DE69224548T2

DE69224548T2 - Verfahren zur Amplifizierung und zum Nachweis von Nukleinsäuren,die einen schnellen PCR-Zyklus verwenden

Info

Publication number: DE69224548T2
Application number: DE69224548T
Authority: DE
Inventors: John W Backus; William H Donish; John B Findlay; John W Sutherland
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1991-04-30
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2012-04-25
Also published as: FI921945A0; MX9201948A; JP3426262B2; CA2065719A1; FI921945L; EP0511712B2; EP0511712B1; EP0511712A1; ATE163681T1; US6475729B1; DK0511712T3; DK0511712T4; KR920019946A; HK1004861A1; JPH05304960A; DE69224548D1; SG64887A1; IE921370A1; DE69224548T3

Description

Die Erfindung betrifft sehr rasche Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von Nucleinsäuren unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion.
Die Nucleinsäure-Sondentechnik hat sich in den letzten Jahren rasch entwickelt, da Forscher ihren Wert zum Nachweis von verschiedenen Krankheiten, Organismen oder genetischen Merkmalen, die in kleinen Mengen in einer humanen oder tierischen Testprobe enthalten sind, entdeckt haben. Die Verwendung von Sonden beruht auf dem Konzept der komplementären Beschaffenheit. DNA weist zwei Stränge auf, die aneinander durch Wasserstoffbruckenbindungen zwischen komplementären Nucleotiden (die auch als Nucleotidpaare bekannt sind) gebunden sind.
Der DNA-Komplex ist normalerweise stabil, wobei aber die Stränge durch Bedingungen, die die Wasserstoffbrückenbindungen aufbrechen, getrennt (oder denaturiert) werden können. Die freigesetzten einzelnen Stränge reassozueren nur mit einem anderen Strang, der eine komplementäre Nucleotidsequenz aufweist. Dieser Hybridisierungsvorgang kann erfolgen, wenn sich beide Stränge in Lösung befinden oder wenn einer der Stränge an ein festes Substrat gebunden ist.
Bei einer Nucleinsäure-Zielsequenz in einem Organismus oder einer Zelle kann es sich um einen nur sehr kleinen Teil des gesamten DNA-Moleküls handeln, so daß es sehr schwierig ist, ihre Anwesenheit unter Verwendung der meisten markierten DNA-Sonden nachzuweisen. Es wurden erhebliche Forschungsanstrengungen unternommen, um Wege aufzufinden, mit denen man nur einige wenige Molekule einer Zielnucleinsäure auffinden kann.
Ein erheblicher Fortschritt auf diesem Gebiet wird in US-A- 4 683 195, US-A-4 683 202 und US-A-4 965 188 beschrieben. Ohne zu weit in Einzelheiten zu gehen beschreiben diese Patente Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis, wobei Primer mit den Strängen einer Zielnucleinsäure (als Matrizen betrachtet) in Gegenwart eines Nucleotid-Polymerisationsmittels (z. B. einer DNA-Polymerase) und von Desoxyribonucleosidtriphosphaten hybridisiert werden. Unter speziellen Bedingungen ergibt sich bei der Addition von Nucleotiden entlang der Matrizen ausgehend vom 3'-Ende der Primer die Bildung von Primer-Extensionsprodukten. Diese Produkte werden sodann denaturiert und als Matrizen für mehrere der gleichen Primer in einer weiteren Extensionsreaktion verwendet. Wenn dieser Zyklus der Denaturierung, Hybridisierung und Primererweiterung für eine bestimmte Anzahl von Zyklen (beispielsweise 25 bis 30 Zyklen) durchgeführt wird, führt das Verfahren, das als "Polymerase-Kettenreaktion bekannt ist, zu einer exponentiellen Zunahme der ursprünglichen Menge der Zielnucleinsäure, so daß diese leicht nachgewiesen werden kann.
Nachdem die Zielnucleinsäure in ausreichendem Maße amplifiziert worden ist (d. h. es ist ein Vielfaches der Kopien des Moleküls hergestellt worden) können verschiedene Nachweisverfahren zu ihrem Nachweis herangezogen werden. Die vorerwähnten Patente beschreiben beispielsweise die Verwendung von insolubilisierten oder nachweisbar markierten Sonden und die Gelelektrophorese als repräsentative Nachweisverfahren.
In US-A-4 965 188 wird der Zyklus für die Amplifikation allgemein folgendermaßen beschrieben:
a) Denaturierung bei einer Temperatur im Bereich von 90 bis 105ºC (vorzugsweise 90 bis 100ºC) für 0,5 bis 5 Minuten (vorzugsweise 0,5 bis 3 Minuten),
b) Hybridisierung von Primer mit Matrize bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 65ºC (vorzugsweise 37 bis 60ºC) für 0,5 bis 5 Minuten (vorzugsweise 1 bis 3 Minuten) und
c) Bildung von Primer-Extensionsprodukten bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 80ºC (vorzugsweise 50 bis 75ºC) für 0,5 bis 40 Minuten (vorzugsweise 1 bis 3 Minuten).
Somit wird ein breiter Bereich von Zeitspannen und Temperaturen allgemein beschrieben, wobei die spezielle Kombination von Zeitspanne und Temperatur in starkem Maße vom Typ der verwendeten DNA-Polymerase, der Komplexität des Gemisches von Nucleinsäuren unter Einschluß der Zielnucleinsäure, der Länge und der Spezifität der Primer, der Länge der Zielnucleinsäure, dem pH-Wert und verschiedenen anderen Reaktionsbedingungen und Komponenten abhängt. Nicht erwähnt wird jedoch die Zeitspanne, die erforderlich ist, um von einer Temperatur auf die andere überzugehen, ein Faktor, der stark vom Typ der für diesen Vorgang verwendeten Wärmeübertragungsvorrichtung abhängt. Somit müssen erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um die optimalen Bedingungen für eine effektive Amplifikation und den Nachweis einer gegebenen Nucleinsäure herauszufinden.
Ein typischer Amplifikationszyklus in Beispiel II von US-A-4 965 188 benötigt 5,5 Minuten für einen einzelnen Zyklus aus folgenden Stufen:
a) Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 37 bis 95ºC über 3 Minuten,
b) Denaturierung von Doppelsträngen bei 9500 für 0,5 Minuten,
c) Abkühlen auf 3700 über 1 Minute und
d) Hybridisieren von Primern mit der Matrize und Bildung des Primerextensionsprodukts bei 3700 für 1 Minute.
Ein weiterer typischer Amplifikationszyklus ist in Beispiel VII von US-A-4 965 188 beschrieben, der ebenfalls 5,5 Minuten benötigt und folgende Stufen umfaßt:
a) Erwärmen des Reaktionsgemisches von 70 auf 98ºC über 1 Minute,
b) Denaturierung von Doppelsträngen bei 98ºC für 1 Minute,
c) Abkühlen auf 38, 45 oder 55ºC über 1 Minute,
d) Hybridisieren von Primern und Matrize bei 38, 45 oder 55ºC für 1 Minute,
e) Erwärmen von 38, 45 oder 55ºCauf 70ºC über 1 Minute und
f) Bildung von Primer-Extensionsprodukten bei 70ºC für 0,5 Minuten.
Seit der Entdeckung der Amplifikations- und Nachweisverfahren unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion wurden ständig Anstrengungen unternommen, Möglichkeiten zur raschen Durchführung der Zyklen herauszufinden. Eine Anzahl von Veröffentlichungen hat darauf hingewiesen, daß eine rasche Zyklusdurchführung erwünscht ist, es wurden jedoch keine geeigneten Anweisungen dafür gegeben, wie dies ermöglicht werden kann. Beispielsweise hängt eine rasche Zyklusdurchführung in gewisser Weise von einer geeigneten Geräteausrüstung ab. Einzelheiten über eine derartige Geräteausrüstung finden sich beispielsweise in EP-A-0 236 069. Die Firmen Oetus Oorporation und Perkin-Elmer haben handelsübliche Thermocyclisiereinrichtungen entwickelt, die es dem Anwender ermöglichen, einen Polymerase-Kettenreaktionszyklus in 3 bis 6 Minuten durchzuführen, ähnlich den Beispielen in US-A-4 965 188 (vorstehend erwähnt) . Obgleich ein Zyklus von 3 bis 6 Minuten als recht rasch erscheint, können angesichts der Tatsache, daß für eine wirksame Amplifikation im allgemeinen 25 bis 30 Zyklen erforderlich sind, um die Nucleinsäuren nachweisbar zu machen, für ein typisches standardmäßiges Amplifikationsverfahren 75 bis 180 Minuten nötig sein.
In jüngerer Zeit haben die Firmen Oetus Corporation und Perkin-Elmer ein Thermocyclisiergerät (POR-System Modell 9600) auf den Markt gebracht, das beim Amplifikationsverfahren den Einsatz von Zyklen von 2 bis 3 Minuten ermöglicht.
Weitere Arbeiten wurden durchgeführt, um eine noch raschere Oyclisiereinrichtung aufzufinden, die mit in sich abgeschlossenen Reaktionsgefäßen (gelegentlich als Küvetten, Beutel oder Testpackungen bekannt) eingesetzt werden kann. Eine derartige Einrichtung ist beispielsweise in EP- A-0 402 994 und EP-A-0 402 994 beschrieben.
Es wurde erkannt, daß eine wirksame Wärmeübertragung bei der Oyclisierung der Reaktionsgemische zu einer Verringerung der für den Zyklus einer Polymerase-Kettenreaktion erforderlichen Zeitspanne beiträgt. Beispielsweise beschreiben Wittwer et al. (Anal. Biochem., Bd. 186(2) (1. Mai 1990), S. 328-331) die Verwendung warmer Luft zur Wärmeübertragung im Zusammenhang mit Reaktionsgemischen. Zyklen von 30, 60, 120 und 180 Sekunden werden beschrieben, wobei die folgenden Stufen in jedem Zyklus durchgeführt werden (gemäß den Angaben für den Zyklus von 30 Sekunden, wobei längere Zyklen proportional längere Stufen aufweisen):
a) Denaturierung von Doppelsträngen bei 90 bis 92ºC für 1-2 Sekunden,
b) Abkühlen auf 50 bis 55ºC über 6 bis 9 Sekunden,
c) Hybridisieren bei 50 bis 55ºC für 1 bis 2 Sekunden,
d) Erwärmen auf 71 bis 73ºC über 3 bis 5 Sekunden und
e) Bilden von Primer-Extensionsprodukten für 5 bis 10 Sekunden.
Die Vorteile der Warmluft-Wärmeübertragung werden von Wittwer et al. beschrieben. Es wird die Theorie vertreten, daß die Amplifikation je nach dem Reaktionsgefäß und der Wärmeübertragungseinrichtung innerhalb von Minuten erfolgen kann. Die von Wittwer et al. beschriebene spezielle Einrichtung weist jedoch für die Praxis eine Anzahl von Nachteilen auf, wozu folgende Nachteile gehören: die Schwierigkeit beim Einbringen von Proben und Reagenzien in Kapillarröhrchen von sehr kleinem Durchmesser, die Brüchigkeit dieser Röhrchen (nur für eine Laboratonumsumgebung geeignet und nicht für eine klinische Umgebung mit hohem Durchsatz), das Verschließen der Röhrchen mit einer Flamme (im Klinikbereich nicht zweckmäßig), die Gefahr der Verunreinigung und Übertragung bei der Entfernung der Amplifikationsprodukte aus den Röhrchen. Ferner ist es nicht leicht, die Wärmeübertragung zu steuern, wenn Luft das Übertragungsmedium darstellt. Zusammenfassend ist festzustellen, daß sich diese Verfahrensweise zwar leicht an Forschungssituationen bei geringem Volumen anpassen lassen, sich jedoch für ein großes Volumen im klinischen Bereich und in Arztpraxen nicht als zweckmäßig oder gewerblich anwendbar erweisen.
GB-A-2 202 328 beschreibt ein Verfahren zum Testen von Nucleinsäuren durch Hybridisierungstechniken, wobei es sich bei den Detektorsonden um modifizierte Primer handelt, die vor der Hybridisierungsreaktion in Kopien der Zielnucleinsäure eingebaut werden.
