DE69434688T2

DE69434688T2 - Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase

Info

Publication number: DE69434688T2
Application number: DE69434688T
Authority: DE
Inventors: Sanjay New York TYAGI
Original assignee: Public Health Research Institute of City of New York Inc
Current assignee: Medicine And Dentistry Of Ne Us, University of
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-14
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2014-01-15
Also published as: EP0682715A4; JPH08505532A; EP0682715A1; JP4108741B2; EP0682715B1; US5807674A; WO1994016106A1; DE69434688D1; AU6027794A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäurehybridisierungsassays zur Detektion von RNA. Solche Assays sind allgemein anwendbar auf die Diagnose einer Krankheit oder von Beschwerden bei Menschen und Tieren, Assays für Pathogene in biologischen Proben und Assays für einen Organismus oder Virus in Nahrungsmitteln, landwirtschaftlichen Erzeugnissen oder der Umgebung.
Hintergrund der Erfindung
Es sind Nukleinsäurehybridisierungsassays verschiedener Arten bekannt. Es gibt einige Assays, die ein DNA-Sondenpaar und einen Schritt zur Ligation der Sonden mit einer DNA-Ligase anwenden, wobei es zur Ligation erforderlich ist, dass die Sonden zueinander benachbart auf einem Target hybridisiert werden. In dieser Anmeldung verwende ich den Begriff "binäres Sondenassay", um damit allgemein jedes Assay zu bezeichnen, das den Schritt der Ligation eines Sondenpaares einschließt, das zueinander benachbart an eine Zielnukleinsäure hybridisiert ist. Die Voraussetzung, dass das Sondenpaar benachbart auf einem Target hybridisiert wird bedeutet, dass die Ligation "targetabhängig" ist. Ich bezeichne das Sondenpaar als "binäre Reportersonden" oder "binäre Sonden".
Ein binäres Sondenassay ist die Ligase-Kettenreaktion (ligase chain reaction "LCR") (Barany, 1991). Bei der LCR wird ein erstes Paar binärer DNA-Sonden an einen komplementären DNA-Zielstrang hybridisiert und dort durch eine DNA-gerichtete DNA-Ligase zu einem ersten ligierten Produkt ligiert, und ein zweites Paar binärer DNA-Sonden wird an das erste ligierte Produkt hybridisiert und gleichzeitig zu einem zweiten ligierten Produkt ligiert. Mittels zyklischen Durchlaufens der Reaktionstemperatur werden Schmelzschritte, das Annealing der Sonden und die Ligation wiederholt, um exponentiell amplifizierte Produkte zu liefern, d.h. ligierte Sonden, die dann detektiert werden. Bisweilen bezeichne ich die ligierten Sonden als ein "Reportermolekül", um sie von den Sonden an sich zu unterscheiden.
EP 439 182 offenbart Varianten der LCR, wobei sich die Sonden nicht in ligierbarer Weise auf dem Target aufreihen, wenn nicht zuvor ein targetabhängiger Schritt durchgeführt wird, entweder die Entfernung eines störenden Restes oder das Auffüllen einer Lücke. EP 439 182 regelt die Verwendung von dem durchschnittlichen Fachmann allgemein bekannten Ligationsbedingungen und Reagenzien, welche die T4-DNA-Ligase mit Sonden-/Target- Hybriden, die entweder DNA/DNA oder DNA/RNA waren, einschloss. Es gibt weder den Hinweis noch die Anweisung, die enzymgerichtete Ligation anzuwenden, wenn RNA-Sonden mit einem RNA-Target verwendet werden.
