DE69132830T2

DE69132830T2 - Verfahren und Reagentien für die Identifikation von Bakterien

Info

Publication number: DE69132830T2
Application number: DE1991632830
Authority: DE
Inventors: Diane Uratsu Leong
Original assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2011-09-27
Also published as: AU657491B2; ES2168250T3; DE69132830D1; EP0479117B1; EP0479117A1; JP3415167B2; CA2052822A1; JPH0690799A; CA2052822C; AU8489591A; NZ239975A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Reagenzien, mit denen Gram-negative Bakterien, die eine Septikämie verursachen, identifiziert und nachgewiesen werden können.
Um eine durch ein Bakterium verursachte Krankheit erfolgreich behandeln zu können, muss das krankheitsauslösende Bakterium schnell und genau nachgewiesen und identifiziert werden. Bisher erfolgten der Nachweis und die Identifizierung normalerweise, indem eine Reinkultur isoliert und anschließend Verfahren zur Identifizierung durchgeführt wurden, wobei die folgenden Kenntnisse genutzt wurden: Herkunft der Probe, Anforderungen für das Wachstum, sichtbare Wachstumsmerkmale (der Kolonie), mikroskopische Morphologie, Färbereaktionen und biochemische Eigenschaften.
Ein wichtiger Schritt beim Bestimmen der Identität eines Bakteriums ist die Gramfärbung. Diese Prozedur umfasst die Behandlung eines hitzefixierten Bakterienausstrichs auf einem Glas-Objektträger mit dem basischen Farbstoff Kristallviolett. Alle Organismen nehmen den Farbstoff auf. Anschließend wird der Ausstrich mit Gram-lodlösung bedeckt (3% Iodkaliumiodid in Wasser oder einem schwachen Puffer, pH 8,0, um die aus bd beim Stehen gebildete Säure zu neutralisieren). Nach dem Spülen mit Wasser und Entfärben mit Aceton wird das Präparat gründlich mit Wasser gewaschen und mit einem roten Farbstoff, normalerweise Safranin, gegengefärbt. Anschließend wird das gefärbte Präparat mit Wasser gespült, getrocknet und anhand eines Lichtmikroskops unter Öl untersucht.
Die meisten Bakterien können durch diese Färbung in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die Gram-positiven Organismen werden blau gefärbt, während etwa ein Drittel der Kokken, die Hälfte der Bacilli und alle spiralförmigen Organismen rot gefärbt und als Gram-negativ bezeichnet werden. Dieses Verfahren ist zwar effektiv, es ist jedoch sehr zeitaufwendig und umfasst viele verschiedene Arbeitsgänge, die viele Fehlermöglichkeiten beinhalten. Für die Gramfärbung und andere auf Kultivierung beruhende Nachweisverfahren ist es erforderlich, dass die Probe mindestens über Nacht mit Kulturmedium inkubiert wird, um eine Reinkultur zu erhalten.
Das Vorliegen von Bakterien oder Pilzen im Blut, das üblicherweise als Septikämie bezeichnet wird, kann ernste und lebensbedrohende klinische Folgen haben. Eine Septikämie kann zu einem septischen Schock führen, bei dem die folgenden Symptome auftreten - Hypotonie, Laktatazidose, Hypoxämie, Oligurie, Verwirrtheit, disseminierte intravaskuläre Koagulation, gastrointestinale Blutungen, Stoffwechselstörungen und feine Hautläsionen. Es kann sein, dass in einer 30-ml-Blutprobe von einem Patienten mit Septikämie nur eine einzige koloniebildende Einheit (CFU) vorliegt. Da die Kultur zurzeit die empfindlichste und am häufigsten verwendete Methode zum Nachweisen von Bakterien oder Pilzen im Blut ist, wird häufig empirisch mit der Behandlung einer vermuteten Septikämie begonnen, ohne dass die Ergebnisse der Kultur abgewartet werden. Deshalb wäre ein schnelles diagnostisches Verfahren, mit dem die Bakterien im Blut mit der gleichen Empfindlichkeit wie bei der Kultur nachgewiesen werden können, eine signifikante Verbesserung gegenüber den zurzeit verwendeten Verfahren.
Aus diesem Grund stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Reagenzien bereit, mit denen Bakterien, die eine Septikämie verursachen, schnell nachgewiesen und identifiziert werden können. Der Nachweis beruht auf der Hybridisierung von Nucleotidsonden mit Nucleotidsequenzen und auch mit deren Transkripten, die in definierten Arten oder Gruppen von Arten vorliegen, nicht jedoch in anderen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Zielbereich aus genomischer DNA oder aus einem reversen Transkript von 16S-rmA amplifiziert und die resultierende amplifizierte DNA mit einer Reihe von Sonden behandelt, die mit der DNA einer Bakterienart oder einer Gruppe von Bakterienarten hybridisieren kann, nicht jedoch mit anderen. Die Sonden, die erfolgreich mit der amplifizierten DNA hybridisieren, werden bestimmt und das Bakterium als Gram-negativ oder als eine bestimmte Art oder Gruppe von Arten klassifiziert, abhängig davon, welche Sonden mit der amplifizierten DNA hybridisieren.
Außerdem werden hier spezifische Sonden und ihre Komplemente definiert und beansprucht, mit denen Gram-negative Bakterien, die eine Septikämie verursachen, identifiziert werden können.
Die Erfindung betrifft ferner die Formulierung und Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR)-Kits, die universelle bakterielle Primer, mit denen ein spezifischer universeller Ziel-DNA-Bereich für alle Bakterien amplifiziert werden kann, und eine Reihe von Sonden enthalten, die mit einer Nucleotidsequenz, die ausschließlich bei einer Bakterienart oder einer Gruppe von Bakterienarten vorliegt, innerhalb des Zielbereichs hybridisieren.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die zwei universellen bakteriellen Primer DG74 und RWO1, die eingesetzt werden können, um einen Zielbereich in Gram-positiven, Gram-negativen oder anderen Bakterien durch PCR zu amplifizieren.
Fig. 2 zeigt eine Gram-positiv-spezifische Sonde, RWO3.
Fig. 3 zeigt vier Kandidaten für Gram-negative Sonden, RWO4, DL04, DL05 und RDR278.
Fig. 4 zeigt zwei Kandidaten für universelle bakterielle Sonden, RDR244 und RDR245.
Fig. 5 zeigt eine Escherichia coli/Enterobakterien-Sonde.
Fig. 6 zeigt eine Bacteroides-Sonde.
In Tabelle 1 sind die Hybridisierungsdaten der Gram-negativen Sonden RWO4 und DL04 zusammengestellt.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse zusammengestellt, die beim Testen mit den Sonden RDR278 und DL04, zwei Gram-negativen Sonden; RDR244 und RDR245, zwei Kandidaten für universelle bakterielle Sonden; und RDR279, der Bacteroides- Sonde, erhalten wurden.
Tabelle 3 zeigt eine Liste von Organismen, die mit RDR244 und RDR245 getestet wurden.
