DE19808534A1

DE19808534A1 - Verfahren zum Nachweis hochkonzentrierter Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE19808534A1
Application number: DE19808534A
Authority: DE
Inventors: Peter Ebert; Stefanie Koehler; Volker Schlueter
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-02-28
Filing date: 1998-02-28
Publication date: 1999-09-02
Also published as: WO1999043849A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis hochkonzentrierter Analyt nukleinsäuren in einer Probe mittels asymmetrischer Amplifikation sowie die Verwendung der asymmetrischen Nukleinsäureamplifikation zur Reduzierung oder Vermeidung falsch negativer Ergebnisse, zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren und zur Erhöhung des dynamischen Meßbereichs bei Nukleinsäurenachweisreaktionen.

Zum Nachweis von viralen und bakteriellen Erregern setzt sich neben der immunologischen Detektion mit Hilfe von Antikörpern immer stärker der Nachweis von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) durch. Im Allgemeinen beinhaltet die Detektion eines DNA/RNA-Abschnittes 3 Schritte, nämlich Probenvorbereitung, Amplifikation der Zielsequenz mittels Targetampli fikationsverfahren und Detektion des Amplicons.

Die Probenvorbereitung beinhaltet üblicherweise die Freisetzung der Nukleinsäuren aus Kom partimenten, in denen sie enthalten sind, z. B. Zellyse, aber auch Vorreinigung, z. B. zur Ent fernung von PCR-Inhibitoren der Probe.

Die am weitesten verbreitete Methode zur Amplifikation von Nukleinsäuren ist die Poly merase Chain Reaction (PCR), die von Saiki et al. (Science 230, 1350-1354, 1985, US-A-4,683,202) entwickelt wurde. Bei der ursprünglichen Anwendung wurden 2 Primer mit gleicher Konzentration eingesetzt. Die Anwendung einer asymmetrischen PCR wurde erst mals 1985 von Gyllensten et al. (PNAS (USA) 85, 7652-7656) beschrieben. Als Hauptanwen dung für diesen experimentellen Ansatz sind Sequenzierreaktionen zu nennen, bei denen ein markierter Primer in einem Überschuß von 100 : 1 bis 1000:1 eingesetzt wird, um möglichst eine einzelsträngige Nukleinsäure zu generieren (WO 90/03444, US-A-5,066,584; WO 90/03442, US-A-5,075,216). In anderen Publikationen wird ein asymmetrischer PCR-Ansatz benutzt, um Sequenzvariationen nachzuweisen (JP-08298998). Eine Anwendung der asym metrischen PCR wird in WO 91/13174 beschrieben. Als Hauptvorteil wird dabei eine erhöhte Sensitivität beim Nachweis der Fluoreszenz beschrieben. Als Grund für diese verbesserte Sen sitivität nennen die Autoren eine Minderung der Kompetition mit dem komplementären Strang. Die Detektion erfolgt hier mittels Gelshift-Analyse. Dieses Verfahren ist jedoch unge nügend quantifizierbar und praktisch nicht automatisierbar.

Die Detektion kann mittels verschiedener Verfahren erfolgen, z. B. Analyse nach Gel elektrophorese (+ Southernblot), Dot-Blot-Analyse oder ELISA-Techniken.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens für Nukleinsäuren mit erhöhtem dynamischen Meßbereich.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß bei Durchführung einer asymmetrischen PCR die Signaldynamik in der Detektion massiv verbessert werden kann und ein "Hook-Effekt" bei hohen Amplifikationskonzentrationen der Detektion zu höheren Konzentrationen hin ver schoben oder sogar vermieden werden kann. Die Signallage kann überraschenderweise bis zu einem Faktor von 10 verbessert werden. Darüber hinaus kann der gesamte Meßbereich der Detektion ausgeschöpft werden. Ein Abfallen der Signale bei hoher Analytkonzentration, durch die eine quantitative Bewertung der Konzentration des Analyten unmöglich wird, kann so vermieden werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis einer hochkonzentrierten Analytnukleinsäure in einer Probe, enthaltend die Schritte Zugabe von mindestens zwei Primern, von denen das Verlängerungsprodukt des einen Primers als Templat für die Ver längerung des anderen Primers dienen kann, zu der Probe und Inkubation des gebildeten Ge misches unter Bedingungen, bei denen in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Analyt nukleinsäure zu jedem der Primer Verlängerungsprodukte gebildet werden, Bindung einer markierten einzelsträngigen Sonde an eines der beiden Verlängerungsprodukte unter Bildung eines Bindeproduktes und Immobilisierung der Verlängerungsprodukte an einer festen Ober fläche, wobei die beiden Sorten von Primern in einem stöchiometrischen Verhältnis von zwi schen 1,5 : 1 und 10 : 1 eingesetzt werden.

