DE3854056T2

DE3854056T2 - Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz in einer Probe.

Info

Publication number: DE3854056T2
Application number: DE3854056T
Authority: DE
Inventors: Nanibhushan Dr Dattagupta; Edward Dr Huguenel; Daniel Dr Rabin; Peter Dr Rae
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-03
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2008-03-04
Also published as: EP0281927A3; EP0281927A2; EP0281927B1; NZ223786A; DE3854056D1; IL85666A0; AU1215188A; JPS63313598A; AU601021B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nachweis und Identifizierung von Microorganismen sowie Nachweis und Identifizierung besonderer prokaryontischer oder eurkaryontischer DNA-Quellen in einer Nucleinsäuren enthaltenden Testprobe.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Lyse ganzer Zellen.

A. Nachweis von Microorganismen

Die Identifizierung von Species von Microorganismen in einer eine Mischung von Microorganismen enthaltenden Probe, indem man die DNA aus der Probe immobilisiert und mit einem markierten Specimen von Species-spezifischer DNA aus einem bekannten Microorganismus hybridisiert und dann untersucht, ob Hybridisierung zwischen der immobilisierten DNA und dem markierten Specimen eintritt und abläuft, ist in PCT/US83/01029 offenbart worden.
Das am meisten wirksame und empfindliche Nachweisverfahren von Nucleinsäuren wie DNA nach Hybridisierung macht radioaktiv markierte DNA erforderlich. Der Einsatz von Autoradiographie und Enzymen verlängert die Assay-Zeit, und man benötigt technisch erfahrenes Personal.
In EP 235 726, die früher eingereicht worden ist, aber nach der Priorität der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, ist ein rascher Nucleinsäure-Hybridisierungsassay beschrieben. Diese Literaturstelle schweigt sich bezüglich der Beschleunigungseigenschaften von Polyethylenglycol aus. EP 184 017 bezieht sich auf die Steigerung von Nucleinsäurehybridisierung durch anionische Polymere.
US 4 358 535 von Falkow et al beschreibt ein Diagnoseverfahren für Infektionskrankheiten, wobei man markierte Nucleotid-Sonden verwendet, die komplementär zu Nucleinsäuren sind, die für ein charakteristisches Pathogenprodukt codieren.

B. Nachweis spezifischer eukaryontischer Sequenzen

Die Identifizierung spezifischer Sequenzveränderung in einer eukaryontischen Nucleinsäureprobe durch Immobilisierung der DNA aus der Probe und Hybridisierung mit einem markierten Oligonucleotid und schließlich durch Untersuchung, ob Hybridisierung zwischen der immobilisierten DNA und der markierten Sonde eintritt bzw. abläuft, ist in EP-A 228 075 beschrieben worden.
Es ist bekannt, daß die Expression eines spezifischen Gens den physischen Zustand eines Menschen bestimmt. Hämoglobin von Erwachsenen ist eine tetramere Assoziation von zwei α- und zwei β-Untereinheiten. Während der embryonalen und fötalen Lebensphase werden die α-Ketten nacheinander mit γ- und δ-Ketten assoziiert, bevor beim Erwachsenen die β-Form dann überwiegt. Die Gene für α-Hämoglobin befinden sich auf Humanchromosom Nr. 16, und die Gene für γ-, δ- und β- Hämoglobin sind tandemartig an Humanchromosom Nr. 11 gebunden. Hämoglobinopathien sind Vererbungskrankheiten, die das Ergebnis von Veränderungen in der Struktur eines oder mehrerer Hämoglobin-Gene sind. Viele der Mutationen sind in beachtlichem molekularen Detail charakterisiert worden und können von einzelnen Basenpaar-Änderungen bis zur Gesamtzerstörung einer Genfamilie reichen. Beispielsweise erzeugt ein Wechsel im β-Globin-Gen, das die Sequenz von GAG bis GTG an der sechsten Aminosäure-Position codiert, Sichel-β-Globin, und ein Homozygot kann eine als Sichelzellenanämie bekannte Kranheit aufweisen bzw. ergeben. In ähnlicher Weise kann die Zerstörung besonderer Sequenzen von α-Globin- oder β-Globin-Genen Thalassemien verursachen.
Ein neuerer Überblick, The New Genetics and Clinical Practice, D.J.Weatherall, The Nuffield Provincial Hospitals Trust (1982), Kapitel 2, beschreibt Häufigkeit und klinisches Spektrum genetischer Krankheiten.
Probleme im Zusammenhang mit genetischen Defekten lassen sich durch Informationen aus der Nucleinsäuresequenz diagnostizieren. Der einfachste Weg zu Nachweis und Auffindung einer solchen Sequenzinformation besteht in der Anwendung des Hybridisierungsverfahrens mit einer spezifischen Sonde bekannter Sequenz.
US 4.395.486 von Wilson et al beschreibt ein Verfahren zur direkten Analyse von Sichelzellenanämie unter Anwendung eines Restriktions-Endonuclease-Assay.
Edward M. Rubin und Yuet Wai Kan, "A Simple Sensitive Prenatal Test for Hydrops Fetalis Caused by α-Thalassaemia", The Lancet, 12. Januar 1985, S. 75-77, beschreiben eine Punkt-Blot-Analyse zur Unterscheidung zwischen den Genotypen homozygoter α-Thalassemie und denen der Hämoglobin-H Krankheit und des α-Thalassemie-Typs.
Das am meisten wirksame und empfindliche Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren, wie von DNA, nach Hybridisierung erfordert radioaktiv markierte DNA. Die Anwendung von Autoradiographie und Enzymen verlängert die Assay-Zeit und benötigt technisch erfahrenes Personal.
In letzter Zeit wurde ein nicht-radioaktives Verfahren mit markierter DNA von Ward et al, EP-A-63.879, beschrieben. Ward et al wenden das Verfahren einer Nick-Translation an, um biotinylierte U(Uracil)-Reste in DNA unter Ersatz von T (Thymin) einzuführen. Der Biotin-Rest wird dann mit Antibiotin-Antikörper oder einem Avidin enthaltenden System durch Assayverfahren anylysiert. Der Nachweis ist in diesem Fall schneller als mit Autoradiographie, aber beim Nick- Translationsverfahren benötigt man Personal mit einem hohen Maß an Geschicklichkeit. Ausserdem funktioniert die Piotinylierung unter Verwendung von biotinyliertem UTP (Uridin-Triphosphat) nur für bzw. mit Thymin enthaltenden Polynucleotiden. Die Verwendung anderer Nucleosid- Triphosphate ist sehr schwierig, weil die chemische Derivatisierung von A (Adenin) oder G (Guanin) oder C (Cytosin) (enthaltend -NH&sub2;) mit Biotin das Geschick geübter organischer Chemiker erforderlich macht.

C. Wirkung von nicht-ionischen Polymeren auf die Hybridisierung

Von Wetmur (Biopolymers, 14, 2517-2524, 1974) ist gezeigt worden, daß anionische Polymere wie Dextransulfat Geschwindigkeit und Umsatz der DNA-DNA-Hybridisierung in Lösung erhöhen. Ebenfalls ist aufgezeigt worden, daß Geschwindigkeit bzw. Umsatz bei Hybridisierung in heterogener Phase durch Dextransulfat ebenfalls gesteigert werden können. US 4.302.204 offenbart die Wirkung geladener Polysaccharide auf Umsatz bzw. Geschwindigkeit der Nucleinsäure- Hybridisierung.
In jüngerer Zeit hat Amasino (Analytical Biochemistry, 152, 304-307 (1986)) aufgezeigt, daß ein neutrales Polymer wie Polyethylenglycol Geschwindigkeit bzw. Umstz der DNA-RNA- Hybridisierung stärker zu erhöhen vermag als Dextransulfat unter optimalen Bedingungen. Obwohl Polyethylenglycol (PEG) bereits vorher im Hybridisierungsmedium verwendet worden ist (z.B. Renz und Kurz, Nucleic Acids Res., 12, 3435-3444, 1984), wurde kein Vorteil gegenüber der Verwendung von Dextransulfat vorausgesagt. Die Anmelderin hat zu ihrer Überraschung dagegen beobachtet, daß die Hybridisierung in der Gegenwart von 10%-igem Polyethylenglycol innerhalb von 15 Minuten im wesentlichen beendet sein kann. Obwohl Amasino (siehe oben) aufgezeigt hat, daß PEG als Beschleunigungsmittel besser als Dextransulfat ist, war dabei die eingesetzte markierte Sonde einzelstrangige RNA. Im Falle der vorliegenden Erfindung stellt allerdings das markierte Material eine ganze DNA aus einer genomischen Probe dar, worin beide komplementären Stränge in Lösung vorhanden sind. Beschleunigt ein Polymer die Geschwindigkeit der Hybridisierung, sollte es auch die Wiederanlagerung in Lösung unterstützen, und es sollte somit die Wirksamkeit einer Hybridisierung vermindern, anstatt sie zu vergrößern.