WO-89/07154 beschreibt ein Verfahren für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der die zu amplifizierende Probe sequentiell bei zwei Temperaturen inkubiert wird.
Auf dem einschlägigen Gebiet gibt es ein anhaltendes Bedürfnis nach einem raschen und wirksamen Amplifikationsverfahren, das den hohen Amplifikationswirkungsgrad von längeren Zykluszeiten aufrechterhält, aber die bis zum Erhalt eines analytischen Ergebnisses erforderliche Zeitspanne stark verkürzt. Ferner ist es wünschenswert, die vorstehend erwähnten Nachteile bei standardmäßigen Verfahren mit der Technologie der Übertragung mit Warmluft zu vermeiden. Außerdem ist es erwünscht, über ein rasches und empfindliches Amplifikations- und Nachweisverfahren zu verfügen, das nicht vom speziellen Typ der verwendeten Wärmeübertragungseinrichtung abhängig ist.
Die Schwierigkeiten der bekannten Verfahren werden durch ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure überwunden, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
A. das Erwärmen einer doppelsträngigen Zielnucleinsäure auf eine er- Ste Temperatur von 85 bis 100ºC für 1 bis 40 Sekunden, um die Stränge der Nucleinsäure zu denaturieren,
B. das Abkühlen der denaturierten Stränge auf eine zweite Temperatur für eine Zeitspanne von 5 bis 20 Sekunden,
C. in Gegenwart von
1) einer thermostabilen DNA-Polymerase, die in einer Menge von mindestens 5 Einheiten/100 ul der Lösung vorhanden ist,
2) Desoxyribonucleosid-5'-triphosphaten, die in für die DNA- Polymerisation wirksamen Mengen vorhanden sind, und
3) einem Satz von Primern, die für die denaturierten Stränge spezifisch sind, wobei die Primer in für die DNA-Polymerisation wirksamen Mengen vorhanden sind,
das Bilden von hybridisierten Primer-Extensionsprodukten aus den Primern und den denaturierten Strängen durch Inkubieren der denaturierten Stränge bei der zweiten Temperatur für 1 bis 80 Sekunden, wobei die zweite Temperatur im Bereich von (Tm-15) ºC bis (Tm+5) ºC liegt, wobei Tm die Schmelztemperatur der denaturierten Stränge und der Primer ist und die Differenz (ΔT) zwischen der ersten und zweiten Temperatur 5 bis 45ºC beträgt,
D. das Erwärmen der hybridisierten Primer-Extensionsprodukte auf die erste Temperatur für eine Zeitspanne von 5 bis 20 Sekunden und das Belassen der Produkte bei dieser Temperatur für 1 bis 40 Sekunden und E. das mindestens einmalige Wiederholen der Stufen B bis D in sequenzieller Weise als ein Zyklus, wobei jeder Zyklus der Stufen B bis D innerhalb einer Zeitspanne bis zu 120 Sekunden durchgeführt wird, mit der Maßgabe, daß dann, wenn die Konzentration der einzelnen Primer unter etwa 0,075 mikromolar ist, die Zeitspanne für jeden Zyklus der Stufen B bis D mindestens 60 Sekunden beträgt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis einer Nucleinsäure bereit, das die Stufen A-E und die vorstehend genannten Bedingungen umfaßt, wobei zusätzlich die folgende Stufe F durchgeführt wird:
F. Das Nachweisen von mindestens einem denaturierten Strang der Nucleinsäure.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert ein sehr rasches und wirksames Polymerase-Kettenreaktionsverfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von Nucleinsäuren, die in Testproben in äußerst niedrigen Konzentrationen vorhanden sind. Da das Verfahren rasch verläuft, läßt sich ein Testergebnis für eine frühe Diagnose in kürzerer Zeit erhalten oder es können mehr Zyklen durchgeführt werden, um einen weiteren Anstieg der Anzahl von Kopien der Zielnucleinsäure zu erreichen. Bei kürzeren Zyklen werden weniger nicht-spezifische (oder unerwünschte) Nucleinsäuren amplifiziert. Somit werden weniger unerwünschte Nucleinsäuren nachgewiesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insofern vorteilhaft, da es leicht an automatisierte Verfahrensweisen angepaßt werden kann, die in großen Mengen im diagnostischen Bereich (beispielsweise Krankenhäuser, Kliniklaboratorien und Arztpraxen) eingesetzt werden können. Die unzweckmäßigen Merkmale der Warmluf t-POR-Verfahren von Wittwer et al. werden vermieden. Jeder Zyklus des erfindungsgemäßen POR-Verfahrens verläuft äußerst rasch (d. h. 120 Sekunden oder weniger) und ist dennoch nicht von einer speziellen Maßnahme zur Wärmeübertragung oder einer speziellen Wärmeübertragungseinrichtung abhängig.
Diese Vorteile werden aufgrund einer Kombination von kritischen Merkmalen ermöglicht, nämlich der Anwendung von relativ hohen Konzentrationen der thermostabilen DNA-Polymerase, einer Temperatur für die DNA- Polymerisation, die mit dem Tm-Wert der denaturierten Stränge in Beziehung steht, und der Primer mit der Bedingung, daß dann, wenn die Konzentration der einzelnen Primer weniger als etwa 0,075 mikromolar beträgt, die Zykluszeit mindestens 60 Sekunden dauert. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner insofern vorteilhaft, als die rasche Durchführbarkeit gesteigert wird, indem nur zwei Temperaturen bei der Zyklusdurchführung anstelle der üblichen drei Temperaturen angewandt werden.
Vorteilhafterweise wird die Erfindung unter Verwendung bestimmter, patentrechtlich geschützter, in sich geschlossener Beutel und einer Cyclisierungseinrichtung durchgeführt, wie sie in EP-A-0 381 501, EP-A- 402 994 und EP-A-0 402 995 beschrieben sind, wobei die Durchführung der Erfindung jedoch nicht hierauf beschränkt ist.
Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation und den Nachweis von Nucleinsäuren unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion sind bekannt. Einzelheiten hierzu finden sich in zahlreichen Druckschriften, darunter US-A-4 683 195, US-A-4 683 202, US-A-4 965 188 und Clin. Microbiol. Rev., Bd. 2(2) (1989), S. 217-226.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Amplifikation oder den Nachweis von einer oder mehreren speziellen Nucleinsäuresequenzen, die in einer oder mehreren Zielnucleinsäuren in einer Testprobe vorhanden sind, abgestellt. Zu derartigen Proben gehören zelluläres oder virales Material, Haar, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien, die genetische DNA oder RNA, die nachgewiesen werden kann, enthalten. Während der primäre Nachweiszweck diagnostischer Natur ist, kann die Erfindung auch zur Verbesserung der Wirksamkeit bei der Klonierung von DNA oder Messenger- RNA oder zur Erzielung großer Mengen der gewünschten Sequenz aus einem Gemisch von Nucleinsäuren, das sich durch chemische Synthese ergibt, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere zur Herstellung von mindestens einer speziellen Nucleinsäuresequenz in exponentiellen Mengen, bezogen auf die Anzahl der beteiligten Reaktionsstufen. Beim Produkt handelt es sich um ein diskretes Nucleinsäure-Duplex mit Termini, die den Enden der verwendeten speziellen Primer entsprechen. Beliebige Quellen von Nucleinsäuren (gereinigt oder ungereinigt) können als Ausgangsmaterial verwendet werden, wenn von diesem bekannt ist, daß es die spezielle Nucleinsäuresequenz, deren Nachweis angestrebt wird, enthält, oder eine Vermutung hierfür besteht. Gegebenenfalls kann ein Gemisch von Nucleinsäuren verwendet werden.
Nachzuweisende Nucleinsäuren lassen sich aus verschiedenen Quellen erhalten, wozu Plasmide und natürlich vorkommende DNA oder RNA aus behebigen Quellen (wie Bakterien, Hefen, Viren, Pflanzen und höhere Tiere sowie Menschen) gehören. Sie können aus verschiedenen Geweben, einschließlich Blut, peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMO), Gewebematerial oder anderen Quellen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, unter Anwendung bekannter Verfahren extrahiert werden. Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere zur Amplifiaktion und zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen, die in genomischer DNA, bakterieller DNA, mykotischer DNA, viraler RNA oder DNA oder RNA, die in Bakterien oder viralen infizierten Zellen auftritt, finden.
Das hier beschriebene Verfahren kann zum Nachweis oder zur Charakterisierung von speziellen Nucleinsäuresequenzen verwendet werden, die mit infektiösen Krankheiten, genetischen Störungen oder zellulären Störungen, wie Krebs, assoziiert sind. Das Verfahren kann bei forensischen Untersuchungen und bei der DNA-Typisierung eingesetzt werden. Für die Zwecke der Erfindung umfaßt der Ausdruck "genetische Erkrankungen" spezielle Deletionen oder Mutationen in der genomischen DNA beliebiger Organismen.
Der Ausdruck "Primer" umfaßt ein Oligonucleotid (unabhängig davon, ob es natürlich auftritt oder synthetisch hergestellt worden ist), das dazu befähigt ist, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es Bedingungen ausgesetzt wird, bei der eine Synthese eines Primerextensionsprodukts, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang (d. h. der Matrize) ist, induziert wird.
Beim Primer handelt es sich vorzugsweise um ein einzelsträngiges Produkt, um einen maximalen Amplifikationswirkungsgrad zu erzielen; er kann aber auch gegebenenfalls eine doppelsträngige Region enthalten. Er muß ausreichend lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in Gegenwart der DNA-Polymerase zu veranlassen. Im allgemeinen weisen die erfindungsgemäß verwendeten Primer 12 bis 60 und insbesondere 18 bis 45 Nucleotide auf.
Die erfindungsgemäß verwendeten Primer werden so gewählt, daß sie "im wesentlichen komplementär" mit den verschiedenen Strängen der jeweils zu amplifizierenden speziellen Sequenz sind. Dies bedeutet, daß sie ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren entsprechenden Strängen unter Bildung der gewünschten hybridisierten Produkte zu hybridisieren, und daß sie anschließend durch eine DNA-Polymerase erweiterbar sein müssen. In der bevorzugten und zweckmäßigsten Situation ist der Primer genau komplementär mit der Zielnucleinsäure.
Für die vorliegenden Zwecke geeignete Primer lassen sich aus einer Anzahl von Quellen erhalten oder unter Verwendung bekannter Techniken und Einrichtungen herstellen, beispielsweise unter Verwendung eines ABI-DNA- Synthesegeräts (erhältlich von der Fa. Applied Biosystems) oder eines Biosearch 8600 Series- oder 8800 Series-Synthesegeräts (erhältlich von der Fa. Milligen-Biosearch, Inc.) sowie unter Einsatz von für deren Verwendung bekannten Methoden. Ferner sind auch natürlich vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert werden, geeignet (z. B. Restriktionsendonuclease-Verdauungsprodukte). Gemäß dem hier verwendeten Sprachgebrauch kann eine "Sonde" eine beliebige Länge von Nucleotiden aufweisen, wobei sie vorzugsweise 12 bis 40 Nucleotide aufweist. Sie sind (üblicherweise am 3'-Ende) mit einem geeigneten nachweisbaren Material (entweder direkt oder indirekt) markiert, wie nachstehend beschrieben wird. Sie können auch an ein wasserunlösliches Substrat eines bestimmten Typs gebunden sein, um die Zielnucleinsäure abzufangen.