In Fig. 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gezeigt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Ge biet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im Folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Hames und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strate gy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridi sation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die Herstellung von markierten Nukleosidtriphosphaten, wie sie in EP-B-0 324 474 beschrieben sind, die chemische Synthese von modifizierten und un modifizierten Oligonukleotiden, die Spaltung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsen zymen, die Auswahl von Hybridisierungsbedingungen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die vom Ausmaß der Homologie zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäu ren, deren GC-Gehalt und deren Länge abhängt sowie die Bildung von Nukleinsäuren aus Nukleosidtriphosphaten mit Hilfe von Polymerasen, gegebenenfalls unter Verwendung von sogenannten Primern.

Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise radioaktive (³²P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen oder Metallatome. Indirekt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame Verbindungen, wie Antikörper, Antigene, Haptene oder Enzyme oder enzymatisch aktive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Hap tene, da an mit ihnen markierte Nukleosidtriphosphate im allgemeinen besonders gut als Sub strate von Polymerasen einsetzbar sind und eine anschließende Reaktion mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten oder das haptenisierte Nukleosid leicht vorgenommen werden kann. Solche Nukleosidtriphosphate sind beispielsweise Brom-Nukleosidtriphosphate oder Digoxigenin-, Digoxin- oder Fluorescein-gekoppelte Nukleosidtriphosphate. Als besonders geeignet haben sich die in EP-A-0 324 474 genannten Steroide und deren Detektion erwiesen. Für deren Inkorporation in Nukleinsäuren wird hiermit auf die EP-A-0 324 474 verwiesen.

Nukleosidtriphosphate (NTP) sind Ribo (rNTP)- oder Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP). Unter einer Analytnukleinsäure wird eine Nukleinsäure verstanden, die Ziel des Nachweises ist. Unter einer hochkonzentrierten Analytnukleinsäure wird eine Nukleinsäure verstanden, die in der Reaktionsmischung zu mehr als 10⁵ Genomäquivalente enthalten ist oder sein kann. Die Obergrenze der Konzentration liegt bei ca. 10¹² Genomäquivalenten/ml. Die Angabe der Konzentration, insofern von hochkonzentrierten Analytnukleinsäuren gespro chen wird, bezieht sich auf die Konzentration der Analytnukleinsäure in der PCR-Reaktions mischung vor Start der Amplifikation, die für die Durchführung der Amplifikation bereitsteht, ohne daß diese nochmals verdünnt wird.

Unter Analytnukleinsäuren sind Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs zu verstehen, beispiels weise Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sie können in Lösung, Suspension, aber auch an Festkörpern fixiert oder in zellhaltigen Medien, Zellab strichen, fixierten Zellen, Gewebsschnitten oder fixierten Organismen vorliegen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung vor.

Eine Templatnukleinsäure ist eine Nukleinsäure, zu der ein im wesentlichen komplementärer Nukleinsäurestrang neu gebildet wird. In Bezug auf die Sequenzinformation dient die Tem platnukleinsäure als Matrize für die Umschreibung.

Denaturierung von Nukleinsäuren bedeutet Auftrennung von Nukleinsäuredoppelsträngen in Einzelstränge. Dem Fachmann stehen prinzipiell eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Ver fügung, z. B. Behandlung durch Alkalihydroxide, durch Hitze, oder durch Chemikalien.

Unter einer zu einer Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz werden Nukleinsäuren oder Sequenzen verstanden, die mit der ent sprechenden Nukleinsäure hybridisieren können, deren Nukleotidsequenz im hybridisierenden Bereich jeweils für direkt aufeinanderfolgende Basen entweder genau komplementär zu der anderen Nukleinsäure ist oder sich in wenigen Basen von der genau komplementären Nukleinsäure unterscheidet. Die Spezifität richtet sich dabei sowohl nach dem Grad der Komplementarität als auch nach den Hybridisierungsbedingungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine spezielle Ausführungsform einer Amplifikation, insbesondere der Polymerase Kettenreaktion (PCR) nach US-A-4,683,202, wobei aber einer der beiden Primer im Überschuß eingesetzt wird. Dieses Verhältnis wird jedoch weit geringer gewählt, als dies beispielsweise in WO 91/13174 oder WO 90/03442 beschrieben wird. Es wurde nämlich gefunden, daß höhere Verhältnisse einen erheblichen Sensitivitätsverlust mit sich bringen und darüber hinaus bei dem erfindungsgemäßen Verhältnis ein größerer dyna mischer Meßbereich erzielt werden kann. Als dynamischer Meßbereich wird der Meßbereich verstanden, in welchem eine eindeutige Zuordnung der gemessenen Signale zu den in der Pro be vorhandenen Konzentrationen der Analytnukleinsäure möglich ist. Der dynamische Meß bereich ist nach unten hin durch den Meßfehler begrenzt, und nach oben hin durch die Pla teaubildung. Es wurde sogar gefunden, daß bei normaler (symmetrischer) PCR bei steigernder Konzentration von Analytnukleinsäuren (z. B. virale Parameter wie HBV, HGV und CMV, oder bakterielle Parameter, wie Chlamydien) in der Probe das Meßsignal sogar wieder ab nimmt, so daß Meßsignale aus den oberen Signalbereichen prinzipiell mindestens 2 Kon zentrationswerten zugeordnet werden könnten und somit keine eindeutige Zuordnung des Meßsignals zu einer Konzentration möglich ist. Dies wird oft als Hook-Effekt bezeichnet.