Ein weiteres binäres Sondenassay für DNA-Targets verwendet ein binäres DNA-Sondenpaar, von dem die eine Sonde dazu dient, das Target auf der Oberfläche eines Festkörpers zu immobilisieren und die andere Sonde ein radioaktives Atom oder einen fluoreszierenden Rest enthält (Landegren et al., 1988). In US-Patent Nr. 4,988,617 berichten Landegren et al., dass ihr binäres Sondenassay, das DNA- oder RNA-Sonden verwendet, auch auf RNA-Targets angewendet werden kann, die Beispiele sind jedoch auf DNA-Sonden und DNA-Targets beschränkt (Landegren & Hood, 1991). Es gibt keine Hinweise oder Anweisungen dafür, die enzymgerichtete Ligation anzuwenden, wenn RNA-Sonden mit einem RNA-Target verwendet werden.
Ein drittes Assay für DNA-Targets verwendet ein binäres DNA-Sondenpaar, von dem eine Sonde dazu dient, das Target auf der Oberfläche eines Festkörpers zu immobilisieren, wobei das Reportermolekül ein Template ist, das die exponentielle Amplifikation durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase, so wie die Bakteriophagen-Qβ-Replikase, gestattet (Martinelli et al., 1992). Das Reportermolekül kann ein DNA-Molekül sein, das selbst ein Template für Qβ-Replikase ist (direkte Amplifikation) oder es kann ein Template zur Transkription durch Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase zur Bildung eines RNA-Templates für Qβ-Replikase sein (indirekte Amplifikation).
Die oben beschriebenen Assays weisen einige hierin relevante Nachteile auf. Beispielsweise sind die meisten für DNA-Targets. Dies ist deswegen ein Nachteil, da zur Detektion geeignete RNA-Targets in den meisten Fällen in wesentlich größerer Anzahl in den Proben vorliegen als ihre entsprechenden DNA-Targets. Alle der oben genannten Assays verwenden binäre DNA-Sonden. Die LCR erfordert zur Amplifikation thermale Zyklen und einen Thermocycler sowie eine Produktanalyse, so wie Gelelektrophorese. Die binären DNA-Sondenassays von Landegren et al., 1988, und Landegren & Hood, 1991, schließen keine Amplifikation ein und sind daher keine empfindlichen Assays. In Assays, die die exponentielle Amplifikation durch Qβ-Replikase anwenden (Martinelli et al, 1992), begrenzt die Verwendung von DNA-Sonden die Empfindlichkeit: entweder wird ein zusätzlicher Transkriptionsschritt benötigt, der die Kosten erhöht, zusätzliche Zeit beansprucht und die Empfindlichkeit vermindert, oder ein DNA-Reportermolekül muss direkt amplifiziert werden, was äußerst ineffizient ist, da DNA kein natürliches Template für Qβ-Replikase ist und dadurch die Empfindlichkeit vermindert.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die Beschränkungen von existierenden binären Sondenassays, die binäre DNA-Sonden verwenden, zu überwinden.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines RNA-Sondenpaares zu ermöglichen, dessen beide Sonden in höchstem Maße spezifisch für ihr Target sind.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von höchst spezifischen binären Sonden zu ermöglichen, die, wenn sie ligiert werden, ein Reportermolekül bilden, das direkt und effizient durch Inkubation mit einer RNA-gerichteten RNA-Polymerase amplifiziert werden kann.
Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung hervorgehen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Assays der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäurehybridisierungsverfahren zur Bestimmung der Präsenz in einer biologischen Probe für RNA-Targets unter Verwendung von binären RNA-Sonden und einer spezifischen und effizienten RNA-gerichteten RNA-Ligase, die ein Protein ist.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Assays, die die exponentielle Amplifikation bei einer bestimmten Temperatur zur Signalerzeugung, am meisten bevorzugt Amplifikation durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase, so wie Qβ-Replikase, einschließen (Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989).
Bevorzugte Ausführungsformen sind Sandwich-Hybridisierungsassays (Syvanen et al., 1986).
Bevorzugte Ausführungsformen verwenden ebenfalls Techniken zur Reduktion des Hintergrunds, so wie beispielsweise die Technik des reversiblen Target-Fangs (reversible target capture) (Morrissey et al., 1989; Hunsaker et al., 1989).
