ein offener Mikrochip zur Analyse multipler Patientenproben mit minimaler Kreuz-Kontamination verwendet.
In diesem Beispiel ist der biotinylierte Primer vorzugsweise entweder eine nicht-spaltbare Version des für die Amplifizierung verwendeten einrahmenden Primer oder eine interne Sequenz. In jedem Falle bildet er ein Sackgassen-Produkt (i.e. ein Produkt, das nicht weiter amplifiziert wird). Der Primer ist vorzugsweise in begrenzten Mengen vorhanden, so dass der gesamte Primer in Produkt umgesetzt wird. Zum Beispiel beim Screenen nach einer genetischen Mutation, wie z.B. der Faktor V-Leiden-Mutation, gibt es nur zwei Allele, nämlich einen Wildtyp und eine Mutante. Die Amplifizierung wird unter Verwendung von Primern durchgeführt, die spezifisch für den Wildtyp-Lokus sind, jedoch nicht für das Allel (i.e. die Mutante). Der interne biotinylierte Primer wird in ein Produkt umgewandelt, das kürzer ist als das durch Verlängerung gebildete Amplicon gesamter Länge, wenn das Allel vorhanden ist. Das Fragment wird dann an ein Kissen adressiert und anschließend mit einer Allel-spezifischen Sonde untersucht oder es wird eine Allel-spezifische biotinylierte interne Sonde verwendet. Die Amplifizierung kann in Anwesenheit von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden stattfinden. Vorzugsweise wird jede Patientenprobe in zwei verschiedenen Reaktionen mit Allel-spezifischen Primern (für Wildtyp- und Mutanten-Allele) amplifiziert, die dann an verschiedene Kissen adressiert werden, oder die zwei Reaktionen werden gleichzeitig unter Verwendung von Reportermolekülen durchgeführt, die in zwei verschiedenen Farben fluoreszieren, und beide Produkte werden an die gleiche Bindungsstelle adressiert (in welchem Falle der Genotyp mittels des Fluoreszenzfarbstoffes analysiert würde, der an der Stelle dieses Patienten zurückbleibt).
(Siehe Beispiel 1B für zusätzliche Ausführungsformen des Allel-spezifischen Verfahrens und der Allel-spezifischen Technik.)
BEISPIEL 5
In einer weitern Ausführungsform können SDA-Produkte gleichzeitig hergestellt und spezifisch auf einem Mikrochip gebunden werden, indem thermophile SDA (tSDA) in einem Fließzellbereich oberhalb des Mikrochips der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird. (Siehe U.S. Patent Nr. 5,648,211 für eine Diskussion über tSDA und U.S. Patent Nr. 5,547,861 für eine Diskussion über Signalprimer-Verlängerung.) Mit tSDA ist eine SDA gemeint, in der thermophile Enzyme verwendet werden, wodurch die Durchführung bei über 40°C ermöglicht ist, so dass eine stringente Hybridisierung erleichtert wird. Vor der Amplifizierung wird eine interne Bindungssequenz, die eine 5'-Biotin-Modifizierung aufweist, vorzugsweise an einer spezifischen, Streptavidin enthaltenden Bindungsstellen-Position immobilisiert wird. Da einzelstrangige Amplicons während des SDA-Vorgangs frei in Lösung hergestellt werden, hybridisiert ein Teil der Amplicons spezifisch an die immobilisierten Bindungs-Oligonukleotide. Der Nachweis des hybridisierten Stranges wird vorzugsweise mittels eines der im Rahmen dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Diese Ausführungsform des Verfahrens gestattet die Verwendung von sehr kleinen Probenvolumina (z.B. in der Größenordnung von etwa 10 μL) und gestattet Spezifitätskontrollen aufgrund der Verwendung von Sequenzen zum Binden, die vorzugsweise auf unterschiedlichen Bindungsstellen positioniert sind und die innerhalb der Sequenzen vorliegen, die für die Durchführung von SDA-Priming verwendet werden. Ferner kann der Nachweis der gebundenen Sequenzen in „Echtzeit" ablaufen, da sie während der SDA-Reaktion hergestellt werden, wobei die gleichzeitige SDA und das Beobachten der SDA-Reaktion und der hergestellten Amplicons erleichtert werden.
Hinsichtlich dieses Verfahrens gibt es zwei beispielhafte Schemata, eine fluoreszierende Art für den Nachweis einzubauen. In einem ersten Schema, eine fluoreszierende Art für den Nachweis einzubauen, wird, wie in 5A dargestellt, ein zusätzliches Oligonukleotid 36 in die Amplifizierungsreaktion eingebaut. Dieses zusätzliche Oligonukleotid ist Fluoreszenz-markiert und bindet an sein einzelstrangiges Komplemer, das bei dem Amplifizierungsvorgang hergestellt wird. Nach dem Binden wird die Polymerisation in einer 5'→3'-Richtung von diesem Primer aus mittels der in der SDA-Reaktion verwendeten Polymerase 37 initiiert. Als ein Verlauf des regulären Amplifizierungsvorgangs bindet ein Oligonukleotid, das als Amplifizierungsprimer wirkt, 5'-aufwärts an den gleichen Strang wie die Fluoreszenz-markierte Art. Da die Polymerase-Verlängerung von diesem Primer ausgeht, wird der Fluoreszenz-markierte Strang verdrängt und als eine einzelstrangige Art frei in die Lösung oberhalb der Matrix abgegeben. Auf dem Array sind vorher adressierte, verankerte, komplementäre Oligonukleotide. Diese dienen dazu, einen Teil der fluoreszierend markierten Oligonukleotide zu binden, und ein Fluoreszenzsignal auf dem Array bereitzustellen, das sowohl Positions-spezifisch (und dadurch Sequenz-spezifisch) ist als auch im Verlauf der Reaktion zunimmt.
In einem zweiten Schema, eine fluoreszierende Art zum Nachweis einzubauen, weisen, wie in 5B dargestellt, verankerte Bindungs-Oligonukleotide 40 entweder eine unveränderte Endonuklease-Restriktionssequenz auf und sind fähig, eine SDA-Reaktion zu unterstützen, oder sie weisen eine veränderte Sequenz auf, die nicht durch eine Endonuklease 45 erkannt wird. Diese verankerten Bindungsprimer 40 und 45 werden zum Binden einzelstrangiger Produkte 42 der Amplifizierungsreaktion verwendet. Diese Bindungs-Oligonukleotide 40 und 45 dienen als die Stelle für Oligonukleotid-Verlängerung mittels Polymerase-Aktivität. Nach Beendigung der Amplifizierungsreaktion wird das doppelstrangige Material geschmolzen, vorzugsweise mittels elektronischer oder chemischer Verfahren (unter anderem z.B. alkalische Behandlung mit pH 12), wobei das ursprüngliche Amplicon 42 und das Verlängerungsprodukt 43 freigesetzt wird. Die Matrix wird gewaschen und dann wird ein fluoreszierend markiertes Oligonukleotid 44 zugegeben. Diese Reporter-Oligonukleotide hybridisieren spezifisch nur an die von der Polymerase verlängerten Bereiche der Bindungs-Oligonukleotide 40 und 45. In diesem Schema wird bevorzugt, dass das Verhältnis von spaltbaren zu nicht-spaltbaren Oligonukleotiden etwa 10:1 beträgt. Es wird angenommen, dass dieses Verhältnis es erlaubt, dass die Amplifizierungsreaktion optimal abläuft, während eine ausreichende Anzahl an ungespaltenen Verlängerungsprodukten bereitgestellt wird, die an den Bindungsstellen zum Nachweis mittels Reportersonden verbleiben.
BEISPIEL 6
In wiederum einem anderen Beispiel der Erfindung wird die SDA vorzugsweise direkt auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Die Probe wird anfänglich vorbereitet und zufällig geschert zu Größen unter etwa 5 kB. Die Probe wird dann denaturiert und die Zielnukleinsäure wird an eine einzelne Bindungsstelle gebunden, die sowohl 5'- als auch 3'-SDA-Primer enthält. „Bumper Primer", die an Bereiche unmittelbar aufwärts der Bindungsprimer hybridisieren, werden in einer relativen Konzentration von etwa 1/10 der Konzentration der Bindungs-Oligonukleotide zugegeben. Eine SDA-Mischung (i.e. 3 unmodifizierte dNTPs, 1 Thiol-modifiziertes NTP, (und, möglicherweise, ein Fluoreszenz-markiertes NTP), und Enzyme, die vorzugsweise thermophile Exo-(–)DNA-Polymerase plus Restriktionsenzym umfassen) werden passiv zugegeben. Der Mikrochip wird dann aufgeheizt auf etwa 40°C bis 60°C und SDA wird fortgesetzt.
„Echtzeit"-Nachweis der SDA-Reaktion und der Produkt-Amplicons ist möglich, indem NTPs eingebaut werden, die Fluoreszenz-Energieübergang oder Fluoreszenz-Quenching gestatten. Zum Beispiel wird ein NTP, das Bodipy-Texas Rot enthält, mit einem NTP kombiniert, das Cy5 enthält. Einbau von NTP mittels Polymerase-Verlängerung kann kontinuierlich mittels Überwachen des Fluoreszenz-Energieübergangs überwacht werden.
In einer Theorie wird angenommen, dass der bevorzugte minimale geschätzte Abstand zwischen benachbarten Oligonukleotiden auf einem Kissen etwa 1,25 nm beträgt (10⁴ ODNs/80 μm² = 100 × 10⁶/80 × (10³)² nm² = 1,25 ODN/nm²). Wenn Überbrückung von Oligonukleotiden zum Starten der SDA notwendig ist, dann wird angenommen, dass die optimale Länge eines SDA-Fragments, das optimale Amplifizierung gestattet, empirisch ermittelt werden kann. Als ein Startpunkt erscheinen 100 bp = 34 nm vernünftig.
BEISPIEL 7
In dieser Ausführungsform wird ein neues Verfahren einer verankerten SDA-Reaktion bereitgestellt, das die räumliche Beziehung zwischen Amplifizierungsprimern, Ziel-DNA und Enzymmolekülen bereitstellt. Da beide Amplifizierungsprimer in enge Nachbarschaft zueinander gebracht werden, ist die Effizienz der SDA-Reaktion tatsächlich erhöht. Die Abstandsbeziehung zwischen den Amplifizierungsprimern kann ebenso anpassbar sein mittels Verändern von Verbindungselementen zwischen den Primern, wobei eine genaue Festlegung der Stöchiometrie-Verhältnisse der Primer, der lokalen Konzentration der Primer, der an Stellen adressierten Template-Bindung und der räumlichen Beziehungen der Primer zueinander ermöglicht wird, so dass der SDA-Mechanismus auf eine gekoppelt-konzertierte Weise angelegt wird, so dass ihm eine exponentielle Amplifizierung der Ziel-DNA zugute kommt.
Nun bezugnehmend auf 12 oder 15, sind die Bindungsprimer für das SDA-Ziel an spezifischen Bereichen oder Bindungsstellen 5 auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip angeheftet. Die Bindungsprimer sind an derart jede Stelle angeheftet, dass sowohl aufwärts als auch abwärts die für die SDA, die spezifisch für eine interessierende Zielnukleinsäure ist, notwendigen Primerpaare zusammen in dichter Nachbarschaft zueinander an der Bindungsstelle vorhanden sind. Hinsichtlich der 12 ist die verzweigte Struktur 3 an die Bindungsstelle 5 angeheftet und an die 5'-Enden des Plus- und des Minus-Strangs der SDA-Nukleinsäureprimer. Für jeden Primer ist eine unmodifizierte Restriktionsstellen-Sequenz 1 (i.e. der unmodifizierte Strang einer halb modifizierten Restriktionsstelle) in 5'-Richtung der Ziel-spezifischen Bindungssequenz 2 und der Ziel-spezifischen Bindungssequenz 4 positioniert. Hinsichtlich der 15 sind der lineare Plus- und der lineare Minus-Strang der Nukleinsäure-SDA-Primer an Bindungsstellen 5 an ihren jeweiligen 5'-Enden angeheftet. Wie die verzweigten Primerpaare weisen die linearen SDA-Primer die unmodifizierte Restriktionsstellen-Sequenz 6 in 5'-Richtung der Ziel-spezifischen Bindungssequenz 7 und der Ziel-spezifischen Bindungssequenz 8 auf.