Der Ausdruck "thermostabile DNA-Polymerase" bezeichnet, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, ein Enzym, das die Synthese von Primer-Extensionsprodukten bewirkt und das gegenüber Wärme stabil ist, insbesondere gegenüber den hohen Temperaturen, die für die Denaturierung von DNA- Strängen eingesetzt werden. Insbesondere dürfen die thermostabilen DNA- Polymerasen bei den hohen Temperaturen, wie sie bei den hier beschriebenen Polymerase-Kettenreaktionen angewandt werden, keiner wesentlichen Inaktivierung unterliegen. Eine Anzahl von thermostabilen DNA-Polymerasen ist aus dem Stand der Technik bekannt, einschließlich die ausführlich in US-A-4 965 188 (vorstehend erwähnt) und US-A-4 889 818 beschriebenen Polymerasen. Als besonders geeignet haben sich Polymerasen erwiesen, die aus verschiedenen Thermus-Bakterienspezies, wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus oder Thermus flavus, erhalten werden. Weitere geeignete thermostabile Polymerasen sind in WO-A-89/06691 beschrieben. Eine Anzahl von Techniken ist für die Isolierung von natürlich vorkommenden Polymerasen aus Organismen und zur gentechnischen Herstellung von Enzymen unter Anwendung rekombinanter Techniken bekannt.
Eine Zielnucleinsäure (d. h. eine zu amplifizierende oder nachzuweisende Nucleinsäure läßt sich aus einer Vielzahl von Quellen erhalten, wie vorstehend dargelegt wurde. Im allgemeinen wird sie in bestimmter Weise extrahiert, um sie für den Kontakt mit den Primern und den anderen Reaktionsmaterialien verfügbar zu machen. Dies bedeutet im allgemeinen, daß man in geeigneter Weise unerwünschte Proteine und zelluläre Bestandteile aus der Probe entfernt. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, wozu die Verfahren von Laure et al., The Lancet, (3. September 1988), S. 538-540, Maniatis et al., Molecular Oloning: A Laboratory Manual, (1982), S. 280-281, Gross-Belland et al., Eur. J. Biochem., Bd. 36 (1973), S. 32 und US-A-4 965 188 gehören. Die Extraktion von DNA aus Vollblut oder Komponenten davon wird beispielsweise in EP-A- 393 744, Beil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78(9) (1981), S. 5759-5763 und Saiki et al., Bio/Technology, Bd. 3 (1985), S. 1008-1012 beschrieben.
Da die zu amplifizierende oder nachzuweisende Nucleinsäure üblicherweise in der doppeisträngigen Form vorliegt, müssen die beiden Stränge getrennt werden, bevor der Priming-Vorgang stattfinden kann. Dies kann während des Extraktionsverfahrens oder später in einer getrennten Stufe erfolgen. Die Denaturierung (Stufe A) wird unter Verwendung einer Wärmebehandlung allein oder in Kombination mit einer geeigneten physikalischen, chemischen oder enzymatischen Maßnahme, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, durchgeführt. Die alleinige Erwärmung auf eine geeignete Temperatur stellt eine bevorzugte Maßnahme dar. Eine anfängliche Denaturierung wird im allgemeinen durch Erwärmen der Probe, von der vermutet wird, daß sie die Zielnucleinsäure enthält, auf eine erste Temperatur von 85 bis 100ºC für 1 bis 40 Sekunden durchgeführt. Vorzugsweise erfordert diese Denaturierung nur 1 bis 20 Sekunden bei 90 bis 98ºC, wobei aber auch andere Kombinationen von Behandlungszeit und Temperatur innerhalb der breiten Bereiche vom Fachmann leicht festgelegt werden können.
Die denaturierten Stränge werden sodann (Stufe B) auf eine zweite Temperatur gekühlt, die im allgemeinen im Bereich von 55 bis 70ºC und vorzugsweise von 60 bis 70ºC liegt. Gemäß einer bevorzugten Bedingung der Erfindung werden die erste und die zweite Temperatur so eingestellt, daß die Differenz zwischen diesen Temperaturen (hier als ΔT identifiziert) im Bereich von 5 bis 45ºC, vorzugsweise von 15 bis 45ºC, insbesondere von 25 bis 40ºC und ganz besonders von 20 bis 35ºC liegt. Diese Bedingung ist besonders wünschenswert, wenn die zweite und dritte Temperatur (nachstehend definiert) gleich sind. Die zum Abkühlen der denaturierten Stränge erforderliche Zeitspanne beträgt im allgemeinen 5 bis 20 Sekunden und vorzugsweise 5 bis 15 Sekunden.
Nachdem die denaturierten Stränge auf die zweite Temperatur abgekühlt worden sind, wird die Stufe C durchgeführt. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß es möglicherweise einen bestimmten Zeitpunkt gibt, zu dem die Stufe B endet und die Stufe C beginnt; jedoch weiß der Fachmann, wie er die einzelnen Stufen einzustellen hat, um die rasche Cyclisierung gemäß der hier gegebenen Lehre zu erreichen. In Gegenwart der nachstehend definierten DNA-Polymerisationsreagenzien werden hybridisierte Primer-Extensionsprodukte der Primer und denaturierte Stränge durch weitere Inkubation bei der zweiten Temperatur für eine Zeitspanne von 1 bis 80 Sekunden und vorzugsweise von 1 bis 40 Sekunden gebildet. Diese weitere (zweite) Inkubationstemperatur liegt im Bereich von (Tm-15) ºC bis (Tm+5)ºC. Tm ist hier als die Temperatur definiert, bei der eine Hälfte der Zielnucleinsäurestränge mit den Primern hybridisiert. Die Bestimmung von Tm kann unter Anwendung verschiedener standardmäßiger Vorgehensweisen, die auf UV-Hypochromie beruhen, durchgeführt werden, beispielsweise indem man das Spektrum bei 260 nm gemäß den Angaben in Biochemistry - The Molecular Basis of Cell Structure and Function, 2. Aufl., Lehninger, Worth Publishers, Inc., (1970), S. 876-877 bestimmt.
Nachdem die Stränge getrennt sind, stehen sie als Matrizen zur Bildung von Primer-Extensionsprodukten bereit. Normalerweise wird die Probe mit der thermostabilen DNA-Polymerase, geeigneten Desoxyribonucleosid-5'- triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und einem geeigneten Satz von Primern vermischt. Die Menge der in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten thermostabilen DNA-Polymerase beträgt mindestens 5 Einheiten/100 ul Lösung. Vorzugsweise liegt die Menge im Bereich von 6 bis 20 Einheiten/100 ul Lösung, wobei aber auch größere Mengen verwendet werden können, falls dies erwünscht ist. Eine "Einheit" ist als die Menge der Enzymeinheit definiert, die zum Einbau von 10 Nanomol gesamten Nucleotiden (dNTPs) in eine sich erweiternde Nucleinsäurekette bei 74ºC innerhalb von 30 Minuten erforderlich ist.
Die dNTPs und Primer sind in Mengen vorhanden, die einen wirksamen Abbau der DNA-Polymerisation ermöglichen, wobei diese Mengen aus dem Stand der Technik bekannt sind. Repräsentative Mengen sind in den nachstehenden Beispielen aufgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge des Primers mindestens 0,075 mikromolar, wobei 0,1 bis 2 mikromolar bevorzugt sind, wobei jedoch weitere allgemeine Mengen bekannt sind. Eine weitere Maßzahl für die Primer besteht darin, daß sie in erheblichem überschuß gegenüber den denaturierten Strängen vorhanden sind, beispielsweise in einem Molverhältnis von mindestens 20:1. Es ist darauf hinzuweisen, daß dann, wenn die Menge der Zielnucleinsäure unbekannt ist, das genaue Verhältnis von Primer zu denaturiertem Strang nicht mit Sicherheit bekannt ist, jedoch der Fachmann eine vernünftige Abschätzung bezüglich der Menge des einzusetzenden Primers machen und somit das Reaktionssystem dementsprechend optimieren kann, wobei er die umfangreichen Ausführungen aus dem Stand der Technik bezüglich der Reagenzmengen berücksichtigen wird.
Ferner sind vorzugsweise weitere Reagenzien vorhanden, wozu Salze, wie Magnesiumchlorid (im allgemeinen 1 bis 10 millimolar), Streckmittel, wie Gelatine oder andere wasserlösliche oder in Wasser dispergierbare Kolbide (im allgemeinen 0,001 bis 0,05 Gew.-%) gehören. Das Reaktionsgemisch wird im allgemeinen auf einen pH-Wert von 7 bis 9 gepuffert, wobei ein pH-Wert von 8 bevorzugt wird. Hierzu können zahlreiche geeignete Puffer, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Das Volumen des Reaktionsgemisches unter Einschluß der Zielnucleinsäure ist nicht kritisch. Jedoch läßt sich die Wärmezufuhr und Wärmeabfuhr umso schneller erreichen, je geringer das Volumen ist. Im allgemeinen beträgt das Volumen 50 bis 300 ul, wobei kleinere oder größere Volumina je nach der Einrichtung und dem Gefäß, die für den Test verwendet werden, ebenfalls geeignet sein können.
Die Reagenzien für die Polymerisation können der die Zielnucleinsäure enthaltenden Probe zu einem beliebigen geeigneten Zeitpunkt zugesetzt werden, d. h. vor oder während der Denaturierung (Stufe A oder D) oder vor, während oder nach der Abkühlstufe (Stufe B). Alternativ können die Reagenzien zu mehreren und verschiedenen Zeitpunkten während des Verfahrens zugesetzt werden. Der Fachmann ist in der Lage, eine geeignete Vorgehensweise für die Reagenzienzugabe zu entwerfen. Es ist wichtig, daß der Mischvorgang rasch erfolgt, so daß das Verfahren in einer möglichst kurzen Zeitspanne durchgeführt werden kann. Somit ist es bevorzugt, daß sämtliche Reagenzien, die für das gesamte Verfahren erforderlich sind, vor oder während der Denaturierungsstufe A des hier definierten Verfahrens zugesetzt werden.
Das neu synthetisierte hybridisierte Produkt der Matrize und deren aus dem Primer gebildete komplementäre Nucleinsäure werden in den nachfolgenden Stufen des Verfahrens verwendet. Sie werden sodann denaturiert, indem man sie für eine Zeitspanne von 5 bis 20 Sekunden auf die erste Temperatur von 85 bis 100ºC erwärmt und diese Temperatur für eine zusätzliche Zeitspanne von 1 bis 40 Sekunden aufrechterhält (Stufe D) . Vorzugsweise beträgt die Denaturierungstemperatur 90 bis 98ºC und die Erwärmungszeit 5 bis 10 Sekunden, wobei die Temperatur weitere 1 bis 15 Sekunden aufrechterhalten wird.
Zu diesem Zeitpunkt ist ein Zyklus der Bildung und Trennung von einem Satz von doppelten Strängen der Zielnucleinsäure beendet (Stufen B bis D). Jeder Zyklus dauert 120 Sekunden oder weniger, wobei die Zeitspanne im allgemeinen im Bereich von 10 bis 120 Sekunden liegt. Vorzugsweise dauert jeder Zyklus 20 bis 90 Sekunden, wobei Zeitspannen von 30 bis 70 Sekunden besonders bevorzugt werden. Der Zyklus kann so oft wie nötig durchgeführt werden, um die gewünschte Menge der Zielnucleinsäure zu bilden.
Für eine wirksame Amplifikation werden mindestens 20 Zyklen der Abkühlung, der Primererweiterung und der Denaturierung durchgeführt, wobei 20 bis 40 Zyklen bevorzugt werden.