Wir haben bestimmte Proteine entdeckt, die in den Assays der vorliegenden Erfindung effizient als RNA-gerichtete RNA-Ligasen funktionieren. Die von uns bevorzugte RNA-gerichtete RNA-Ligase ist die Bakteriophagen-T4-DNA-Ligase. Sie ist targetabhängig und besitzt in Abwesenheit von Target eine geringe Ligationseffizienz; es wird angenommen, dass sie tolerant gegenüber fehlgepaarten Hybriden ist, insbesondere Hybriden am Ligationsknotenpunkt; sie akzeptiert Sonden, die beide lange Sondensequenzen aufweisen, die die Spezifität zu einer Targetsequenz gewährleisten; und sie ist mehr als ausreichend effizient, d.h. sie ermöglicht die Durchführung von extrem empfindlichen Assays. Ein Protein, das eine in den Assays der vorliegenden Erfindung nützliche Ligase ist, ist eines, das die Detektion von 100.000 Targetmolekülen im Assay aus Beispiel 1 gestattet.
Wir haben einen einfachen Test zur schnellen Identifizierung von in Frage kommenden Proteinen entwickelt.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls diagnostische Kits für präselektionierte Targets ein, die ein binäres RNA-Sondenpaar enthalten, das komplementär zu unmittelbar benachbarten Regionen der Targetsequenz ist, wobei jede Sonde enthält: mindestens fünfzehn Nukleotide, die zur Targetsequenz komplementär sind, eine Ligase, die eine RNA-gerichtete RNA-Ligase ist, und eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase. Bevorzugte Kits können zusätzliche Reagenzien einschließen.
Eine detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, einschließend besonders bevorzugte Ausführungsformen, folgt in der Detaillierten Beschreibung. Der Rahmen der vorliegenden Erfindung, wie in den angehängten Ansprüchen definiert, soll weder durch die Detaillierte Beschreibung noch durch die Beispiele eingeschränkt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt das Assay aus Beispiel 1 dar.
2 zeigt die Sequenzen der Sonden aus Beispiel 1.
3 stellt die Herstellung von binären Sonden aus Beispiel 1 dar.
4 zeigt Ergebnisse eines Testassays gemäß Beispiel 1 für eine in Frage kommende Ligase, die T4-DNA-Ligase.
5 zeigt die Ergebnisse eines Assays von infizierten Zellen gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von T4-DNA-Ligase.
6 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Assays gemäß Beispiel 1 für bekannte Mengen von infizierten Zellen.
7 ist ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse eines Screeningtests gemäß Beispiel 2 zeigt.
Detaillierte Beschreibung
Wir haben einen unkomplizierten Screeningtest zur Identifizierung von Proteinen entwickelt, die in Assays gemäß der vorliegenden Erfindung potentiell nützlich sind. Dieser Test wird unten in Beispiel 2 beschrieben. Er bedient sich eines RNA-Targets und eines binären RNA-Sondenpaares, von dem beide Sonden in höchstem Maße spezifisch für das Target sind, um Spezifität zu garantieren. Ergebnisse des einen Tests sind in 7 gezeigt, einem Autoradiogramm des Testprodukts. Der Test schließt nicht nur ein als RNA-gerichtete RNA-Ligase getestetes Protein ein (oder mehrere davon), sondern auch eine Kontrolle, in der keine Ligase verwendet wird. Zeigt das Autoradiogramm signifikant mehr amplifiziertes Produkt in einer ein bestimmtes Protein enthaltenden Reaktion als in einer Kontrollreaktion ohne Ligase, so dass es mit bloßem Auge zu erkennen ist, so ist dieses Protein ein in Frage kommendes Protein für weitere Tests, um herauszufinden, ob es als eine Ligase in Assays der vorliegenden Erfindung nützlich ist.