Tabelle 4 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die mit der E. coli/Enterobakterien-Sonde RDR140KG erhalten wurden.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Bakterien mit Hilfe von Sonden nachgewiesen und identifiziert werden können, wobei die Sonden mit Nucleotidsequenzen hybridisieren, welche ausschließlich bei Gram-negativen Bakterien oder bei einer Art oder einer Gruppe von Arten von Gram-negativen Bakterien vorliegen.
Die Verwendung spezifischer Polynucleotidsequenzen als Sonden zum Nachweis infektiöser Agenzien stellt eine wertvolle Alternative zu problematischen immunologischen Identifizierungstests dar. In der PCT-Veröffentlichung WO84/02721, veröffentlicht am 19. Juli 1984, wird z. B. die Verwendung von Nucleinsäure-Sonden, die zu Ziel-Nucleinsäuresequenzen komplementär sind, die aus ribosomaler RNA, Transfer-RNA oder einer anderen RNA bestehen, in Hybridisierungsverfahren beschrieben, wodurch die Ziel-Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden kann. Mit dem Test kann zwar eine größere Empfindlichkeit und Spezifität erreicht werden als mit bekannten DNA-Hybridisierungstests, jedoch sind Hybridisierungsverfahren, bei denen die Verwendung einer komplementären Sonde erforderlich ist, im allgemeinen von der Züchtung eines Testorganismus abhängig und daher für eine schnelle Diagnose ungeeignet. Sonden können nur dann direkt bei klinischen Proben angewendet werden, wenn ein Verfahren zum Amplifizieren des DNA-Ziels verfügbar ist.
Die PCT-Patentveröffentlichung Nr. 90/15157 beschreibt ein Verfahren, mit dem das Vorliegen von Eubakterien nachgewiesen werden kann, indem als Primer und/oder Sonden verschiedene, von einem 16S-rRNA-Gen stammende Sequenzen verwendet werden, die für alle Eubakterien oder für bestimmte spezifische Untergruppen von Eubakterien, z. B. Gram-positive oder Gram-negative Bakterien, spezifisch sind. Eine solche Sonde, die Sonde 1746, entspricht den Positionen 1188 bis 1216 der 16S-rRNA von E. coli und hybridisiert vorzugsweise mit Gram-positiven Bakterien (vgl. Seite 21, Zeilen 8 bis 9, und Seite 27).
Die PCT-Patentveröffentlichung Nr. 90/01560 beschriebt Nucleinsäure- Sonden, die mit der RNA von verschiedenen Hauptklassen von Bakterien hybridisieren, nicht jedoch mit der von Säugerzellen.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Sonden für Bakterienarten oder Gruppen von Bakterienarten, die Septikämie verursachen, Gramnegative Sonden und Bacteroides-Sonden.
Diese Sonden können eingesetzt werden, um mit DNA oder RNA zu hybridisieren, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wurde. Die PCR ist eine leistungsfähige Technik, die zum Nachweis von kleinen Mengen von Pathogenen, deren in vitro-Kultivierung schwierig oder zeitaufwendig ist, oder anstelle von anderen Verfahren eingesetzt werden kann, bei denen für den Nachweis das Vorliegen von lebenden Proben erforderlich ist. In ihrer einfachsten Form ist die PCR ein in vitro-Verfahren für die enzymatische Synthese spezifischer DNA-Sequenzen, wobei zwei Oligonucleotid-Primer verwendet werden, die mit gegenüberliegenden Strängen hybridisieren und den Bereich von Interesse in der Ziel-DNA flankieren. Eine Serie von sich wiederholenden Zyklen, die die Denaturierung der Matrize, die Primer- Anlagerung und die Verlängerung der angelagerten Primer durch eine DNA- Polymerase umfassen, führt zu einer exponentiellen Akkumulierung eines spezifischen Fragments, dessen Termini durch die 5'-Enden der Primer definiert sind. Wie berichtet wird, ist die PCR in der Lage, eine selektive Anreicherung einer spezifischen DNA-Sequenz um den Faktor 10'2 zu bewirken. Das PCR-Verfahren wird in Saiki et al., Science 230 (1985), 1350-1354, beschrieben und ist das Thema der US- Patente Nr. 4 683 195, 4 683 202 und 4 800 159. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um das Vorliegen der abnormen Sequenz in dem Betaglobin-Gen, das mit der Sichelzellanämie assoziiert ist (Saiki et al., (1985), vorstehend), und die RNA des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) nachzuweisen (Byrne et al., Nuc. Acids Res. 16 (1988), 4165). Bevor das Verfahren eingesetzt werden kann, muss jedoch genug der Nucleotidsequenz des mit der Krankheit zusammenhängenden Polynucleotids bekannt sein, um Primer für die Amplifikation gestalten zu können und um Sonden gestalten zu können, die spezifisch genug sind, um das amplifizierte Produkt nachzuweisen.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem das Vorliegen eines bakteriellen Polynucleotids in Proben, von denen vermutet wird, dass sie das Polynucleotid enthalten, bestimmt werden kann, wobei das Polynucleotid einen ausgewählten Zielbereich enthält und das Verfahren folgendes umfasst:
(a) Amplifizieren des Zielbereichs, falls vorhanden, bis zu einer nachweisbaren Menge;
(b) Inkubieren des amplifizierten Zielbereichs, falls vorhanden, mit einer Sonde unter Bedingungen, die eine Spezifität der Hybriddoppelstränge erlauben; und
(c) Nachweisen von Hybriden, die zwischen dem amplifizierten Zielbereich, falls vorhanden, und der Sonde gebildet wurden.
Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann somit das Vorliegen von Bakterien schneller bestimmt werden, als es bisher mit den Nachweisverfahren nach dem früheren Stand der Technik möglich war. Der zugrundeliegende PCR-Prozess wird folgendermaßen durchgeführt.
Eine Probe wird bereitgestellt, von der angenommen wird, dass sie eine bestimmte Nucleinsäuresequenz von Interesse, die "Zielsequenz", enthält. Die in der Probe enthaltene Nucleinsäure kann gegebenenfalls zuerst in cDNA revers transkribiert werden, wobei Tth-DNA-Polymerase als gereinigtes Enzym eingesetzt wird, und anschließend kann sie denaturiert werden, wobei ein geeignetes Denaturierungsverfahren verwendet wird, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Methoden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine bevorzugte physikalische Methode zum Trennen von Strängen besteht im Erhitzen der Nucleinsäure, bis sie vollständig (> 99%) denaturiert ist. Eine typische Hitzeinaktivierung umfasst Temperaturen im Bereich von etwa 80ºC bis etwa 150ºC und Zeiten im Bereich von fünf Sekunden bis zehn Minuten, wobei die herkömmliche Technologie eingesetzt wird.
Die denaturierten DNA-Stränge werden anschließend mit den ausgewählten Oligonucleotid-Primern unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert; dies sind Bedingungen, unter denen die Bindung der Primer an die einzelnen Oligonucleotidstränge erfolgen kann. Wie dem Fachmann bekannt ist, werden die Primer so ausgewählt, dass ihre relativen Positionen entlang einer Doppelstrangsequenz entsprechend sind, dass ein von dem einen Primer aus synthetisiertes Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem Komplement getrennt wird, als eine Matrize für die Verlängerung des anderen Primers dient, so dass eine replizierte Kette von definierter Länge erhalten wird.
Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart des Polymerisationsmittels primen zu können. Die genaue Länge der Primer hängt von vielen Faktoren ab, umfassend Temperatur, Herkunft des Primers und verwendetes Verfahren. Z. B. enthält der Oligonucleotid-Primer, abhängig von der Komplexität der Zielsequenz, typischerweise etwa 15 bis 30 Nucleotide, wobei er jedoch auch mehr oder weniger Nucleotide enthalten kann. Für kurze Primermoleküle sind im allgemeinen kühlere Temperaturen erforderlich, so dass sie mit der Matrize ausreichend stabile Hybridkomplexe bilden können. Die Primer müssen ausreichend komplementär sein, so dass sie selektiv mit ihren entsprechenden Strängen hybridisieren.
Die hier verwendeten Primer werden so ausgewählt, dass sie zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen Sequenz, die amplifiziert werden soll, "im wesentlichen" komplementär sind. Die Primer müssen nicht die exakte Sequenz der Matrize widerspiegeln, sie müssen jedoch ausreichend komplementär sein, um selektiv mit ihren entsprechenden Strängen zu hybridisieren. Nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen können in den Primer eingebaut werden, oder der Primer kann einen Untersatz enthalten, die zu der spezifischen Sequenz komplementär ist, mit der Maßgabe, dass der Primer eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz von einem der Stränge, die amplifiziert werden sollen, beibehält, so dass er damit hybridisiert und dadurch eine Doppelstrangstruktur bildet, die durch Polymerisationsmittel verlängert werden kann. Die nicht-komplementären Nucleotidsequenzen der Primer können Restriktionsenzymstellen umfassen. Das Anhängen einer Restriktionsenzymstelle an das (die) Ende(n) der Zielsequenz ist insbesondere für das anschließende Clonieren der Zielsequenz hilfreich.
Die Oligonucleotid-Primer und Sonden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in den Fig. 1 bis 6 dargestellt. Sie können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren hergestellt werden. Verfahren zum Herstellen von Oligonucleotiden mit einer spezifischen Sequenz sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. das Clonieren und die Restriktion geeigneter Sequenzen sowie die direkte chemische Synthese. Die Primer können, wenn dies gewünscht wird, durch den Einbau von Stoffen markiert werden, die spektroskopisch, photochemisch, biochemisch, immunchemisch oder chemisch nachgewiesen werden können.
Eine Matrizen-abhängige Verlängerung des Oligonucleotid-Primers (der Oligonucleotid-Primer) wird anschließend durch ein Polymerisationsmittel in Gegenwart entsprechender Mengen der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) oder Analoga in einem Reaktionsmedium katalysiert, das aus den entsprechenden Salzen, Metall-Kationen und einem pH-Puffersystem besteht. Geeignete Polymerisationsmittel sind Enzyme, von denen man weiß, dass sie eine Primer- und Matrizen-abhängige DNA-Synthese katalysieren. Bekannte DNA-Polymerasen umfassen z. B. die DNA-Polymerase I aus E. coli oder ihr Klenow-Fragment, die T4-DNA-Polymerase, die Taq-DNA-Polymerase, die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus und die DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralis. Die Reaktionsbedingungen, die erforderlich sind, damit diese DNA-Polymerasen die DNA- Synthese katalysieren, sind dem Fachmann bekannt.
Die Produkte der Synthese sind Doppelstrangmoleküle, die aus den Matrizensträngen und den Primer-Verlängerungssträngen bestehen, die die Zielsequenz umfassen. Diese Produkte dienen ihrerseits als Matrizen für eine weitere Replikationsrunde. In der zweiten Replikationsrunde wird der Primer-Verlängerungsstrang des ersten Zyklus an seinen komplementären Primer angelagert; die Synthese ergibt ein "kurzes" Produkt, das an sowohl dem 5'- als auch dem 3'-Ende durch Primersequenzen oder ihre Komplemente gebunden ist. Wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primer-Anlagerung und Verlängerung führen zu einer exponentiellen Akkumulierung des durch die Primer definierten Zielbereichs. Wenn ausreichend viele Zyklen durchgeführt werden, wird die gewünschte Menge des Polynucleotids erhalten, welches den Zielbereich der Nucleinsäure enthält. Die gewünschte Menge kann variieren und wird durch die Funktion bestimmt, die das Polynucleotid-Produkt erfüllen soll.
Das PCR-Verfahren kann in verschiedenen zeitlichen Abfolgen durchgeführt werden. Z. B. kann es schrittweise erfolgen, wobei nach jedem Schritt neue Reagenzien zugegeben werden, oder es kann in einer Art und Weise erfolgen, wobei alle Reagenzien gleichzeitig zugegeben werden, oder in einer zum Teil schrittweisen Art, wobei nach einer bestimmten Anzahl von Schritten frische Reagenzien zugegeben werden.
In einem bevorzugten Verfahren wird die PCR-Reaktion als ein automatisierter Prozess durchgeführt, bei dem ein thermostabiles Enzym verwendet wird. In diesem Prozess wird das Reaktionsgemisch einem Zyklus mit einem Denaturierungsschritt, einem Schritt der Primer-Anlagerung und einem Syntheseschritt unterworfen. Ein Thermal-DNA-Cycler kann eingesetzt werden, der spezifisch für die Verwendung eines thermostabilen Enzyms ausgestattet ist, wobei ein System mit Temperaturzyklus verwendet wird, ohne dass mit Flüssigkeiten hantiert werden muss, so dass es nicht erforderlich ist, das Enzym bei jedem Zyklus zuzufügen. Diese Art von Apparatur ist im Handel verfügbar.
Nach der Amplifikation durch die PCR können die Ziel-Polynucleotide direkt durch Gelanalyse nachgewiesen werden, mit der Maßgabe, dass die Ziel-DNA effizient amplifiziert wurde und die Primer für den zu amplifizierenden Zielbereich hochspezifisch sind. Um die Effizienz der PCR sicherzustellen, können Glycerin oder andere verwandte Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid verwendet werden, um die Empfindlichkeit der PCR auf der Ebene der Amplifikation zu steigern und Probleme zu umgehen, die das Sequenzieren von DNA-Bereichen betreffen, die eine starke Sekundärstruktur aufweisen. Diese Probleme können folgendes umfassen: (1) eine geringe Effizienz der PCR, die auf einer großen Häufigkeit von Matrizen beruht, welche durch das Polymerisationsmittel nicht vollständig verlängert werden, oder (2) eine unvollständige Denaturierung der Doppelstrang-DNA bei einer hohen Temperatur, die auf einem hohen GC-Gehalt beruht. Durch die Verwendung solcher Lösungsmittel kann die Empfindlichkeit des Tests auf der Ebene der Amplifikation auf etwa mehrere Femtogramm DNA gesteigert werden (dies ist die Menge, die vermutlich einer einzelnen Bakterienzelle entspricht). Bei dieser Empfindlichkeitsstufe ist es nicht mehr erforderlich, amplifizierte Ziel-DNA anhand einer Sonde nachzuweisen, und deshalb sind weder radioaktive Sonden noch Gel-Elektrophorese, Southern-Blotting, Filter-Hybridisierung, Waschgänge und Autoradiographie erforderlich. Der Konzentrationsbereich für Glycerin liegt bei 5 bis 20% (VoI. Vol.), und der Konzentrationsbereich für DMSO liegt bei etwa 3 bis 10% (Vol.Vol.).