Der Mikrochip kann entsprechend dem Stand der Technik vorbereitet werden, wie in dem in U.S. Patent Nr. 5,605,662 veröffentlichten Verfahren, das hierin durch Bezug aufgenommen ist. In dem vorliegenden Beispiel wurde vor der Zugabe der SDA-Primer die Streptavidin-Agarose-Schicht von den äußeren Elektroden der Mikrochips weg gekratzt. Die Kanten jedes Mikrochips wurden mit Rain-X (Unelko Corporation, Scottsdale, Arizona) wasserfest gemacht und die Oberfläche des Mikrochips poliert und gereinigt mit einem Applikator für Baumwolltupfer. Die Mikrochips wurden vor Verwendung mit Milli-Q-Wasser für etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Mikrochips wurden dann mit 50 mM Histidinpuffer gewaschen und biotinylierte Oligonukleotide (z.B. Oligo-dT12-Btr), die einen Fluorofarbstoff aufweisen, in 50 mM Histidinpuffer wurden an die Bindungsstellen unter Verwendung eines Standard-A/C-Protokolls (800 nA für 25 Sekunden) adressiert, so dass die Qualität der Streptavidin-Mikrochips kontrolliert wurde. Der Btr-Fluorofarbstoff wurde unter Verwendung der für Btr geeigneten Anregungs- und Emissionsfilter abgebildet. Die SDA-Primer (SEQ ID Nr. 20 und Nr. 21) wurden unter Verwendung des gleichen Standard-A/C-Protokolls an ausgewählte Bindungsstellen adressiert.
Wie in 13 dargestellt, wird die SDA an Bindungsstellen durchgeführt. Im Anschluss an die Denaturierung der doppelstrangigen Zielarten werden erst einzelstrangige Zielmoleküle (i.e. ein Plus-Strang 10+ aus 13) an die Bindungsstellen adressiert. Für die elektronische Hybridisierung der verschiedenen Templates wurde die doppelstrangige DNA-Zielsequenz erst bei 95°C denaturiert und mit einem gleichen Volumen an 100 mM Histidinpuffer gemischt. Die Template-Mischung wurde dann elektronisch unter Verwendung eines Standard-A/C-Protokolls für Hybridisierung (1,6 μA für 60 Sekunden) an die SDA-Bindungsprimer hybridisiert. Nach dem Hybridisieren der Template-Mischung wurden die Mikrochips zweimal mit Wasser gewaschen und mit 1 mg/mL BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so dass jegliche nicht-spezifischen Bindungsstellen blockiert waren. Die Mikrochips wurden wieder zweimal mit Wasser gewaschen und bei 60°C für 5 Minuten vorgewärmt. Alle SDA-Lösungen wurden ebenfalls bei 60°C für 5 Minuten vorgewärmt. Nach dem Vorwärmen wurde das Wasser entfernt und die Mikrochips wurden mit 10 μL SDA-Reaktionsmischung (40 mM K₂HPO₄ pH 7,6, jeweils 1,6 mM dCTPαS, dTTP, dATP und dGTP, 8,3 mM MgCl₂, 1,3 Units BsoBI und 0,5 Units Bst-Polymerase) für 30 Minuten bei 60°C in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem der Überstand von der Oberfläche des Mikrochips in ein Eppendorf-Röhrchen mit 2 μL 100 mM EDTA überführt wurde.
Wie in 13 angegeben, unterlaufen sowohl der Plus-Strang als auch der Minus-Strang nach der Strangverlängerung der Zielnukleinsäure eine Strangverdrängung, so dass einzelstrangige Plus- und Minus-Amplicons (z.B. 12– und 13+) gebildet werden. Das Plus- und das Minus-Strang-Amplicon können jeweils elektronisch an benachbarte oder nahebei positionierte, ungenutzte Sätze an Primerpaaren hybridisiert werden.
In dem vorliegenden Beispiel wurden die Mikrochips im Anschluss an die SDA-Reaktion dreimal mit 0,5 × SSC, pH 7,2 gewaschen. Die SDA-Produkte wurden dann auf dem Mikrochip in situ mit Zugabe von 0,5 × SSC, pH 12,0 für 4 Minuten denaturiert, in denen die Mikrochips mit frischem Puffer jede Minute gewaschen wurden. Die Mikrochips wurden dann mit 0,5 × SSC, pH 7,2 mindestens dreimal, mit 4 × SSC, pH 7,2 etwa dreimal gewaschen. Die Mikrochips wurden dann mit einer 1 μM Mischung aus Btr-markierten Reporter-Oligonukleotiden in 4 × SSC für 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von extensivem Waschen mit 4 × SSC bei Raumtemperatur, dann mit dem geeigneten Laser und geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern abgebildet.
Obwohl dieses Beispiel für die Einfachheit, die Effizienz verankerter SDA zu zeigen, den Nachweis von SDA-Produkten im Anschluss an die Amplifizierung ausführt, kann der Nachweis unter Verwendung von markierten, Ziel-spezifischen Sonden, die an ihren jeweiligen 3'-Enden, wie mittels Einbaus einer 3'-Phosphatgruppe statt einer 3'-OH-Gruppe an dem Ende der Sonde, blockiert sind, während der Amplifizierung durchgeführt werden. Solche markierten Sonden können ferner einzelstrangige Nukleinsäuren aufweisen, die elektronisch an die Bindungsstellen adressiert werden können, wobei ein gesteigertes Signal nachgewiesen werden kann, da Ziel- und Ampliconarten an den Bindungskissen-Stellen amplifiziert werden, ohne dass die Sonde selbst an der SDA-Verlängerung oder dem Amplifizierungsvorgang teilnimmt.
Zusätzlich zu der oben beschriebenen, elektronisch kontrollierten, verankerten SDA wurden zwei zusätzliche Protokolle als Kontrolle verwendet, worin Zielnukleinsäuren mittels passiver Hybridisierung gefolgt von verankerter SDA gebunden wurden, und worin SDA in Lösung durchgeführt wurde. Erstens, in den Experimenten mit passiver Hybridisierung, wurden doppelstrangige Zielnukleinsäuren erst bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Die Lösung wurde dann mit einer 20 × SSC-Vorratslösung (3 M NaCl, 0,3 M NaCitrat) auf eine 4 × SSC-Konzentration gebracht und 20 μL der Mischung wurden auf den Mikrochip (der vorher mit SDA-Primern elektronisch adressiert wurde) pipettiert und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Im Anschluss an die Ziel-Hybridisierung an die Primer wurden die SDA-Experimente wie oben beschrieben ausgeführt.
Zweitens, wenn die SDA in Lösung durchgeführt wurde, wurden keine Mikrochips verwendet. Der Grund hierfür ist, dass das Ziel, die auf Lösung basierende SDA auszuführen, war, die Kapazität dazwischen zu vergleichen, Zielarten in einem Mehrfach-Format in Lösung zu amplifizieren und auf einem Mikrochip. Die auf Lösung basierenden SDA-Experimente wurden in Eppendorf-Röhrchen in einer Summe von 50 μL der SDA-Mischung, wie oben beschrieben, durchgeführt.
In einem ersten Verfahren dieses Beispiels wurden drei verschiedene Nukleinsäure-Zielarten mittels SDA amplifiziert unter Verwendung von Primerpaaren, die an spezifische Positionen auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip adressiert waren. Hochreine humane DNA der Plazenta, genomische Chlamydia-Templates und Desoxynukleosid-Triphosphate wurden von Becton Dickenson bezogen. Die Ziel-Templates für die Nukleinsäuren, die dazu bestimmt waren, das Vorhandensein von mit Hämochromatose- und Faktor V-assoziierter Gensequenz nachzuweisen, wurden unter Verwendung von SDA-Bumper-Primern (SEQ ID Nr. 22 und Nr. 23) und humaner plazentaler DNA hergestellt. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion zum Amplifizieren solcher Templates sind wohl bekannt für den Amplifizierungsfachmann. SDA-Bindungs-Primerpaare, Bumper und Signalsonden für jede Test-Zielart wurden von Oligos, Etc. (Oregon) synthetisiert und mit PAGE gereinigt. Die in die Primer-Sequenzen kodierte Restriktionsstelle war BsoBI.
Das Folgende ist eine Liste der verschiedenen SDA-Primer und Signalsonden für jede der Zielarten:
SDA-Primer biofacV10sSDA.213, (SEQ ID Nr. 20) 5'-[biot]ACCGCATCGAATGCATGTCCTCGGGTCTCTGGGCTAATAGGA-3'
SDA-Primer biofacVaSDA.297, (SEQ ID Nr. 21) 5'-[biot]ACGATTCAGCTCCAGACTTCTCGGGTCAGAATTTCTGAAAGG-3'
Bumper-Primer facV10s.179, (SEQ ID Nr. 22) 5'-ACTACAGTGACGTGGACATC-3'
Bumper-Primer facV10a.-127 (SEQ ID Nr. 23) 5'-TGTTATCACACTGGTGCTAA-3'
Signalsonde facV10a.276 (SEQ ID Nr. 24) 5'-[BTR]-CTGTATTCCTCGCCTGTC-3'
SDA-Primer chlaAL1.4811, (SEQ ID Nr. 25) 5'-[biot]-CACGTAGTCAATGCATGTCCTCGGGTACAACATCAACACCTG-3'
SDA-Primer chlaAR1.4858, (SEQ ID Nr. 26) 5'-[biot]-ACGATTCAGCTCCAGACTTCTCGGGTGAGACTGTTAAAGATA-3'
Bumper-Primer chlaBL1, (SEQ ID Nr. 27) 5'-CAGCAAATAATCCTTGG-3'
Bumper-Primer chlaBR1, (SEQ ID Nr. 28) 5'-CATTGGTTGATGGATTATT-3'
Signalsonde chlaDIL.4826, (SEQ ID Nr. 29) 5'-[BTR]-GTCGCAGCCAAAATG-3'
Signalsonde chlaCP2.4841, (SEQ ID Nr. 30) 5'-[BTR]-TTCCATCAGAAGCTGT-3'
SDA-Primer haemsdas.6679, (SEQ ID Nr. 31) 5'-[biot]-CACGTAGTCAATGCATGTCCTCGGGTATAACCTTGGCTGTAC-3'
SDA-Primer haemsdaa.6773, (SEQ ID Nr. 32) 5'-[biot]-ACGATTCAGCTCCAGACTTCTCGGGTGCTCTCATCAGTCACA-3'
Bumper-Primer haempcrs.6596, (SEQ ID Nr. 33) 5'-TGAAGGATAAGCAGCCAAT-3'
Bumper-Primer haempcra.6773, (SEQ ID Nr. 34) 5'-CTCCTCTCAACCCCCAATA-3'
Signalsonde haemreps.6712, (SEQ ID Nr. 35) 5'-[BTR]-AGATATACGTGCCAGGTG-3'
Signalsonde haemreps.6733, (SEQ ID Nr. 36) 5'-[BTR]-CTGATCCAGGCCTGGGTG-3'.