7 zeigt, dass zwei Proteine, T4-DNA-Ligase und E. coli-DNA-Ligase, zu signifikant mehr Produkt führten als die Kontrolle ohne Ligase. Sie sind ausreichend effizient für weitere Tests. Jedoch erwiesen sich weder T4-RNA-Ligase noch Thermus aquaticus-DNA-Ligase im Screeningtest als vielversprechend. Keine von beiden kommt für weitere Tests in Frage. Da die T4-DNA-Ligase nach Sicht effizienter war als die E. coli-DNA-Ligase, bevorzugen wir sie und werden sie in den Assays von Beispiel 1 verwenden.
Erscheint ein Protein aus dem Screeningtest als eine in Frage kommende Ligase, so kann es daraufhin im Assay aus Beispiel 1 verwendet werden, um zu bestimmen, ob es eine "effiziente Ligase" ist, d.h. eine in den Assays der vorliegenden Erfindung nützliche Ligase, oder nicht. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, einschließlich der angehängten Ansprüche, ist eine effiziente Ligase definiert als eine Ligase, die die Detektion von 100.000 Targetmolekülen im Assay aus Beispiel 1 gestattet. Die Fähigkeit, jede gegebene Menge an Targetmolekülen in dem Assay aus Beispiel 1 zu detektieren, ist sowohl eine Funktion der targetabhängigen Ligationseffizienz eines Proteins und der Anfälligkeit des Proteins zur targetunabhängigen Ligation, die meist den Hintergrund verstärkt. Eine bevorzugte Ligase ist eine Ligase, die die Detektion von 1.000 Targetmolekülen im Assay aus Beispiel 1 gestattet. Eine am meisten bevorzugte Ligase ist eine Ligase, die die Detektion von 100 Molekülen im Assay aus Beispiel 1 gestattet. T4-DNA-Ligase ist eine am meisten bevorzugte Ligase. Sie gestattet die Detektion von 100 Targetmolekülen im Assay aus Beispiel 1. Wir schätzen, dass in diesem Assay die T4-DNA-Ligase eine Ligationseffizienz von zehn Prozent, plus oder minus zwei Prozent, aufweist. Natürlich kann der Screeningtest gemäß Beispiel 2 übersprungen werden, indem das Assay aus Beispiel 1 direkt dazu benutzt wird zu bestimmen, ob ein bestimmtes Protein eine effiziente Ligase ist oder nicht.
Die Assays der vorliegenden Erfindung sind für RNA-Targets. Sie erfordern binäre RNA-Sonden und ein Protein, das eine effiziente RNA-gerichtete RNA-Ligase ist. Mit diesen Einschränkungen kann jedes geeignete Assayprotokoll verwendet werden. Das ligierte Produkt, hierin bezeichnet als RNA-"Reportermolekül", kann allein, d.h. ohne amplifiziert zu werden, in zu den bekannten Assays analogen Assays unter Verwendung von binären DNA- Sonden detektiert werden (Landegren et al., 1988; Landegren und Hood, 1991). Alternativ können die binären RNA-Sonden so gestaltet sein, dass das durch ihre Ligation gebildete Reportermolekül amplifizierbar, d.h. ein Template für eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase, so wie Qβ-Replikase, ist (für Beispiele von geeigneten RNA-Molekülen siehe Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989; Pritchard und Stefano, 1991; Martinelli et al., 1992).
Die Assays der vorliegenden Erfindung können eine der binären RNA-Reportersonden verwenden, um Targetmoleküle auf einer festen Oberfläche zu immobilisieren, analog zu einigen der oben angeführten Referenzen, die dies mit DNA-Sonden machen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugte Assays verwenden binäre Sonden, die beide "in höchstem Maße spezifisch" für ihr Target sind, womit wir Sonden meinen, die eine Sondensektion von mindestens 15 mit der Targetsequenz hybridisierbaren Nukleotiden aufweisen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugte Assays verwenden die exponentielle Amplifikation von RNA-Reportermolekülen durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase, wie oben beschrieben. Zusätzlich verwenden bevorzugte Ausführungsformen von erfindungsgemäßen Assays Techniken zur Reduktion des Hintergrunds, so wie beispielsweise die Reversible-Target-Capture-Technik (Morrissey et al., 1989; Hunsaker et al., 1989).