D. Zell-Lyse

Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein Verfahren zur wirksamen Lyse ganzer Zellen bereitgestellt, und zwar in einer solchen Weise, daß deren DNA freigesetzt und zur photochemischen Markierung verfügbar gemacht wird. Während eukaryontische Zellen, die aus mehrzelligen Lebewesen stammen, leicht unter relativ milden Bedingungen lysiert werden, sind einzellige Eukaryonten und Prokaryonten, besonders gram-positive Prokaryonten, wegen der komplizierten chemischen Natur und dem Ausmaß an Vernetzungen ihrer Zellwände schwieriger zu lysieren. Es gibt Verfahren zur wirksamen Lyse dieser hartnäckigen Organismen, entweder durch chemisch-enzymatische oder physikalische Maßnahmen, diese Verfahren sind jedoch oft kompliziert, zeitaufwendig und zur Bewahrung der Unversehrtheit der DNA ungeeignet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rasch und bequem durchzuführendes Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Polynucliotid-Sequenzen aus Microorganismen oder eukaryontischen Quellen in einer biologischen Probe, wobei Polyethylenglycol als Hybridisierungsbeschleuniger verwendet wird.
Die Lösung der vorliegenden Aufgabe und die damit verbundenen Vorteile werden gemäß der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis (i) eines oder mehrerer Microorganismen oder (ii) von Nucleinsäure-Sequenzen aus einer prokaryontischen oder eukaryontischen Quelle in einer Nucleinsäure enthaltenden Testprobe bewerkstelligt.
Das Verfahren beinhaltet die folgenden Stufen, in denen man:
(a) die Nucleinsäuren, z.B. die Nucleinsäuren der Organismen oder Zellen oder Zellreste, in der Testprobe markiert,
(b) unter Hybridisierungsbedingungen die markierte hybridisierbare Proben-Nucleinsäure mit einer oder mehreren immobilisierten hybridisierbaren (z.B. einzelstrangigen) Nucleinsäuren (z.B. DNA)-Sonden, umfassend (i) einen oder mehrere bekannte Microorganismen oder (ii) Nucleinsäure- Sequenzen aus eukaryontischen oder prokaryontischen Quellen, zur Bildung hybridisierter markierter Nucleinsäuren in Kontakt bringt, und
(c) die hybridisierten Nucleinsäuren durch Nachweis der Markierung mit einem Assay-Verfahren analysiert,
wobei die Hybridisierung durch die Zugabe von Polyethylenglycol beschleunigt wird.
Die hybridisierbare Nucleinsäure kann eine ganze genomische Nucleinsäure oder ein Fragment davon, z.B. ein w Oligonucleotid, sein.
In Stufe (a) können die Nucleinsäuren direkt in der Testprobe markiert werden. In Stufe (a) können, zu dieser direkten Markierung, die Zellen der Testprobe lysiert werden, und dann kann ein Markierungsreagens zugefügt werden, wodurch die Nucleinsäure markiert wird.
Ferner werden in dem Verfahren die markierten Nucleinsäuren aus Stufe (a) zur Bildung markierter denaturierter Nucleinsäuren denaturiert.
Die Testprobe mit der markierten Nucleinsäure wird mit mehreren verschiedenen Typen von Nucleinsäure-, z.B. DNA-, Sonden gleichzeitig zur Hybridisierung in Kontakt gebracht. Die Nucleinsäure-Testprobe wird markiert und mit mehreren unmarkierten immobilisierten Sonden hybridisiert. Die Positionen der Sonden sind fixiert, und die nach Hybridisierung nachgewiesene markierte Sonde zeigt an, daß die Testprobe eine Nucleinsäure-Sequenz aufweist, die zur entsprechenden Sonde komplementär ist.
Nucleinsäure-Sonden für verschiedene Microbiologische Systeme oder für unterschiedliche Allele eines oder mehrerer Gene können getrennt an einer festen Trägerunterlage, z.B. Nitrocellulose-Papier, immobilisiert werden. Die Testproben- Nucleinsäuren werden markiert und verbleiben in Lösung. Das feste Material, das die immobilisierte Sonde enthält, wird mit der markierten Test-Nucleinsäurelösung unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht. Das feste Material wird von unhybridisierter Nucleinsäure freigewaschen, und man analysiert die Markierung durch ein Assayverfahren. Das Vorhandensein der Markierung bei einer oder mehreren der Sonden zeigt an, daß die Testprobe Nucleinsäuren enthält, die zu diesen Sonden im wesentlichen komplementär sind und somit beispielsweise aus einer Infektion durch besondere Microbiologische Systeme herrühren.
Die Markierung kann in einer ganzen lebenden Zelle oder einem Zell-Lysat durchgeführt werden, und dies kann auch auf nichtisotopischem Weg erfolgen. Die Nucleinsäure kann zur Hybridisierung ohne weitere Reinigung eingesetzt werden
Wie oben dargelegt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Hybridisierungsmedium, das den Vorgang der Hybridisierung beschleunigt. Der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Hybridisierungsbeschleuniger ist Polyethylenglycol.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Hybridisierung, wobei man zwei komplementäre einzelstrangige Nucleinsäuren, von denen mindestens eine immobilisiert ist, unter Mybridisierungsbedingungen in Kontakt bringt, wobei Polyethylenglycol zugefügt ist.
Die in der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangende Testprobe schließt Körperflüssigkeiten ein, z.B. Urin, Blut, Samen, cerebrospinale Flüssigkeit, Eiter, amniotische Flüssigkeit, Tränen oder halbfeste oder flüssige Ausscheidungen, z.B. Auswurf, Speichel, Lungenaspirat, Vaginal- oder Urethalausscheidung, Stuhl oder feste Gewebeproben, wie eine Biopsie oder chorionische Villispecimen. Die Testproben schließen auch Proben ein, die aus Abstrichen aus der Haut, den Genitalien oder dem Rachen anfallen.
Alle diese Testproben können zur Hybridisierungsdiagnose nach Markierung der Nucleinsäuren der Probe herangezogen werden.Die Markierung kann ohne besondere Zubereitung der Probe durchgeführt werden. So kann beispielsweise eine Urinprobe (bei der bakterielle Infektionen angenommen werden) ohne Zentrifugation, Filtration oder Dialyse markiert werden. Die Zellen in den Proben können ohne jegliche Trennungsstufe lysiert werden. Es ist überraschend, daß eine Nucleinsäure Markierungsreaktion in solch einer komplexen Mischung wie einer klinischen Probe stattfindet und abläuft.
Die Nucleinsäure wird vorzugsweise durch photochemische Maßnahmen markiert, wobei man eine photoreaktive DNA-bindende Furocumarin- oder Phenanthridin-Verbindung zur Anwendung bringt, um sich mit der zu markierenden Nucleinsäure zu verbinden, welche dann in herkömmlicher Weise, einschließlich Fluoreszenz-Nachweis, "gelesen" oder durch Assayverfahren analysiert werden kann. Das Endprodukt stellt somit eine markierte Nucleinsäure dar, die (a) eine Nucleinsäure-Komponente, (b) einen Intercalator oder einen sonstigen, mit DNA sich verbindenden Ligand, welche photochemisch an die Nucleinsäure-Komponente gebunden werden, sowie (c) eine an (b) chemisch gebundene Markierung umfaßt.
Das photochemische Verfahren ergibt günstigere Reaktionsbedingungen als das üblche chemische Kupplungsverfahren für biochemisch empfindliche Substanzen. Der Intercalator und die Markierung können zuerst gekuppelt und dann durch Photoreaktion mit der Nucleinsäure umgesetzt oder die Nucleinsäure kann zuerst mit dem Intercalator durch Photoreaktion umgesetzt und dann mit der Markierung gekuppelt werden.
Ein allgemeines Schema zur Kupplung einer Nucleinsäure, die beispielsweise durch eine doppelsträngige DNA dargestellt ist, zur Anbringung einer Markierung ist das folgende: Markierung photoreaktiver Intercalator markierten photoreaktiven Intercalator + DNA hν doppelsträngige DNA + photoreaktiver Intercalator hν chemisch-funktionalisierte DNA + Markierung markiete DNA
Liegt das hybridisierbare Teilstück der Nucleinsäure in einer doppelsträngigen Form vor, wird dieses Teilstück dann denaturiert, um ein hybridisierbares einzelstrangiges Teilstück zu ergeben. Alternativ dazu kann, falls die markierte DNA das hybridisierbare Teilstück bereits in einzelstrangiger Form aufweist, eine solche Denaturierung, falls erwünscht, vermieden werden.
Zur Erzeugung spezifischer und wirksamer photochemischer Produkte ist es erwünscht, daß Nucleinsäure-Komponente und photoreaktive Intercalatorverbindung im Dunkeln in einer spezifischen Weise zur Reaktion gebracht werden.
Zur Kupplung an DNA sind Aminomethylpsoralen, Aminomethylangelicin und Aminoalkylethidium- oder -methidium- Azide besonders geeignete Verbindungen. Sie werden an doppelsträngige DNA gebunden, und nur der Komplex ergibt ein Photoaddukt. Falls markierte doppelsträngige DNA denaturiert werden muß, um einen hybridisierbaren einzelstrangigen Bereich zu ergeben, werden Bedingungen angewandt, bei denen eine gleichzeitige Wechselwirkung von zwei Strängen von DNA mit einem einzelnen Photoaddukt vermieden wird. Es ist notwendig, daß die Häufigkeit von Modifikationen entlang eines hybridisierbaren einzelstrangigen Teilstücks der Nucleinsäure nicht so groß ist, um eine Hybridisierung im wesentlichen zu verhindern, und demgemäß liegt vorzugsweise nicht mehr als 1 Stelle einer Modifikation pro 25, üblicher pro 50, und vorzugsweise pro 100, Nucleotid-Basen vor. Angelicin-Derivate sind bezüglich einer Monoaddukt-Bildung gegenüber Psoralen-Verbindungen überlegen. Ist einzelstrangige DNA-Nucleinsäure kovalent an einiges an zusätzlicher doppelsträngiger DNA gebunden, ist die Verwendung von Phenanthridium- und Psoralen-Verbindungen erwünscht, da diese Verbindungen spezifisch mit doppelsträngiger DNA im Dunkeln wechselwirken. Die Chemie für die Synthese der gekuppelten Reagentien zur Modifizierung der zur Markierung vorgesehenen Nucleinsäuren, die nachfolgend umfänglicher beschrieben wird, ist bei allen Fällen ähnlich.
Die Nucleinsäure-Komponente kann durch einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA oder Fragmente davon, wie sie durch Restriktionsenzyme erzeugt werden, oder sogar durch relativ kurze Oligomere dargestellt sein.