Andererseits und gemäß der vorliegenden Erfindung können die Ziel- Polynucleotide durch Hybridisierung mit einem Sonden-Polynucleotid nachgewiesen werden, das mit der Zielsequenz unter stringenten bis niedrig-stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein stabiles Hybrid bildet. Wenn zu erwarten ist, dass die Sonden zur Zielsequenz vollständig komplementär sind (d. h. zu etwa 99% oder mehr), werden stringente Bedingungen eingesetzt. Wenn eine gewisse Fehlpaarung zu erwarten ist, z. B. wenn man Variantenstämme vermutet, die zur Folge haben, dass die Sonde nicht vollständig komplementär ist, kann die Stringenz der Hybridisierung herabgesetzt werden. Jedoch werden die Bedingungen immer so gewählt, dass eine unspezifische/zufällige Bindung ausgeschlossen ist. Bedingungen, die die Hybridisierung beeinflussen und eine unspezifische Bindung verhindern, sind dem Fachmann bekannt. Im allgemeinen steigern eine niedrigere Salzkonzentration und eine höhere Temperatur die Stringenz der Bindung. Normalerweise beinhalten stringente Bedingungen z. B. eine Inkubation in Lösungen, die etwa 0,1x SSC und 0,1% SDS enthalten, bei einer Inkubations-/Waschtemperatur von etwa 65ºC, und mäßigstringente Bedingungen beinhalten eine Inkubation in Lösungen, die etwa 1x bis 2x SSC und 0,1% SDS enthalten, und eine Inkubations-/Waschtemperatur von etwa 50 bis 65ºC. Bedingungen mit niedriger Stringenz sind 2 · SSC und etwa 30 bis 50ºC.
Ein anderes Hybridisierungs- und Waschverfahren besteht darin, eine Hybridisierung mit niedriger Stringenz (5x SSPE, 0,5% SDS) durchzuführen, auf die ein Waschgang mit hoher Stringenz in Gegenwart von 3 M Tetramethylammoniumchlorid (TMACI) folgt. Die Wirkung von TMACI besteht darin, die relative Bindung von A-T- und G-C-Basenpaaren auszugleichen, so dass die Effizienz der Hybridisierung bei einer bestimmten Temperatur eine Funktion der Länge des Polynucleotids ist. Unter Verwendung von TMACI ist es möglich, die Temperatur des Waschgangs so zu variieren, dass die gewünschte Stringenzstufe erreicht wird (vgl. Base compositionindependent hybridisation in tetramethylammonium chloride: A method for oligonucleotide screening of highly complex gene libraries; Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 1585-1588).
Die Sonden für die bakteriellen Zielsequenzen können von den 16S-rRNA- Gensequenzen oder ihren Komplementen hergeleitet werden. Die Sonden können jede geeignete Länge aufweisen, so dass sie den Zielbereich überspannen, die Primer jedoch ausschließen, und eine spezifische Hybridisierung mit dem Zielbereich erfolgen kann. Im allgemeinen weisen die Sonden mindestens 14 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 18 Nucleotide und stärker bevorzugt mindestens 20 bis 30 Nucleotide von einem der komplementären DNA-Stränge auf. Tatsächlich kann die Zielsequenz aus beiden komplementären DNA-Strängen stammen. Wenn eine vollständige Komplementarität vorliegen soll, d. h. wenn der Stamm eine Sequenz enthält, die mit der Sequenz der Sonde identisch ist, können die Sonden kurz sein, d. h. im Bereich von etwa 10 bis 30 Basenpaaren liegen, da der Doppelstrang auch unter stringenten Bedingungen relativ stabil sein wird. Wenn ein gewisser Grad an Fehlpaarungen mit der Sonde zu erwarten ist, d. h. wenn vermutet wird, dass die Sonde mit einem Bereich einer Variante hybridisiert, kann die Sonde eine größere Länge aufweisen, da die Länge einen Teil der Wirkung der Fehlpaarung(en) auszugleichen scheint. Die Sonde kann aus einem Untersatz des Zielbereichs gebildet werden und muss deshalb nicht den gesamten Zielbereich überspannen. Zum Herstellen der Sonde kann ein beliebiger Untersatz des Zielbereichs verwendet werden, mit der Maßgabe, dass der Zielbereich durch die Sonde, indem sie mit diesem Teil des Zielbereichs hybridisiert, spezifisch identifiziert werden kann. Die Sonde kann auch markiert werden, sofern dies gewünscht wird. Verschiedene Markierungen, die angewendet werden können, und Verfahren für ihren Einbau in die Sonde sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. radioaktive Atome, z. B. 32P, oder andere erkennbare Funktionalitäten, z. B. Biotin (vorzugsweise unter Verwendung eines Spacerarms), fluoreszierende Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme, die leicht nachweisbare Reaktionsprodukte erzeugen können (z. B. alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase), oder Antigene, für die spezifische Antiseren oder monoclonale Antikörper verfügbar sind.
Die Analyse der Nucleotidsequenz des Zielbereichs kann durch eine direkte Analyse der PCR-amplifizierten Produkte erfolgen, wie in Gyllensten und Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 7652-7656, beschrieben.
Es kann wünschenswert sein, die Länge des durch die Sonde nachgewiesenen PCR-Produkts zu bestimmen. Dies trifft insbesondere zu, wenn vermutet wird, dass Varianten-Bakterienstämme innerhalb des Zielbereichs möglicherweise Deletionen oder Insertionen enthalten, oder wenn man die Länge des PCR-Produkts bestätigen will. Unter solchen Umständen ist es bevorzugt, die Produkte einer Größenanalyse und auch einer Hybridisierung mit der Sonde zu unterwerfen. Verfahren, mit denen die Größe von Nucleinsäuren bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. Gel-Elektrophorese, Sedimentierung in Gradienten sowie Gel-Ausschlusschromatographie.