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform eines Assays gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet die exponentielle Replikation von Reportermolekülen, insbesondere durch Qβ-Replikase, in Verbindung mit Hintergrundreduktionstechniken. Die Hintergrundreduktionstechniken bezeichnen die Verwendung einer separaten Fängersonde, die an eine sich von der Targetsequenz, an die die binären Reportersonden hybridisieren, unterscheidenden Stelle hybridisierbar ist, um Fängersonde/Targetreportersonden-Hybride zu bilden und die Immobilisierung dieser Hybride sowie die Freisetzung der Reportersonden/Target-Hybride von den Fängersonden mittels Abspaltung, wie durch Ribonuklease H (RNase H) zu veranlassen. Beispiel 1 offenbart unser am meisten bevorzugtes Assay.
Proteine, die RNA-gerichtete RNA-Ligasen sind, sind auch in Assays nützlich, die als Amplifizierungsschritt eine Ligase-Kettenreaktion einschließen, beispielsweise Ligase-Kettenreaktionen, bei denen alle Nukleinsäurekomponenten RNAs sind. Ist das Protein nicht thermostabil, muss während eines jeden LCR-Zyklus Protein zugegeben werden.
Wie zuvor erwähnt, beinhaltet die vorliegende Erfindung ebenfalls Kits, wie definiert in Anspruch 14, zur Durchführung von Assays gemäß der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugtes Kit kann einige oder alle der folgenden Elemente enthalten:

1. 5 M Guanidinthiocyanat(GuSCN)puffer für die Lysis der Zellen in klinischen Proben;
2. eine binäre RNA-Reportersonden, vorzugsweise in höchstem Maße spezifische binäre Sonden, enthaltende Mischung für ein präselektioniertes RNA-Target und vorzugsweise DNA-Fängersonden;
3. einen Festkörper, so wie einen Eintauchstab, ein Reaktionsgefäß oder paramagnetische Partikeln, an die Streptavidin kovalent gebunden ist;
4. eine magnetische Trennvorrichtung;
5. Nukleotide;
6. eine in der vorliegenden Erfindung nützliche effiziente Ligase, vorzugsweise T4-DNA-Ligase;
7. RNase H und Qβ-Replikase;
8. Puffer zur Ligation und Amplifikation;
9. Reagenzien zur Detektion der amplifizierten Reporter, so wie radioaktives alpha-P³²-Cytidintriphosphat oder Propidiumjodid;
10. Instruktionen zur Durchführung eines Assay gemäß der vorliegenden Erfindung.

Ein Basiskit kann lediglich die Elemente 2, 6, 10 und eine RNA-gerichtete RNA-Ligase enthalten. Ein vollständigeres Kit wird mindestens auch die Elemente 1, 3 und 7 enthalten. Ein Kit, das mindestens die Elemente 1 bis 2 und 5 bis 10 enthält, wobei der Festkörper ein Eintauchstab oder ein Reaktionsgefäß ist, ist insbesondere nützlich für Assays, die außerhalb eines gut ausgestatteten Labors durchgeführt werden sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1: RNA-Target, binäre RNA-Sonden, DNA-Fängersonden, Ribonuklease H-Spaltung und T4-DNA-Ligase
Diese Ausführungsform unter Verwendung von T4-DNA-Ligase führte zu dem extrem empfindlichen Assay zur Detektion eines DNA-Targets, der allgemein in 1 dargestellt ist, hier veranschaulicht anhand von RNA des humanen Immuninsuffizienz-Virus ("HIV"). Die Targetsequenz 2 des Targets 1 befindet sich im Integrasebereich der HIV-RNA. Das Assay beginnt mit der Auflösung der Probe in 5 M Guanidinthiocyanat (GuSCN). Eine Mischung aus vier verschiedenen Nukleinsäuresonden wird dann der Probe zugegeben. Diese Sonden hybridisieren an die HIV-RNA, wie in 1 gezeigt. Zwei der Sonden sind Fängersonden 3, 4 aus