Wie in 16 abgebildet, wurden biotinylierte SDA-Primer für Faktor V (FAC V), Chlamydia (CHL) und Hämochromatose (HC) auf Streptavidin enthaltenden Mikrochips verankert und eine Mischung aus Faktor V-, Chlamydia- und Hämochromatose-Templates wurden elektronisch an die Primer hybridisiert. Das Kontroll-Template T12 wurde ebenfalls verankert.
Die verankerte SDA wurde auf Mikrochips in situ bei 60°C für 30 Minuten wie vorher beschrieben durchgeführt und entsprechend verarbeitet. Wie gesehen werden kann, können keine SDA-Amplicons nachgewiesen werden, wenn das Template nicht an die SDA-Primer auf dem Mikrochip hybridisiert (17). Wenn jedoch eine Mischung der Templates an die SDA-Primer hybridisiert wird, kann gleichzeitige Amplifizierung der drei Amplicon-Systeme beobachtet werden (18 bis 20). Dementsprechend zeigt, wenn nur eine Art von Template bei Anwesenheit aller drei Typen an SDA-Primern hybridisiert wird, nur der Bereich, in dem der entsprechende SDA-Primer verankert ist, ein Signal, das anzeigt, dass Amplifizierung stattgefunden hat. Das bestätigt sowohl die Spezifität als auch die Flexibilität des verankerten SDA-Systems, wenn es in situ auf Mikrochips durchgeführt wird. Interessanterweise wird, wie in 21 dargestellt, wenn auf Lösung basierende SDA unter Verwendung der gleichen drei Sätze an SDA-Primern durchgeführt wird, die Mehrfach-Amplifizierung weitgehend beeinträchtigt. Die auf Lösung basierende SDA wurde sowohl für Faktor V, Chlamydia und Hämochromatose getrennt durchgeführt, als auch zusammen in einer Reaktion (ALLE), gefolgt von einer Analyse auf einem 6%igen, nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Wie gesehen werden kann, amplifizieren alle drei Systeme, wenn sie getrennt durchgeführt werden. Jedoch wird, wenn alle drei Sätze an Primern und Templates in einer Reaktion kombiniert werden, die Amplifizierung von Faktor V weitgehend unterdrückt. Zusätzlich war, wenn die Templates mittels passiver Hybridisierung an die Primer hybridisiert wurden, die Effizienz der Amplifizierung signifikant reduziert, möglicherweise aufgrund von ineffizientem Hybridisieren durch Wiederanlagern der Templates. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit in der Technik für ein System wie das der vorliegenden Erfindung für ein System der Mehrfach-Amplifizierung, das Mehrfach-Amplifizierung und Nachweis der Zielarten durchführen kann, ohne Behinderungen, wie sie bei auf Lösung basierenden und/oder passiven Hybridsierungs-Systemen beobachtet werden kann.
In einer zweiten Ausführungsform dieses Beispiels kann die Vorbereitung der verzweigten SDA-Ziel-Bindungsprimerpaare auf vielfältige Weise synthetisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die verzweigte Einheit wie unten beschrieben hergestellt werden. Zuerst, wie in 22 dargestellt, ist das Startsubstrat für die Synthese der Y-Primer ein mit Biotin konjugiertes Lysin mit einem Tert-Butyloxycarbonyl-geschützten α-Amino-Ende. Die Tert-Butyloxycarbonyl-Einheit (TBC-Einheit) an dem α-Amino-Ende gestattet es, die SDA-Primerarme separat selektiv zu befestigen. In diesem Fall ist das α-Amino-Ende geschützt, aber das α-Amino-Ende kann mit Carboxylsäure reagieren, wodurch die SDA-Sense-Primer an dem α-Amino-Ende angelagert werden können. Dem α-Amino-Ende kann dann der Schutz mit Tri-Fluoro-Essigsäure/Dichlormethan (TFA/DCM) wieder genommen werden, was die Tert-Butyloxycarbonyl-Einheit und die Anlagerung der SDA- Antisense-Primer mittels des Carboxylsäure-Endes gestattet. Diese Anlagerungsfolge erlaubt die Bildung eines Y-Primer, bei dem beide SDA-Primer an die verzweigte Einheit an ihren jeweiligen 5'-Enden adressiert werden. Das resultierende Y-förmige Primerpaar kann dann an der Streptavidin-Permeationsschicht auf dem Mikrochip gebunden werden.
Die Synthese der Y-förmigen Primerpaare für die verankerte SDA soll die Gesamteffizienz der SDA-Reaktion zweifach steigern: 1) indem die SDA-Primer in relativer Nähe zueinander angeordnet sind, wobei die Wechselwirkungsrate zwischen den verlängerten Amplicons eines Stranges und dem anschließenden Binden der gespaltenen Amplicons an den Primer des gegenüberliegenden Stranges gesteigert wird; und 2) indem die Dichte der Primer in einem bestimmten Bereich über die Dichte der konventionellen Oligonukleotid-SDA-Primer gesteigert wird. In dem oben beschriebenen Syntheseprotokoll ist der Y-Primer an die Permeationsschicht des Mikrochips mittels einer Streptavidin-Biotin-Bindung befestigt ist; jedoch können andere Arten einer Anlagerungschemie mit einer Amid-Bindung verwendet werden, darunter, aber nicht begrenzt darauf, Prolinx, R-SH oder jede andere funktionelle Gruppe auf dem Makromolekül. Die verzweigten Primerpaare können wie oben beschrieben beim Durchführen der SDA-Reaktionen verwendet werden.
BEISPIEL 8
In wiederum einem anderen Beispiel wird ein asymmetrisches Amplifikationsverfahren hinsichtlich des Problems der Hybridisierung zwischen den während der SDA hergestellten Sense- und Antisense-Amplicons bereitgestellt. Wenn SDA verwendet wird, werden im Allgemeinen sowohl Sense- und Antisense-Stränge in gleichen Mengen hergestellt. Unter typischen Amplifizierungsbedingungen hybridisieren die komplementären Stränge miteinander. Jedoch erfordert die Hybridisierung von Oligonukleotiden an spezifische Stellen auf einem mikroelektronischen Array (sowohl für die Hybridisierung der Amplimere an Bindungs-Oligonukleotide als auch für den Nachweis von hybridisiertem Material mittels Fluoreszenz-markierten Reporter-Oligonukleotiden) die Herstellung einzelstrangiger Arten von den Amplicons. Folglich müssen die komplementären Stränge, die zusammenhybridisiert sind, vor dem Hybridisieren an Bindungsstellen auf dem Array und/oder vor dem Nachweis mittels markierter Reporter voneinander getrennt werden, wenn nicht ein Strang stärker amplifiziert ist als der andere (i.e. wenn nicht die Amplifizierung asymmetrisch ist). Dies wird für gewöhnlich unter Verwendung von Hitze oder chemischer Denaturierung vor oder nach dem elektronischen Adressieren gemacht. Eine asymmetrische Amplifizierung beseitigt die Notwendigkeit eines solchen thermozyklischen Schritts.
Ein Schlüsselelement der asymmetrischen Amplifizierung ist die Erzeugung eines Übergewichts eines Amplicons über seine komplementäre Ampliconsequenz. In einer Lösungsumgebung wird dieses Verfahren typischerweise umgesetzt, indem ein unproportionales Verhältnis von amplifizierenden Primern umgesetzt wird. In den Anfangsstadien des Amplifizierungsvorgangs produziert die effektive Konzentration der Sense- und der Antisense-Amplifizierungsprimer, die gegenüber dem Template in großem Überschuss vorhanden sind, eine Umgebung, die für die exponentielle Amplifizierung des originalen, doppelstrangigen Template-Materials förderlich ist. Während die Reaktion fortschreitet, wird der Amplifizierungsprimer, der ursprünglich in geringeren Mengen vorhanden war, effektiv erschöpft, was durch den im Überschuss zurückbleibenden Primer zu Bedingungen der linearen Amplifizierung führt. Der spezielle Effekt der von der Polymerase vermittelten Verdrängung von amplifiziertem Material während der SDA stellt sicher, dass dieses linear amplifizierte Material frei in Lösung vorliegt und für die Hybridisierung verfügbar ist, ohne die Notwendigkeit, die doppelstrangigen Arten zu denaturieren. In Bezug auf Gegenstände dieser Erfindung ist ein alternativer Ansatz, beide Primer in der gleichen Konzentration in Lösung zu bringen, jedoch einen Konkurrenten zuzugeben, der die Herstellung eines Stranges teilweise hemmt oder „vergiftet". Über die Zeit wird dies ebenso zu einem Übergewicht eines Stranges des amplifizierten Ziels führen.
Wenn Bindungssonden verankert sind, kann die Bildung von vorherrschend einem Strang verstärkt werden, indem verankerte Bindungssonden gestaltet werden, die zu einem Strang der hergestellten und in die Lösung freigesetzten Amplicons komplementär sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungssonden in zwei Punkten von normalen SDA-Primern verschieden. Erstens besitzen sie vorzugsweise nicht eine funktionsfähige Restriktionsstelle, wodurch sie die Einschneiden durch Endonuklease/Verlängern durch Polymerase mit Verdrängung-Schritte blockieren. Zweitens sind die 3'-Enden der Bindungssonden vorzugsweise nicht für die Verlängerung mittels Polymerase-Aktivität geeignet. Während der SDA werden diese modifizierten Bindungsprimer an Ampliconstränge hybridisieren, wodurch sie sie effektiv aus dem SDA-Pfad herausziehen, so dass sie nicht für weitere Amplifizierung zur Verfügung stehen. Die Bindung solcher Einzelstränge kann so dirigiert werden, dass sie an einer Bindungsstelle auftritt, die an einer von der Stelle, an der die SDA abläuft, entfernten Position positioniert ist. Folglich wird eine Tendenz der Strangigkeit der Amplicon-Population hergestellt, die eine effektive Form der asymmetrischen Amplifizierung darstellt, aufgrund der Mengenbegrenzung eines Stranges des Amplifizierungsproduktes.
In einem weiteren Beispiel kann asymmetrische Amplifizierung verstärkt werden, indem in die SDA-Reaktion ein kompetitiver Inhibitor von einem der Primer aus einem gegebenen Satz an Primern aufgenommen wird. Wie in dem oben genannten Beispiel ist der kompetitive Primer vorzugsweise entweder nicht-verlängerbar oder nicht-spaltbar. Die Aufnahme des kompetitiven Primer gibt der Reaktion eine Tendenz in Richtung der Bildung von Einzelsträngen durch einen linearen Reaktionsvorgang.
Oligonukleotid-Sequenzen werden nicht-verlängerbar gemacht unter Verwendung verschiedener Mittel, darunter Blockieren des 3'-OH-Endes und Fehlpaarung des 3'-terminalen Nukleotids (oder der 3'-terminalen Nukleotide) hinsichtlich der Template-Sequenz. Oligonukleotid-Sequenzen werden nicht-spaltbar gemacht, indem das Oligonukleotid-Rückgrat modifiziert wird durch die Aufnahme modifizierter Bindungen wie Phosphorothioate oder einfach, indem die Sequenz an der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuklease verändert wird. Derart modifizierte Sonden bleiben vollständig für die Hybridisierung geeignet. Die Sequenz des Konkurrenten ist vorzugsweise identisch (oder nahezu identisch) zu der der Amplifizierungsprimer. Der Konkurrent kann folglich mit dem Amplifizierungsprimer für die Hybridisierung mit einer Zielsequenz konkurrieren. Wenn der Konkurrent an die Zielsequenz gebunden ist, kann er (1) nicht mittels DNA-Polymerase verlängert werden oder (2) er kann verlängert werden, so dass eine Kopie der Zielsequenz hergestellt wird. In dem Fall, dass der Konkurrent verlängert wird, wird der Konkurrent so modifiziert, dass die resultierenden Kopien der Zielsequenz nicht mittels eines Restriktionsenzyms gespalten werden können. Verschieden Typen von Konkurrenten werden abhängig von dem verwendeten Amplifizierungsverfahren verwendet.