Die zur Bindung der Nucleinsäure-Komponente an die Markierung verwendeten DNA-Bindungsliganden können durch jede geeignete photoreaktive Form bekannter DNA-Bindungsliganden dargestellt sein. Besonders bevorzugte DNA-Bindungsliganden sind Intercalatorverbindungen wie die Furocumarine, z.B. Angelicin (Isopsoralen) oder Psoralen oder Derivate davon, die photochemisch mit Nucleinsäuren reagieren, z.B. 4'- Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicin, 4'-Aminomethyltrioxsalen (4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen), 3-Carboxy-5- oder -8-Amino- oder -Hydroxypsoralen sowie Mono- oder Bisazidoaminoalkylmethidium- oder -ethidiumverbindungen.
Besonders geeignete photoreaktive Formen von Intercalationsmitteln sind die Azidointercalatoren. Deren reaktive Nitrene werden rasch bei langwelligem UV- oder sichtbarem Licht gebildet, und die Nitrene von Arylaziden bevorzugen Insertionsreaktionen gegenüber der Bildung ihrer Umlagerungsprodukte (siehe White et al, Methods in Enzymol., 46, 644, 1977). Repräsentative Intercalationsmittel schließen Azidoacridine, Ethidiummonoazide, Ethidiumdiazide, Ethidium- Dimerazide (Mitchell et al, JACS, 104, 4265, 1982), 4-Azido- 7-chlorchinolin und 2-Azidofluoren ein. Eine spezifische Nucleinsäure bindende Azidoverbindung ist von Forster et al, Nucleic Acid Res., 13, 1985, 745, beschrieben worden. Die Struktur dieser Verbindung ist die folgende:
Weitere geeignete photoreagierbare Intercalatoren sind Furocumarine, die mit Pyrimidin-Resten (2+2)-Cycloaddukte bilden. Alkylierungsmittel können ebenfalls verwendet werden, wie Bischlorethylamine und Epoxide oder Aziridine, z.B. Aflatoxine, polycyclische Kohlenwasserstoffepoxide, Mitomycin und Norphillin A.
Nicht einschränkende Beispiele von Intercalatorverbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Acridin-Farbstoffe, Phenanthridine, Phenazine, Furocumarine, Phenothiazine und Chinoline ein.
Die Markierung, die gemäß der vorliegenden Erfindung an die Nucleinsäure-Komponente gebunden wird, kann durch jede chemische Gruppe oder einen entsprechenden Rest dargestellt sein, welche eine nachweisbare physikalische oder chemische Eigenschaft aufweisen, d.h., die Markierung kann durch chemische Reaktion oder physikalische Adsorption erfolgen. Die Markierung weist eine funktionelle chemische Gruppe auf, um an die Intercalatorverbindung chemisch gebunden zu werden. Solche Markierungsmaterialien sind auf dem Gebiet der Immunoassayverfahren gut entwickelt worden, und im allgemeinen kann fast jede der in diesen Verfahren geeigneten Markierungen in der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Besonders geeignet sind enzymatisch aktive Gruppen, wie Enzyme (siehe Clin. Chem., 1976, 22, 1243), Enzym-Substrate (GB 1.548.741), Coenzyme (US 4.230.797 und 4.238.565) und Enzym-Inhibitoren (US 4.134.792); Fluoreszoren (siehe Clin. Chem., 1979, 25, 353) und Chromophoren, einschließlich w Phycobiliproteine; Lumineszoren wie Chemilumineszoren und Biolumineszoren (siehe Clin. Chem., 1979, 25, 512 und ibid, 531); spezifisch bindbare Liganden, d.h. Protein- Bindungsliganden; und Reste, enthaltend Radioisotope wie ³H, ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;J und ¹&sup4;C. Diese Markierungen werden auf der Basis ihrer eigenen physikalischen Eigenschaften (z.B. Fluoreszoren, Chromophoren und Radioisotopen) oder auf der Basis ihrer reaktiven oder bindenden Eigenschaften (z.B. Enzyme, Substrate, Coenzyme und Inhibitoren) nachgewiesen. Beispielsweise kann eine mit einem Cofaktor markierte Nucleinsäure durch Zugabe des Enzyms, für das die Markierung einen Cofaktor darstellt, und eines Substrats für das Enzym nachgewiesen werden. Eine mit einem Hapten oder einem Ligand (z.B. Biotin) markierte Nucleinsäure kann durch Zugabe eines Antikörpers oder eines Antikörper-Pigments zum Mapten oder eines Proteins (z.B. Avidin) nachgewiesen werden, welches den Ligand bindet, der mit einem nachweisbaren Molekül behaftet ist. Ein Antigen kann ebenfalls als eine Markierung verwendet werden. Ein solches nachweisbares Molekül kann ein Molekül mit einer meßbaren physikalischen Eigenschaft (z.B. Fluoreszenz oder Absorptionsvermögen) oder ein Teilnehmer in einer Enzymreaktion (z.B., siehe obige Liste) sein. Beispielsweise kann man ein Enzym verwenden, das auf ein Substrat einwirkt, um ein Produkt mit meßbarer physikalischer Eigenschaft zu erzeugen. Beispiele des letzteren schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Papain und Peroxidase ein. Für Untersuchungen von in-situ-Hybridisierung ist im Idealfall das Endprodukt wasserunlöslich. Weitere Markierungsmittel, z.B. Farbstoffe, sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Das Markierungsmittel wird an die Intercalatorverbindung, z.B. die Acridin-Farbstoffe, Phenanthridine, Phenazine, Furocumarine, Phenothiazine und Chinoline, durch direkte chemische Bindung wie kovalente Bindungen oder durch indirekte Verbindung wie durch die Einbringung des a Markierungsmittels in eine Microkapsel oder ein Liposom gebunden, welche sich ihrerseits an die Intercalatorverbindung binden. Verfahren, durch die das Markierungsmittel an die Intercalatorverbindungen gebunden wird, sind im Stand der Technik im wesentlichen bekannt, und jedes herkömmliche Verfahren kann zur Durchführung der vorliegenden Erfindung herangezogen werden.
Vorteilhafterweise wird die Intercalatorverbindung zuerst mit Markierungsmittel chemisch und danach mit der Nucleinsäure- Komponente verbunden. Da Biotin eine Carboxylgruppe aufweist, kann es beispielsweise mit einem Furocumarin über eine Amidoder Esterbildung verbunden werden, ohne daß sich Störungen bei der photochemischen Reaktivität des Furocumarins oder der biologischen Aktivität des Biotins ergeben, z.B.: Biotin-N-hydroxysuccinimid oder Biotin-p-nitrophenylester oder Biotin + ROH Carbodiimid BiotiCOOR Als Beispiel Biotinnitrophenylester
Weitere Aminomethylangelicin-, -psoralen- und -phenanthrididium-Derivate können in ähnlicher Weise zur Reaktion gebracht werden, wie auch Phenanthrididium- Halogenide und Derivate davon wie Aminopropylmethidium- Chlorid, d.h.:
(siehe Herzberg et al, J. Am.Chem.Soc., 104, 313, 1982).
Alternativ dazu, kann ein bifunktionelles Reagens wie Dithiobissuccinimidylpropionat oder 1,4- Butandioldiglycidylether dazu verwendet werden, das photochemisch reaktive Molekül mit dem Markierungsmittel direkt zu verkuppeln, wobei die Reaktionsteilnehmer Alkylaminoreste aufweisen, und zwar erfolgt dies wiederum in bekannter Weise bezüglich der Lösungsmittel, Mengenverhältnisse und Reaktionsbedingungen. Bestimmte bifunktionelle Reagentien, wie gegebenenfalls Glutaraldehyd, können nicht geeignet sein, weil sie bei der Kupplung die Nucleinsäure modifizieren können und somit das Assayverfahren stören. Routinemäßige Vorkehrungen können zur Vermeidung solcher Schwierigkeiten getroffen werden.
Die besondere Abfolge, die zur Herstellung der markierten Nucleinsäure angewandt wird, kann variiert werden. So kann z.B. ein Amino-substituiertes Psoralen zuerst mit einer Nucleinsäure photochemisch gekuppelt werden, wobei das Produkt anhängige Aminogruppen aufweist, durch welche es an das Markierungsmittel gekuppelt werden kann, d.h., die Markierung kann durchgeführt werden, indem man einen DNA- Bindungsligand mit der Nucleinsäure in der Testprobe photochemisch reagieren läßt. Alternativ dazu, kann das Psoralen zuerst an ein Markierungsmittel wie ein Enzym und dann an die Nucleinsäure gekuppelt werden.
Wie in EP-A-187 332 beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls eine markierte Nucleinsäure, umfassend (a) eine Nucleinsäure-Komponente, (b) einen Nucleinsäure- Bindungsligand, der photochemisch an die Nucleinsäure- Komponente gebunden ist, (c) ein Markierungsmittel und (d) einen Spacer, der (b) und (c) chemisch verbindet.
Vorteilhafterweise schließt der Spacer eine Kette von bis zu ca. 40 Atomen, vorzugsweise von ca. 2 bis 20 Atomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, ein.
Ein solcher Spacer kann der polyfunktionelle Rest eines Vertreters sein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Peptid, Kohlenwasserstoff, Polyalkohol, Polyether, Polyamin, Polyimin und Kohlenhydrat, z.B. -Glycyl-Glycl-Glycyl- oder ein anderes Oligopeptid, Carbonyl-Dipeptide und ω- Aminoalkylcarbonylreste wie -NH-(CH&sub2;)&sub5;-CO-, ein Spermin- oder Spermidin-Rest, ein α-ω-Alkandiamin-Rest wie -HN-(CH&sub2;)&sub6;-NH- oder -HN-CH&sub2;-CH&sub2;-NH- oder dgl.. Zucker-, Polyethylenoxid- Reste, Glyceryl-, Pentaerythryt- und ähnliche Reste können ebenfalls als Spacer dienen.
Diese Spacer können direkt an den Nucleinsäure-Bindungsligand und/oder das Markierungsmittel gebunden sein, oder die Bindungen können einen zweiwertigen Rest eines Kupplers wie Dithiobissuccinimidylpropionat, 1,4-Butandioldiglycidylether, ein Diisocyanat, Carbodiimid, Glyoxal, Glutaraldehyd oder dgl. einschließen.
Der Spacer kann in jeder Stufe des Verfahrens zur Herstellung der Sonde eingelagert werden:
a-b-d-c
wie oben definiert. Somit kann die Abfolge jede der folgenden sein:
a+b+d+c
b+d+c+a
d+c+b+a
b+d+a+c usw.
Die Bedingungen für die jeweiligen Stufen sind in der Chemie wohlbekannt.
Ist das Markierungsmittel beispielsweise ein Enzym, wird das Produkt letztlich auf ein geeignetes Medium gegeben, und es wird das Ausmaß der Katalyse ermittelt. Ist somit das Enzym eine Phosphatase, könnte das Medium Nitrophenylphosphat enthalten, und man würde die Menge an erzeugtem Nitrophenol durch Beobachtung der Farbentwicklung ermitteln und aufzeichnen. Ist das Enzym eine β-Galactosidase, könnte das Medium o-Nitrophenyl-D-galactopyranosid enthalten, das ebenfalls Nitrophenol freisetzen wird.