DNA. Jede Fängersonde hat eine zum Target 1 komplementäre Hybridisierungssequenz 5 oder 6 an ihrem 3'-Ende. Die Fängersonden 3, 4 haben ebenfalls einen Biotinrest 7 an ihren 5'-Enden. Die anderen beiden Sonden 8, 9 sind in höchstem Maße spezifische binäre Reportersonden aus RNA. Nach der Hybridisierung werden die Hybride auf der Oberfläche von paramagnetischen Partikeln 10 gefangen, die mit Streptavidin 11 beschichtet sind, das fest an den Biotinrest 7 der Fängersonden bindet. Die paramagnetischen Partikeln 10 werden dann gründlich gewaschen, um nicht hybridisierte binäre Sonden zu entfernen. Stringentes Waschen mit 2 M GuSCN anstatt mit einer verdünnteren Lösung, beispielsweise 1 M GuSCN, kann angewendet werden, da die binären Sonden beide in höchstem Maße spezifisch sind. RNase H wird dann zugegeben, um die Target-RNA in der Region zu spalten, wo sie an die Fängersonden hybridisiert ist. Die Spaltung der Target-RNA befreit die binäre Sonden/Target-Hybride 12 (in 1 nach der Ligation gezeigt) von den Fängersonden.
Der Schritt der Spaltung und Freisetzung ist quantitativ und spezifisch. Die binären Sonden, die unspezifisch an den DNA-Fängersonden oder an der Oberfläche der paramagnetischen Partikeln (d.h. Quellen des Hintergrundsignals) haften, werden durch diese Spaltung nicht freigesetzt. Die paramagnetischen Partikeln 10 werden verworfen.
Im Überstand werden binäre Sondenpaare, die in korrekter Weise zueinander benachbart auf ihren Targets hybridisiert sind, in einer targetabhängigen Weise miteinander ligiert unter Verwendung einer Ligase, die ein Protein ist, in diesem Fall T4-DNA-Ligase. Die ligierten Sonden 13 werden dann durch Inkubation mit Qβ-Replikase amplifiziert. Das amplifizierte Signal hängt strikt von der Anwesenheit des Targets ab und die Stärke des Signals als eine Funktion der Zeit kann dazu verwendet werden, die Anzahl der HIV-RNA-Moleküle in der Originalprobe quantitativ zu bestimmen.
A. Synthese der Sonden
Die in diesem Beispiel verwendeten Fängersonden (2) besitzen drei funktionale Teile. Einen Kopf aus 40 bis 50 Nukleotiden, die an das präselektionierte Target hybridisieren, einen Spacer aus etwa 4 Nukleotiden und ein Ende, das fest an die feste Oberfläche bindet. Wir wählten das Ende als einen kovalent an das 5'-Ende einer jeden Fängersonde gekoppelten Biotinrest. Der Biotinrest kann an beliebiger Stelle in der Fängersonde befestigt werden, einschließlich am 3'-Ende und im Inneren. Das Ende kann aus einem beliebigen anderen Affinitätsreagens bestehen, so wie einem Homopolynukleotid.
1 zeigt die Art und Weise, in der Fängersonden 3, 4 an das Target 1 binden. Anstatt von nur einer wurden zwei verschiedene Fängersonden verwendet, um die Effizienz des Fangens und die Stringenz der Freisetzung der binäre Sonde-Target-Komplexe zu erhöhen. Die beiden Fängersonden 3, 4 binden an einer der Seiten der Targetsequenz 2, an die die binären Sonden binden, an das Target. Die Hybridisierungssequenz 5 der Fängersonde 3 ist komplementär zur 4415-4458-Region der HIV-Genom-RNA und die Hybridisierungssequenz 6 der Fängersonde 4 ist komplementär zur 4808-4852-Region der HIV-Genom-RNA. 2 zeigt die Sequenzen der beiden in diesem Beispiel verwendeten Fängersonden 3, 4. Unterstreichungen zeigen die zur Target-RNA komplementären Hybridisierungssequenzen 5, 6 an. Beide Fängersonden wurden auf einem DNA-Synthesizer hergestellt.