Das Vorliegen der Zielsequenz in einer biologischen Probe wird nachgewiesen, indem bestimmt wird, ob ein Hybrid zwischen der Sonde und der den PCR- Amplifikationstechniken unterworfenen Nucleinsäure gebildet wurde. Verfahren zum Nachweisen von Hybriden, die zwischen einer Sonde und einer Nucleinsäuresequenz gebildet wurden, sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann eine unmarkierte Probe auf eine feste Matrix überführt werden, an die sie bindet, und die gebundene Probe kann Bedingungen unterworfen werden, die eine spezifische Hybridisierung mit einer markierten Sonde erlauben; anschließend wird die feste Matrix auf das Vorliegen der markierten Sonde untersucht. Wenn andererseits die Probe markiert ist, wird eine unmarkierte Sonde an die Matrix gebunden, und nachdem die Exposition mit den geeigneten Hybridisierungsbedingungen erfolgt ist, wird die Matrix auf das Vorliegen einer Markierung untersucht. Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1988), 6230-6234, beschreiben Verfahren, bei denen mehrere Sonden an einem festen Träger immobilisiert und die amplifizierten Ziel-Polynucleotide von Interesse anhand der Hybridisierung nachgewiesen werden. Das letztere Verfahren ist für die Verwendung einer Reihe von Sonden gut geeignet, die unterschiedliche Identifizierungsgrade einer amplifizierten Ziel-DNA bereitstellen können, abhängig von der Art der gewünschten Information. In einem anderen Verfahren kann ein Sandwich-Test in Lösungsphase zusammen mit markierten Polynucleotid-Sonden eingesetzt werden, wobei die Verfahren zum Herstellen solcher Sonden im US-Patent Nr. 4 820 630, veröffentlicht am 11. April 1989, beschrieben werden.
Außerdem liegen PCR-Kits im Umfang der vorliegenden Erfindung, mit denen die vorstehend erwähnten PCR-Prozesse durchgeführt werden können. Die PCR- Kits zum Nachweisen von Bakterien umfassen einen ersten Behälter und einen zweiten Behälter, wobei der erste Behälter Primer enthält, die zum Amplifizieren eines Zielbereichs einer Polynucleotidsequenz innerhalb von Bakterien befähigt sind, und der zweite Behälter eine oder mehrere Sonden enthält, die befähigt sind, mit der amplifizierten Ziel-Nucleinsäuresequenz zu hybridisieren. Vorzugsweise werden die in Fig. 1 dargestellten Primer eingesetzt, und die Sonde wird aus den in den Fig. 2 bis 6 angegebenen Sonden ausgewählt. Diese können markiert oder nicht markiert sein. Wenn sie nicht markiert sind, können die Bestandteile für die Markierung auch im Kit vorliegen. Der Kit kann außerdem andere auf geeignete Weise verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die für das bestimmte Hybridisierungsprotokoll erforderlich sind, z. B. Standards und/oder Polymerisationsmittel, ferner Anweisungen zum Durchführen des Tests.
Bei Verwendung wird aus den Komponenten des PCR-Kits, wenn sie zu einer Nucleinsäureprobe zugegeben werden, ein Reaktionsgemisch hergestellt, mit dem die Ziel-Nucleinsäuresequenzen nachgewiesen und amplifiziert werden können. Das Reaktionsgemisch umfasst also Komponenten des Kits und außerdem eine Nucleinsäureprobe, die die Polynucleotidkette von Interesse enthält.
Zum Zweck der weiteren Spezifizierung werden die folgenden Angaben zu den Nucleotidbasen von Sonden und Primerpaaren bereitgestellt:
Die Sonde RDR245, Fig. 4, entspricht dem Komplement der Nucleotidbasen Nr. 1369 bis 1395 in dem ribosomalen 16S-RNA-Gen von E. coli, wie in der Referenz von Neefs et al., (vorstehend), erläutert.
Der Primer RWO1, Fig. 1, entspricht den Nucleotidbasen Nummer 1170 bis 1189 in dem ribosomalen 16S-RNA-Gen von E. coli, das in der Referenz von Neefs erläutert wird.
Der Primer DG74, Fig. 1, entspricht dem Komplement der Nucleotidbasen Nummer 1522 bis 1540 in dem ribosomalen 16S-RNA-Gen von E. coli, das in der Referenz von Neefs erläutert wird.
Die Sonde RWO3, Fig. 2, entspricht den Nucleotidbasen Nummer 1190 bis 1217 in dem ribosomalen 16S-RNA-Gen von E. coli, das in der Referenz von Neefs erläutert wird.
Die Sonden DL04 und RDR278; Fig. 3, entsprechen dem Komplement der Nucleotidbasen Nummer 1190 bis 1217 in dem ribosomalen 16S-RNA-Gen von E. coli, das in der Referenz von Neefs erläutert wird.
Die Sonde RDR140 KG, Fig. 5, entspricht den Nucleotidbasen Nummer 1458 bis 1482, in dem ribosomalen 16S-RNA-Gen von E. coli, das in der Referenz von Neefs erläutert wird.
Die Sonde RDR279, Fig. 6, entspricht dem Komplement der Nucleotidbasen Nummer 1190 bis 1217 in dem 16S-rmA-Gen von E. coli, das in der Referenz von Neefs erläutert wird.
Die auf dem 16S-rmA-Gen beruhenden Oligonucleotid-Sonden für den Nachweis von Aminosäuren aus verschiedenen Mikroorganismen wurden in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Universelle bakterielle Sonden wurden z. B. von Wilson et al. ("Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase cham reaction", Kenneth Wilson, Rhonda Blitchington und Ronald Greene, Journal of Clinical Microbiology 28 (1990), 1942-1946) und Chen et al. ("Broad range DNA probes for detecting and amplifying eubacterial nucleic acids", Kui Chen, Harold Neimark, Peter Rumore und Charles Steinman, FEMS Microbiology Letters 57 (1989), 19-24) beschrieben. Beispiele von Gattung- und Art-spezifischen Sonden wurden von Barry et al. ("A general method to generate DNA probes for microorganisms", Tom Barry, Richard Powell, Frank Gannon, Biotechnology 8 (1990), 233-236); Atlas und Bej ("Detecting bacterial pathogens in environmental water samples by using PCR and gene probes", Ronald Atlas und Asim Bej, in "PCR protocols: A guide to methods and applications"; (1990), S. 399-406 (Jnis, M. A., Hrsg.), Academic Press, Inc.); und in Genprobe, fnterantionale Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer WO 88/03957 beschrieben. Die in der vorliegenden Anmeldung beanspruchte Erfindung unterscheidet sich von diesen Erfindungen in dem Bereich der Bakterien, die nachgewiesen werden. Die Gram-positiven und Gram-negativen Sonden weisen einen Bereich unterschiedlicher bakterieller Gattungen nach und sind deshalb spezifischer als universelle bakterielle Sonden und umfassender als Gattung- oder Artspezifische Sonden. Unter Verwendung einer Reihe, die eine universelle bakterielle Sonde, Gram-positive und Gram-negative Sonden sowie Art- oder Gruppenspezifische Sonden enthält, kann ein Bakterium zuverlässiger nachgewiesen werden als unter Verwendung einer Sammlung von Gattung- oder Art-spezifischen Sonden, da mit den universellen bakteriellen und Gram-negativen oder Gram-positiven Sonden Bakterien nachgewiesen werden können, die mit den spezifischeren Sonden nicht nachgewiesen werden können. Die beschriebene Reihe stellt außerdem umfassendere klinisch nutzbare Informationen bereit als eine einzelne universelle bakterielle Sonde, da für Infektionen mit Gram-negativen bzw. Gram-positiven Bakterien eine unterschiedliche Antibiotikatherapie erforderlich ist.
Die folgenden Beispiele sollen die verschiedenen Verfahren und Verbindungen der Erfindung erläutern.