In Fig. 1 (1A und 1B) ist für HBV graphisch dargestellt, welche Meßwerte für bestimmte be kannte Konzentrationen bei symmetrischer PCR (beide Primer sind in gleicher Konzentration vorhanden, dunkel) bzw. asymmetrischer PCR (heller) erhalten werden. Aufgetragen sind die Signalintensitäten gegen die Konzentration von HBV in geq/ml. Es ist erkennbar, daß die Kurve für die asymmetrische PCR auch bei höheren Konzentrationen eine eindeutige Zuord nung zu einem Meßsignal erlaubt.

In Fig. 1A ist dieser Vergleich für Versuchsbedingungen gezeigt, wenn kein Natriumchlorid in der PCR-Mischung enthalten ist (Niedrigsalzbedingungen). In Fig. 1B hingegen ist der Fall gezeigt, daß 625 mM Natriumchlorid anwesend ist (Normalsalzbedingungen). Aus dem Vergleich zwischen Fig. 1A und Fig. 1B wird klar, daß es bevorzugt ist, wenn relativ wenig Salz in der Reaktionsmischung enthalten ist. Bei geringeren Salzkonzentrationen ist erstaunlicherweise auch der Hook-Effekt zu höheren Konzentrationen verschoben, d. h. der dynamische Meßbereich ist gegenüber höheren Salzkonzentrationen erhöht. Eine Konzen tration von zwischen 150 mM und 600 mM Natriumchlorid ist bevorzugt, da eine geringere Konzentration einen Sensitivitätsverlust zur Folge hat.

Erfindungsgemäß werden die beiden Sorten von Primern in einem stöchiometrischen Ver hältnis von zwischen 1,5 : 1 und 10 : 1, bevorzugt zwischen 2 : 1 und 5 : 1 eingesetzt. Der engere Bereich hat den Vorteil, daß die Sensitivität des Nachweises besonders hoch ist. Dabei wird darauf geachtet, daß der nachzuweisende Nukleinsäurestrang im Überschuß entsteht und immobilisiert markiert ist.

Bei symmetrischer PCR wird die Konzentration der Primer üblicherweise aus einem Bereich zwischen 200 mM und 1 µM ausgewählt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird einer der Primer, bevorzugt der immobilisierbar markierte, bevorzugt aus dem Konzentrationsbereich von zwischen 150 bis 400, besonders bevorzugt zwischen 150 bis 200 mM und der andere Primer, bevorzugt ein nicht (immobilisierbar) markierter, aus einem Konzentrationsbereich zwischen 200 und 1000, besonders bevorzugt zwischen 300 bis 800 mM gewählt. Für den zweiten Primer hat sich besonders eine Konzentration von ca. 400 mM bewährt. Diese Be dingungen führen dazu, daß nach der Amplifikation ein Überschuß an immobilisierbarem Verlängerungsprodukt vorliegt. Dieses wird dann zum Gegenstand des weiteren Nachweises gemacht.

In Fig. 2 ist gezeigt, daß sich der dynamische Meßbereich für HGV von ca. 10³ bis zwischen 10⁸ und 10⁹ erstreckt bei asymmetrischer PCR, während er für symmetrische PCR nur bei zwischen 10³ und 10⁶ liegt. Dasselbe gilt auch für eine zugegebene interne Kontrolle, bei der es sich im vorliegenden Fall um ein kompetetives Templat (HGV mit im Zwischenprimerbe reich veränderter Nukleotidsequenz) handelt. Es ist daher klar erkennbar, daß der dynamische Meßbereich bei asymmetrischer PCR (A1 und B1) weitaus größer ist als bei symmetrischer PCR (A2 und B2).

Wenngleich die Durchführung der PCR aus US-A-4,683,202 bekannt ist und diesbezüglich auf die dort befindliche Offenbarung verwiesen wird, soll doch das erfindungsgemäße Ver fahren kurz beschrieben werden. Die Reaktionssequenz wird meist gestartet durch Verfüg barmachung der Analytnukleinsäure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (Einfrieren/Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (Osmotischer Druck), Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen), alleine oder in Kombination zur Freisetzung der Nukleinsäuren beitragen.

Nach Probenvorbereitung befinden sich die nachzuweisenden Nukleinsäuren in einer Probe, zu der die für die Amplifikation erforderlichen Reagenzien zugegeben werden. Dies geschieht bevorzugt durch Zugabe einer Lösung, die alle Reagenzien, wie die Polymerase, die Deoxyribonukleosidtriphosphate, die ein Set von Primern und Puffer, enthält. Nach Herstel lung der Reaktionsmischung wird das gebildete Gemisch unter Bedingungen inkubiert, bei denen in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Analytnukleinsäure zu jedem der Primer Verlängerungsprodukte gebildet werden, insbesondere unter Anwendung von Thermocyclern zur Denaturierung von Doppelsträngen, Hybridisierung der Primer an einen oder beide der Stränge der Analytnukleinsäure bzw. die gebildeten Verlängerungsprodukte der Primer und enzymatische Verlängerung der Primer. Die Thermocyclen werden solange fortgeführt, bis ausreichend Amplifikationsprodukte gebildet wurden, bevorzugt zwischen 20 und 40 Zyklen. Die Amplifikationsprodukte stellen im wesentlichen Kopien eines Teils der nachzuweisenden Analytnukleinsäure dar.