Das gewünschte Reportermolekül dieser speziellen Ausführungsform erfordert die Ligation von zwei binären Sonden, wie in 1 gezeigt. Die Verwendung von binären Sonden stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar. 1 veranschaulicht die Konstruktion der in höchstem Maße spezifischen binären Reportersonden 8, 9. Das 5'-Ende 14 der Sonde 8 besteht aus den ersten 69 Nukleotiden der replizierbaren Sonde für HIV, wie in unseren früheren Studien verwendet (Lomeli et al., 1989). Die nächsten 23 Nukleotide sind die Sondensequenz 15, welche zur 4596-4618-Region der HIV-Genom-RNA komplementär ist. Das 5'-Ende der Sonde 9 besteht aus der 19-Nukleotid-Sondensequenz 17, die zur 4577-4595- Region der HIV-Genom-RNA komplementär ist. Der Rest 16 der Sonde 9 entspricht den Nukleotiden 95 bis 280 der replizierbaren Sonde für HIV, wie in unseren früheren Studien verwendet (Lomeli et al., 1989). 2 zeigt die Sequenzen der binären Sonden 8, 9. Unterstreichungen zeigen die zur Targetsequenz komplementären Hybridisierungssequenzen 15, 17 an. Die Hybridisierungssequenzen 15, 17, beide mindestens 15 Nukleotide lang, Sonden 8, 9 sind "in höchstem Maße spezifisch" gemäß der vorliegenden Erfindung. Werden diese Moleküle mit Qβ-Replikase inkubiert, so ist keines von ihnen ein guter Replikator; werden sie jedoch miteinander ligiert, so bilden sie ein exponentiell replizierbares Reporiermolekül.
Die binären Sonden 8, 9 wurden durch Transkription von in einer in 3 gezeigten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugten DNA-Templates hergestellt. Das in Lomeli et al., 1989, auf Seite 1827 beschriebene Plasmid 20, das wir Plasmid pT7MDVHIV20 nennen, wurde in den PCR-Reaktionen als Quelle von MDV-Sequenzen verwendet. Der relevante Abschnitt des Plasmids ist in 3 gezeigt. Selbstverständlich ist es doppelsträngig. Vier PCR-Primer 21, 22, 23 und 24 wurden so konstruiert, dass sie zusätzliche Sequenzen zu den PCR-Produkten 27, 28 beisteuerten, die in Plasmid 20 nicht vorhanden, jedoch erforderlich waren. PCR-Produkt 27 wird aus Primern 21, 22 hergestellt. PCR-Produkt 28 wird aus Primern 23, 24 hergestellt. Primer 22 lieferte die terminalen 23 Nukleotide 25 im Template für Sonde 8. Primer 23 lieferte T7-promotor 26 am 5'-Ende des Templates für Sonde 9. (Plasmid 20 lieferte einen T7-Promotor im Bereich von Primer 21). Sonde 8 wurde in der üblichen Weise aus ihrem PCR-Template transkribiert, jedoch erforderte die Synthese von Sonde 9 eine Modifikation der Transkriptionsbedingungen durch T7-RNA-Polymerase. Der Donor der Phosphatgruppe in einer Ligationsreaktion, in diesem Fall Sonde 9, muss an seinem 5'-Ende ein einzelnes Phosphat aufweisen. Durch Transkription hergestellte RNA-Moleküle weisen üblicherweise an ihren 5'-Enden ein Triphosphat auf. Um Sonde 9 mit einer einzelnen Phosphatgruppe an ihrem 5'-Ende zu synthetisieren, wurde ein zehnfacher Überschuss von Guanosin-5'-Monophosphat gegenüber den Nukleosid-5'-Triphosphaten in die Transkriptionsreaktion eingeschlossen. Dies führte zum Einbau von Guanosin-5'-Monophosphat an der ersten Position der Sonde 9. Als Folge davon besaßen die Kopien der Sonde 9 das erforderliche Monophosphat an ihren 5'-Enden. Nach der Transkription wurde jede der Binärsonden-RNAs 8, 9 durch vorbereitende Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgereinigt. Die RNA wurde direkt von der Gelscheibe in eine 2 M Guanidinthiocyanat(GuSCN)lösung eluiert.