Das hier beschriebene Amplifikationsverfahren wird ferner unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß dann, wenn die Konzentration der einzelnen Primer weniger als etwa 0,075 uM beträgt, die Zeitspanne für die einzelnen Zyklen der Stufen B bis D mindestens 60 Sekunden und vorzugsweise 90 bis 120 Sekunden beträgt.
Nachdem die Stufe C im Test zum letzten Mal durchgeführt worden ist, können die endgültigen Primer-Extensionsprodukte unter Anwendung bekannter Verfahren, die nachstehend beschrieben werden, nachgewiesen werden. Die Produkte können in nicht-denaturierter Form unter Anwendung bekannter Verfahren, beispielsweise durch Agarose-Gelelektrophorese oder Färbung mit Ethidiumbromid, nachgewiesen werden, oder die Stufe D kann erneut durchgeführt werden, um die Produkte für den Nachweis zu denaturieren.
Vorzugsweise werden die Produkte ein letztes Mal denaturiert (Stufe D), wobei Mehrfachkopien der Stränge der Zielnucleinsäure bereitgestellt werden. Die Denaturierung kann gemäß der vorstehend gegebenen Lehre durchgeführt werden, mit der Ausnahme, daß die Zeitspanne für die Denaturierung beim letzten Mal nicht so kritisch wie bei den früheren Zyklen ist (d. h. sie kann gegebenenfalls länger sein) . Nach der gewünschten Anzahl an Zyklen kann die Reaktion ferner durch Inaktivierung der DNA-Polymerase unter Anwendung bekannter Techniken oder durch Trennung der Reaktionskomponenten gestoppt werden.
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wird vorzugsweise kontinuierlich in automatisierter Weise durchgeführt, so daß das Reaktionsgemisch für erwünschte, vorher eingestellte Zeitspannen einer Temperatur- Zyklusführung unterworfen wird. Für diesen Zweck wurde eine Anzahl von Vorrichtungen entwickelt, die dem Fachmann geläufig sind.
Eine derartige Vorrichtung für diesen Zweck ist ausführlich in US-A- 4 965 188 und EP-A-0 236 069 beschrieben. Dabei werden Flüssigkeiten unter kontrollierten Bedingungen von einer Temperaturumgebung in eine andere Temperaturumgebung transportiert.
Eine weitere Vorrichtung bedient sich der Temperatur-Zyklusführung ohne ein Flüssigkeitshandhabungssystem. Eine derartige Vorrichtung ist ausführlich in US-A-4 965 188 und EP-A-0 236 069 beschrieben. Im allge 3 meinen umfaßt diese Vorrichtung einen wärmeleitenden Behälter zur Aufnahme einer Anzahl von Reaktionsröhrchen mit einem Gehalt an einem Reaktionsgemisch, eine Einrichtung zum Erwärmen, Abkühlen und Konstanthalten der Temperatur sowie eine Recheneinrichtung zur Erzeugung von Signalen zur Steuerung der Amplifikationssequenz, der Temperaturänderungen und der Zeitgebung.
Eine bevorzugte Vorrichtung zur Bearbeitung von Amplifikationsreaktionen in einer chemischen Einweg-Testpackung ist ausführlich in EP-A- 0 402 994 beschrieben. Im allgemeinen umfaßt diese Vorrichtung eine Trägeroberfläche zur Aufnahme einer chemischen Testpackung, auf der Oberfläche angeordnete Druckanwendungsvorrichtungen, um die Reaktionspackung zur Übertragung von Flüssigkeiten zwischen benachbarten Kammern in der Testpackung zu veranlassen, und eine Einrichtung zur Betätigung der Druckanwendungsvorrichtungen durch eine Reihe von Bewegungen, die sich über die Testpackung erstrecken.
EP-A-0 402 994 gibt Einzelheiten über geeignete chemische Testpackungen an, die unter Verwendung der in EP-A-0 402 995 beschriebenen Vorrichtung eingesetzt werden können. Ferner ist darin eine Einrichtung zum Erwärmen und Abkühlen der Testpackung in wiederholten Intervallen, (d. h. über Zyklen hinweg) in einer für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Art und Weise beschrieben. Wie vorstehend erwähnt, sind diese Vorrichtungen und Testpackungen für die erfindungsgemäße Praxis zwar bevorzugt, können aber nicht als wesentlich für das Erreichen der hier beschriebenen vorteilhaften Ergebnisse angesehen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vorteilhafter Weise zum raschen Nachweis oder zur raschen Charakterisierung einer Zielnucleinsäure, die in einem infektiösen Mittel vorhanden ist, eingesetzt werden. Der Nachweis kann in einer Anzahl von bekannten Wegen durchgeführt werden, beispielsweise gemäß US-A-4 965 188. Beispielsweise kann die amplifizierte Nucleinsäure unter Anwendung von Southern-Blotting-Techniken analysiert werden. Alternativ kann die Amplifikation unter Verwendung von mit Radioisotopen markierten oder biotinylierten Primern, die unter Anwendung geeigneter Techniken nachgewiesen werden können, durchgeführt werden. Sequenzspezifische Oligonucleotide können zusammen mit Punkt- Blot-Techniken herangezogen werden, um einzelne Basenpaarvariationen in Nucleinsäuren nachzuweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die amplifizierte Zielnucleinsäure, nachdem eine gewünschte Menge der in Frage stehenden 3 Nucleinsäuresequenz erzeugt worden ist und die Primer-Extensionsprodukte ein letztes Mal denaturiert worden sind, unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde nachgewiesen, die für den Nachweis markiert ist und direkt oder indirekt mit einem der Primer-Extensionsprodukte hybridisiert werden kann. Verfahren zum Anbringen von Markierungen und zur Herstellung von Sonden sind aus dem Stand der Technik bekannt; vgl. beispielsweise Agrawal et al., Nucleic Acid Res., Bd. 14 (1986), S. 6227-6245 und US-A- 4 914 210 in bezug auf Biotin-Markierungen, US-A-4 962 029 in bezug auf Enzymmarkierungen sowie die dort genannten Literaturstellen. Zu geeigneten Markierungen gehören Radioisotope, elektronendichte Reagenzien, chromogene, fluorogene, phosphoreszierende Reste, Ferritin und andere magnetische Teilchen (vgl. US-A-4 795 698 und US-A-4 920 061), chemilumineszierende Reste und Enzyme (die bevorzugt sind). Zu geeigneten Enzymen gehören Glucose-oxidase, Peroxidasen, Uricase, alkalische Phosphatase und andere aus dem Stand der Technik bekannte Enzyme. Sie können an Oligonucleotide unter Anwendung bekannter Verfahren fixiert werden. Substrate und einen Farbstoff bildende Zusammensetzungen für derartige Enzyme sind bekannt.
Sofern es sich bei der Markierung um ein bevorzugtes Enzym, wie eine Peroxidase, handelt, werden zu einem bestimmten Testzeitpunkt Wasserstoffperoxid und geeignete, einen Farbstoff bildende Zusammensetzungen zugesetzt, um einen nachweisbaren Farbstoff zu erzeugen. Besonders geeignete, einen Farbstoff erzeugende Zusammensetzungen sind in US-A- 5 024 935 beschrieben.
Der Nachweis der Anwesenheit der Sonde, die sich im komplementären Produkt befindet, kann unter Anwendung bekannter geeigneter Nachweisvorrichtungen und Verfahren vorgenommen werden. Bestimmte Sonden können für das Auge ohne Anwendung einer Nachweiseinrichtung sichtbar sein.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein Primer biotinyliert und die amplifizierte Nucleinsäure unter Verwendung eines nachweisbar markierten Avidins oder eines Derivats davon nachgewiesen. Beispielsweise kann Avidin mit einem Enzym konjugiert werden oder einen radioaktiven Rest aufweisen. Biotin am amplifizierten Produkt bildet einen Komplex mit Avidin, wobei entsprechende Nachweistechniken herangezogen werden.
Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren in einem geeigneten Behälter durchgeführt werden. Die einfachsten Behälter sind Teströhrchen, Küvetten, Kolben oder Bechergläser, wobei aber auch kompliziertere Behälter entworfen wurden, um automatisierte Vorgehensweisen zur Durchführung des Verfahrens zu erleichtern. Beispielsweise wird in US-A-4 902 624 eine Küvette beschrieben, die so konstruiert ist, daß sie bei der praktischen Durchführung des Verfahrens bestimmte Temperaturcharakteristika erfüllt. Geeignete Testpackungen weisen eine Mehrzahl von Reaktionskammern mit verschiedenen Reagenzien, Puffern und anderen Materialien auf, die in verschiedenen Stufen des Amplifikationsverfahrens eingesetzt werden können. Die Packungen können während der Zyklen in geeigneter Weise und rasch erwärmt und abgekühlt werden, um die verschiedenen Stufen des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens zu fördern. Weitere geeignete Behälter können in geeigneter Weise für eine automatisierte oder einmalige Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens entworfen werden.
Um das amplifizierte Produkt nachzuweisen, ist es häufig wertvoll (aber nicht notwendig), es von den übrigen Materialien im Reaktionsmedium abzutrennen. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, wobei man sich einer wasserunlöslichen Abfangeinrichtung an einem Primer oder einer Sonde bedient, so daß die Primer-Extensionsprodukte, die im Verfahren repliziert werden, wasserunlöslich gemacht und aus dem Reagenzgemisch entfernt werden. Primer oder Sonden können auf geeignete Weise an unlösliche Materialien fixiert oder sie können in abfangbarer Weise konzipiert werden, d. h. sie sind mit einer Abfangeinrichtung an einer bestimmten Stelle des Verfahrens reaktiv.
Weitere geeignete Abfangeinrichtungen sind in EP-A-0 370 694 beschrieben. Ein Primer weist einen daran gebundenen spezifisch bindenden Liganden auf (z. B. Biotin, einen Antikörper oder ein Lectin), der zur spezifischen Bindung an ein Rezeptormolekül (wie Avidin, ein antigenes Material oder ein Zucker) befähigt ist, das seinerseits in geeigneter Weise an ein unlösliches Material, z. B. polymere Teilchen, gebunden ist. Das erhaltene, insolubilisierte, spezifisch gebundene Produkt kann von wasserlöslichen Materialien durch Filtration, Zentrifugation oder andere geeignete Trenntechniken abgetrennt werden. Der Nachweis des abgefangenen Nucleinsäurestrangs kann direkt erreicht werden, indem man eine hierzu komplementäre Sonde verwendet, oder er kann indirekt erfolgen, indem man sich eines oder mehrerer Zwischenoligonucleotide bedient, mit der eine markierte Sonde hybridisiert werden kann.
Alternativ kann das amplifizierte Produkt von unerwünschten Materialien abgetrennt werden, indem man sich eines dazu komplementären Oligonucleotids bedient, wobei dieses Oligonucleotid an ein unlösliches Substrat (z. B. polymere Teilchen) unter Anwendung bekannter Fixierungstechniken fixiert ist. Eine derartige Technik ist in EP-A-0 439 222 beschrieben. Weitere Techniken sind beispielsweise in US-A-4 713 326, WO-A- 88/01302 und EP-B-0 070 687 beschrieben, so daß Zwischenoligonucleotide in einem hybridisierten Produkt aus Mehrfachkomponenten, an die das Abfangoligonucleotid und amplifizierte Nucleinsäuren gebunden werden, verwendet werden.