Bei der Analytnukleinsäure kann es sich sowohl um DNA als auch um RNA handeln. Bevor zugte Analytnukleinsäuren sind virale Nukleinsäuren. DNA-Viren sind z. B. HBV und Parvo B 19. Für den Fall RNA, wie z. B. RNA-Viren, wie HGV, führt man zweckmäßigerweise eine sogenannte RT-PCR durch, d. h. in einem ersten Schritt wird zu der RNA eine cDNA gebil det, welche dann der Amplifikation zur Verfügung steht. Diese Vorgehensweise ist ebenfalls für symmetrische PCR bekannt und wird nach der vorliegenden Erfindung durch Einsatz des bestimmten Primerverhältnisses modifiziert.

Unter einem Primer wird eine die Analytnukleinsäure bindende Verbindung verstanden, die durch die enzymatische Aktivität einer DNA-Polymerase, vorzugsweise an seinem 3'-Ende um mindestens ein NTP verlängert werden kann, wobei die gebundene Nukleinsäure als Templatnukleinsäure für die Basensequenz des Verlängerungsproduktes des Primers dient. Primer sind bevorzugt Oligonukleotide.

Ein Set von Primern für die PCR enthält mindestens zwei Primer, die zu unterschiedlichen Strängen der Analytnukleinsäuren komplementär sind. Diese werden üblicherweise als "forward" und "reverse" Primer bezeichnet. Die PCR kann jedoch noch weitere Primer be nutzen, z. B. bei einer multiplex-PCR, d. h. bei simultaner Amplifikation mehrerer Sequenzen einer Analytnukleinsäure oder mehreren Analytnukleinsäuren, oder aber bei simultaner Amplifikation der Analytnukleinsäure und einer Standardnukleinsäure. Es ist bei dem erfin dungsgemäßen Verfahren aber auch besonders vorteilhaft, die simultane Amplifikation der Analytnukleinsäure und einer Standardnukleinsäure mit Primern derselben Sequenz durchzu führen. Hierbei kompetieren die Primer eines Sets mit der Analytnukleinsäure und der Stan dardnukleinsäure. Kompetitive (symmetrische) Amplifikation ist z. B. aus WO 91/02817 be kannt und kann erfindungsanalog auf das erfindungsgemäß (asymetrische) Format angewen det werden. Dies erlaubt den Einsatz relativ hoher und somit genauer dosierbarer Konzentra tionen an Standardnukleinsäuren, vorzugsweise von zwischen 100 und 10 Mio Genomäqui valente (geq).

Eine Standardnukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die in einer oder mehreren bekannten und definierten Konzentrationen der Probe, einem Aliquot der Probe oder eine Vergleichsflüssig keit für die Probe zugesetzt wird. Die Standardnukleinsäure verhält sich ähnlich wie die Ana lytnukleinsäure bezüglich ihrer Abtrennbarkeit und Amplifikation, unterscheidet sich jedoch von der Analytnukleinsäure in definierter Weise in ihrer Sequenz und/oder Länge. Bevorzugt ist in der Standardnukleinsäure eine Teilsequenz gegenüber der Analytnukleinsäure bei im wesentlichen gleichbleibender Gesamtlänge des erzeugten Amplifikats ausgetauscht, wobei jedoch die Primerbindungsstellen im wesentlichen identisch sind. Für HCV ist die Konstruk tion solcher Standardnukleinsäuren beispielsweise in J. Clin. Microb. 32/8 : 1887-1893 be schrieben.

Einer oder beide der Primer können durch Verknüpfung mit einer modifizierenden Gruppe, beispielsweise einer detektierbaren oder immobilisierbaren Gruppe, modifiziert sein. Hier durch wird in die Verlängerungsprodukte jeweils eine solch modifizierende Gruppe eingebaut. Solche Verfahren sind allgemein in DE-38 07 994 bzw. US-5,476,769 beschrieben.

Unter einem immobilisierbaren Primer wird ein Oligonukleotid verstanden, welches struk turell gegenüber normalen, zu der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komple mentären Nukleinsäure dahingehend verändert ist, daß es eine oder mehrere immobilisierbare Gruppen I aufweist. Zur Immobilisierung befähigende Gruppen I sind beispielsweise chemi sche Gruppen, die normalerweise in natürlichen Nukleinsäuren nicht vorhanden sind und die kovalent, beispielsweise über eine chemische oder eine Photoreaktion an eine feste Phase ge bunden werden können, oder Gruppen bzw. Molekülteile, die über gruppenspezifische Wech selwirkungen von einem anderen Molekül oder Molekülteil erkannt und gebunden werden können. Solche Gruppen sind daher z. B. Haptene, Antigene und Antikörper, Nukleotidse quenzen, Rezeptoren, Regulationssequenzen, Glykoproteine, beispielsweise Lectine, oder auch die Bindungspartner von Bindeproteinen, wie Biotin oder Iminobiotin. Bevorzugt sind Vitamine und Haptene, besonders bevorzugt sind Biotin, Fluorescein oder Steroide, wie Digo xigenin oder Digoxin.