Die markierte Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung ist auf alle herkömmlichen Hybridisierungsassay-Formate anwendbar, und im allgemeinen auf jedes Format, das sich auf der Grundlage der Bildung eines Mybridisierungsprodukts oder -aggregats, welche die markierte Nucleinsäure enthalten, zur Anwendung bringen läßt. Insbesondere kann die einzigartige markierte Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung in Lösungs- und Festphasen-Hybridisierungsformaten verwendet werden, einschließlich, in letzterem Fall, von Formaten, die eine Immobilisierung von entweder der Proben- oder der Sonden-Nucleinsäuren sowie Sandwich-Formate beinhalten.
Die Nucleinsäure-Sonde enthält mindestens 1 hybridisierbare, z.B. einzelstrangige, Basensequenz, die im wesentlichen komplementär zu oder homolog mit der nachzuweisenden Sequenz ist. Allerdings braucht diese Basensequenz kein einzelnes kontinuierliches Polynucleotid-Segment zu sein, sondern sie kann zwei oder mehr individuelle Segmente enthalten, die durch nicht-homologe Sequenzen unterbrochen sind. Diese nicht-homologen Sequenzen können linear sein, oder sie können selbst-komplementär sein und Haarnadelschleifen bilden. Außerdem kann die homologe Region der Sonde an den 3'- und 5'-Enden durch nicht-homologe Sequenzen flankiert sein, wie durch jene, welche die DNA oder RNA oder einen Vektor enthalten, in welche die homologe Sequenz zur Fortpflanzung inseriert worden ist. In jedem Fall zeigt bzw. ergibt die als analytisches Reagens vorliegende Sonde eine nachweisbare Hybridisierung an einem oder mehreren Punkten mit den Proben- Nucleinsäuren von Interesse. Lineare oder zirkulare hybridisierbare, z.B. einzelstrangige, Polynucleotide können als das Sondenelement verwendet werden, wobei größere oder kleinere Anteile mit einem komplementären Polynucleotid- Strang oder entsprechenden Strängen dupliziert sind, unter der Voraussetung, daß das kritische homologe Segment oder die Segmente in einzelstrangiger Form vorliegen und zur Hybridisierung mit Proben-DNA oder -RNA verfügbar sind. Geeignete Sonden schließen lineare oder zirkulare Sonden ein, worin die homologe Sondensequenz in im wesentlichen alleiniger einzelstrangiger Form vorliegt (siehe insbesondere Hu und Messing, Gene, 17:271, 1982).
In Festphasen-Hybridisierungs-Formaten ist eine der Polynucleotid-Species, die an der Hybridisierung teilnehmen, in geeigneter Weise in ihrer einzelstrangigen Form an eine feste Trägerunterlage fixiert. Geeignete feste Trägerunterlagen sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen jene ein, die Nucleinsäuren entweder kovalent oder nicht-kovalent binden. Nicht-kovalente Trägerunterlagen, unter denen im allgemeinen solche verstanden werden, die eine hydrophobe Bindung beeinhalten, schließen natürlich vorkommende und synthetische polymere Materialien, wie Nitrocellulose, derivatisiertes Nylon und fluorierte Polykohlenwasserstoffe, in einer Vielzahl von Formen wie von Filtern, Perlen oder Festplatten ein. Kovalent bindende Trägerunterlagen (in der Form von Filtern, Perlen oder Festplatten, um nur einige zu nennen) sind ebenfalls geeignet und umfassen Materialien, die chemisch reaktive Gruppen oder Gruppen, wie Dichlortriazin, Diazobenzyloxymethyl und dgl., aufweisen, welche zur Bindung an Polynucleotide aktiviert werden können.
Es ist wohlbekannt, daß eine nicht-kovalente Immobilisierung eines Oligonucleotids unwirksam auf einer festen Trägerunterlage, z.B. auf Nitrocellulose-Papier, ist. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch neue Verfahren der Oligunucleotid-Immobilisierung. Dies wird durch Phosphorylierung eines Oligonucleotids durch eine Polynucleotid-Kinase oder durch Ligation des 5'- phosphorylierten Oligonucleotids bewerkstelligt, um Multi- Oligonucleotid-Moleküle zu erzeugen, die zur Immobilisierung befähigt sind. Die Bedingungen für die Kinase- und Ligationsreaktion sind in Standard-Textbüchern beschrieben worden, z.B. Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 1-123.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die immobile Phase des Hybridisierungssystems eine Reihe oder Matrix von Flecken bekannter Arten und/oder Verdünnungen denaturierter DNA sein. Dies wird am einfachsten dadurch zubereitet, daß man geeignete kleine Volumina nativer DNA auf eine trockene Nitrocellulose- oder Nylon-Platte pipettiert, eine Natriumhydroxidlösung über die Platte fließen läßt, um die DNA zu denaturieren, die Platte in einer Neutralisierlösung spült und sie dann einem Backverfahren unterzieht, um die DNA zu fixieren. Vor der DNA:DNA-Hybridisierung wird die Platte gewöhnlich mit einer Lösung behandelt, die nicht-spezifische Bindung zugefügter DNA während der Hybridisierung zu inhibieren vermag.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Markierung von ganzer genomischer DNA, ganzer in Zellen vorhandener Nucleinsäuren, ganzer Zell-Lysate oder unlysierter ganzer Zellen. Sobald das markierte Material zubereitet und hergestellt ist, kann es für die entsprechenden Nachweisreaktionen herangezogen werden, d.h. den Nachweis der An- oder Abwesenheit bestimmter spezifischer genomischer Sequenzen mittels spezifischer Nucleinsäure-Hybridisierungs- Assayverfahren.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Abtrennung von Zellen aus einer Probe vom Menschen, oder die Probe vom Menschen wird direkt durch Vermischen mit einem photochemisch reaktiven Nucleinsäure bindenden Intercalationsligand behandelt. Die Mischung wird in Abhängigkeit vom Typ der Probe inkubiert. Ist die Probe durch lysierte Zellen oder Nucleinsäuren dargestellt, wird sie über eine Dauer von einigen Sekunden bis 5 Minuten inkubiert, und wenn ganze Zellen oder teillysierte Zellen verwendet werden, wird eine Inkubation in einer Dauer von 2 Minuten bis 2 Stunden angewandt. Nach Vermischung und Inkubation wird die gesamte Probenmischung bei einer bestimmten Wellenlänge zur kovalenten Wechselwirkung zwischen dem photochemisch reaktiven DNA-Bindungsligand und der Testprobe bestrahlt. Dann wird dieses markierte Material unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen mit einer spezifischen Sonde hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wird unreagiertes unhybridisiertes markiertes Testprobenmaterial durch Waschen entfernt. Nach dem Waschvorgang wird das Hybrid durch die Markierung nachgewiesen, die die Testprobe aufweist, welche in spezifischer Weise mit einer spezifischen Sonde hybridisiert worden ist.
Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung sind insofern überraschend, als in einer genomischen Probe von Menschen die Menge eines einzelnen Kopie-Gens sehr niedrig ist. Stellt beispielsweise ein Restriktionsfragment von 1000 Basenpaaren die Hybridisierungsregion dar, beträgt die Häufigkeit einer solchen Sequenz in der gesamten genomischen Probe vom Menschen 1 in einigen Millionen. Diese Berechnung ist abgeleitet worden, indem man aus der Literatur entnommen hat, daß eine genomische Probe vom Menschen 3 x 10&sup9; Basenpaare aufweist und 1000 Basenpaare 1/3.000.000 dieser Zahl ergeben. Ganz automatisch sind in einer Probe menschlicher DNA, die annähernd 5 bis 10 ug Nucleinsäuren enthält, lediglich 5 bis 10 pg der entsprechenden Sequenzen verfügbar, und eine w Markierung der übergroßen Mehrheit an nicht-spezifischer DNA sollte vergleichsweise mehr Hintergrund erzeugen als richtiges Signal. Jedoch ist es nach der Reaktion überraschend, festzustellen, daß die Ergebnisse nicht nur spezifisch sind, sondern sich auch durch unerwartet höhere Empfindlichkeit auszeichnen.
Ohne an eine besondere Theorie der einschlägigen Vorgänge und Abläufe gebunden sein zu wollen, könnte der Grund für die unerwartete Empfindlichkeit darin liegen, daß sich ein Netzwerk nicht-spezifischer Nucleinsäure-Hybride bildet, die an das spezifische Hybrid gebunden sind und somit die Menge des Signals verstärken. Wie in einem typischen Beispiel gezeigt worden ist, wird eine spezifische Sequenz mit einer Länge von 19 Nukleotiden, welche ein Plasmid enthält, bei Vorliegen von 5 ug Äquivalent einer Testprobe immobilisiert und hybridisiert, die photochemisch markiert werden, und man weist sehr leicht das aus einem solchen Hybrid entstandene Signal nach. Ein solches Ergebnis konnte durch keine andere Technik bisher erzielt werden, und zwar wegen der Probleme im Zusammenhang mit dem Markierungsverfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Hybridisierungstechnik, wobei Sonden immobilisiert sind und eine eukaryontische Nucleinsäure-Probe markiert und mit der immobilisierten unmarkierten Sonde hybridisiert wird. Es stellt ein überraschendes Kennzeichen der vorliegenden Erfindung dar, daß man befähigt ist, einzelne oder mehrfache Kopiegen-Defekte durch Markierung einer Testprobe nachzuweisen. Da ein Überschuß an markierter Hybridisierungssequenz nicht erforderlich ist, gestaltet sich das vorliegende Verfahren spezifisch. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung läßt sich auch ein gleichzeitiger Nachweis verschiedener Gen-Defekte durch Immobilisierung entsprechender spezifischer Sonden leicht durchführen.
Beipsielsweise kann man durch Anwendung der vorliegenden Erfindung Oligonucleotid-Sonden, die für genetische Defekte spezifisch sind, welche im Zusammenhang mit Hämoglobinopathien, wie Sichelzellenanämie und α-Thalassemien, stehen, an einem Blatt aus Nitrocellulose- Papier immobilisieren, die Testprobe markieren und die markierte Testprobe mit den immobilisierten Sonden hybridisieren. Dabei ist es überraschend, daß nur teilweise gereinigte oder ungereinigte Nucleinsäure-Proben (Zell-Lysat oder ganze Zelle) mit empfindlichen Molekülen photochemisch markiert werden können, ohne die spezifische Hybridisierbarkeit zu beeinträchtigen.