Geeignete Trenneinrichtungen sind mikroporöse Filtrationsmembranen, z. B. Polyamidmembranen der Fa. Pall Corporation.
Die Membranen können als ein getrenntes Substrat mit zur Durchführung anderer Stufen des Tests geeigneten Behältern eingesetzt werden. Vorzugsweise sind sie jedoch als ein Teil einer Testvorrichtung angebracht. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, beispielsweise aus US-A-3 825 410, US-A-3 888 629, US-A-3 970 429 und US-A-4 446 232. Besonders geeignete Vorrichtungen sind in US-A- 4 921 677 beschrieben.
Für die Trennung des wasserunlöslichen Produkts für Nachweiszwecke können beliebige geeignete feste Träger verwendet werden, beispielsweise Mikrotiterplatten, Teströhrchen, Bechergläser, Kügelchen, Filme, Membranfilter, Filterpapiere, Gele, magnetische Teilchen oder Glaswolle. Bei besonders geeigneten festen Trägermaterialien handelt es sich um polymere Kügelchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 0,1 bis 10 um.
Der Nachweis kann auch durch Immobilisieren einer Abfangsonde an einem ebenen Substrat, z. B. an mikroporösen Filtrationsmembranen gemäß den vorstehenden Ausführungen, oder an dünnen polymeren Filmen, unbeschichteten Papieren oder mit einem Polymeren beschichteten Papieren, für die aus dem Stand der Technik zahlreiche Beispiele bekannt sind, durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten über derartige Materialien finden sich in EP-A-0 408 738.
Die folgenden Beispiele erläutern die praktische Durchführung der Erfindung und sind in keiner Weise als beschränkend anzusehen. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich, sofern nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht.
Eine Perkin-Elmer-Cetus-Thermocyclisiervorrichtung (Perkin-Elmer Corporation, Bezeichnung "DNA Thermal Cycler ") wurde zusammen mit Mikrozentrifugenröhrchen-Amplifikationen eingesetzt. Die Temperaturprofile wurden unter Verwendung von mit einem Thermoelement versehenen Röhrchen geprüft. Mineralöl wurde oben auf das Polymerase-Kettenreaktionsgemisch aufgesetzt, um eine Verdampfung und Kondensation zu verhindern.
Amplifikationen mit chemischen Testpackungen wurden unter Verwendung eines doppelseitigen Heizgeräts und eines Prozessors gemäß EP-A-0 402 994 durchgeführt. Mit Thermoelementen versehene Kammern in den chemischen Testpackungen wurden zur Uberwachung der Temperaturen herangezogen. Diese Kammern waren aus einer Polyesterfolie (0,01 cm Dicke), die mit Polyethylen beschichtet war, gebildet, wobei sie über eine kreisförmige Kammer (gelegentlich als "Blister" bezeichnet) von 1,3 cm Durchmesser gefaltet war. Eine Öffnung war vorgesehen, um die Zugabe des Polymerase-Kettenreaktionsgemisches zu ermöglichen. Dieses Gemisch wurde unter Vakuum in die Kammer gezogen. Die Öffnung wurde sodann durch Heißsiegeln verschlossen. Nach der Amplifikation wurde eine Ecke der Kammer abgeschnitten, und die Lösung wurde auf ein Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 ml) übertragen und bei 4ºC gelagert, bis der Nachweis der Produkte erfolgte.
Das Polymerase-Kettenreaktionsgemisch (100 ml) enthielt Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer (10 mM, pH-Wert 8), Kaliumchlorid (50 mM), Magnesiumchlorid (10 mM) dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 1,5 mM), Primer (nachstehend angegeben, jeweils 1 um), Gelatine (0,01%), thermostabile DNA-Polymerase (aus Thermus aquaticus), rekombinantes Produkt der Fa. Cetus Corp. (75 U/100 ml).
Für den HIV-I-DNA-Nachweis wurden folgende Primer, die komplementär mit der gag-Region des Virus waren, herangezogen:
SEQ ID NR: 1:
5'-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3' und
SEQ ID NR: 2:
5'-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3'
worin X ein Biotin, das über eine Aminotetraethylenglykol-Abstandshaltergruppe unter Anwendung des in US-A-4 962 029 beschriebenen Verfahrens angebracht ist.
Folgende, zu den Strängen von β-Globin-DNA komplementäre Primer wurden verwendet:
SEQ ID NR: 3:
5'-X-CAACTTCATC CACGTTCACC-3' und
SEQ ID NR: 4:
5' -ACACAACTGT GTTCACTAGC-3'
worin X die vorstehend beschriebene Bedeutung hat.
Sämtliche Primer und Sonden wurden gemäß standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie hergestellt, durch Hochdruck-Flüssigchromatographie gereinigt und durch Analyse der Basenzusammensetzung und durch Elektrophorese- Hochdruck-Flüssigchromatographie charakterisiert.
Die Abfangsonde für HIV-I-DNA wies folgende Sequenz auf (SEQ ID NR: 5):
5'-X-ATCCTGGAAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-3'
worin X die vorstehend für die Primer definierte Bedeutung hat.
Die Abfangsonde für β-Globin-DNA wies folgende Sequenz auf (SEQ ID NR: 6):
5'-X-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C-3'
worin X die vorstehend definierte Bedeutung hat.
Die Sonden wurden an Teilchen aus Poly-(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 97,5:2,5, durchschnittlicher Durchmesser 1,3 um) fixiert. Eine Suspension (1%) der Teilchen in Glycinpuffer (0,1 M, pH-Wert 8,5) wurde 2 mal mit 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure-Puffer (0,1 M, pH-Wert 6) gewaschen. Eine Probe der gewaschenen Teilchen (30 mg) in Puffer (1 ml) wurde mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (0,15 ml 100 mg/ml Puffer) und der entsprechenden Sonde (28,8 ml mit 57,3 OD/ml nanopurem Wasser) vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden über die Enden hinweg rotiert und sodann zentrifugiert. Die Teilchen wurden 3 mal mit nanoreinem Wasser gewaschen und darin suspendiert (1% Feststoffe).
Bei den HIV-I-DNA-Zielnucleinsäuresequenzen handelte es sich entweder um M13/HIV (ein Segment mit 180 Basenpaaren von HIV-I, das gemäß standardmäßigen Verfahren im M13-Phagen geklont war) oder um HUT 78- Zellinien-DNA (eine Zellinie, die eine einzelne, integrierte Kopie des HIV-I-Genoms enthält) . Diese Zielnucleinsequenzen wurden gemäß standardmäßigen DNA-Reinigungsverfahren zubereitet.
Die β-Globin-DNA-Zielnucleinsäuresequenz befand sich in humaner Placenta-DNA (10 mg/ml), von der angenommen wird, daß sie zwei Kopien des β- Globin-Gens pro Zelle aufweist.
Der Nachweis der amplifizierten Nucleinsäure wurde entweder durch Agarose-Gelelektrophorese (3% NUSIEVE -Agarose und 1% Agarose, gefärbt mit Ethidiumbromid) oder durch Abfangen und Nachweisen in einer SURECELL -Einmaltestvorrichtung und Abfangen mit der Abfangsonde durchgeführt.
Eine Salz-Puffer-Lösung (250 ml) enthielt Natriumdihydrogenphosphat (10 mM, pH-Wert 7,4), Natriumchlorid (150 mM) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mM)
Eine Leukofarbstoff-Zusammensetzung mit einem Gehalt an 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis-(4-methoxyphenyl)-imidazol wurde auf folgende Weise hergestellt:
Fester Leukofarbstoff (zur Herstellung einer 0,1% Lösung) wurde in einer Lösung von Poly-(vinylpyrrolidon) (20%) in Natriumphosphatpuffer (5 mM) gelöst. Diese Lösung wurde sodann zu einer Lösung von Wasserstoffperoxid (10 mM), 4'-Hydroxyacetanilid als Elektronenübertragungsmittel (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure als chelatbildendem Mittel (10 mM) in Natriumphosphatpuffer versetzt, wodurch sich eine endgültige Konzentration von 1% Polymerem und 0,005% Leukofarbstoff ergab.
Ein Streptavidin-Meerrettich-peroxidase-Konjugat wurde von der Fa. Zymed Labs bezogen und 1:8000 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Casein (0,5%), 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäurepuffer (100 mM, pH-Wert 7,5) und Thimerosal-Konservierungsmittel (0,01%) verdünnt. Die endgültige Konjugatkonzentration betrug 156 ng/ml. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthielt Natriumphosphat (25 mM, pH-Wert 7,3) und Natriumchlorid (75 mM).
Die Polymerase-Kettenreaktion wurde entweder in Mikrozentrifugenröhrchen (100 ml) oder in chemischen Testpackungen (180 ml) gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt. Die Polymerase-Kettenreaktionslösung mit einem Gehalt an HIV-I-DNA-Ziel (10&supmin;¹&sup6; M) und den entsprechenden Primern wurde für die in den Beispielen angegebenen Zykluszahlen mit den angegebenen Temperaturstufen amplifiziert.
Bei den Tests, bei denen die SURECELL -Einmaltestvorrichtungen verwendet wurden, wurden die Sonden an den polymeren Teilchen (1 ml, 1% Suspension) in definierten Regionen der mikroporösen Membranen (unbeschichtet, 5 mm LOPRODYNER -Nylon) in den Testvorrichtungen abgelegt
und getrocknet. Ein Teil der Polymerase-Kettenreaktionslösung (5 ml) wurde mit der Pufferlösung (95 ml) vermischt und 5 Minuten bei 95ºC inkubiert, um die Nucleinsäuren zu denaturieren. Sodann wurde die Lösung auf Testvorrichtungen übertragen, um die amplifizierte Zielnucleinsäure mit der immobilisierten Probe an der Membran bei 42ºC zu hybridisieren. Die Testvertiefungen der Vorrichtungen wurden mit einer Lösung (250 ml) mit einem Gehalt an Natriumdecylsulfat (1%) in Salz-Puffer-Lösung bei 55ºC gewaschen. Eine gepufferte Lösung mit einem Gehalt an dem Streptavidin- Konjugat (50 ml mit einem Gehalt an 7,8 ng Konjugat) wurde bei Raumtemperatur zugegeben und zum Fließen durch die Membranen gebracht. Nach 2 Minuten wurden die Testvertiefungen erneut gewaschen. Die Leukofarbstoff- Zusammensetzung (50 ml) wurde zugegeben. Die Vorrichtungen wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Natriumazidlösung (0,1%) wurde zugesetzt. Der Farbstoff an den Membranen wurde visuell an einer Dichteskala von 0 bis 10 (höchste Dichte) bewertet. Die Hintergrundablesungen wurden von Regionen an der Membran in der Umgebung der die Sonden enthaltenden Testregionen vorgenommen.
Die Gelelektrophorese wurde durchgeführt, indem man das Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an der amplifizierten Zielnucleinsäure (6 ml) zu Agarosegelen (4%) gab, die mit Ethidiumbromid (4 ml, 10 mg/ml) vorgefärbt worden waren. Die Gele wurden 1 Stunde einer Elektrophorese bei 160 V/cm unter Verwendung eines Elektrophoresepuffers (600 ml) mit einem Gehalt an Ethidiumbromid (24 ml) unterworfen. Beim Puffer handelte es sich um ein Gemisch aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Borat und Ethylendiamintetraessigsäure. Die erzielten Banden wurden mit Molekulargewichtsmarkern verglichen. Die Intensität der Produktbande wurde entsprechend der Skala (-, w=, w, w+, +, ++ und +++) bewertet (115-mer für HIV-I-DNA und 110-mer für β-Globin), wobei (-) das schwächste Signal und (+++) das stärkste Signal darstellte.