Die Flüssigkeit, welche das Nukleinsäurehybrid aus Amplifikat und Detektorsonde gelöst ent hält, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure in der Probe vorhanden war, wird mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, welche das Hybrid über die immobilisierbare Gruppe des eingebauten Primers spezifisch binden kann. Die Art dieser Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe I. Bevorzugt weist sie eine immobilisierende Gruppe R auf, die eine bindende Wechselwirkung mit I eingehen kann. Ist die immobilisierbare Gruppe beispielsweise ein Hapten dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche Antikörper gegen dieses Hapten aufweist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase bindende Proteine, wie Avidin oder Strep tavidin immobilisiert enthalten. Besonders bevorzugte Reste I und R sind Biotin und Strepta vidin. Die Immobilisierung über eine Gruppe an der modifizierten Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridi sierungsreaktionen. Bevorzugt wird zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren die Reaktionsmischung vor, während oder nach Bildung der Nukleinsäurehybride in ein Gefäß gefüllt, welches an seiner Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren kann. Be vorzugt findet die Hybridisierungsreaktion mit der Sonde im wesentlichen gleichzeitig mit der Immobilisierung statt. Es ist auch möglich, eine Festphase in Form eines porösen Materials, wie einer Membran, eines Gewebes oder eines Vlieses, zu verwenden, auf welche die Reak tionsmischung aufgegeben wird. Ebenso ist die Verwendung von Perlen, sogenannten beads, oder Latex-Partikeln möglich. Das Gefäß für die Durchführung der Immobilisierung an sol chen porösen Materialien ist bevorzugt eine Küvette, ein Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte. Die feste Phase sollte mindestens so viele Bindungsstellen für die immobilisierbare Gruppe der Sonde haben, wie Nukleinsäurehybride und damit nachzuweisende Nukleinsäuren vor handen sind. Die Herstellung einer bevorzugten festen Phase ist in der EP-A- 0 344 578 be schrieben, auf welche vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Bei der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt eine markierte einzelsträngige Sonde einge setzt, um eines der beiden Verlängerungsprodukte nachzuweisen. Hierzu ist die Sonde kom plementär zu einem der beiden Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure. Abhängig von dem eventuellen Einbau einer immobilisierbaren oder detektierbaren Gruppe in dieses Verlän gerungsprodukt wird entweder eine detektierbare oder immobilisierbare Gruppe an der Sonde vorgesehen. Bevorzugt weist die im Überschuß vorhandene Sorte von Primern eine immo bilisierbare Gruppe auf, so daß das Verlängerungsprodukt immobilisierbar markiert wird. Die hierzu komplementäre markierte einzelsträngige Sonde ist dann bevorzugt detektierbar mar kiert. Es kann sich sowohl um ein Oligonukleotid (vorteilhafterweise chemisch-synthetisiert) oder eine Peptidnukleinsäure (PNA gemäß WO 92/20702) handeln. Auch die markierte ein zelsträngige Sonde wird bevorzugt in einem Überschuß gegenüber der erwarteten Menge an Verlängerungsprodukten eingesetzt.