In der PCR wird der Konkurrent derart modifiziert, dass er nicht verlängert werden kann. Angemessene Modifizierungen sind oben beschrieben. In jedem Zyklus der Reaktion wird der Konkurrent mit einem der PCR-Primer um das Hybridisieren an verfügbare Zielsequenzen konkurrieren. Zum Beispiel werden in einer Reaktion, bei der der Konkurrent zu 10% der Konzentration des PCR-Primer zugegeben wurde, etwa 10% der Hybridisierungsereignisse dadurch fruchtlos sein, dass ein Verlängerungsprodukt nicht hergestellt werden kann. Der entgegengesetzte PCR-Primer ist frei, an alle verfügbaren Zielsequenzen zu hybridisieren und verlängert zu werden. Folglich wird eine Tendenz von etwa 10% in der relativen Anzahl der beiden Verlängerungsprodukte in jedem gegebenen Zyklus produziert. Während eine 10%ige Tendenz in den frühen Zyklen nicht signifikant sein können, da die Zielkonzentration niedrig ist, wird eine derartige Tendenz in späten Statuszyklen eine hohe Konzentration an einzelstrangigem Material produzieren (wenn nM-Mengen, oder größer, der Verlängerungsprodukte hergestellt werden).
In der SDA sind mehrere Verfahren vorzuziehen. Verwendung eines nicht-verlängerbaren Konkurrenten wird eine Tendenz in Richtung der Herstellung von doppelstrangigen Templates ergeben, was das Einschneiden und die Verlängerungsreaktion erlauben wird, so dass vorzugsweise eines der einzelstrangigen verdrängten Produkte hergestellt wird. Verwendung eines verlängerbaren, nicht-spaltbaren Konkurrenten führt zu Asymmetrie, indem doppelstrangige Produkte hergestellt werden, die nicht an der Reaktion Einschneiden/Verdrängen teilnehmen können. Verwendung von beiden Konkurrenztypen kann optimal sein, da die Verlängerungsprodukte, die von dem nicht-spaltbaren Primer hergestellt werden, Teil von doppelstrangigen Molekülen werden, wenn nur ein Strang eingeschnitten und verdrängt werden kann. (Siehe 14.)
BEISPIEL 9
In diesem Beispiel der Erfindung wird SDA in Verbindung mit einem elektronisch adressierbaren Mikrochip durchgeführt, wobei der atmosphärische Druck bei der SDA-Reaktion erhöht ist.
Wenn genomische Nukleinsäure verwendet wird, wird es vorgezogen, dass sie in Fragmente zwischen etwa 250–500 bp gespalten wird. Dies kann mittels eines Restriktionsenzyms wie HhaI, FokI oder DpnI vorgenommen werden. Die Auswahl des Enzyms und die Länge der Sequenz sollten so bestimmt werden, dass die gesuchte Zielsequenz vollständig innerhalb des hergestellten Fragments enthalten ist, oder dass mindestens ein ausreichender Teil der Zielsequenz in dem Fragment vorhanden ist, so dass eine ausreichende Bindung der SDA-Amplifizierungsprimer vorliegt. Zu anderen Verfahren zur Herstellung von Fragmenten gehören PCR und Beschallung.
Die in diesem Verfahren verwendeten Primer weisen im Allgemeinen eine Länge von 25–100 Nukleotiden auf. Primer einer Länge von etwa 40 Nukleotiden sind bevorzugt. Die Nukleinsäuresequenz der Primer sollte im Wesentlichen zu der Zielsequenz homolog sein, so dass unter Bedingungen hoher Stringenz Hybridisierung zwischen Primer und Template-Nukleinsäure auftritt.
Fragmente der Zielnukleinsäure werden denaturiert, so dass sie einzelstrangig vorliegen, so dass das Binden der Primer an die Zielstränge stattfinden kann. Erhöhen der Temperatur auf etwa 95°C ist ein bevorzugtes Verfahren zur Denaturierung der Nukleinsäuren. Zu anderen Verfahren gehört Erhöhen des pH-Wertes; jedoch erfordert dies Absenken des pH-Wertes, so dass es den Primern ermöglicht wird, an das Ziel zu binden. Im Anschluss an die Bildung einzelstrangiger Zielmoleküle wird die SDA, wie in den zahlreichen Beispielen hierin diskutiert, durchgeführt. Typischerweise beinhaltet die SDA-Reaktion die Verwendung von mindestens einem substituierten Nukleotid während der Primerverlängerung, so dass das Einschneiden eines Stranges während der Amplifizierung erleichtert ist. Die Nuklease kann jede Nuklease sein, die typischerweise für SDA nützlich ist, wie vorher diskutiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist der atmosphärische Druck erhöht, entweder bevor alle SDA-Reaktionsbestandteile kombiniert werden oder danach. Der Druck ist erhöht, so dass die Sternaktivität reduziert ist, so dass die Spezifität der Restriktionsendonuklease für ihr Ziel effektiv erhöht ist. Die Anwendung erhöhten Drucks kann auch die Spezifität der Primerwechselwirkung mit der Template-Nukleinsäure und die Gesamtrate der Reaktion der verwendeten Enzyme steigern, wobei die für die SDA-Reaktion notwendige Zeit reduziert wird, während ihre Spezifität erhöht ist. Mittels der Reduzierung der Sternaktivität ist die Template-unabhängige Amplifizierung abgesenkt, wobei der kompetitive Verbrauch von Reagenzien durch unspezifische Amplifizierung reduziert ist.
Erhöhter Druck kann während der Amplifizierung mittels verschiedener Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel können die Reaktionen in Hochdruckgefäßen durchgeführt werden. Die Reaktionen können auch durchgeführt werden, indem das Behältnis in eine Reaktionskammer gestellt wird, die mit einem Hochdruckgerät verbunden ist oder ein Teil davon ist (High Pressure Equipment Co. Erie, PA). Es kann vorteilhaft sein, die wässrigen Reaktionsmedien mit einer unvermischbaren Phase wie Silikonöl (Sigma) zu überschichten, wodurch Druck auf die wässrige Lösung, die die Zielnukleinsäure, Nukleosidtriphosphate und Enzyme enthält, ausgeübt werden kann. Vorzugsweise wird der Druck in dem Bereich von etwa 100 bis etwa 500 Atmosphären erhöht.
Zu den in diesem Verfahren nützlichen Polymerasen gehören diejenigen, die die 5'→3'-Polymerisation an einer Einschnittstelle anfangen. Die Polymerase sollte auch den polymerisierten Strang abwärts des Einschnitts verdrängen und, was wichtig ist, sollte auch keine 5'→3'-Exonukleaseaktivität aufweisen und hitzestabil sein. Polymerasen wie das große Fragment der DNA-Polymerase I und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem die Exonukleaseaktivität fehlt, und ein ähnliches Fragment der Bst-Polymerase (New England Biochemicals, Beverly, Mass.) sind nützlich. SEQUENASE 1,0 und SEQUENASE 2,0 (U.S. Biochemical), T5-DNA-Polymerase und Phi29-DNA-Polymerase sind ebenso nützlich. Im Allgemeinen sind thermophile DNA-Polymerasen bevorzugt. Das thermophile Klenow-Fragment ohne Exonukleaseaktivität der Bst-Polymerase aus Bacillus stearothermophillus (New England Biochemicals, Beverly, Mass.) wird am meisten bevorzugt.
In diesem Verfahren kann eine einzelne Reaktionstemperatur verwendet werden, nachdem die Denaturierung stattgefunden hat, und diese Temperatur sollte hoch genug sein, einen Pegel an Stringenz einzustellen, der unspezifisches Binden minimiert, aber niedrig genug, spezifisches Hybridisieren an den Zielstrang zu ermöglichen. Zusätzlich sollte die Verwendung einer Temperatur, die vorzugsweise zwischen etwa 45°C und etwa 60°C liegt, eine effiziente Enzymaktivität unterstützen. Denaturieren der Enzyme und der Nukleinsäure muss vermieden werden.
Während der SDA-Reaktionszyklen werden theoretisch etwa 20 Wiederholungen oder Zyklen in einer etwa 10⁶-fachen Amplifizierung resultieren (i.e. SDA × 2²⁰ = 10⁶). Typischerweise ist in etwa 30 Minuten Amplifizierung eine 10⁸-fache Amplifizierung oder mehr zu erzielen.
Hochdruck-SDA ist für verschiedene Anwendungen günstig, darunter die Herstellung einzelstrangiger Nukleinsäuresonden mit hoher Wiedergabequalität oder einzelstrangiger Templates zum Sequenzieren. In Richtung dieses Ziels kann Hochdruck-SDA entweder mit einem einzelnen Primer oder unter Verwendung von zwei Primern geführt werden, von denen ein Primer im Überfluss gegenüber dem anderen vorliegt. Das Ergebnis ist eine Überflussproduktion eines verdrängten Einzelstranges über den anderen.
Das Vorhandensein des amplifizierten Ziel kann dann mittels beliebiger Anzahl an Verfahren nachgewiesen werden. Ein Verfahren ist es, Reaktionsprodukte einer bestimmten Stelle mittels Gelelektrophorese nachzuweisen. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn die Nukleotide mit einer Radiomarkierung wie ³²P markiert sind. Zu anderen Verfahren gehört Markieren der Nukleotide mit einer physikalischen Markierung wie Biotin. Biotin-enthaltende Reaktionsprodukte können dann mittels an ein Signal-generierendes Enzym, wie der Peroxidase, gebundenes Avidin identifiziert werden. Ein weiteres Verfahren ist die Verlängerung eines fluoreszierend markierten internen Primer.
Zu den Nachweissystemen, die in der Praxis dieser Erfindung nützlich sind, gehören homogene Systeme, die keine Trennung erfordern, und heterogene Systeme. In jedem System werden ein nachweisbarer Marker oder mehr nachweisbare Marker verwendet und die Reaktion oder Emission von dem Nachweissystem wird beobachtet, vorzugsweise mittels automatisierter Mittel. Beispiele für homogene Systeme umfassen Fluoreszenz-Polarisation, mittels Enzymen vermittelte Immunoassays, Fluoreszenz-Energieübergang, Hybridisierungsschutz (z.B. Acridiniumleuchten) und geklonte Enzym-Donor-Immunoassays. Beispiele heterogener Systeme umfassen Enzymmarkierungen (wie Peroxidase, alkalische Phosphatase und Beta-Galaktosidase), Fluoreszenzmarkierungen (wie Enzymmarkierungen und direkte Fluoreszenzmarkierungen (z.B. Fluoreszein und Rhodamin)), Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Liposomen oder andere sackartige Partikel können auch mit Farbstoffen und anderen nachweisbaren Markern und in solchen Nachweissystemen verwendet werden. In diesen Systemen können die nachweisbaren Marker direkt oder indirekt mit einer Bindungseinheit verbunden sein oder die amplifizierten Produkte können in der Anwesenheit eines Rezeptors hergestellt werden, der mittels eines Liganden für den Rezeptor erkannt werden kann.