Das Oligonucleotid kann auch zu Klonierungsvektoren, z.B. M 13, PUC 19 und PBR, kloniert werden, und demzufolge fungiert der das Oligonucleotid enthaltende Vektor als die Sonde.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere auch ein Nachweisverfahren für Eukaryonten (Einzeller) in Proben aus höheren Organismen, wie von Tier oder Mensch.
Eukaryonten schließen Algen, Protozoen, Pilze und Schleimmoder ein.
Der Begriff "Algen" bezieht sich im allgemeinen auf Chlorophyll-haltige Einzeller, von denen Beschreibungen in G.M. Smith, Cryptogamic Botany, 2. Ausgabe, Bd. 1, Algae and Fungi, McGraw-Hill, 1955, zu finden sind.
Eukaryontische Sequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung schließen alle krankhaften Sequenzen ein, ausgenommen Bakterien und Viren. Demnach sind beispielsweise genetische Krankheiten ebenfalls vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt. Nicht-einschränkende Beispiele solcher genetischer Krankheiten sind die folgenden: Betroffener Bereich Krankheiten Metabolismus Nervensystem Akute intermittierende Porphyrie Vielfältige Prophyrie α&sub1;-Antitrypsin-Mangel Cystische Fibrose Phenylketonurie Tay-Sachs-Krankheit Mucopolysaccharidose Galactosaemie Homocystinurie Cystinurie Metachrome Leucodystrophie Huntington's Chorea Neurofibromatose Myotonische Dystrophie Tuberöse Sklerose Neurogenische Muskelatrophien Blut Darm Nieren Augen Ohren Kreislauf Zähne Knochenbau Haut Locomotorik Sichelzellenanaemie β-Thalassaemie Congenitale Spherocytose Hämophilie A Polyposis coli Polycystische Erkrankung Dominante Blindheit Retinoblastoma Dominante frühe Kindheits-Taubheit Dominant Otosklerose Monogene Hypercholesterolaemie Congenitale Spherocytose Dentinogenesis imperfecta Amelogenesis imperfecta Diaphysiale Aclasie Thanatophorer Zwergenwuchs Osteogenes imperfecta Marfan Syndrom Achondroplasie Ehlers-Danlos Syndrom Osteopetrosis tarda Gespaltene(r) Lippe/Gaumen (Wolfsrachen) Ichthyose Muskeldystrophie
Eine erfindungsgemäß verwendete Nucleinsäure-Sonde ist eine Sequenz, die die Sequenz der Testprobe zu bestimmen vermag. Die Sonden sind gewöhnlich DNA, RNA, gemischte Polymere von Ribo- und Deoxyribonucleinsäuren, Oligonucleotide, enthaltend Ribonucleotid- oder Deoxiribonucleotid-Reste oder deren modifizierte Formen. Die Sequenz einer solchen Sonde sollte komplementär zur Test-Sequenz sein. Das Ausmaß komplementärer Eigenschaften bestimmt die Stabilität der nach Hybridisierung gebildeten Doppelhelix. Die Sonde kann auch kovalent gebundene nicht-komplementäre Nucleinsäuren aufweisen. Sie können als Orte zum Nachweis der Markierung dienen.
Die Nucleinsäure wird vorzugsweise durch photochemische Maßnahmen markiert, wobei man eine photoreaktive, sich an DNA bindende Furocumarin- oder Phenanthridin-Verbindung zur Anwendung bringt, um sich mit der Nucleinsäure zur Markierung zu verbinden, welche dann in herkömmlicher Weise, einschießlich eines Fluoreszenz-Nachweises, "gelesen" oder durch ein Assayverfahren analysiert werden kann.
Ein Verwendungsgegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Identifikation bakterieller Species in biologischen Flüssigkeiten. In einer Anwendungsform können Urinproben von Personen, bei denen Urintrakt-Infektionen oder ein entsprechender Verdacht vorliegen, das Material zur Zubereitung markierter DNA(s) oder RNA(s) liefern, wobei ein fester Trägerunterlagenstreifen, z.B. aus Nitrocellulose oder Nylon, individuelle Punkte oder Flecken bekannter Mengen denaturierter gereinigter DNA aus jedem der verschiedenen Bakterien enthalten kann, die wahrscheinlich für die Infektion verantwortlich sind.
Der Format-Ansatz markierten unbekannten Materials und unmarkierter Sonden, welcher die Umkehrung von Standard- Schemata darstellt, ermöglicht es, unter einer Anzahl von Möglichkeiten die Species eines Organismus in einer Probe mit lediglich einer einzigen Markierung zu identifizieren. Ebenfalls wird eine gleichzeitige Bestimmung des Vorliegens von mehr als einer unterscheidbaren bakteriellen Species in einer Probe ermöglicht (unter der Annahme, daß in einer Mischung beim Markierungsvorgang keine DNA gegenläufig gekennzeichnet wird). Es läßt sich allerdings nicht in einfacher Weise, und zwar besser als eine Abschätzung der Menge an DNA (und deshalb der Konzentration an Bakterien), eine solche in einer gemischten Probe durchführen. Für eine solche quantitative Abschätzung wird Proben-DNA in einer Reihe von Verdünnungsflecken neben Flecken von Standard-DNA immobilisiert, und die Sonden-DNAs sind markiert.
Eine Urintrakt-Infektion (UTI) tritt fast immer aufgrund von monoklonalem Wachstum einer der folgenden, ein halbes Dutzend zählenden Arten eines Microorganismus auf: Escherichia coli (60-90% UTI), Proteus spp. (5-20% UTI), Klebsiella spp. (3- 10% UTI), Staphylococcus spp. (4-20% UTI), Streptococcus spp. (2-5% UTI). Pseudomonas und einige weitere gram-negative stäbchen machen zusammen einen niedrigen Prozentsatz von UTI aus. Ein allgemeines Kontaminans von Harnproben, welches einen Hinweis auf unsaubere Probennahme darstellt, ist Lactobacillus.
Die Konzentration an Bakterien in einer Urinprobe, die eine Infektion definiert, beträgt ca. 10&sup5; pro ml.
Das Format für ein unmarkiertes Sonden-Hybridisierungssystem, das auf Urintraktinfektion anwendbar ist, soll eine Matrix von DNAS aus der obigen Liste von Species aufweisen, welche denaturiert und auf einer Trägerunterlage wie Nitrocellulose immobilisiert sind, und zwar in einem Mengebereich, der sich für Konzentrationen von bakteriellen DNAS eignet, die in Proben markierter unbekannter Species zu erwarten sind.
Standard-Hybridisierung mit biotinylierten ganzen Genom-DNA- Proben findet in 5 bis 10 ml statt, bei einer Probenkonzentration von ca. 0,1 ug/ml; Hybridisierung der Probe an einem Fleck, der ca. 10 ng denaturierter DNA enthält, ist rasch nachweisbar. Es sind ca. 5 fg an DNA pro bakterieller Zelle vorhanden, so daß es für eine Probe zum Erhalt von 1 ug markierter DNA notwendig ist, 2 x 10&sup8; Bakterien zu sammeln. Erzeugt eine Infektion Urin mit annähernd 10&sup5; Bakterien ml, wird dann bakterielle DNA, um aus einer geeigneten Probe markiert werden zu können, aus 2000 ml des Harns aufkonzentriert. Werden mehr als 10 ng unmarkierte Sonden-DNA in einem Punkt immobilisiert, z.B. 100 ng oder 1 ug, oder wird das Hybridisierungsvolumen verringert, dann beträgt das Volumen des für die Zubereitung der markierten unbekannten Probe erforderlichen Urins annähernd einige Zehntel eines ml.
Ein Streifen von Punkten, die immobilisierte, denaturierte, unmarkierte Sonden-DNAS enthalten, könnte die folgende Konfiguration aufweisen: Escherichia Proteus Klebsiella Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas Lactobacillus
Die weitere Vorgehensweise beinhaltet die Markierung von DNA oder RNA in einem rohen Zell-Lysat. In idealer Weise ist die Zubereitung von markierter Proben-DNA oder -RNA durch die folgenden Gesichtspunkte gekennzeichnet:
(1) Bakterien werden aus einer fließfähigen Probe durch Zentrifugation oder Filtration aufkonzentriert;
(2) Bakterien werden unter Bedingungen lysiert, die ausreichen, um Nucleinsäuren aus den widerstandsfähigsten der Organismen von Interesse freizusetzen;
(3) das Markierungsprotokoll erfordert weder eine Reinigung markierter Nucleinsäuren von nicht-eingelagerten Vorstufen noch die Reinigung der Nucleinsäuren vor der Markierung;
(4) das Markierungsprotokoll ist hinreichend spezifisch für DNA und/oder RNA, so daß in der Zubereitung vorhandene Proteine, Lipide und Polysaccharide weder die Hybridisierung noch die Ablesung stören.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur wirksamen und raschen Lysierung ganzer Zellen, einschließlich gram-positiver Bakterien, zur Verfügung gestellt. Dabei beinhaltet das Verfahren, daß man Zellen, z.B. ganze Zellen, mit Alkali, z.B. mit einer Natrium- oder Kaliumhydroxidlösung, in einer Konzentration von 0,1 bis 1,6 normal in Kontakt bringt.
Die wichtigen Merkmale des vorliegenden Lyse-Protokolls sind dessen relative Einfachheit sowie die Geschwindigkeit. Es wird eine übliche Chemikalie eingesetzt, die keine besonderen Lagerungsbedingungen erforderlich macht, und sie lysiert mit hoher Effizienz, sogar gram-positive Organismen, wobei die Eigenschaften der DNA, die für die anschließenden Stufen im photochemischen Markierungsverfahren wichtig sind, aufrechterhalten bleiben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die immobile Phase des Hybridisierungssystems eine Reihe oder Matrix von Flecken bekannter Arten und/oder Verdünnungen denaturierter DNA sein. Dies wird am einfachsten zubereitet und hergestellt, indem man geeignete kleine Volumina nativer DNA oder von Oligonucleotiden auf ein trockenes Blatt aus Nitrocellulose oder Nylon pipettiert, eine Natriumhydroxidlösung zur Denaturierung der DNA über das Blatt fließen läßt, das Blatt in einer Neutralisierlösung spült, und es dann zur Fixierung der DNA einem Backvorgang unterzieht. Vor der DNA:DNA- Hybridisierung wird das Blatt gewöhnlich mit einer Lösung behandelt, die nicht-spezifische Bindung zugefügter DNA während der Hybridisierung inhibiert.
Die Erfindung wird nun in den folgenden nicht-einschränkenden Beispielen noch weiter beschrieben, worin die als Teile angegebene Menge auf das Gewicht bezogen ist, wenn nichts anderes ausgesagt ist.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung einer Markierungsverbindung