Beispiele 1-2

Aplifikationsvergleiche

Diese Beispiele vergleichen das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von HIV-I-DNA (gag-Region) unter Amplifikation der gleichen Zielnucleinsäure bei Anwendung eines standardmäßigen Verfahrens, das beispielsweise in US-A-4 965 188 beschrieben ist.
Drei Kontrollverfahren wurden so durchgeführt, daß die Amplifikation in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt wurde. Die Kontrolle A benötigte 350 Sekunden für einen Amplifikationszyklus (Stufen B-D) und umfaßte die folgenden Stufen (die hier nicht aufgeführten Zeitspannen dienten für die Erwärmungs- und Abkühlphasen der Stufen):
Stufe A: Die Zielstränge wurden etwa 30 Sekunden bei 95ºC denaturiert.
Stufe B: Die denaturierten Stränge wurden abgekühlt und etwa 30 Sekunden bei 55ºC belassen, um die Hybridisierung mit den Primern hervorzurufen.
Stufe C: Das Gemisch wurde auf 70ºC erwärmt und etwa 60 Sekunden bei dieser Temperatur belassen, um Primer-Extensionsprodukte zu bilden.
Stufe D: Die erhaltenen hybridisierten Produkte wurden durch eine Erwärmung von etwa 60 Sekunden auf 95ºC denaturiert und etwa 30 Sekunden bei dieser Temperatur belassen.
Stufe E: Die Stufen B bis D wurden 31 mal wiederholt.
Stufe F: Der Nachweis der amplifizierten Ziel-HIV-I-DNA wurde in SURECELL Einwegtestvorrichtungen unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Die Kontrolle B war ähnlich. Sie erforderte etwa 240 Sekunden für einen Amplifikationszyklus und umfaßte die folgenden Stufen: Stufe A: Die Zielstränge wurden etwa 15 Sekunden bei 95ºC denaturiert.
Stufe B: Die denaturierten Stränge wurden auf 53ºC abgekühlt und etwa 30 Sekunden bei dieser Temperatur belassen, um ihre Hybridisierung mit den Primern zu veranlassen.
Stufe C: Das Gemisch wurde auf 68ºC erwärmt und etwa 30 Sekunden bei dieser Temperatur belassen, um Primer-Extensionsprodukte zu bilden.
Stufe D: Die erhaltenen hybridisierten Produkte wurden durch Erwärmen auf 95ºC und durch Beibehalten dieser Temperatur für etwa 15 Sekunden denaturiert.
Stufe E: Die Stufen B bis D wurden 31 mal wiederholt.
Stufe F: Der Nachweis der amplifizierten Ziel-HIV-I-DNA wurde in SURECELL -Einwegtestvorrichtungen unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Bei der Kontrolle C wurde die Amplifikation unter Anwendung der folgenden Stufen und einer Amplifikationszykluszeit (Stufen B-D) von etwa 130 Sekunden durchgeführt:
Stufe A: Die Zielstränge wurden etwa 15 Sekunden bei 95ºC denaturiert.
Stufe B. Die denaturierten Stränge wurden innerhalb von etwa 50 Sekunden auf 65ºC abgekühlt.
Stufe C: Das Reaktionsgemisch wurde etwa 15 Sekunden bei 65ºC belassen, um Primer-Extensionsprodukte zu bilden.
Stufe D: Die erhaltenen hybridisierten Produkte wurden durch Erwärmen auf 95ºC in einer Zeitspanne von etwa 50 Sekunden denaturiert und 15 Sekunden bei dieser Temperatur belassen.
Stufe E: Die Stufen B bis D wurden 31 mal wiederholt.
Stufe F: Der Nachweis der amplifizierten Ziel-HIV-I-DNA wurde in Mikrozentrifugenröhrchen gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt.
Das Beispiel 1 war ähnlich dem Kontrollversuch 0, mit der Ausnahme, daß die Amplifikationszykluszeit etwa 100 Sekunden betrug, wobei für die Stufen B-D die folgenden Zeiten galten:
Stufe B: etwa 49 Sekunden
Stufe C: etwa 1 Sekunde
Stufe D: etwa 49 Sekunden erwärmen und belassen bei dieser Temperatur für 1 Sekunde.
Das Beispiel 2 wurde in ähnlicher Weise durchgeführt, wobei aber für die Amplifikation Testpackungen verwendet wurden. Die Amplifikationszykluszeit betrug etwa 59 Sekunden, wobei für die Stufen B-D die folgenden Zeiten und Temperaturen galten:
Stufe B: etwa 9 Sekunden Abkühlung auf 66ºC
Stufe 0: etwa 40 Sekunden bei 66ºC
Stufe D: etwa 9 Sekunden erwärmen auf 94ºC und aufrechterhalten bei dieser Temperatur für 1 Sekunde. Tabelle I
Die amplifizierten Produkte wurden auf die vorstehend beschriebene Weise nachgewiesen. Die Werte der visuellen Dichte sind in der vorstehenden Tabelle I aufgeführt. Die Signale wurden bei unterschiedlicher Anzahl von "Kopien" bewertet, die sich auf die Anzahl der Zielnucleinsäure-Moleküle pro 100 ul Reaktionsvolumen beziehen. Die Beispiele 1-2 belegen, daß eine wesentlich raschere Amplifikationszykluszeit zur Erzielung einer hohen Signaldichte unter erheblicher Verringerung des Hintergrunds herangezogen werden kann. Die Kontrollverfahren benötigen längere Zykluszeiten um dichte Signale zu erhalten, wobei in zahlreichen Fällen höhere Hintergrundwerte gegeben sind.