Nach einer Inkubationszeit, während der die Hybridisierung der Sonde mit dem Verlänge rungsprodukt des Primers und (bei Anwesenheit einer zur Bindung des immobilisierbaren Primers bzw. des daraus gebildeten Verlängerungsproduktes geeigneten Festphase) auch die Immobilisierungsreaktion stattfindet, wird die flüssige Phase aus dem Gefäß, von dem porö sen Material oder von den pelletierten beads entfernt. Die Festphase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, da die Bindung der Hybride an der Festphase sehr effizient ist. Dann wird die an die Festphase gebundene Menge an nachweisbarer Mar kierung als Maß für die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure an der Probe gemessen und bestimmt. Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenslabeln oder Elektrochemilumineszenzlabeln, wie Bispyridin-ruthenium-komplexen, wird die Menge an Markierung fluorometrisch bzw. elektrisch angeregt und photometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Farb- oder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie β-Galactosi dase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische chemoluminometrische oder fluorome trische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist in Fig. 3 gezeigt, wenn die immobilisier bare Gruppe I Biotin und die detektierbare Gruppe D ein Rutheniumbispyridylkomplex ist. Unter Verwendung eines Überschusses des immobilisierbar markierten Primers 2 wird die Analytnukleinsäure mit Hilfe der PCR (DNA) bzw. RT-PCR (RNA) amplifiziert. Es entste hen nn Verlängerungsprodukte des Primers 1 und mn Verlängerungsprodukte des Primers 2, wobei m größer ist als n. Sobald eine ausreichende Menge an Amplifikat gebildet worden ist, folgt bevorzugt ein Denaturierungsschritt mit Alkali. Anschließend wird die detektierbar mar kierte Sonde, die komplementär zu einem Teil des Verlängerungsproduktes des zweiten Pri mers ist, der neu aus Mononukleotiden gebildet wurde, zugegeben und mit dem immobilisier bar markierten Verlängerungsprodukt hybridisiert. Dabei konkurrieren die Sonde und der un markierte Strang des PCR-Produktes um den markierten Strang des PCR-Produktes. Da bei der asymmetrischen PCR mehr markierter Strang des PCR-Produktes gebildet wird, ist die Konkurrenzreaktion vermindert und es wird eine größere Menge gewünschtes Hybridisie rungsprodukt für den Nachweis gebildet. Das gebildete Hybrid aus Sonde und biotin-markier tem Verlängerungsprodukt wird an Streptavidin beschichtete Magnetpartikel gebunden. Nach Abtrennung überschüssiger Sonde (durch Entfernung der Flüssigkeit, Zurückhalten der Ma gnetpartikel mit den Hybriden an einem Magneten und einem Waschschritt) wird den Ma gnetpartikeln der Puffer für die Erzeugung der Elektrochemilumineszenz zugegeben und das Elektrochemilumineszenzsignal durch Anlegen einer Spannung erzeugt. Das Blitzsignal wird gemessen und zur Auswertung für den Nachweis der Analytnukleinsäure verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich hervorragend für eine qualitative Bestimmung (Anwesenheit der Analytnukleinsäure in der Probe) aber auch ausgezeichnet für quantitative Bestimmung (Bestimmung der Menge an Analytnukleinsäure in der Probe). Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß falschnegative Analysenergebnisse bei hochkonzentrierten Analytnukleinsäuren reduziert oder gar vermieden werden. Dies wird wohl darauf zurückzuführen sein, daß der high-dose Hook-Effekt, der bei flüssigen Hybridi sierungsverfahren üblich ist, durch das erfindungsgemäße Verfahren entweder vermieden oder zu noch höheren Konzentrationen verschoben wird. Unter einem High Dose Hoch Effekt wird das Phänomen verstanden, daß bei zunehmenden Analytkonzentrationen zunächst wie erwar tet auch das gemessene Signal größer wird, bei weiter zunehmenden Analytkonzentrationen erstaunlicherweise aber wieder abnimmt. Dies kann bei hohen Analytkonzentrationen zu falsch-niedrigen bis falsch-negativen Ergebnissen fahre. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß in der Detektionsreaktion die Detektionssonde mit dem unmarkierten Strang des PCR-Produktes um den markierten Strang des PCR-Produktes konkurriert. Aufgrund dieser Konkurrenzreaktion wird die Anzahl der gewünschten Hybride für die Detektion reduziert, was zu dem beobachteten Effekt führt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für Routine arbeiten, wie sie in der klinischen Diagnostik erforderlich werden, automatisierbar. Der dyna mische Meßbereich ist beim erfindungsgemäßen Verfahren besonders hoch. Umgekehrt gese hen ist es möglich, auch Proben, bei denen der Verdacht auf Anwesenheit hoher Analytkon zentrationen, einer eindeutigen Auswertung zuzuführen, ohne eine Verdünnung vorzunehmen. Dasselbe gilt für in einer Probenvorbereitung aufkonzentrierte Nuleinsäuren.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren weiter.

Beispiel 1 Nachweis von HGV

Die Reduktion des Hook-Effektes durch eine asymetrische RT-PCR konnte am Beispiel He patitis G Virus gezeigt werden. Als Proben dienten dabei zwei mit Hilfe des Bakteriophagen promotors T7 in vitro transkribierte RNA-Standards, die Herstellung erfolgte nach bereits be schriebenen Standardmethoden (vergl. Sambrock et al.: Molecular cloning, S. 10.27 ff). Beide RNA-Transkripte hatten eine Länge von ca. 900 Nukleotiden, die Sequenzen der 5'-nicht ko dierenden Region von HGV enthielten. Interne Kontroll-RNA ist eine sogenannte homologe interne Kontrolle, die sich im Vergleich zur wildtyp (wt) RNA nur um 23 Nukleotide unter scheidet. Diese ausgetauschte Sequenz dient zur Unterscheidung von beiden RNA Molekülen während der Detektion, die durch Verwendung von unterschiedlichen Detektionssonden er folgt (siehe unten). Für die Amplifikation sowohl der wt RNA als auch der internen Kontrolle wurden folgende HGV spezifischen Primer verwendet:
HGV Primer Sequenzen:

Die Markierung des nicht kodierenden Primers diente nur dem Detektionsverfahren, welches weiter unten beschrieben ist.