Zur Herstellung der Markierungsverbindung wurde 1-Amino-17-N- (biotinylamido)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan herangezogen. Diese Verbindung wurde in den folgenden vier Stufen hergestellt:
(a) Es wurde 3,6,9,12,15-Pentaoxaheptadecan-1,17-diol- Ditosylat synthetisiert.
(b) Es wurde das 1,17-Diphthalimido-Derivat von 3,6,9,12,15- Pentaoxaheptadecan hergestellt.
(c) Es wurde das 1,17-Diamino-Derivat von 3,6,9,12,15- Pentaoxaheptadecan hergestellt.
(d) Es wurde das 1-Amino-17-biotinylamido-Derivat von 3,6,9,12,15-Pentaoxaheptadecan hergestellt.

Beispiel 1 (a):

Herstellung des Ditosylats von 3,6,9,12,15- Pentaoxaheptadecan-1,17-diol

Zu einer gerührten Lösung, enthaltend 50 g Hexaethylenglycol (0,177 Mol) und 64 ml Triethylamin (39,36 g, 0,389 Mol) in 400 ml CH&sub2;Cl&sub2; , tropfte man bei 0ºC 2,5 h lang eine Lösung, w enthaltend 73,91 g p-Toluolsulfonylchlorid (0,389 Mol) in 400 ml CH&sub2;Cl&sub2;. Die Reaktionsmischung wurde dann 1 h lang bei 0ºC gerührt und dann bei Umgebungstemperatur 44 h lang gehalten. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der entstehende heterogene Rückstand wurde in 500 ml Ethylacetat suspendiert und filtriert. Das Filtrat wurde dann im Vakuum auf ein gelbes Öl eingeengt, welches achtmal mit 250 ml Teilmengen warmen Hexans verrieben wurde, um unreagiertes p-Toluolsulfonylchlorid zu beseitigen. Das sich ergebende Öl wurde dann unter Hochvakuum eingeengt, um 108,12 g eines gelben Öls (quantitative Ausbeute) zu ergeben.
Analyse: für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub8;O&sub1;&sub1;S&sub2;
berechnet:C, 52,87; H, 6,48
gefunden: C, 52,56; H, 6,39
PMR: (60 MHz, CDCl&sub3;)δ: 2,45 (s, 6H); 3,4-3,8 (m, 20H); 4,2 (m, 4H); 7,8 (AB-Quartett, J= 8Hz, 8H).
IR: (rein) cm&supmin;¹: 2870, 1610, 1360, 1185, 1105, 1020, 930, 830, 785, 670.

Beispiel 1 (b):

Herstellung von 1,17-Diphthalimido-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan

Eine gerührte Suspension, enthaltend 108 g Ditosylat von 3,6,9,12,15-Pentaoxaheptadecan-1,17-diol (0,183 Mol), 74-75 g Kaliumphthalimid (0,403 Mol) und 700 ml Dimethylacetamid wurde bei 160 - 170ºC 2 h lang erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser und Aceton gewaschen, um 53,05 g Produkt als weißes Pulver zu ergeben, das bei 55ºC (0,1 mm) getrocknet wurde. F.= 124-126ºC.
Eine zweite Gewinnung von Produkt wurde aus dem Dimethylacetamid-Filtrat durch Eindampfen im Vakuum erhalten, und es wurde der sich ergebende Niederschlag nacheinander mit Ethylacetat, Wasser und Aceton gewaschen. Das sich ergebende weiße Pulver wurde bei 55ºC (0,1 mm) getrocknet, um zusätzliche 9,7 g Produkt zu ergeben. F.= 124,5 - 126,5ºC. Die zusammengefaßte Produktausbeute betrug 62,82 g (68% Ausbeute).

Analyse: (1. Gewinnung)

Für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub9; x 1/2 H&sub2;O
berechnet:C, 61,19; H, 6,05; N, 5,09
gefunden: C, 61,08; H, 6,15; N, 5,05

(2. Gewinnung)

Für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub9;
berechnet: C, 62,21; H, 5,97; N, 5,18
gefunden: C, 61,78; H, 6,15; N, 5,13
PMR: (60 MHz, dmso-d&sub6;) δ: 3,5 (s, 8H); 3,6 (s, 8H); 3,8 (bt, J=3Hz, 8H); 8,1 (s, 8H).
IR: (KBr) cm&supmin;¹: 2890, 1785, 1730, 1400, 1100, 735.

Beispiel 1(c)

Herstellung von 1,17-Diamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan

Eine Lösung, enthaltend 60 g 1,17-Diphthalimido-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan (0,118 Mol), 14,8 g Hydrazin-Hydrat (0,296 Mol) und 500 ml Ethanol, wurde unter mechanischem Rühren in einem 100ºC Ölbad 3 h lang erhitzt. Die Mischung wurde dann abgekühlt und filtriert. Der entstandene Filterkuchen wurde viermal mit 300 ml Teilmengen Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingeengt, um 32,35 g eines gelben opaken glasartigen Öls zu ergeben. Die Verdampfungsdestillation bei 150-200ºC (0,01 mm) ergab 22,82 g eines hellgelben Öls (69% Ausbeute). Literatur- Siedepunkt: 175-177ºC (0,07 mm).
PMR (60 MHz, CDCl&sub3;) δ: 1,77 (s, 4H, NH&sub2;); 2,85 (t, J=5Hz, 4H); 3,53 (t, J=5Hz, 4H); 3,67 (m, 16H)
IR: (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹: 3640, 3360, 2860, 1640, 1585, 1460, 1350, 1250, 1100, 945, 920, 870.
Massenspektrum: (EI) m/e = 281,2 (0,1%, M+1).
(FAB) m/e = 281,2 (100%, M+1).
Analyse für C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub5; x 1/2 H&sub2;O
berechnet: C, 49,80, H, 10,10; N, 9,68
gefunden: C, 50,36; H, 9,58; N, 9,38
Literatur-Angabe: W. Kern, S. Iwabachi, H. Satu und V. Bohmer, Makrol. Chem., 180, 2539 (1979).

Beispiel 1 (d)

Herstellung von 1-Amino-17-N-(biotinylamido)-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan

Eine Lösung, enthaltend 7,2 g 1,17-Diamino-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan (25 mMol) in 75 ml DMF unter einer Argon- Atmosphäre, wurde mit 3,41 g N-Succinimidylbiotin (10 mMol) behandelt, welches anteilweise über 1,0 h zugefügt wurde. Die sich ergebende Lösung wurde 4 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. TLC (SiO&sub2;, 70:10:1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH-konz.NH&sub4;OH), sichtbar gemacht durch Dimethylaminozimtaldehyd-Sprühreagens, zeigte eine ausgezeichnete Umsetzung zu einem neuen Produkt (Rf=0,18). Die Reaktionsmischung wurde in zwei Hälften aufgeteilt, und es wurde jede Hälfte auf SiO&sub2; absorbiert und an 500 g SiO&sub2;-60 (230-400 mesh) unter Verwendung einer 70:10:1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH-konz.NH&sub4;OH-Lösungsmittelmischung einer Blitzchromatographie unterzogen. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden zusammengefaßt und eingeengt, um 2,42 g eines gelatinösen, wachsartigen Feststoffs zu ergeben. Das Produkt wurde als ein Feststoff aus Isopropanol-Ether ausgefällt, mit Hexan gewaschen und bei 55ºC (0,1 mm) getrocknet, um 1,761 g eines weißen Pulvers (35% Ausbeute) zu ergeben.
Analyse: für C&sub2;&sub2;H&sub4;&sub2;N&sub4;O&sub7;S x 3/2 H&sub2;O:
berechnet: C, 49,51; H, 8,50; N, 10,49
gefunden: C, 49,59; H, 8,13; N, 10,39
PMR: (90 MHz, dmso-d&sub6;) δ: 1,1-1,7 (m, 6H); 2,05 (t, J= 7Hz, 2H); 2,62 (t, J=4Hz, 1H); 2,74 (t, J=4Hz, 1H); 3,0-3,4 (m, 14H); 3,50 (s, 14H); 4,14 (m, 1H); 4,30 (m, 1H); 6,35 (d, J=4Hz, 1H); 7,80 (m, 1H).
CMR: (22,54 MHz, dmso-d&sub6;) δ: 25,2; 28,0; 28,2; 35,1; 40,6; 55,3; 59,2; 61,1; 69,6; 69,8; 71,2; 162,7; 172,1.
IR: (KBr) cm&supmin;¹: 2900, 2850, 1690, 1640, 1580, 1540, 1450, 110.
Massenspektrum (FAB) m/e: 507,3 (M+1, 56%)