Protokoll für Strangverdrängungs-Amplifizierung (SDA) unter erhöhtem Druck
Amplifizierungsreaktionen verbrauchen ungefähr 100 ng genomischer DNA (Faktor V) in einem Gesamtvolumen von 50 μL. Die genomische DNA (humane plazentale DNA; Becton Dickinson) wird bei 95°C für 5 Minuten denaturiert, gefolgt von einer Zentrifugation zur Sammlung von Kondensat. Als nächstes wird 1 μL der SDA-Primermischung hinzugefügt (50 μM pro Reaktion) und bei 60°C für 5 Minuten inkubiert. Die SDA-Mischung (40 mM K₂HPO₄ pH 7,6, jeweils 1,4 mM dCTPαS, dTTP, dATP und dGTP, 8,3 mM MgCl₂, 40 Units/rxn BsoBI (New England Biochemicals), 15,6 Units/rxn Bst-Polymerase (New England Biochemicals) und jeweils 0,05 μM SDA-Bumper-Primer) wird zugegeben und für 5 Minuten bei 60°C vorgewärmt, gefolgt von einer Zugabe der Mischung zu SDA-Primern und der Zielprobe. Siliconöl wird oben auf die Reaktionsröhrchen hinzugefügt und in einer Hochdruckkammer positioniert. Der Druck wird auf zwischen 100 und 500 Atmosphären erhöht und bei 60°C für 30 Minuten inkubiert. Im Anschluss an den Reaktionszeitraum wird der Druck auf atmosphärischen Druck reduziert und die Reaktion mittels Zugabe von 10 μL 100 mM EDTA beendet. Die SDA-Produkte werden mittels Elektrophorese auf 6%igen, nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt. Die Gele werden mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Fluoreszenz photographiert.
Alternativ dazu ist es möglich, eine Vorrichtung zu nutzen, in der die Temperatur und/oder der Druck vor der Zugabe der Polymerase und/oder der Restriktionsendonuklease erhöht werden.
Die Verwendung erhöhten Drucks kann auch bei der Durchführung der verankerten SDA oder jedwedes SDA-Vorgangs genutzt werden, wie oben beschrieben. Speziell bei Durchführung von verankerter SDA auf elektronisch adressierbaren Mikrochips sollte erhöhter Druck Sternaktivität senken und Effizienz erhöhen, indem Primer-unabhängige Amplifizierung reduziert wird.
BEISPIEL 10
In einem weiteren Beispiel kann SDA in Verbindung mit elektronisch adressierbaren Mikrochips verwendet werden, wobei die SDA-Reaktion „Ligations-abhängig" oder „auf Ligation basierend" ist. Dieses Verfahren weist die SDA-Amplifizierung einer ligierten Sonde unter Verwendung eines Paares von universellen Amplifizierungprimern auf. Die Amplifizierungsprimer sind in dem Sinne universell, dass sie so gestaltet sind, dass alle ligierten Sonden in einer Testreaktion amplifiziert werden, ob die Reaktion eine Mehrfach-Reaktion ist oder ob sie auf ein einzelnes Ziel gerichtet ist. Die ligierte Sonde wird mittels Zusammen-Ligierens eines Paares an Ligationssonden gebildet, das an eine Zielsequenz hybridisiert wurde. Es sind keine Bumper-Primer notwendig.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren der auf Ligation basierenden SDA bereitgestellt, in dem das Verfahren nicht mittels eines elektronischen Mikrochips unterstützt wird. In dieser Ausführungsform ist es unter anderem nicht notwendig, irgendwelche Primer zu verankern, was eine Prozedur ist, die das Separieren von Primersätzen während der Mehrfach-Amplifizierung unterstützt, da die Primer universell sind – es gibt keine Notwendigkeit dafür, Zielsequenzen an spezifische Primer zu dirigieren.
Die folgenden funktionalen Beschreibungen der Oligonukleotid-Reagenzien sind nicht dazu gedacht, ihre aktuelle physikalische Zusammensetzung zu definieren oder einzuschränken. Eher zeigt die Beschreibung lediglich, dass jedes Reagens bestimmte funktionale Eigenschaften offenbart. Folglich sollte vermerkt werden, dass die funktionellen Bereiche eines gegebenen Oligonukleotid-Reagens überlappen können oder tatsächlich eine gemeinsame Ausdehnung aufweisen können, als ob eine spezifische Nukleinsäuresequenz fähig ist, mehr als eine Funktion auszuüben. Zusätzlich hängt die individuelle Basensequenz in einem jeweiligen gegebenen Oligomer von der interessierenden Zielnukleinsäure ab, von dem für die Verwendung in der SDA ausgewählten Restriktionsenzym oder von einer für Bereiche des Amplifizierungsprimer oder der Ligationssonde ausgewählten zufälligen Sequenz, so dass der Grad an Universalität in das Amplifizierungsprotokoll eingebaut werden kann.
Bei der Durchführung verwendet das auf Ligation basierende SDA-Verfahren, wie in 23(a–c) dargestellt, ein Paar an Ligationssonden, die sich an benachbarte Nukleinsäuresequenzen auf einem Ziel anlagern. Das Paar an Ligationssonden bindet funktionell derart an eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, dass es zusammen ligiert werden kann, während es sich an das Ziel anlagert, so dass ein ligiertes Sondentemplate gebildet wird. Ligation findet nur im Anschluss an die Hybridisierung der beiden Ligationssonden eines Ligationssonden-Paares an eine Zielsequenz statt.
Die erste Ligationssonde kann in drei funktionelle Bereiche unterteilt werden: einen 5'-Bereich, der an die Zielnukleinsäure hybridisieren kann; einen mittleren Bereich; und einen 3'-Bereich, der eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die an den ersten Amplifizierungsprimer binden kann. Die zweite Ligationssonde kann ebenfalls in drei funktionelle Bereiche unterteilt werden: einen 5'-Bereich, der eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die mit Nukleinsäuresequenzen identisch sind, die in dem zweiten Amplifizierungsprimer gefunden werden und die eine Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease aufweist; einen mittleren Bereich; und einen 3'-Bereich, der an Zielnukleinsäure hybridisieren kann.
In Bezug auf die Amplifizierungsprimer kann der erste Amplifizierungsprimer in zwei funktionelle Bereiche unterteilt werden: einen 5'-Bereich, der eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease aufweist und einen 3'-Bereich, der an die erste Ligationssonde hybridisieren kann. Der zweite Amplifizierungsprimer kann ebenfalls in zwei funktionelle Bereiche unterteilt werden: einen 5'-Bereich, der eine Erkennungssequenz für eine DNA-Restriktionsendonuklease aufweist und einen 3'-Bereich, der eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die die gleiche Sequenz aufweist wie der 5'-Bereich der zweiten Ligationssonde.
Die auf Ligation basierende SDA-Reaktion weist eine Zahl an Teilschritten auf. In Schritt 1 lagert sich das Paar an Ligationssonden an benachbarte Sequenzen von einzelstrangiger Zielnukleinsäure an, so dass die zweite Ligationssonde an den Zielstrang an einer Position auf dem Ziel hybridisiert, die in 3'-Richtung der Hybridisierungsposition der ersten Ligationssonde liegt. In Schritt 2 katalysiert die DNA-Ligase die Ligation der beiden Ligationssonden, so dass das ligierte Sonden-Tamplate gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das 3'-Ende des ligierten Sonden-Templates modifiziert, so dass eine Primerverlängerung von diesem Ende verhindert wird. (23(a–c)).
In Schritt 3 bindet der erste Amplifizierungsprimer an das 3'-Ende des ligierten Sonden-Templates, so dass die Amplifizierungsprimer über das Ende des Templates hinaus verlängert werden, wobei sie einen 5'-Überhang bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform katalysiert die DNA-Polymerase eine neue DNA-Synthese vom 3'-Ende der ersten Amplifizierungsprimer, wodurch die ligierte Sonde von der Zielnukleinsäure verdrängt wird. Dies resultiert in der Freisetzung von einzelstrangiger Zielnukleinsäure und der Bildung von doppelstrangigen DNA-Oligonukleotiden, die einen 5'-Überhang aufweisen (markiertes Produkt I, 23). Die Freisetzung von einzelstrangiger Zielnukleinsäure und die Bildung der doppelstrangigen Oligonukleotide findet ohne die Unterstützung von Bumper-Primern statt. Außerdem wird der Ziel-Einzelstrang für weiteres Binden von unligierten ersten Bindungssonden und unligierten zweiten Bindungssonden verfügbar.
Somit weist Produkt I einen ersten Strang auf, der eine Sequenz von 5' nach 3' aufweist, die dem ligierten Sondentemplate entspricht, und einen zweiten Strang, der zu dem ligierten Sondentemplate komplementär ist, mit einer zusätzlichen Nukleinsäuresequenz an seinem 5'-Ende, die dem 5'-Ende der ersten Amplifizierungsprimer entspricht. Dieses doppelstrangiges DNA-Molekül kann einer Folge von SDA-Reaktionen unterworfen werden, die einzelstrangige DNA-Moleküle produzieren, die mittels der universellen Amplifizierungsprimer gebunden und amplifiziert werden können. Die aus diesen Reaktionen resultierenden doppelstrangigen DNA-Moleküle sind ebenfalls empfindlich gegenüber Amplifizierung. Einschneiden mittels einer Restriktionsendonuklease, gefolgt von Primerverlängerung und Strangverdrängung regeneriert im Wesentlichen das doppelstrangige DNA-Startermaterial. Zusammengenommen amplifizieren diese Ligations-abhängigen SDA-Reaktionen schließlich die Oligonukleotid-Sequenzen, die der ligierten Sonde entsprechen, wobei sie den Nachweis der Zielsequenz gestatten. Diese Reaktionen werden unten im Detail beschrieben.
In Schritt 5 wird Produkt I mittels eines Restriktionsenzyms eingeschnitten, so dass Produkt II hergestellt wird. In Schritt 6 wird Produkt II einer Primerverlängerung und Verdrängung von der Einschnittstelle unterzogen, woraus Produkt III und Produkt IV resultieren. Produkt III ist im Wesentlichen das gleiche wie Produkt 1, mit Ausnahme dessen, dass der erste Strang von Produkt III (der dem ersten Strang von Produkt I entspricht) an seinem 3'-Ende eine zusätzliche Sequenz aufweist, die zu dem 5'-Ende des ersten Amplifizierungsprimer komplementär ist. Produkt IV ist ein einzelstrangiges Molekül mit einer Sequenz, die den ersten Strang von Produkt II aufweist, an einer Position in 3'-Richtung von der Stelle, an der dieser Strang mittels der Restriktionsendonuklease eingeschnitten wurde.
In Schritt 7 wird Produkt III mittels einer Restriktionsendonuklease eingeschnitten, so dass Produkt V gebildet wird. In Schritt 8 durchläuft Produkt V Primerverlängerung und Strangverdrängung, so dass Produkt VI und Produkt VII gebildet werden. Produkt VI ist im Wesentlichen das gleiche wie Produkt III. Produkt VII ist ein einzelstrangiges DNA-Molekül, das den eingeschnittenen Strang von Produkt V aufweist, der in 3'-Richtung zu der Einschnittsstelle positioniert ist.