Für die PCR wurde der folgende Reaktionsansatz gewählt (1-Schritt RT-PCR; durchgeführt mit BM Titan RT-PCR System, Enzymmix ohne Pwo Polymerase; Id. Nr. 1 855 476):
4 U AMV Reverse Transkriptase
2,5 U Taq Polymerase
50 mM Tricine/HCl, pH 9,0
15 mM (NH₂)SO₄
2,5 mM MgCl₂
0,1% Tween 20
2% DMSO
5 mM Dithiothreiol
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding-strand primer
200 nM non-coding strand primer, Biotin-markiert bei symetrischen Ansätzen
400 nM non-coding strand primer, Biotin-markiert bei asymetrischen Ansätzen
variable Kopienzahl der in vitro transkribierten RNA-Standards (s. Abbildung)
Angegeben sind die Endkonzentration/RT-PCR.

Die Amplifikation wurde mit folgendem Temperaturprofil auf einem Perkin Elmer Cycler 9600 durchgeführt:

Die PCR-Produkte wurden anschließend direkt in die unten stehende Detektionsreaktion eingesetzt.

Detektionsverfahren

Die Detektion erfolgte mit Hilfe von Elektrocheminumileszenz (ECL) auf einem Elecsys 1010 (Boehringer Mannheim GmbH). Reaktionstemperatur für alle Schritte ist 37°C. 10 µl Probe werden zunächst mit 35 µl Denaturierungsreagenz versetzt und für 5 Minuten inkubiert. An schließend werden 120 µl der Sondenlösung (50 ng/ml in Hybridisierungspuffer) zugegeben und 20 min inkubiert. Nach Beendigung der Hybridisierung werden dem Reaktionsansatz 35 µl Streptavidin-beschichtete magnetische Mikropartikel beigemischt und dieser erneut 10 Mi nuten inkubiert. Die Hybride (Bi-markierter HGV Strang mit Ru-markierter Detektionssonde) werden dabei an die Festphase (Mikropartikel) gebunden. Nach Beendigung der Inkubation werden die Proben in die Meßzelle transferiert und dort die Mikropartikel über einen Magne ten gebunden. Anschließend erfolgt in der Meßzelle die Chemilumineszenz. Unter Katalyse von TPA gibt der Ru-Komplex Lichtblitze ab, deren Anzahl in der Meßzelle bestimmt wer den. Die Chemie zur Elektrocheminolumineszenz ist in J. Electrochem. Soc. 137 : 3127-3131 beschrieben.

1. Denaturierungsreagenz, pH: < 12

2. Hybridisierungslösung, pH 6,5

Zu dem Hybridisierungspuffer wird eine Detektionssonde mit einer Endkonzentration von 50 ng/ml zugegeben. Als Detektionssonden wurden die folgenden spezifischen Rutheniumbis pyridkomplexe (zum Nachweis von HGV wt bzw. HGV interne Kontrolle) verwendet:
HGV wildtyp: Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT SEQ. ID. NO. 3
HGV interne Kontrolle: Ru- ATG CTG TCA GCA CTC TGA G SEQ. ID. NO. 4.

Das Ergebnis ist in Fig. 2 wiedergegeben. Fig. 2A zeigt das Ergebnis unter Verwendung des HGV Wildtyp-Standards, 2B das Ergebnis unter Verwendung der internen Kontroll-RNA. Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
Der asymetrische Einsatz der Primer führt zu einer deutlichen Signalerhöhung. Das HGV spe zifische Signal ist bis zu einem Faktor 7 verstärkt, das Signal der internen Kontrolle verstärkt sich bis zu 5,5-fach. Die Kopienzahl, bei der das maximale Signal erreicht wird, wird zu höhe ren Konzentrationen hin verschoben. Insgesamt wird das Signalmaximum erst 2 Zehnerpoten zen später erreicht. Dadurch setzt auch der Hook-effekt erst später ein, falsch negative Ergeb nisse bei stark positiven Proben können vermieden werden.

Beispiel 2 Nachweis von HBV

Die generelle Durchführung des Experimentes ist unter Beispiel 1 beschrieben. Im Folgenden sind die Veränderungen im Vergleich zum Beispiel 1 angegeben.

1. Probenmaterial

Als Probenmaterial wurde ein HBV positives Plasma eingesetzt. Die Virus-Konzentration im Material wurde am "Eurohep HBV reference plasma sample 1/Genotyp A" (Gerlich WH, Heermann KH, Thomssen R et al.: Quantitative assays for hepatitis B virus DNA: standardi zation and quality control. Virol. Hepatitis Rev. 1995; 1 : 53-57) abgeglichen. Die Probenprä paration erfolgte mit dem High Pure viral nucleic acid kit (Boehringer Mannheim GmbH) analog der Packungsbeilage.