Beispiel 2:

Herstellung von 4'-Biotinyl-PEG-4,5'-dimethylangelicin

Eine Lösung von 203 mg 1-Amino-17-N-(biotinylamido)- 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan (0,4 mMol) in 1 ml DMF wurde unter einer Argon-Atmosphäre mit 78 mg N,N-Carbonyldiimidazol (0,48 mMol) behandelt. Die sich ergebende Mischung wurde 4 h lang gerührt und dann mit 55 mg 4'-Aminomethyl-4,5'- dimethylangelicin-Hydrochlorid (0,2 mMol), 140 ul Diisopropylethylamin und 100 ul DMF behandelt. Die sich ergebende Mischung wurde über Nacht bei 50ºC gerührt. Die Mischung wurde dann auf SiO&sub2; im Vakuum eingedampft, und es wurde das entstandene imprägnierte Feststoff-Blitzprodukt an 60 g SiO&sub2; (230 - 400 mesh) chromatographiert, worauf mit 1,5 1 von 7% CH&sub3;OH-CHCl&sub3; und anschließend mit 1 l von 10% CH&sub3;OH- CHCl&sub3; eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden zusammengefaßt und eingeengt, um 72 mg eines glasigen Feststoffs (47% Ausbeute) zu ergeben.
PMR: (90 MHz, dmso-d&sub6;) δ: 1,1-1,8 (m, 6H); 2,04 (bt, J=7Hz, 2H); 2,5 (s, 6H); 2,56 (m, 1H); 2,74 (bd, J=4Hz, 1H); 2,8 - 3,4 (m, 14H); 3,40 (m, 14H); 4,14 (m, 1H); 4,25 (m, 1H); 4,40 (bd, J=6Hz, 2H); 6,5 (m, 1H); 6,35 (s, 1H); 7,02 (s, 1H); 7,45 (d, J=8Hz, 1H); 7,62 (d, J=8Hz, 1H); 7,80 (m, 1H).
CMR: (22,5 MHz, dmso-6) δ: 11,9; 18,9; 25,3; 28,2; 28,3; 33,4; 35,2; 55,4; 59,2; 61,0; 69,2; 69,6; 69,8; 70,0; 89,0; 107,8; 112,0; 113,1; 114,3; 120,6; 121,6; 153,6; 154,4; 155,6; 157,9; 159,5; 162,7; 172,1.
Literatur-Angabe: F. Dall'Acqua, D. Vedaldi, S. Caffieri, A. Guiotto, P. Rodighiero, F. Baccichetti, F. Carlassare und F. Bordin, J.Med.Chem., 24, 178 (1981).

Beispiel 3

Allgemeines Verfahren zur Markierung der Testproben- Nucleinsäuren

Es wird eine DNA mit hohem Molekulargewicht aus der Probe eines Patienten durch das in US 4.395 482 (Wilson et al) beschriebene Verfahren isoliert.
Die Nucleinsäure wird in 10 mM Borat-Puffer (pH = 8,0) in einer Menge aufgelöst, daß die Endkonzentration annähernd 20 ug/ml beträgt. Zu der Nucleinsäure-Lösung wird "Angelicin- PEG-Biotin" in wässriger Lösung auf eine Endkonzentration von 10 ug/ml zugefügt. Die Mischung wird dann ca. 60 Minuten lang unter Verwendung einer schwarz strahlenden UVL 56 Lampe einer langwelligen Bestrahlung ausgesetzt. Das Produkt ist ohne w Reinigung zur Hybridisierung einsatzfähig. Allerdings kann das Produkt durch Dialyse oder Alkohol-Fällung (US 4.395.486) gereinigt werden, wie dies gewöhnlich bei Nucleinsäuren befolgt wird.
Statt der Nucleinsäuren kann ein ganzes Zell-Lysat unter Befolgung einer identischen Vorgehensweise ebenfalls markiert werden. Die Lyse wird durchgeführt, indem man die Zellen in 0,1 N Natriumhydroxid siedet, worauf Neutralisation mit Salzsäure erfolgt.
Werden ganze Zellen herangezogen, wird die Mischung aus "Ang- PEG-Bio" und den Zellen mindestens 60 Minuten lang vor der Bestrahlung inkubiert, um einen wirksamen Transport der Liganden zu gewährleisten. Es können viele verschiedene Variationen der oben beschriebenen Verfahrensweisen zur Markierung angewandt werden.

Beispiel 4

Hybridisierung mit markierter genomischer DNA zum nichtradioaktiven Nachweis.

Normale genomische (XX) DNA vom Menschen wurde mit "Biotin- PEG-Angelicin" (BPA) in 10 mM Borat-Puffer (pH = 8,2) mit einem Gewichtsverhältnis von 0,3 zu 1 (BPA:DNA) 15 Minuten lang auf Eis mit einer langwelligen UV-Lampe, Modell UVL 21, λ = 366 nm, photomarkiert. Eine Reinigung ist nicht notwendig.
Target-DNA-Oligonucleotide wurden direkt auf S & S- Nitrocellulose in 1 ul Aliquotmengen in der folgenden Konzentration immobilisiert und dann in einem 80ºC Vakuumofen 30 Minuten lang einem Backvorgang unterzogen. Die Mengen der verschiedenen immobilisierten Sonden sind die folgenden: durch Kinase (Verfahren ) BRL Handelsübliche biotinylierte * T für 43-mer S 16-mer (gemeinsam für sowohl A und S) 3'-TTAGAATTCCTAAATT-5'
Es wurden Filter in Blotto (5% Magertrockenmilch, 6xSSC, 20 mM Na-Pyrophosphat) 30 Minuten lang in einem 45ºC H&sub2;O-Bad vorhybridisiert.
Alle 4 Streifen wurden in Lösungen von 2 ml, enthaltend 2 ug markierte XX DNA, enthaltend normales β-Globingen (die Hybridisierungslösung war Blotto mit 10% PEG), 2 h lang in einem H&sub2;O-Bad von 45ºC hybridisiert.
Eine Strigenzwäsche wurde wie folgt durchgeführt:
1 x 20' bei Raumtemperatur in 6 x SSC
2 x 20' bei den in Fig. 1 angegebenen Temperaturen unter sehr schwachem Rühren.
50 ml Zentrifugenröhrchen wurden für die Wäsche bei erhöhter Temperatur verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Der Nachweis von Biotin im Hybrid wurde gemäß Handbuch von Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland, USA, unter Verwendung von deren Kit zum Biotin-Nachweis durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten spezifische Hybridisierung an.

Beispiel 5

Nachweis einer Urintrakt-Infektion in einer Urinprobe

Urinproben wurden von einem Hospital gesammelt, wo sie mit Microbiologischen Verfahren analysiert worden waren, und die Ergebnisse wurden geheimgehalten, bis die Hyridisierungsdiagnose durchgeführt war. Dann wurden sie zur Sicherung der Gültigkeit der Hybridisierungsergebnisse verglichen.
1 ml klinische Probe (Urin), die unter dem Verdacht einer UT- Infektion stand, wurden einer Brinkman Microzentrifuge 5 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurden 0,1 ml 1,2 N Natriumhydroxid zugefügt und die Suspension auf 100ºC zur Lyse der Zellen erhitzt. Die Suspension wurde dann auf 1 ml mit 10 mM Natriumborat-Puffer (pH = 8) verdünnt und mit Salzsäure auf einen pH von 7 neutralisiert. Zu der Lösung wurden 50 ug "Biotin-PEG-Angelicin" (siehe Beispiel 2) gegeben, und die Mischung wurde mit einer UVL-56, einer UV- Lampe, die Licht einer langen Wellenlänge ausstrahlt, 15 Minuten lang bestrahlt. Die bestrahlte Probe (0,1 ml) wurde zu 3 ml 3 x SSC, mit 5% Magertrockenmilch, 10% PEG mit 0,2 M Natriumpyrophosphat, gegeben, und es wurde mit Sonden (ganze genomische DNA), die auf Nitrocellulose-Papier immobilisiert waren, bei 68ºC über eine Dauer von 5 Minuten bis über Nacht hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde der Nachweis mit Chemilumineszenz, mit kolorimetrischem Verfahren oder mit Immunogold durchgeführt, wobei die Flecken oder Fotografien visuell bezüglich des Vorliegens spezifischer Bakterien in der Testprobe interpretiert wurden. Ein Fleck von Human-DNA war ebenfalls auf dem Nitrocellulose-Papier zum Nachweis von Leukozyten vorhanden. Die Anwesenheit von Leukozyten wurde ferner mit einem üblichen Verfahren unter Verwendung von "LEUKOSTIX" (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA) verifiziert.
Typische Ergebnisse (Tabelle 1 und 2) zeigen, daß die Hybridisierungsdiagnose ähnliche Ergebnisse in einer kürzeren Zeit liefert, als dies mit den entsprechenden Microbiologischen Assayverfahren der Fall ist. Die vorliegende Erfidung liefert nicht nur eine Information bezüglich einer Species-Identifikation, sondern auch bezüglich des Leukozytgehalts in einer klinischen Probe. Tabelle 1 Diagnose klinischer Urinproben * Hospital-Diagnose Hybridisierungsergebnisse der Anmelderin Nachweissystem E. coli/Klebsiella mix E. coli/Staph mix Klebsiella spp. /ml K. pneumoniae Enterobacter spp. Candida /ml Proteus Mischung aus unidentifizierten Gm(+) Gold Chemi
* Diagnose, durchgeführt durch Streifen von Urin auf eine Agar-Platte und Behandeln der Platte unter Bedingungen, unter denen der infektiöse Organismus wachsen kann.
** Enterobacter/Candida-Sonden sind im Hybridisierungsassay nicht enthalten, deshalb sind die Negativergebnisse nicht überraschend; bei den gegebenen Bedingungen hoher Stringenz, die im Assay angewandt wurden, wurde eine Kreuz- Hybridisierung mit Enterobacter ähnlichen Species nicht nachgewiesen.
Abkürzungen: VS = sehr starke; S = starke; M = mittlere; W = schwache; und VW = sehr schwache Hybridisierungssignale; GOLD = Nachweisverfahren mit Immunogold; CHEMI = Chemilumineszenznachweis
Die Hybridisierungsergebnisse der Anmelderin stellen das Ergebnis einer subjektiven Interpretation der Intensität der nach der Nachweisreaktion erhaltenen Hybridisierungssignale dar. Die DNAS aus den Organismen, die in Spalte 2 aufgelistet sind, sind lediglich diejenigen, für die ein Hybridisierungssignal erhalten wurde. Die Liste von DNAS, die zur Hybridisierung verwendet wurden, schlossen E. coli ("E.c."), Klebsiella pneumoniae ("Kl"), Proteus vulgaris ("Pr"), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermatis ("SE"), Streptococcus faecalis und Homo sapiens ein. Tabelle 2 Vergleich von Ames-Leukostix-Assay mit dem Assay der Anmelderin "Leukostix"-Ergebnis Hybridisierungsergebnis der Anmelderin Nachweissystem GOLD CHEMI SPUR CHEMI GOLD
Die in Spalte 2 von Tabelle 2 zusammengefaßten Hybridisierungsergebnisse stellen subjektive Interpretationen der Intensität eines erhaltenen Hybridisierungssignals dar, als die in Tabelle 1 beschriebenen markierten Urinproben mit genomischer Human-DNA hybridisiert wurden.
Der "LEUKOSTIX -Assay" ist ein kolorimetrischer Reagensstreifen-Assay. Die Farbentwicklung auf dem Reagensstreifen wird mit einer Karte verglichen, die zusammen mit den Assay-Reagensstreifen geliefert wird und von negativ (keine Farbentwicklung) bis 3+ (sehr starke Farbentwicklung) rangiert.