In Schritt 9 bindet der zweite Amplifizierungsprimer an Produkt VII. In Schritt 10 unterläuft Produkt VII einer Primerverlängerungsreaktion in beiden Richtungen, so dass Produkt VIII gebildet wird. Produkt VIII ist ein doppelstrangiges Nukleinsäuremolekül, wobei der erste Strang eine Sequenz aufweist, die Produkt VII entspricht, plus eine zusätzliche 3'-Sequenz, die zu dem 5'-Bereich des zweiten Amplifizierungsprimer komplementär ist, und der zweite Strang zu dem ersten Strang komplementär ist. In Schritt 11 wird Produkt VIII mittels einer Restriktionsendonuklease eingeschnitten, so dass Produkt IX gebildet wird. Produkt IX ist im Wesentlichen das gleiche wie Produkt VIII, mit Ausnahme dessen, dass das 5'-Ende von Produkt IX einen Einschnitt in der Nukleinsäure enthält, der dem 5'-Bereich des zweiten Amplifizierungsprimer entspricht. In Schritt 12 unterläuft Produkt IX Primerverlängerung und Strangverdrängung, so dass Produkt X und Produkt XI entstehen. Produkt X ist das gleiche wie Produkt VIII. Produkt XI ist ein einzelstrangiges Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die der Sequenz in 3'-Richtung des Einschnittes auf dem eingeschnittenen Strang von Produkt IX entspricht. In Schritt 13 wird Produkt XI mittels des ersten Amplifizierungsprimer gebunden und in Schritt 14 resultiert Primerverlängerung in beiden Richtungen in Produkt XII. Produkt XII ist ein doppelstrangiges Nukleinsäuremolekül, das Produkt II in dem Sinne ähnlich ist, dass es in den oben beschriebenen Reaktionspfad im Anschluss an Schritt 6 und vor Schritt 7 eintreten kann. Folglich wird ein anfängliches Reaktionsprodukt des Ligations-abhängigen SDA-Pfades schließlich substanziell regeneriert.
Wie vorher beschrieben, kann die SDA-Reaktion unter Verwendung von verankerten Sonden durchgeführt werden. In Bezug auf die auf Ligation basierende SDA sind die verankerten Sonden vorzugsweise entweder einer der Amplifizierungsprimer oder beide Amplifizierungsprimer oder eine der Ligationssonden oder beide Ligationssonden.
Experimentelle Daten für BEISPIEL 10
Experiment 1
In diesem Beispiel wird ein generelles Protokoll für die bevorzugte, auf Ligation basierende SDA einer Zielnukleinsäure bereitgestellt. Konzentrationen und Volumina von Reaktionsbestandteilen und Zeit- und Temperaturprofile können angepasst werden wie benötigt. Die Volumenangaben setzen ein Reaktionsvolumen für die Ligation von 25 μL voraus und ein Endreaktionsvolumen für die SDA von 50 μL.
Zu einem Mikrozentrifugenröhrchen von 250 μL wird ein Aliquot von 5 μL einer wässrigen Lösung von Ligationssonden zugegeben, so dass die Endkonzentration jeder Sonde in einem Reaktionsvolumen für die Ligation von 25 μL 5 nM beträgt. Als nächstes werden 10 μL einer Lösung von nicht-spezifischer (Carrier) DNA (z.B. Kalbsthymus-DNA) zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 20–100 μL/mL erreicht wird. Als nächstes werden 5 μL der Probe in einer angemessenen Konzentration zugegeben, die die Template-Nukleinsäure enthält (z.B. Zelllysat oder gereinigte genomische DNA), und das Röhrchen wird bei 60°C für 3 Minuten zum Temperaturausgleich belassen. Nach dem Ausgleich werden 5 μL einer Lösung zugegeben, die eine thermostabile DNA-Ligase enthält, zusammen mit einer ausreichenden Menge einer Mischung an notwendigen Pufferbestandteilen 5-facher Stärke, so dass die Funktion der DNA-Ligase gestattet ist und damit die Sonde hybridisieren kann. (Siehe Tabelle IV.)
Die 25 μL an Ligationsreaktion wird bei 60°C für 15 Minuten inkubiert und dann werden 20 μL einer SDA-Vorratslösung, die zusätzliche Pufferbestandteile, dNTPs und Amplifizierungsprimer enthält, zugegeben, so dass endgültige Reaktionskonzentrationen (in 50 μL), wie in Tabelle V angegeben, erreicht werden. In einer Ausführungsform wird ein zusätzlicher Schritt eingefügt, bei dem die Reaktion auf 95°C für 3 Minuten aufgeheizt wird, so dass ligierte Sonden von den Templates denaturiert werden, und dann wird das Röhrchen bei 60°C für 3 Minuten equilibriert. Zu dieser Reaktionsmischung werden 5 μL einer Flüssigkeit zugegeben, die die SDA-Enzyme enthält, so dass die folgenden Endkonzentrationen in einem Endreaktionsvolumen von 50 μL erreicht werden:
BsoBI-Restriktionsenzym: 0,8 Enzymunits/μL (40 U/rxn)
Bst-DNA-Polymerase: 0,32 Enzymunits/μL (16 U/rxn).
Die Reaktionsmischung wird bei 60°C für 30 Minuten inkubiert, dann wird die Reaktion gestoppt, indem die Reaktionsmischung auf Eis gestellt wird.
Tabelle IV
Tabelle V
Experiment 2
In diesem weiteren Beispiel wird das potentiell in einer Probe vorhandene Salmonella spaQ-Gen (von dem ein Teil in 23d eingezeichnet ist und das als SEQ ID Nr. 41 bezeichnet ist) amplifiziert. Dem Reaktionsprotokoll, das in Experiment 1 beschrieben ist, wird gefolgt unter der Verwendung den Ligationssonde LP1 (SEQ ID Nr. 37) und LP2 (SEQ ID Nr. 38) und der Amplifizierungsprimer S1 (SEQ ID Nr. 39) und S2 (SEQ ID Nr. 40), die in 23(d) dargestellt sind. Das in Experiment 2 beschriebene Beispiel soll allgemeine Anwendbarkeit aufweisen. Man könnte verschiedene Ziel-spezifische Ligationssonden herstellen zur Verwendung mit dem Amplifizierungsprimern S1 und S2, indem die Sequenzen der Ligationssonden L1 und L2, die komplementär zu dem spaQ-Gen sind, ersetzt werden durch Sequenzen, die zu irgendeiner anderen interessierenden Zielnukleinsäure komplementär sind. Außerdem können Amplifizierungsprimer S1 und S2, wie die in 23(d) abgebildeten, in einer Mehrfach-Amplifizierung von mehr als einer Zielnukleinsäure verwendet werden.
Experiment 3
Bei hohen Konzentrationen an Ligationssonde kann die Ligase die Ligation der Ligationssonden in einer Ziel-unabhängigen Weise katalysieren. Die daraus resultierende ligierte Sonde kann SDA unterstützen und so ein falsch positives Signal bewirken. In diesem weiteren Beispiel ist ein bevorzugter Aspekt der Ligations-abhängigen SDA beschrieben, bei der dieses Problem überwunden ist, indem die Ligationssonden anfangs unfähig gemacht werden, mittels der Ligase zusammen ligiert zu werden. In dieser Ausführungsform wird ein Paar an unligierbaren Sonden ligierbar gemacht, so dass Ziel-spezifische, Ligations-abhängige SDA ermöglicht wird.
Im Allgemeinen kann die Amplifizierung eines Hintergrund-Moleküls, das Ziel-unabhängig ist, verhindert werden, indem die Enden der innerhalb des Ligations-Verbindungspunktes beteiligten Ligationssonden modifiziert werden. Dies kann auf verschiedene Weisen stattfinden. Eine solche Modifizierung umfasst die Modifizierung (darunter Entfernen, Blockade etc.) der 3'-Hydroxylgruppe, die an dem 3'-terminalen Nukleotid der zweiten Ligationssonde (der Aufwärts-Sonde) vorhanden ist.
Eine weitere solche Modifizierung umfasst die Modifizierung (darunter Entfernen, Blockade etc.) der 5'-Phosphatgruppe, die an dem 5'-terminalen Nukleotid der ersten Ligationssonde (der Abwärts-Sonde) vorhanden ist. Verschiedene Verfahren wurden empfohlen und können empfohlen werden, in denen das Entfernen und/oder Veränderung dieser Modifikationen vorzugsweise in der Gegenwart von Ziel-DNA stattfindet.
Speziell ein Aspekt dieses Beispiels stellt eine Änderung der 3'-Hydroxylgruppe, die an dem 3'-terminalen Nukleotid der zweiten Ligationssonde (der Aufwärts-Sonde) vorhanden ist, so dass eine Ligation der stumpfen Enden zwischen den Ligationssonden verhindert wird. Die modifizierte, unligierbare Sonde wird unter Verwendung einer Endonuklease, vorzugsweise Endonuklease IV, für die Ligation kompetent gemacht. Dieses Reagens kann 3'-terminale Nukleotide aus Oligonukleotiden herausschneiden und wird somit zum Herausschneiden des 3'-terminalen Nukleotids der zweiten Ligationssonde genutzt, so dass ein neues 3'-terminales Nukleotid mit einer 3'-Hydroxylgruppe enthüllt ist. Diese Reaktion ist mehr bevorzugt, wenn das Substrat der Ligationssonde mit Ziel-DNA verknüpft ist, und weniger bevorzugt, wenn das Substrat der Ligationssonde nicht mit anderen DNA-Molekülen verknüpft ist. Daraus ergibt sich, dass, sobald die Ligationssonden an Ziel-DNA gebunden sind, die Endonuklease (vorzugsweise Endonuklease IV) das 3'-terminale Nukleotid der zweiten Ligationssonde herausschneiden kann, so dass ein neues 3'-terminales Nukleotid mit einer 3'-Hydroxylgruppe enthüllt ist. Die freie 3'-Hydroxylgruppe der zweiten Ligationssonde, zusammen mit der freien 5'-Phosphatgruppe der ersten Ligationssonde, sind nun neue Substrate für die Ligation mittels DNA-Ligase.
Da Endonuklease dazu tendiert, effizienter zu wirken, wenn das Substrat-Oligonukleotid doppelstrangig ist, wird sie vorzugsweise das 3'-terminale Nukleotid der zweiten Ligationssonde herauszuschneiden, wenn diese Sonde an Ziel-DNA gebunden ist, nicht, wenn sie frei in Lösung vorliegt. Da die Endonuklease vorzugsweise die anfänglich Ligations-inkompetenten Ligationssonden kompetent für die Ligation macht, wenn sie in der Gegenwart von Ziel-DNA vorliegen, ist die Ziel-unabhängige Amplifizierung von Hintergrund-Molekülen verringert.
Ein weiterer Aspekt dieses Beispiels stellt die Modifizierung (darunter Entfernen, Blockade etc.) der 5'-Phosphatgruppe, die an dem 5'-terminalen Nukleotid der ersten Ligationssonde (der Abwärts-Sonde) vorhanden ist, so dass Ligation stumpfer Enden zwischen den Ligationssonden verhindert wird. Die modifizierte, unligierbare Sonde wird kompetent gemacht für die Ligation unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Exonukleaseaktivität. Dieses Reagens lässt DNA-Polymerisation (neue DNA-Synthese) von dem 3'-Ende der Aufwärts-Sonde (der zweiten Ligationssonde) in das 5'-Ende der Abwärts-Sonde (der ersten Ligationssonde) hinein stattfindet. Wenn die Polymerase das 5'-Ende der ersten Ligationssonde berührt, wird sie beginnen, Nukleotide vom 5'-Ende her herauszuschneiden. Während sie Nukleotide aus der ersten Ligationssonde herausschneidet, werden Nukleotide an dem 3'-Ende der zweiten Ligationssonde hinzugefügt. In der Quintessenz bewegt dies die „Lücke" zwischen der ersten Ligationssonde und der zweiten Ligationssonde, wobei der Verbindungspunkt mittels Ligase von 5' zu 3' ligiert wird. Der Grad des Herausschneidens und des Ersetzens kann begrenzt werden, indem die Menge und/oder der Typ der frei in Lösung vorhandenen Nukleotide kontrolliert wird. Im Anschluss an die Abspaltung der Polymerase enthält der Verbindungspunkt eine freie 3'-Hydroxylgruppe und eine freie 5'-Phosphatgruppe, die beide Substrate für die Ligation mittels DNA-Ligase darstellen. Wie oben angegeben, wird diese Reaktion mehr bevorzugt, wenn das Substrat der Ligationssonde mit Ziel-DNA verknüpft ist und weniger bevorzugt, wenn das Substrat der Ligationssonde nicht mit anderen DNA-Molekülen verknüpft ist. Dies verhält sich wiederum so, weil die Reaktion, die die Ligationssonden ligierbar macht, es vorzieht, dass die Ligationssonden verknüpft vorliegen, so dass dsDNA gebildet wird. Wie es für den Fachmann verständlich ist, wird solches Verknüpfen eher für Ziel-DNA bevorzugt als das Verknüpfen mit Nicht-Ziel-DNA. Folglich ist die unabhängige Amplifizierung von Hintergrund-Molekülen verringert.