2. HBV spezifische Primer

3. PCR-Ansatz

Für die PCR wurde der folgende Reaktionsansatz gewählt:
2,5 U Taq polymerase
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCL
1,5 mM MgCl₂
0,1 mg/ml gelantine
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding-strand primer/200 nM non-coding strand primer, Biotin-markiert bei symetri scher PCR
200 nM coding-strand primer/400 nM non-coding strand primer, Biotin-markiert bei asyme trischer PCR
präparierte, HBV enthaltene Nukleinsäure

Die Amplifikation wurde mit folgendem Temperaturprofil auf einem Perkin Elmer Cycler 9600 durchgeführt:
35 Zyklen:

15 sec	94°C
30 sec	55°C
30 sec	72°C

3. dann: hold 4°C

Detektion

Die Detektion wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt. In einem Experiment wurde der sy metrische Ansatz direkt mit dem asymetrischen Ansatz verglichen. Als Detektionssonde wur de die folgende spezifische Rutheniumbispyrid-komplex-markierte Sonde verwendet:

Ru- AGA CCA CCA AAT GCC CCT SEQ. ID. NO. 7

Das Ergebnis ist in Fig. 3 wiedergegeben. Fig. 3A zeigt das Ergebnis unter Verwendung von 625 mM NaCl im Hybridisierungspuffer, im Experiment, das in 3B dargestellt ist, enthielt der Hybridisierungspuffer kein NaCl. Die wichtigsten Erkenntnisse sind:

- Wie schon in Beispiel 1 beschrieben bewirkt der asymetrische Einsatz der Primer zu einer deutlichen Signalerhöhung im Vergleich zum Experiment mit symetrischen Primerkonzen trationen. Das HBV spezifische Signal ist bis zu einem Faktor von 18,8 verstärkt.
- Die Kopienzahl, bei der das maximale Signal erreicht wird, wird zu höheren Konzentra tionen hin verschoben. Im Beispiel 3A ist das Signalmaximum mindestens um 3 Zehnerpo tenzen verschoben.
- In der Literatur sind HBV-Konzentrationen in Seren bis zu 10¹⁰ Genomäquivalenten/ml (geq/ml) beschrieben worden (W.H. Gehrlich, Hepatitis B Virus-structure and molecular virology, S. 83-113; in Viral Hepatitis, Editors A.G Zuckermann, H.C. Thomas; Churchill Livingstone, Edinburgh, London, Madrid, Melbourne, New York, Tokyo, 1993). Legt man diese Angaben zugrunde, erscheint es möglich, das eine sehr hohe Viruskonzentration im Serum beim Einsatz einer symetrischen PCR zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Der asymetrische Ansatz kann daher das Auftreten von falsch negativen Ergebnissen ver meiden.

Der Hook-Effekt tritt nicht auf, wenn kein Salz im Hybridisierungspuffer vorhanden ist (Abb. 3B). Die Vermeidung bzw. Verminderung des Hook-Effektes kann also auch durch Reduktion der Salzkonzentration während der Hybridisierung erreicht werden. Allerdings ist in der Lite ratur häufig beschrieben worden, das Nukleinsäurehybridisierungen ohne Salz sehr viel schle chter ablaufen und darum die Sensitivität verloren geht (Bryan et al., S. 47ff in Nucleic acid hybridisation, Editors B.D. Hames, S.J. Higgins; IRL press, 1985).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer hochkonzentrierten Analytnukleinsäure in einer Probe, enthaltend die Schritte

- Zugabe von zwei Sorten von Primern, von denen das Verlängerungsprodukt des einen Primers als Templat für die Verlängerung des anderen Primers dienen kann, zu der Probe und Inkubation des gebildeten Gemisches unter Bedingungen, bei denen in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Analytnukleinsäure zu jedem der Primer Ver längerungsprodukte gebildet werden,
- Bindung einer markierten einzelsträngigen Sonde an eines der beiden Verlängerungs produkte unter Bildung eines Bindeproduktes und Immobilisierung der Verlänge rungsprodukte an einer festen Oberfläche,

dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Sorten von Primern in einem stöchiometrischen Verhältnis von zwischen 1,5 : 1 und 10 : 1 eingesetzt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die im Überschuß vor handene Sorte von Primern zu einem Verlängerungsprodukt führt, welches die mar kierte Sonde binden kann.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sorte von Primern eine immobilisierbare Gruppe gebunden hat, die das gebildete Verlängerungsprodukt aufgrund spezifischer Wechselwirkungen an die feste Oberfläche binden kann.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kon zentration der Analytnukleinsäure in der Probe größer sein kann als 10⁵ Genomäqui valente/ml.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nach weis die Bestimmung der Menge an Analytnukleinsäuren in der Probe einschließt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Über schuß zwischen 2 : 1 und 5 : 1 liegt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ana lytnukleinsäure eine virale Nukleinsäure ist.

8. Verwendung einer asymmetrischen Nukleinsäureamplifikation zur Reduzierung oder Vermeidung falschnegativer Analyseergebnisse bei potentiell hochkonzentrierten Ana lytnukleinsäuren.

9. Verwendung einer asymmetrischen Nukleinsäureamplifikation zur quantitativen Be stimmung von hochkonzentrierten Nukleinsäuretargets.

10. Verwendung einer asymmetrischen Nukleinsäureamplifikation zur Erhöhung des dyna mischen Meßbereiches bei Nukleinsäurenachweisverfahren.