Beispiel 1

Verfahren, anhand derer die Sonden der folgenden Beispiele gestaltet werden

Die Kandidaten für Gram-negative Sonden, RWO4, DL04, DL05 und RDR278, die Gram-positive Sonde RWO3 und die Bacteroides-Sonde RDR279 wurden aus Daten der Genbank oder der EMBL-Nucleotidsequenzbanken gestaltet (Dams et al., "Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences", Nucleic Acids Research, Bd.16 (1988), Supplement, und Neefs et al., "Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences", 18 (1990), 2237-2317, Supplement, und in einer Veröffentlichung von C. Woese (C. R. Woese, "Bacterial evolution", Micorbiological Reviews 51 (2), (1987), 221-271).
Die Lage der Sonden wurde aufgrund der Entdeckung von Bereichen im 16SrRNA-Gen ausgewählt, die "Sequenz-Unterschriften" enthalten, die ausschließlich bei den verschiedenen Gruppen von Bakterien vorliegen (Referenz von Woese). Alle diese sechs Sonden liegen im gleichen Bereich des Gens. Die Nucleotidsequenz der Sonden wurde aufgrund der Sequenzen gestaltet, die für jede Gruppe von Bakterien, die nachgewiesen werden sollen, verfügbar sind, und mit entsprechenden Sequenzen in den Bakteriengruppen verglichen, die ausgeschlossen werden sollten. Beispielsweise wurde die Gram-positive Sonde so gestaltet, dass sie mit den meisten in einem Großteil der Gram-positiven Bakterien vorliegenden Sequenzen übereinstimmt und sich von den entsprechenden Sequenzen in Gram-negativen Bakterien unterscheidet.
Der Kandidaten für universelle bakterielle Sonden, RDR244 und RDR245, entsprechen einem hoch-konservierten Bereich des 16S-rmA-Gens. Der größte Teil der Sondensequenz in diesem Bereich liegt in den meisten Bakterienarten vor, für die eine Sequenzinformation verfügbar ist, jedoch liegt er nicht in der Kern- oder Mitochondrien-DNA von eukaryotischen Arten vor.
Außerdem wurde jedes der vorstehend beschriebenen Oligonucleotide auf Selbst-Komplementarität untersucht (die Fähigkeit, mit sich selbst Basenpaare zu bilden), wobei ein FOLD genanntes Computerprogramm der Programmreihe der Universität von Wisconsin verwendet wurde. Die Lage der Oligonucleotid-Sonde wurde so gewählt, dass die Bildung einer Sekundärstruktur minimiert wurde, wo dies möglich war, während die gewünschte Spezifität noch erhalten blieb.
Die E. coli/Enterobakterien-Sonde wurde aus den Daten der Genbank entworfen. Die Sonde wurde anhand der folgenden Schritte entworfen:
Zuerst wurde die Nucleotidsequenz von bp1430 bis 1536 (wie in der Referenz von Neefs angegeben) (innerhalb des 370-bp-Bereichs, an den die Amplifikationsprimer RWO1 und DG74 binden) für E. coli und Proteus vulgaris mit der einer Reihe von Nicht-Enteroarten, einschließlich Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa und Pseudomonas testosteroni, verglichen. Bereiche, in denen Unterschiede in der Sequenz vorlagen, wurden notiert und verwendet, um einen Kandidaten für eine Sonde zu entwerfen.
Als zweites wurde der Sondenkandidat mit den entsprechenden Nucleotidsequenzen von anderen, phylogenetisch stärker verschiedenen Arten verglichen, die in der Genbank oder EMBL angegeben sind, wodurch sichergestellt wurde, dass mit dem Oligonucleotidkandidat keine anderen Arten nachgewiesen werden.
Als drittes wurde das Oligonucleotid auf Selbst-Komplementarität untersucht (die Fähigkeit, mit sich selbst Basenpaare zu bilden), wobei ein OLIGO genanntes Computerprogramm verwendet wurde (National Biosciences, Hamel, NN). Die Lage der Oligonucleotid-Sonde wurde so gewählt, dass die Bildung einer Sekundärstruktur minimiert wurde, wo es möglich war, während die gewünschte Spezifität noch erhalten blieb.