Wiederum ein anderer Aspekt dieses Beispiels stellt Blockieren der Ligation unter Verwendung von Fehl-Basenpaarung bereit. Hier wird Ligation zwischen der ersten Ligationssonde und der zweiten Ligationssonde verhindert, indem das 5'-Ende der Abwärts-Sonde (der ersten Sonde) ein Basenpaar mit Fehlpaarung oder mehr Basenpaare mit Fehlpaarung aufweist. Wenn eine Sonde eine Basen-Fehlpaarung enthalten soll, sollte dies so verstanden werden, dass die Sonde ein Nukleotid aufweist, das nicht zu Ziel-DNA-Sequenzen komplementär ist, in einem Bereich der Sonde, die sonst zu der Ziel-DNA komplementär ist. Fehlgepaarte Basen verhindern Ligation mittels DNA-Ligase, bis die Basen mit Fehlpaarung herausgeschnitten sind, wie in dem oben genannte Beispiel mit DNA-Polymerase.
Zur Demonstration des Aspekts der Exonuklease/Ligase-abhängigen SDA (XL-SDA) dieser Erfindung, wie in diesem weiteren Beispiel beschrieben, wurden die neun Sätze an Ligationssonden aus Tabelle VI synthetisiert. Diese Sonden wurden zum Identifizieren der verschiedenen gezeigten Bakterienstämme gestaltet. Die Sonden weisen Bereiche auf, die komplementär zu den spezifischen bakteriellen Genen sind und zu Bereichen für das Binden der Primer für die SDA-Amplifizierung.
Tabelle VI
Die Sonden wurden zu identischen Sätzen von Ligations-SDA-Reaktionen zugegeben, so dass die Anzahl an Sätzen an Ligationssonden in den Reaktionen in dieser Reihenfolge zunahm: 1 Satz (spaQ), 5 Sätze (spaQ, stx₁, stX₂, sodB, ipaH), 6 Sätze (wie 5 + lcrV), 7 Sätze (as 6 + asd), 8 Sätze (wie 7 + eaeA), 9 Sätze (wie 8 + gnd), und so dass die Endkonzentration jeder Sonde 5 nM betrug.
Ein Vollextrakt von genomischer DNA aus Salmonella enteritidis wurde als Template so zugegeben, dass die geschätzte Zahl an genomischen Äquivalenten entweder 10⁵, 10⁴, 10³ oder Null als eine Negativkontrolle war. XL-SDA-Reaktionen wurden wie unten beschrieben durchgeführt und die Reaktionsprodukte sowohl mittels Acrylamid-Gelelektrophorese als auch mittels elektronischen Hybridisierens auf einer Mikroelektroden-Matrix durchgeführt.
XL-SDA-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt, obwohl die Konzentrationen und Volumina der Reaktionsbestandteile und Zeit-/Temperatur-Profile wie benötigt angepasst werden können. Die verwendeten Volumina setzen ein Reaktionsvolumen der Ligation von 25 μL voraus und ein Endreaktionsvolumen für SDA von 50 μL.
In einem Mikrozentrifugenröhrchen von 250 μL wurden Lösungen der folgenden Reagenzien kombiniert, so dass die gegebenen Endkonzentrationen erreicht wurden: (1) zwei (oder mehr) Ziel-spezifische Ligationssonden (z.B. Sonde exo-LP1, die eine 5'-Sequenz aufweist, die im Wesentlichen zu einem Bereich der interessierenden Zielsequenz komplementär ist, und eine 3'-Sequenz, die zu einem universellen Amplifizierungsprimer komplementär ist, und Sonde exo-LP2, die eine 3'-Sequenz aufweist, die im Wesentlichen zu einem Bereich der Zielsequenz komplementär ist, die abwärts von LP1 positioniert ist, und eine 5'-Sequenz, die mit einem zweiten universellen Amplifizierungsprimer identisch ist), so dass Sondenkonzentrationen von 5 nM für jede Sonde erreicht werden; und (2) eine Lösung, die die interessierende Ziel-DNA enthält.
Die Exonuklease-/Ligationsreaktion wurde mittels Zugabe des Folgenden gestartet: eine thermostabile DNA-Ligase (wie Taq-DNA-Ligase oder Pfu-DNA-Ligase); eine thermostabile DNA-Polymerase mit 5'→3'-Exonukleaseaktivität (wie Taq-DNA-Polymerase); Puffersalze, so dass die unten in Tabelle VII gegebenen Endkonzentrationen erreicht werden; und dATP zu 2,8 mM in einem Reaktionsvolumen von 25 μL.
Tabelle VII
Die Ligations-/Exonuklease-Reaktion wurde bei 60°C für 15–30 Minuten inkubiert. Dann wurden 20 μL einer SDA-Vorratsmischung zugegeben, die zusätzliche Pufferbestandteile enthält, eine Mischung von dNTPs, so dass die Endkonzentration alle vier dNTPs enthält, und Amplifizierungsprimer, so dass die Endkonzentrationen (in 50 μL) aus Tabelle VIII erreicht werden.
Tabelle VIII
Dann werden 5 μL einer, die SDA-Enzyme enthaltenden Lösung zugegeben, so dass die folgenden Endkonzentrationen erreicht werden: BsoBI-Restriktionsenzym zu 0,8 Enzymunits/μL (40 U/rxn) und Bst-DNA-Polymerase zu 0,32 Enzymunits/μL (16 U/rxn). Diese Reaktionsmischung wird dann bei 60°C für 30 Minuten inkubiert, so dass die SDA-Reaktion stattfinden kann. Die Reaktion wird gestoppt, indem sie auf Eis gestellt wird, und die amplifizierten Produkte werden nachgewiesen.
Die hergestellten Reaktionsprodukte wurden sowohl mittels einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese als auch mittels elektronischen Hybridisierens auf einer Mikroelektroden-Matrix analysiert. Eine Analyse von 5 μL der XL-SDA-Reaktionen mittels Acrylamid-Gelelektrophorese zeigte, dass ein spezifisches Amplifizierungsprodukt auf eine von der Template-Konzentration abhängigen Weise in allen Kombinationen von Ligationssonden hergestellt wird. Zur Demonstration spezifischer Amplifizierung der spaQ-Gensequenz von Salmonella enteritidis wurden die Reaktionsprodukte der Ligations-SDA auf einem Mikroelektroden-Array analysiert, auf der spezifische Bindungssonden für fünf der bakteriellen Gene vorher an bestimmten Positionen angeordnet waren. 24 zeigt, dass in allen analysierten Proben die spaQ-Sequenz nachgewiesen wurde.
Das Vorangegangene ist dazu bestimmt, die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen, und ist nicht dazu bestimmt, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken. Eine Vielzahl an Variationen und Modifikationen der vorliegenden Erfindung können ausgeführt werden, ohne von dem wahren Geist und der Bandbreite der Erfindung abzuweichen. Wie für jeden Fachmann verständlich ist, kann jede der Ausführungsformen, wie oben veröffentlicht, zusammen in beliebiger Kombination verwendet werden. Zum Beispiel kann SDA in Verbindung mit einem elektronisch adressierbaren Mikrochip durchgeführt werden, wobei die für eine Zielnukleinsäure spezifischen Amplifizierungsprimer (so wie verzweigte Primerpaare oder unverzweigte Primerpaare, die zu Ligationssonden komplementäre Sequenz aufweisen, oder andere interessierende Zielnukleinsäuren) an einem elektronisch adressierbaren Bindungskissen verankert sind, die Zielnukleinsäure elektronisch an solche Bindungskissen adressiert ist und SDA unter hohem Druck durchgeführt wird. In einem weiteren Beispiel kann SDA in Verbindung mit einem elektronisch adressierbaren Mikrochip durchgeführt werden, wobei Allel-spezifische Amplifizierungsprimer (so wie verzweigte Primerpaare oder unverzweigte Primerpaare) auf einem elektronisch adressierbaren Bindungskissen verankert sind, Zielnukleinsäure an solche Bindungskissen elektronisch adressiert sind und SDA unter hohem Druck oder alternativ bei atmosphärischem Druck durchgeführt wird. In wiederum einem anderen Kombinationsbeispiel kann SDA in Verbindung mit einem elektronisch adressierbaren Mikrochip durchgeführt werden, wobei die SDA-Reaktion unter Verwendung von nicht-spaltbaren Primern oder unter asymmetrischen Amplifizierungsbedingungen durchgeführt wird. Zusätzlich können andere Kombinationen auf Ligation basierende SDA in Verbindung mit dem elektronisch adressierbaren Mikrochip entweder unter erhöhtem Druck oder unter normalem atmosphärischem Druck aufweisen. Wie für jeden Fachmann verständlich ist, sind viele andere Kombinationen möglich.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf spezifische Änderungen beschrieben wurde, sollen die Details davon nicht als Einschränkungen aufgefasst werden, da es offensichtlich ist, dass auf verschiedene Äquivalente, Änderungen und Modifikationen zurückgegriffen werden kann, ohne von ihrem Geist und ihrer Bandbreite abgewichen wird, und es versteht sich, dass solche äquivalenten Ausführungsformen hierin aufgenommen sein sollen.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Amplifizierung von einer interessierenden Zielnukleinsäure oder mehr interessierenden Zielnukleinsäuren in einer Probe oder mehr Proben unter Verwendung eines bioelektronischen Mikrochips, aufweisend: a) Einführen von mindestens einer der Zielnukleinsäuren auf einen bioelektronischen Mikrochip, der eine Vielzahl von adressierbaren Bindungsstellen aufweist; b) elektronisches Adressieren der Zielnukleinsäuren an mindestens eine Bindungsstelle, an der erste SDA-Oligonukleotidprimer und zweite SDA-Oligonukleotidprimer angebracht sind, die die Fähigkeit haben, Strangverdrängungsamplifizierung zu unterstützen, wobei der erste Primer und der zweite Primer eine Erkennungssequenz für Restriktionsendonuklease strangaufwärts einer Sequenz aufweisen, die für die zu verstärkende Zielnukleinsäure spezifisch ist; c) Hybridisieren der zu amplifizierenden Zielnukleinsäure an mindestens dem ersten SDA-Primer; d) Kontaktieren der hybridisierten Zielnukleinsäure mit Enzymen und Reagenzien, die notwendig sind, um Strangverdrängungsamplifizierung zu unterstützen, eingeschlossen einer Restriktionsendonuklease, die die Erkennungssequenz für Restriktionsendonuklease erkennt, ferner eingeschlossen ein ungleiches effektives Konzentrationsverhältnis des ersten SDA-Primer zu dem zweiten SDA-Primer, wobei der erste SDA-Primer und der zweite SDA-Primer einen Satz an Primern bilden; und e) Amplifizieren der Zielnukleinsäure durch Strangverdrängungsamplifizierung zur Herstellung einer unsymmetrischen Population von Amplicon-Arten, wobei die Amplifizierung aufweist: i) Verlängern des ersten SDA-Primer, an den die Zielnukleinsäure hybridisiert wurde, so dass ein Amplicon des ersten Primer gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, an die der für die Zielnukleinsäure spezifische Teil des zweiten Primer hybridisiert; ii) Abspalten des Amplicons des ersten Primer von Zielnukleinsäure in mindestens dem Bereich, an den der für die Zielnukleinsäure spezifische Teil des zweiten Primer hybridisiert; und iii) Hybridisieren von mindestens einem Teil der Amplicons des ersten Primer an unmittelbar benachbarte zweite SDA-Primer und Verlängerung der unmittelbar benachbarten zweiten SDA-Primer, so dass Amplicons des zweiten Primer gebildet werden, die an die Erkennungsstelle für Endonuklease der Amplicons des ersten Primer hybridisiert sind, wobei ein Amplicon hergestellt wird, das fähig ist, Strangverdrängungs-Selbstamplifizierung zu unterstützen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zielnukleinsäuren aus mehr als einer Probe amplifiziert werden, ferner aufweisend das Durchführen der Schritte (a) bis (e) für die Zielnukleinsäuren jeder zusätzlichen Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei Kontaktierungsschritt (d) und Amplifizierungsschritt (e) gleichzeitig für die Zielnukleinsäuren von mehr als einer Probe ablaufen.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei mindestens einige der Amplicon-Arten an der Bindungsstelle verankert sind.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, ferner aufweisend einen Spülschritt vor Schritt (d).