Beispiele 3 und 4

Amplifikation und Nachweis von HIV-I-DNA

Diese Beispiele bringen einen Vergleich eines standardmäßigen Amplifikations- und Nachweisverfahrens ähnlich den Kontrollen der vorstehenden Beispiele bei Durchführung in Mikrozentrifugenröhrchen mit den erfindungsgemäßen Verfahren bei extrem kurzen Zykluszeiten in einer chemischen Testpackung gemäß der vorstehenden Beschreibung. Bei der Zielnucleinsäure handelt es sich um HIV-I-DNA in den zwei Konzentrationen: 5 x 10&supmin;&sup5; M und 1 x 10&supmin;¹&sup6; M. 30 Amplifikationszyklen wurden durchgeführt. Der Nachweis erfolgte entweder unter Verwendung von Abfangsonden in SURECELL -Testvorrichtungen oder durch Gelelektrophorese. Ein Perkin-Elmer-Cetus-Thermocydisiergerät (Bezeichnung "DNA Thermal Cycler ") wurde beim Kontrollverfahren verwendet, während beim erfindungsgemäßen Verfahren der Thermoprozessor gemäß EP-A-0 402 994 eingesetzt wurde.
Das Kontrollverfahren wies die gleichen Stufen wie bei der vorstehenden Kontrolle A (in den Beispielen 1-2) auf. Somit betrug die Temperatur für die Stufe B 55ºC und für die Stufe C 70ºC.
Ein Vergleichsverfahren (Beispiel 3) wurde bei 94ºC jeweils für die Stufen A und D, bei 50ºC oder 60ºC (nur 49 Sekunden Zykluszeit) für die Stufe B und bei 70ºC für die Stufe C durchgeführt. Die Zykluszeiten (Stufen B bis D) variierten von 49 bis 67 Sekunden.
Das erfindungsgemäße Verfahren (Beispiel 4) wies die in Beispiel 1 angegebenen Stufen auf, so daß die Temperatur bei den Stufen A und D 94ºC und bei den Stufen B und C 65ºC betrug (ausgenommen der Test mit einer Zykluszeit von etwa 22,5 Sekunden, bei dem die Denaturierungstemperatur 92ºC betrug).
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt. Es ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine hochempfindliche Polymerase-Kettenreaktionsamplifikation bei sehr kurzen Zykluszeiten ermöglichte, während das bekannte Kontrollverfahren wesentlich mehr Zeit und mehr Arbeitsaufwand bei den Temperatureinstellungen erforderte. Tabelle II
*Nachweis durch Gelelektrophorese
**Nachweis in einer SureCell -Testvorrichtung unter Verwendung einer Abfangsonde

Beispiel 5

Vergleichstests unter Verwendung von Testpackungen

Dieses Vergleichsbeispiel ist ähnlich dem von Beispiel 4, mit der Ausnahme, daß sämtliche Tests unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion in Testpackungen durchgeführt wurden und die Amplifikationseinrichtung gemäß EP-A-0 402 995 herangezogen wurde. Zwei Zielnucleinsäuren wurden nachgewiesen: M13/HIV-I-DNA (5 x 10&supmin;&sup5; M) und HUT 78-Zellinien-DNA (5000 Kopien/ml). 30 Amplifikationszyklen wurden durchgeführt.
Beim Kontroliverfahren wurde für die Denaturierung eine Temperatur von 94ºC, für die Anellierungsstufe eine Temperatur von 53ºC und für die Primererweiterung eine Temperatur von 68ºC angewandt. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde bei mehreren Temperaturen, die in der nachstehenden Tabelle III angegeben sind, durchgeführt (die erste Temperatur in der Spalte gilt für die Stufen A und D und die zweite Temperatur für die Stufen B und C). Tabelle III
*Nachweis durch Gelelektrophorese
** Nachweis in einer SureCell -Testvorrichtung unter Verwendung einer Abfangsonde
(v) Die erste Temperatur bezeichnet die Denaturierung und die zweite Temperatur die Anellierung und Primererweiterung.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt und zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung von Amplifikationszykluszeiten von nur 18 Sekunden durchgeführt werden kann.

Beispiel 6

Vergleichsbeispiel unter Verwendung von verschiedenen Mengen an thermostabiler DNA-Polymerase

Dieses Beispiel ist ähnlich wie Beispiel 4. Vergleichstests wurden unter Verwendung von Mikrozentrifugenröhrchen und längeren Zykluszeiten sowie mit chemischen Testpackungen und kürzeren Zykluszeiten durchgeführt. Ferner wurden verschiedene Konzentrationen der thermostabilen DNA- Polymerase sowohl in Mikrozentrifugenröhrchen als auch in chemischen Testpackungen verglichen.
Bei der Zielnucleinsäure handelte es sich um HIV-I-DNA aus der gag- Region, die in einer Konzentration von etwa 5000 Kopien/100 ul vorlag. Die Amplifikation wurde bei jedem Test unter Anwendung von 36 Zyklen durchgeführt. Der Nachweis der amplifizierten Produkte wurde entweder durch Messung des Farbstoffsignals (gemäß den vorstehenden Angaben) mit wasserunlöslichen Abfangsonden in einer SURECELL -Testvorrichtung oder durch Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Eine handelsübliche Vorrichtung (mit der Bezeichnung "DNA Thermal Cycler , der Fa. Perkin Elmer Cetus) wurde für die Amplifikationsverfahren unter Verwendung der Mikrozentrifugenröhrchen verwendet, während ein Thermocyclisiergerät gemäß den Angaben in EP-A-0 402 994 für die chemischen Testpackungen eingesetzt wurde. In der nachstehenden Tabelle IV sind die Konzentrationen der verwendeten thermostabilen DNA-Polymerase aufgeführt.
Sämtliche Kontrolltests in Röhrchen wurden wie die Kontrolle B der Beispiele 1-2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Stufen A und D bei 94ºC abliefen. Ferner gelten für diese Kontrolltests folgende Angaben: Die Stufen B bis D wurden 35 mal wiederholt (Stufe E), die Stufe A erforderte 15 Sekunden, die Stufe D erforderte 60 Sekunden, um die gewünschte Temperatur zu erreichen, die dann weitere 15 Sekunden aufrechterhalten wurde, die Stufe B erforderte 30 Sekunden und die Stufe C erforderte 30 Sekunden. Die gesamte Zykluszeit für die Kontrolltests betrug etwa 240 Sekunden pro Zyklus, wobei die Erwärmungs- und Abkühlungstemperaturen so rasch eingestellt wurden, wie es die Thermocyclisiervorrichtung zuließ.
In den erfindungsgemäßen Tests wurden die Stufen A bis D gemäß den Angaben in Beispiel 2 durchgeführt, wobei die Stufen B bis D 35 mal wiederholt wurden. Die Stufen A und D wurden bei 94ºC durchgeführt und benötigten bis zum Erreichen der Temperatur jeweils 11 Sekunden, wobei diese Temperatur weitere 3 Sekunden aufrechterhalten wurde. Die Stufe B benötigte etwa 11 Sekunden zur Abkühlung des Reaktionsgemisches auf 65ºC. Die Stufe C zur Bildung des Primererweiterungsprodukts wurde bei der gleichen Temperatur 5 Sekunden durchgeführt. Die Gesamtzeit für die einzelnen Zyklen betrug etwa 30 Sekunden. Die in chemischen Testpackungen unter Verwendung geringer Mengen an DNA-Polymerase durchgeführten Tests wurden ebenfalls unter Anwendung von Zykluszeiten von 30 Sekunden durchgeführt, wobei aber, wie die Ergebnisse zeigen, die rasche Zykluszeit allein nicht ausreichte, die gewünschten Ergebnisse zu erzielen.
Die in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß die amplifizierte Zielnucleinsäure entweder mit Abfangsonden (Messung des Farbstoffsignals) oder durch Gelelektrophorese bei Heranziehung der vorstehend beschriebenen Ergebnisbewertung nachgewiesen werden konnten. Außerdem ergaben Tests mit rascheren Cyclisierungszeiten einen akzeptablen Nachweis von amplifizierten Produkten nur bei DNA-Polymerase-Konzentrationen von mehr als 6 Einheiten/100 ul. Raschere Zykluszeiten bei geringen DNA-Polymerase-Konzentrationen führten zu inakzeptablen Ergebnissen. Tabelle IV