Beispiel 2

Nachweis von Gram-negativen Bakterien unter Verwendung von PGR und der Sonde DL04

Die PGR-Amplifikation von Gram-negativer Bakterien-DNA wurde folgendermaßen durchgeführt. Die verwendeten Primer sind in Fig. 1 dargestellt.
Ein 2x Standard-PCR-Gemisch wurde hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt und zum Amplifizieren einer Zielsequenz für sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien verwendet wurde.
10 · Standard-PCR-Puffer 10,0 ml
50 mM MgCl&sub2; 1,0 ml
dNTPs (2,5 mM Gesamt-dNTPs) 2,5 m)
Primer RWO1 (50 mM) 1,0 m)
Primer DG74 (50 mM) 1,0 ml
H&sub2;O 35,0 ml
Taq-DNA-Polymerase (5 U/ml) 0,5 ml
Der 10 · Standard-PCR-Puffer enthält:
100 mM Tris-HCl, pH 8,3
500 mM KCl
15 mM MgCl
A. 50 ml einer DNA-Probe von Gram-negativen Bakterien wurden mit 50 ml des 2x PCR-Gemisches gemischt.
Das Reaktionsgemisch wurde in ein 0,5-ml-Mikrofugenröhrchen gefüllt und das Röhrchen anschließend in einen von Perkin-Elmer hergestellten Thermal-Cycler gestellt. Ein aus zwei Schritten bestehender PCR-Zyklus wurde eingesetzt und der Thermal-Cycler folgendermaßen eingestellt:
1. Wartezeit-File - 5 Minuten bei 95ºC
2. Thermozyklus-File - 25 Sekunden bei 95ºC
25 Sekunden bei 55ºC, jede Inkubation
25 bis 35 Zyklen
3. Wartezeit-File - 10 Minuten bei 72ºC.

B. Nachweis von amplifizierten Produkten

Nachdem die Amplifikationsreaktion vollständig abgelaufen war, wurden 5 ml des 100 ml Reaktionsgemisches mit 1 ml 10x DNA-Farbstoffpuffer (50% Saccharose, 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1,0% SDS, 0,05% Bromphenolblau) gemischt. Die Probe wurde auf ein Gel aus 2% Nusieve-Agarose, 0,5% Seakem-Agarose und 1x TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) aufgetragen. Nachdem die Front des Bromphenolblau-Farbstoffs zum unteren Ende des Gels gelaufen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid (5 mg/ml) gefärbt, in Wasser gewaschen und mit einer Polaroid- Kamera und einem orangen Filter unter UV-Licht fotografiert.
Die Größe des PCR-Produkts beträgt etwa 370 bp.

C. Übertragung der amplifizierten DNA auf eine Nylonmembran

Nachdem das Gel fotografiert worden war, wurde es bei Raumtemperatur 10 Minuten in 0,25 N HCl eingeweicht. Anschließend wurde es mit Wasser gespült und danach 30 Minuten in eine Lösung von 0,5 N NaOH und 1,5 M NaCl gelegt. Danach wurde das Gel mit Wasser gespült und anschließend 30 Minuten in eine Lösung von 1 M Tris, pH 7,5, und 1,5 M NaCl gelegt.
Danach wurde die DNA auf eine Nylonmembran (Pall Biodyne) überführt, die vorher in Wasser eingeweicht worden war, wobei eines der folgenden Verfahren verwendet wurde: (1) Vakuum-Transfer unter Verwendung eines Stratagene- Stratavac-Vakuumblotters oder (2) Kapillar-Transfer durch das Verfahren von Southern.
Nach der Übertragung wurde die DNA anhand von UV-Licht in einem Stratagene-Stratalinker an die Membran fixiert.

D. Radioaktive Markierung der Oligonucleotid-Sonde DL04 (Fig. 3)

Das Oligonucleotid DL04 wurde anhand der T4-Polynucleotid-Kinase im folgenden Reaktionsgemisch markiert:
γ-³²P-ATP 10 ml
10 · Kinasepuffer 2,5 ml
Oligonucleotid (10 mM) 2,0 ml
H&sub2;O 8,5 ml
T4-Polynucleotid-Kinase 2,0 ml
Der 10 · Kinasepuffer enthält folgendes:
500 mM Tris, pH 8
100 mM MgCl&sub2;
50 m M DTT
Das Kinase-Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde abgestoppt, indem 5, 6 von 0,25 M EDTA und 169,4 ml H&sub2;O zugegeben wurden. Dieses Gemisch wurde auf eine Biogel-P4-Säule mit 1,0 ml Inhalt aufgetragen und in einer Tischzentrifuge fünf Minuten bei 5000 UpM abzentrifugiert, wodurch das markierte Oligonucleotid von der nicht-eingebauten Radioaktivität abgetrennt wurde. 1 ml des Eluats aus der Säule wurde in einem Szintillationszähler ohne Zugabe von Szintillationsflüssigkeit gezählt (Cerenkov-Zählung), so dass die Menge der eingebauten Radioaktivität bestimmt werden konnte. In der anschließenden Hybridisierung wurde für jeden Blot ein Volumen eingesetzt, das etwa 1 · 10&sup6; CpM ergab.