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die hybridisierte Zielnukleinsäure ferner in Schritt (d) mit mindestens einem ersten Bumper Primer kontaktiert ist, der an einen Teil der Zielnukleinsäure hybridisiert, der sich strangaufwärts des Teils der Zielnukleinsäuresequenz befindet, an den der erste SDA-Primer hybridisiert; und wobei die Abspaltung aus Schritt (e) durchgeführt wird, indem die Zielnukleinsäure von dem hybridisierten Komplex Amplicon des ersten Primer/Zielnukleinsäure durch Hybridisierung und Verlängerung des ersten Bumper Primer entfernt wird.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, ferner aufweisend das Durchfließen einer genügend negativen Ladung durch die Elektrode, die der Bindungsstelle zugeordnet ist, so dass in Schritt (c) gebildete, nicht-zusammenpassende hybridisierte Zielnukleinsäuren entfernt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der erste SDA-Primer ein verlängerbarer und spaltbarer Strangaufwärts-Primer ist und der zweite SDA-Primer ein verlängerbarer und spaltbarer Strangabwärts-Primer ist, wobei beide Primer eine Erkennungssequenz für Endonuklease aufweisen und der erste SDA-Primer für die Zielnukleinsäure spezifisch ist und der zweite SDA-Primer spezifisch ist für eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem Teil der Zielnukleinsäure strangabwärts von dem ersten SDA-Primer komplementär ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei mindestens einer der ersten SDA-Primer und der zweiten SDA-Primer in dem Aufbau an einem Substrat verankert sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 8 oder 9, wobei das ungleiche effektive Konzentrationsverhältnis erreicht wird, indem mindestens einer der SDA-Primer des Sets in molarem Überschuss verglichen mit dem anderen SDA-Primer im Satz bereitgestellt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 8 oder 9, wobei das ungleiche effektive Konzentrationsverhältnis erreicht wird, indem in der Verstärkungsreaktion ein Konkurrent für entweder den ersten SDA-Primer oder den zweiten SDA-Primer bereitgestellt wird und wobei der Konkurrent aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: nicht-verlängerbaren Konkurrenten, nicht-spaltbaren Konkurrenten und Konkurrenten, die nicht-verlängerbar und nicht-spaltbar sind.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Konkurrent an einem Substrat verankert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Konkurrent in Lösung vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Konkurrent ein nicht-verlängerbarer Konkurrent ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der Konkurrent eine nicht-verlängerbare 3'-Modifikation aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: einem bezüglich der Basen nicht-zusammenpassenden 3'-Ende, einer 3'-Didesoxy-Nukleinsäure und einer blockierenden Gruppe, die an die 3'-Hydroxylgruppe der 3'-terminalen Nukleinsäure gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Konkurrent ein nicht-spaltbarer Konkurrent ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei der nicht-spaltbare Konkurrent eine aus der Gruppe ausgewählte Nukleinsäure aufweist, bestehend aus: methylierte Nukleinsäuren und phosphorothiolierte Nukleinsäure, oder wobei der nicht-spaltbare Konkurrent eine aus der Gruppe ausgewählte modifizierte Nukleinsäure aufweist, bestehend aus 2'-Desoxyadenosin 5'-O-(1-Thiotriphosphat), 5-Methyldesoxycytidin 5'-Triphosphat, 2'-Desoxyuridin 5'-Triphosphat und 7-Desaza-2'-Desoxyguanosin 5'-Triphosphat.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der SDA-Primer, mit dem der Konkurrent nicht konkurriert, markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der SDA-Primer, der in molarem Überschuss vorhanden ist, markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, eine Chemilumineszenz-Markierung, eine Elektrochemilumineszenz-Markierung oder Biotin.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Fluoreszenzmarkierung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bodipy-Derivaten, Cyaninderivaten, Fluoresceinderivaten und Rhodaminderivaten.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Allel-spezifische Strangverdrängungsamplifizierung für interessierende Zielnukleinsäuren durchgeführt wird, die für ein Gen mit zwei bekannten Allelen oder mehr bekannten Allelen kodieren, wobei in Schritt (b) die Zielnukleinsäuren elektronisch an mindestens zwei Bindungsstellen adressiert sind, an die erste SDA-Oligonukleotidprimer und zweite SDA-Oligonukleotidprimer gebunden sind, die die Fähigkeit aufweisen, Strangverdrängungsamplifizierung zu unterstützen, wobei der erste Primer und der zweite Primer eine Erkennungssequenz für Restriktionsendonuklease strangaufwärts einer für die zu verstärkende Zielnukleinsäure spezifische Sequenz aufweisen, und wobei, für jede von mindestens zwei Bindungsstellen mindestens einer der ersten verankerten SDA-Primer oder der zweiten verankerten SDA-Primer spezifisch ist für ein bestimmtes Allel des Gens, für das die interessierende Zielnukleinsäure kodiert, wobei der für ein bestimmtes Allel spezifische Primer ein 3'-Ende aufweist, das vollständig komplementär zu dem bestimmten Allel ist, das aber nicht vollständig komplementär zu anderen Allelen des Gens ist, und wobei in Schritt (e) durch Strangverdrängungsamplifizierung an Bindungsstellen Amplicons hergestellt werden, die SDA-Primer enthalten, die spezifisch für Allele des Gens sind, das innerhalb der Zielnukleinsäure enthalten ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei das Gen zwei bekannte Allele aufweist und die Zielnukleinsäuren an zwei Bindungsstellen adressiert sind, oder wobei das Gen eine Vielzahl von bekannten Allelen aufweist und die Zielnukleinsäuren an eine Vielzahl von Bindungsstellen adressiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die SDA-Primer, die speziell für spezifische Allele sind, an ihrer letzten 3'-Nukleinsäure nicht zu anderen Allelen komplementär sind, oder wobei die SDA-Primer, die speziell für spezifische Allele sind, an ihrer vorletzten 3'-Nukleinsäure nicht zu anderen Allelen komplementär sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, ferner aufweisend den Schritt, Amplicon-Arten an den Bindungsstellen zu detektieren, wobei beim Detektieren der Amplicon-Arten an den Bindungsstellen die Zielnukleinsäuren der Probe als homozygot oder heterozygot für das Gen unterschieden werden können.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei mindestens eine zusätzliche Zielnukleinsäure gleichzeitig mit der ersten Zielnukleinsäure verstärkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei mindestens drei Zielnukleinsäuren gleichzeitig amplifiziert werden, oder mindestens vier Zielnukleinsäuren gleichzeitig verstärkt werden.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Amplifizierung der Zielnukleinsäure unter erhöhtem Luftdruck durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei der erhöhte Luftdruck zwischen 100 und 500 Atmosphären liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9, wobei der erste SDA-Primer und der zweite SDA-Primer innerhalb einer verankerten verzweigten Primerstruktur vorliegen, die die Fähigkeit aufweist, Strangverdrängungsamplifizierung zu unterstützen.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei der verzweigte Primer durch eine Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung verankert ist, oder wobei der verzweigte Primer durch eine kovalente Bindung verankert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei der verzweigte Primer durch Bindung des ersten SDA-Primer und des zweiten SDA-Primer an eine Aminosäure gebildet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Aminosäure Lysin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei der verzweigte Primer durch Bindung des ersten SDA-Primer und des zweiten SDA-Primer an ein aus der Gruppe ausgewähltes Abstandshalter-Molekül gebildet ist, bestehend aus Polyethylenglykol-Polymeren, Polyaminosäuren und einer polyfunktionalen Aminosäure, die mit zwei Nukleinsäure-Oligomeren derivatisiert wurde.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9, wobei der erste SDA-Primer und der zweite SDA-Primer einzeln verankert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei der erste SDA-Primer und der zweite SDA-Primer durch eine Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung verankert sind, oder wobei der erste SDA-Primer und der zweite SDA-Primer durch eine kovalente Bindung verankert sind.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Restriktionsendonuklease, die die Erkennungssequenz für Restriktionsendonuklease erkennt, aus BstBNI besteht, oder wobei die Restriktionsendonuklease, die die Erkennungssequenz für Restriktionsendonuklease erkennt, aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: HincII, HindII, BsoBI, AvaI, Fnu4HI, Tthl11I und NciI, oder wobei die Restriktionsendonuklease, die die Erkennungssequenz für Restriktionsendonuklease erkennt, aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: BstXI, BsmI, BsrI, BsaI, NlaV, NspI, PflMI, HphI, AlwI, FokI, AccI, TthIIII, MraI, MwoI, BsrBI, BstNI, BstOI und BsmAI.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zielnukleinsäure ferner in dem Amplifizierungsschritt mit mindestens einer modifizierten Nukleinsäure kontaktiert ist, wobei die Modifizierung Spaltung eines Polynukleotids durch die Restriktionsendonuklease verhindert, das die modifizierte Nukleinsäure enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei die modifizierte Nukleinsäure methyliert oder phosphorothioliert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei die modifizierte Nukleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 2'-Desoxyadenosin 5'-O-(1-Thiotriphosphat), 5-Methyldesoxycytidin 5'-Triphosphat, 2'-Desoxyuridin 5'-Triphosphat und 7-Desaza-2'-Desoxyguanosin 5'-Triphosphat.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, ferner umfassend einen Schritt, eine Amplicon-Art oder mehr Amplicon-Arten zu detektieren.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei die Amplicons durch mindestens eine aus der Gruppe ausgewählte Methode detektiert werden, bestehend aus Fluoreszenzdetektion, Chemilumineszenz-Detektion und Elektrochemilumineszenz-Detektion.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei durch Hybridisierung einer markierten Oligonukleotid-Sonde an die Amplicon-Arten detektiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 41, ferner aufweisend einen Schritt, in dem thermisch Arten von einzelstrangigen Nukleinsäuren aus allen Arten von doppelstrangigen Amplicons vor dem Detektionsschritt hergestellt werden, oder ferner aufweisend einen Schritt, in dem elektronisch Arten von einzelstrangigen Nukleinsäuren aus allen Arten von doppelstrangigen Amplicons vor dem Detektionsschritt hergestellt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei durch Eingliederung eines markierten Nukleotids in das Amplicon detektiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 41 bis 45, wobei der Ammplifizierungsschritt und der Detektionsschritt gleichzeitig zueinander auftreten.