Beispiel 7

Vergleich von Amplifikationsverfahren unter Verwendung verschiedener Primerkonzentrationen

Dieses Beispiel ist ähnlich wie Beispiel 6, mit der Ausnahme, daß sämtliche Tests in chemischen Testpackungen durchgeführt wurden. Bei der Zielnucleinsäure handelte es sich um HIV-I-DNA aus der HUT-Zellinie. Sie war in einer Konzentration von 5000 Kopien/100 ul vorhanden. Bei der DNA- Polymerase handelte es sich um das vorstehend erwähnte Produkt, das in einer Konzentration von 7,5 Einheiten/100 ul vorhanden war. Die Primerkonzentration variierte von 0,01 bis 10 uM. Jede Amplifikation wurde in 30 Zyklen der Stufen B-D durchgeführt.
Das Amplifikationsverfahren für die Kontrolltests erforderte eine Zykluszeit von 160 Sekunden. Die Bedingungen der Stufen waren die gleichen wie in Beispiel 6, mit der Ausnahme, daß die Stufen A und D bei 94ºC durchgeführt wurden und jeweils etwa 12 Sekunden bis zum Erreichen dieser Temperatur, die dann 1 Sekunde aufrechterhalten wurde, benötigten. Die Stufe B erforderte die Abkühlung des Gemisches auf 66ºC innerhalb einer Zeitspanne von etwa 12 Sekunden. In der Stufe C wurde diese Temperatur 135 Sekunden aufrechterhalten. Die Stufen B bis D wurden 29 mal wiederholt.
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde in identischer Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Gesamtzykluszeit 38,5 Sekunden betrug. Bei den Stufen A und D wurden jeweils etwa 9 Sekunden bis zum Erreichen von 94ºC benötigt. Diese Temperatur wurde 1 Sekunde aufrechterhalten. Bei der Stufe B waren zum Abkühlen auf 66ºC etwa 9 Sekunden erforderlich. In der Stufe C wurde diese Temperatur 20 Sekunden aufrechterhalten. Die Stufen B bis D wurden 29 mal wiederholt.
Eine weitere Amplifikation wurde unter Verwendung einer sehr geringen Primerkonzentration, d. h. 0,01 um, bei einer Zykluszeit von 38,5 Sekunden durchgeführt, wobei aber aufgrund des raschen Verlaufs der Zykluszeit schlechtere Ergebnisse erzielt wurden.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß ein akzeptables Signal unter Verwendung von Primerkonzentrationen von mehr als etwa 0,075 um bei der sehr raschen Zykluszeit von 38,5 Sekunden erzielt werden konnte. Die Primerkonzentration von 0,1 um ergab in diesem Fall kein akzeptables Signal, wobei aber längere Zykluszeiten, die immer noch unter 120 Sekunden liegen, beispielsweise 60 bis 120 Sekunden, vermutlich eine akzeptable Amplifikation ergeben würden. Die mit 160 Sekunden durchgeführten Kontrolltests ergaben bei sämtlichen Primerkonzentrationen (ausgenommen die niedrigste Konzentration) ein gutes Signal. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß der Fachmann leicht dazu in der Lage sein sollte, die optimalen Bedingungen für eine gegebene Primerkonzentration und eine gegebene Zykluszeit festzulegen, um erfindungsgemäß in akzeptabler Weise eine Amplifikation und einen Nachweis zu erreichen. Tabelle V
Erfindung = 38,5 Sekunden pro Zyklus
Kontrollen = 160 Sekunden pro Zyklus

Beispiel 8

Vergleich von Primerkonzentrationen für Amplifikationsverfahren Dieses Beispiel ist ähnlich wie Beispiel 7, mit der Ausnahme, daß bezüglich der Reaktantengase und der Vorgehensweise einige Änderungen vorgenommen wurden. Sämtliche Tests wurden für die Stufen B bis D mit 30 Zyklen durchgeführt. Bei der Zielnucleinsäure handelte es sich um β-Globin-DNA aus humaner Placenta-DNA. Bei den Primern handelte es sich um die vorstehend beschriebenen Primer, die in verschiedenen Konzentrationen vorhanden waren. HIV-I-DNA (HUT-Zellinie mit 5000 Kopien/100 ul) war ebenfalls vorhanden und wurde in sämtlichen Tests unter Verwendung einer Primerkonzentration von 1 uM amplifiziert.
Bei diesen Tests wurden die Stufen A und D jeweils bei 94ºC durchgeführt, wobei etwa 9 Sekunden bis zum Erreichen dieser Temperatur erforderlich waren. Diese Temperatur wurde sodann 3 Sekunden aufrechterhalten. Für die Stufe B waren etwa 9 Sekunden erforderlich, um das Gemisch auf 66ºC abzukühlen. Die Stufe C wurde bei der gleichen Temperatur durchgeführt, wobei aber die Zeitspanne für die Produktbildung bis zu 120 Sekunden für die vorliegende Erfindung und bis zu 140,5 Sekunden für die Kontrolltests variierte.
Die Ergebnisse sowohl in bezug auf das Farbstoffsignal als auch auf die Gelelektrophorese sind in der nachstehenden Tabelle VI unter Bezugnahme auf die Amplifikation und den Nachweis der β-Globin-DNA aufgeführt. Es ist ersichtlich, daß eine Primerkonzentration unter 0,075 pM für die vorliegende Erfindung unter Anwendung kurzer Zykluszeiten keine akzeptablen Ergebnisse für Amplifikation und Nachweis ergab. In den Kontrolltests unter Anwendung unerwünscht langer Zykluszeiten wurde ein Signal erhalten. Die Primerkonzentration von 0,1 ul ergibt bei einer Zykluszeit von 60,5 Sekunden ein akzeptables Signal, jedoch nicht bei einer Zykluszeit von 40,5 Sekunden. Dies zeigt, daß der Fachmann im Rahmen der erfindungsgemäßen Praxis leicht Zykluszeiten, Primerkonzentrationen und andere erfindungsgemäße Parameter einstellen kann, um akzeptable Ergebnisse unter Anwendung wesentlich rascherer Zykluszeiten zu erhalten. Tabelle VI

Claims

1. Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure, umfassend folgende Stufen:

A. das Erwärmen einer doppelsträngigen Zielnucleinsäure auf eine (h erste Temperatur von 85 bis 100ºC für 1 bis 40 Sekunden, um die Stränge der Nucleinsäure zu denaturieren,

B. das Abkühlen der denaturierten Stränge auf eine zweite Temperatur für eine Zeitspanne von 5 bis 20 Sekunden,

C. in Gegenwart von

1) einer thermostabilen DNA-Polymerase, die in einer Menge von mindestens 5 Einheiten/100 ul der Lösung vorhanden ist,

2) Desoxyribonucleosid-5'-triphospaten, die in für die DNA- Polymerisation wirksamen Mengen vorhanden sind, und

3) einem Satz von Primern, die für die denaturierten Stränge spezifisch sind, wobei die Primer in für die DNA-Polymerisation wirksamen Mengen vorhanden sind,

das Bilden von hybridisierten Primer-Extensionsprodukten aus den Primern und den denaturierten Strängen durch Inkubieren der denaturierten Stränge bei der zweiten Temperatur für 1 bis 80 Sekunden,

wobei die zweite Temperatur im Bereich von (Tm-15)ºC bis (Tm+5)ºC liegt, wobei Tm die Schmelztemperatur der denaturierten Stränge und der Primer ist und die Differenz (AT) zwischen der ersten und zweiten Temperatur 5 bis 45ºC beträgt,

D. das Erwärmen der hybridisierten Primer-Extensionsprodukte auf die erste Temperatur für eine Zeitspanne von 5 bis 20 Sekunden und das Belassen der Produkte bei dieser Temperatur für 1 bis 40 Sekunden und

E. das mindestens einmalige Wiederholen der Stufen B bis D in sequenzieller Weise als ein Zyklus, wobei jeder Zyklus der Stufen B bis D innerhalb einer Zeitspanne bis zu 120 Sekunden durchgeführt wird, mit der Maßgabe, daß dann, wenn die Konzentration der einzelnen Primer unter etwa 0,075 mikromolar ist, die Zeitspanne für jeden Zyklus der Stufen B bis D mindestens 60 Sekunden beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die folgende zusätzlich Stufe:

F. das Nachweisen von mindestens einem denaturierten Strang der amplifizierten Nucleinsäure.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei einer der Primer biotinyliert ist und der Nachweis in Stufe F durchgeführt wird, indem man den erhaltenen amplifizierten, biotinylierten Strang unter Verwendung von Avidin, das an ein festes Substrat gebunden ist, abfängt und den abgefangenen Strang direkt oder indirekt mit einer markierten Sonde nachweist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei einer der Primer biotinyliert ist und der Nachweis in Stufe F durchgeführt wird, indem man den erhaltenen amplifizierten, biotinylierten Strang unter Verwendung eines dazu komplementären, insolubilisierten Oligonucleotids abfängt und den biotinylierten Strang mit nachweisbar markiertem Avidin komplexiert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Amplifikation von viraler oder bakterieller DNA.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Erwärmungsstufe A bei einer Temperatur von 90 bis 98ºC für eine Zeitspanne von 1 bis 20 Sekunden durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Stufe D bei einer Temperatur von 90 bis 98ºC durchgeführt wird und die Zeitspanne zum Erwärmen auf die Temperatur 5 bis 10 Sekunden und die Zeitspanne zur Aufrechterhaltung der Temperatur 1 bis 15 Sekunden beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zweite Temperatur 55 bis 70ºC beträgt und die Stufe 0 6 bis 55 Sekunden durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei jeder Zyklus der Stufen B bis D innerhalb von 20 bis 90 Sekunden durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die thermostabile DNA-Polymerase in einer Konzentration von 6 bis 20 Einheiten/100 ul der Lösung vorhanden ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei AT 15 bis 45ºC beträgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei AT 20 bis 35ºC beträgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Konzentration der einzelnen Primer 0,1 bis 2 mikromolar ist.