Beispiel 6:

Lyse von Zellen

Eine 1,0 ml Aliquot-Menge einer Zell-Suspension wurde zentrifugiert und das Zell-Pellet wurde in 100 ul ungepufferter NaOH-Lösung resuspendiert. Die Probe wurde dann kurzzeitig einer hohen Temperatur ausgesetzt und dann auf das Ursprungsvolumen mit 10 mM Borat-Puffer verdünnt. Der pH der Lösung wurde dann mit HCl auf den Neutralwert eingestellt.
Tabelle 3 zeigt die Effizienz der Lyse von zwei verschiedenen gram-positiven Cocci, Staphylococcus epidermis und Streptococcus faecalis, bei verschiedenen NAOH- Konzentrationen entweder bei 68 oder 100ºC. In diesem Beispiel wurde das Absorptionsvermögen der 1,0 ml Aliquot- Mengen bei 600 nm zunächst vor der Zentrifugation ermittelt und aufgezeichnet. Nach der Zentrifugation wurden die Zell- Pellets in verschiedenen Konzentrationen von NaOH (100 ul) resuspendiert, und es wurden Duplikatproben einer jeden Probe einer Temperatur von 68ºC 10 Minuten lang oder von 100ºC 5 Minuten lang ausgesetzt. Jede Probe wurde dann auf 1,0 ml verdünnt, und es wurde das Absorptionsvermögen bei 600 nm erneut ermittelt und aufgezeichnet. Da die Anfangs- und Endvolumina identisch sind, liefern das Anfangs- und Endabsorptionsvermögen bei 600 nm einen direkten Meßwert für die Effizienz der Lyse.
Während gram-negative Organismen bei einer so niedrigen Konzentration wie von 0,1 N NaOH wirksam lysiert werden, zeigt Tabelle 3 ganz klar, daß eine wirksame Lyse eine Funktion von sowohl der NaOH-Konzentration als auch der Temperatur ist, so daß höhere NaOH-Konzentrationen in dem Maße erforderlich sind, wie die Inkubationstemperatur absinkt. Bei 100ºC (Maximaltemperatur bei 1 Atmosphäre) war eine Konzentration von mindestens 1,6 N NaOH zur effizienten Lyse von S. epidermis und S. faecalis erforderlich. Sind niedrigere Temperaturen erwünscht oder notwendig, werden dann höhere Konzentrationen an NaOH zur Aufrechterhaltung der Lyse-Effizienz benötigt. Tabelle 3 Effizienz der Lyse gram-positiver Bakterien bei verschiedenen Konzentrationen von NaOH bei 68 und 100ºC Streptococcus faecalis 100ºC/5 Minuten %Lyse OD600 PRE OD600 POST Staphylocuccus epidermis

Beispiel 7

Direkte Markierung von Nucleinsäuren in einer infizierten Urinprobe

Ein Satz klinischer Urin-Testproben wurde von einem Hospital gesammelt. 1 ml Urin wurde in ein Polypropylen-Röhrchen (1,5 ml) gegeben. Zum Urin wurden 150 ul 8 N Natriumhydroxidlösung in Wasser gegeben. Die Mischung wurde in einem siedenden Wasserbad 5 Minuten lang gehalten. Die alkalische Suspension wurde dann in ein anderes Röhrchen übertragen, das 0,3 g feste Borsäure zur Neutralisation enthielt. Die Mischung wurde von Hand zur Vermischung und Solubilisierung gut geschüttelt. Zu dieser Mischung wurden 10 ug des Fotomarkierungsreagens "Bio-PEG-Ang", verwendet wie vorher, gegeben (10 ul von 1 mg/ml in Wasser). Die Mischung wurde dann 60 Minuten lang unter Verwendung einer von Hand gehaltenen UV-Lampe (UVL 25) unter Festlegung einer langen Wellenlänge bestrahlt. Das Röhrchen wurde während der Bestrahlung auf Eis gehalten.
Ein Nitrocellulose-Papierstreifen, enthaltend immobilisierte unmarkierte genomische DNA-Sonden (verwendet wie vorher), 700 ul Mischung, enthaltend 5% Magertrockenmilch, 10% Polyethylenglycol (MG = 6000), 10 mM Natriumpyrophosphat, alles in 3 x SSC, sowie 300 ul markierte Testproben wurden in einen Beutel (zum Verschließen einer Mahlzeit) gelegt. Der Beutel wurde heißgesiegelt. Die Hybridisierung wurde dann 2 h lang bei 68ºC durch Inkubieren des versiegelten Beutels in einem Wasserbad durchgeführt.
Nach der Hybridisierung wurde der Nitrocellulose-Streifen bei 68ºC mit 0,1 x SSC, 0,1% SDS 30 Minuten lang gewaschen. Die ungesättigten Stellen werden dann blockiert, indem man das Papier in 3%-ige BSA-Lösung in 0,1 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid 30 Minuten lang taucht, das Hybrid wird dann durch entweder Immunogold oder durch Chemilumineszenz oder das BRL-Verfahren nachgewiesen. Für jede Probe wurde die Diagnose ebenfalls mit bakteriologischen Wachstumsverfahren vorgenommen. Die Ergebnisse wurden dann bezüglich der Gültigkeit des vorliegenden Verfahrens verglichen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Polynucleotid-Sequenzen aus Microorganismen oder eukaryontischen Quellen in einer biologischen Testprobe, worin Stufen enthalten sind, in denen man:

(a) die genannte biologische Testprobe ohne vorherige Zentrifugation oder Filtration behandelt, um die Zellen zu lysieren und Nucleinsäuren daraus freizusetzen;

(b) freigesetzte Proben-Nucleinsäuren direkt im Lysat spezifisch markiert, welches in Stufe (a) ohne Reinigung oder Isolierung spezifischer Nucleinsäure-Sequenzen erzeugt worden ist,

(c) die sich ergebenden markierten Nucleinsäuren, unter Hybridisierungsbedingungen, mit einer oder mehreren immobilisierten Oligonucleotid- oder Nucleinsäure-Sonden in Kontakt bringt, die mit der oder den nachzuweisenden Sequenz(en) hybridisierbar sind, um dadurch hybridisierte markierte Nucleinsäuren zu bilden, und

(d) die hybridisierten Nucleinsäuren mit einem Assayverfahren analysiert, indem man die Markierung nachweist,

dadurch gekennzeichnet, daß

die Hybridisierung durch Zugabe von Polyethylenglycol beschleunigt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die biologische Testprobe aus Urin, Blut, Cerebrospinal-Flüssigkeit, Eiter, amniotischer Flüssigkeit, Tränen, Auswurf, Speichel, Lungenaspirat, Vaginalausfluß, Stuhl, einer festen Gewebsprobe, einer Hautabstrichprobe, einer Rachenabstrichprobe und einer Genitalabstrichprobe ausgewählt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die genannte Markierung durch photochemische Reaktion einer markierten Form eines Nucleinsäure-Bindungsligand mit den Proben-Nucleinsäuren durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, worin die aus der Probe freigesetzten Nucleinsäuren in doppelsträngiger Form vorliegen und, vor der Stufe (c), die markierten Nucleinsäuren denaturiert werden, um markierte einzelstrangige Nucleinsäuren zu ergeben.

5. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 4, worin die genannten eukaryontischen Quellen aus Algen, Protozoen, Pilzen, Schleimmodern und Säugetierzellen oder die genannten Microorganismen aus Escherichia, Proteus, Klebsiella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas und Lactobacillus ausgewählt sind.

6. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Zellen in der Probe durch Behandlung mit Alkali lysiert werden.

7. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Markierung aus Protein-Bindungsliganden, Haptenen, Antigenen, Fluoreszenzverbindungen, Farbstoffen, radioaktiven Isotopen und Enzymen ausgewählt ist.

8. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Sonden durch kovalente Kupplung oder Adsorption an eine feste Oberfläche immobilisiert sind.

9. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Sonden in der Form von Punkten auf einem festen Trägerunterlagenstreifen immobilisiert sind.