E. Hybridisierung von Sonden mit DNA

Die DNA-Blots wurden in einem Gemisch aus 5x SSPE und 0,5% SDS bei 60ºC vorhybridisiert (lx SSPE = 0,18 M NaCl, 10 mM NaPO&sub4;, pH 7,4, 1mM EDTA). Die markierte Oligonucleotid-Sonde wurde zu 7,5 ml 5x SSPE und 0,5% SDS zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde in einen Kunststoffbeutel überführt, der den eingeweichten Blot enthielt. Der Blot wurde eine bis 18 Stunden bei 60ºC inkubiert.
Der Blot wurde aus dem Kunststoffbeutel entnommen und in eine Lösung von 2 · SSPE und 0,1% SDS gebracht und zehn Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend wurde der Blot, im Fall der Gram-negativen Sonde DL04, in einer Lösung von 3 M Tetramethylammoniumchlorid (TMACI), 50 mM Tris, pH 8, und 0,2% SDS zehn Minuten bei 64ºC gewaschen.
Der Blot wurde luftgetrocknet, in Saranumhüllung eingewickelt und in einem Röntgenfilmhalter zusammen mit einem Bogen Kodak XAR-5-Röntgenfilm mit oder ohne Verstärkungsschrim eine bis 72 Stunden bei -70ºC inkubiert.

Beispiel 3

Nachweis von Gram-negativen Bakterien - Vergleich der Sonden RW04 und DL04

Der Kandidat für eine Gram-negative Sonde, RW04, wurde mit 32P markiert und mit den PCR-Produkten aus verschiedenen bakteriellen DNAs hybridisiert, wie für die Gram-negative Sonde DL04 im Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Waschgang in TMACI bei 62ºC durchgeführt wurde. Die Southern-Blot- Ergebnisse der Hybridisierungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Werte zeigen, dass sich die durch die zwei Sonden erhaltenen Hybridisierungsergebnisse unterscheiden, obwohl beide Sonden so gestaltet waren, dass sie "universelle" Gramnegative Sonden sind. RW04 ergab ein positives Signal auch für viele Grampositiven Arten, die durch sie nicht hätten nachgewiesen werden sollen; stattdessen ergab DL04 nur für Gram-negative Arten, die durch sie nachgewiesen werden sollten, positive Signale (mit Ausnahme von T. maritima und T. thermophilus, die keine menschlichen Pathogene sind). Deshalb wurde DL04 als geeignete Sonde zum Nachweis von Gram-negativen Bakterien ausgewählt. Durch weiteres Testen (Tabelle 2) wurde gezeigt, dass DL04 nicht alle Gram-negativen Arten nachwies. Ein zweiter Kandidat für eine Gram-negative Sonde, RDR278, wurde wie im folgenden Beispiel 4 getestet.

Beispiel 4

Nachweis von Gram-negativen Bakterien mit der Sonde RDR278

Gram-negative Bakterien wurden nachgewiesen, indem die gleichen Verfahren und Materialien wie in Beispiel 2 verwendet wurden, einschließlich des Waschgangs in TMACI, der bei 64ºC durchgeführt wurde.
Die Gram-negative Sonde RDR278 wurde mit ³²P markiert und mit den PCR- Produkten aus verschiedenen bakteriellen DNAs hybridisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. RDR278 ergab für die meisten Arten, die durch DL04 nicht nachgewiesen wurden, ein positives Hybridisierungssignal. Die Ausnahme unter den getesteten Arten stellte Bacteroides fragilis dar, für das eine eigene Sonde gestaltet wurde. Somit kann festgestellt werden, dass durch die Kombination der Gramnegativen Sonden DL04 und RDR278 der größte Teil der getesteten Gram-negativen Bakterien nachgewiesen wurde.

Beispiel 5

Nachweis von Bacteroides fragilis mit der Sonde RDR279

Die Verfahren und Materialien von Beispiel 2 wurden verwendet, einschließlich des Waschgangs in TMACI, der bei 64ºC durchgeführt wurde.
Die Sonde RDR279, die einem Bereich entsprach, der eine Sequenz- Unterschrift für Bacteroides darstellt (Ref.), wurde mit 32P markiert und mit den PCR- Produkten aus verschiedenen bakteriellen DNAs hybridisiert. Die Ergebnisse des Tests mit RDR279 auf andere Bakterienarten sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Die Sonde wies Bacteroides fragilis nach und ergab keine Reaktion mit den anderen getesteten Bakterienarten.

Claims

1. Sonde zum Nachweis oder zur Identifizierung von pathogenen Gramnegativen Bakterien, die eine Septikemie verursachen, enthaltend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

DL04 : 5'-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3',

RDR278 : 5'-GACGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTC-3';

RDR279 : 5'-GACGTAAGGGCCGTGCTGATTTGACGTC-3',

oder eine dazu komplementäre Nucleotidsequenz, wobei die Sonde unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die einzigartig für Gram-negative Bakterien ist.

2. Sonde nach Anspruch 1, enthaltend eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

DL04 : 5'-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3',

RDR278 : 5'-GACGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTC-3',

oder eine dazu komplementäre Sequenz.

3. Sonde nach Anspruch 2, bestehend aus einer Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

DL04 : 5'-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3',

RDR278 : 5'-GACGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTC-3',

oder einer dazu komplementären Sequenz.

4. Sonde nach Anspruch 1 zum Nachweis oder zur Identifizierung von Bacteroides-Bakterien, enthaltend die Nucleotidsequenz:

RDR279 : 5'-GACGTAAGGGCCGTGCTGArJTTGACGTC-3'

oder die dazu komplementäre Sequenz.

5. Sonde nach Anspruch 4, bestehend aus der Nucleotidsequenz:

RDR279 : 5'-GACGTAAGGGCCGTGCTGATTTGACGTC-3'

oder der dazu komplementären Sequenz.

6. PCR-Kit zum Nachweis oder zur Identifizierung von pathogenen Gramnegativen Bakterien, umfassend einen ersten Behälter und einen zweiten Behälter, wobei der erste Behälter Primer enthält, die zur Amplifikation eines Zielbereiches einer Polynucleotidsequenz innerhalb der Bakterien fähig sind, und der zweite Behälter eine oder mehrere Sonden nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines bakteriellen Polynucleotids von einem pathogenen Gram-negativen Bakterium in einer Probe, von der vermutet wird, dass sie das bakterielle Polynucleotid enthält, wobei das bakterielle Polynucleotid einen ausgewählten Zielbereich umfasst, wobei das Verfahren umfasst:

a) Amplifizieren des Zielbereiches, falls vorhanden, bis zu einer nachweisbaren Menge;

b) Inkubieren des amplifizierten Zielbereiches, falls vorhanden, mit einer Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Bedingungen, die eine Spezifität der Hybriddoppelstränge erlauben; und

c) Nachweisen der Hybride, die zwischen dem amplifizierten Zielbereich, falls vorhanden, und der Sonde gebildet wurden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Zielbereich mit Hilfe der Polymerase- Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert wird.