Aufgrund der Durchführung dieses Beispiels haben wir entdeckt, dass Sonde 9 durch die Verwendung eines zwanzigfachen Guanosin-5'-Monophosphat-Überschusses eher verbessert werden kann als durch den oben beschriebenen zehnfachen Überschuss. Die Ligationseffizienz verdreifacht sich von zehn auf dreißig Prozent wenn der größere Überschuss verwendet wird, mit T4-DNA-Ligase als RNA-gerichtete RNA-Ligase.
B. Hybridisierung, Fangen, Waschen und Freisetzung
Das Assay dieses Beispiels wurde mit Proben durchgeführt, die bekannte Mengen von HIV-RNA-Molekülen enthielten. Dieses Assay wird dazu verwendet festzustellen, ob ein bestimmtes Protein eine in Assays gemäß der vorliegenden Erfindung "effiziente Ligase" ist oder nicht. Das Assay wird unter Bezugnahme auf einen Test von T4-DNA-Ligase beschrieben. Als Modelltarget wurde eine der mRNA des Integrasegens von HIV entsprechende RNA verwendet. Diese RNA wurde durch Transkription aus linearisierter Plasmid-pGEM-Integrase hergestellt, die in unserem Labor vorbereitet wurde. Acht Reaktionsgefäße, die verschiedene Mengen Integrase-RNA in 50 Mikrolitern 2 M GuSCN enthielten, beispielsweise 10.000.000, 1.000.000, 100.000, 10.000, 1.000, 100, 10 und 0 Moleküle, wurden durch serielle Verdünnung hergestellt. Eine 2 M GuSCN-Lösung (50 Mikroliter) enthaltend 10¹³ Moleküle einer jeden der Fängersonden und 2 × 10¹⁰ Moleküle einer jeden der binären Sonden wurden in jedes Reaktionsgefäß zugegeben. Die Hybridisierung wurde mittels Inkubation bei 37°C für eine Stunde durchgeführt. Eine 30 Mikroliter-Suspension mit Streptavidin (Promega) beschichteter paramagnetischer Partikeln wurde dann diesem Hybridisierungsgemisch zugegeben. Die Sonden – Target-Hybriden wurden durch eine 10-minütige Inkubation bei 37°C auf der Oberfläche der paramagnetischen Partikeln gefangen. Die Partikeln wurden viermal mit 2 M GuSCN, dreimal mit 300 mM KCl und schließlich zweimal mit 1 X-Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM ATP) gewaschen. Nach dem Waschen wurde eine Einheit E. coli-RNase H (Pharmacia), aufgelöst in 50 Mikrolitern 1 X Ligasepuffer, zugegeben. Die binäre Sonden-Target-Hybriden wurden durch eine 10-minütige Inkubation bei 37°C von der Oberfläche der paramagnetischen Partikeln gelöst. Die die Mischung enthaltenden Reaktionsgefäße wurden in dem von einer magnetischen Trennvorrichtung bereitgestellten magnetischen Feld platziert, um die paramagnetischen Partikeln an die Wände der Reaktionsgefäße heranzuziehen. Der Überstand wurde dann durch Aspiration von den paramagnetischen Partikeln getrennt und in ein frisches Reaktionsgefäß gegeben.
Die Sonde – Target-Hybride wurden dann mit dem in Frage kommenden Protein, T4-DNA-Ligase, inkubiert, um ihre binären Sonden, die korrekt an Targets hybridisiert waren, zu ligieren. Die Ligation wurde in 40 Mikrolitern des Überstands durch die Zugabe von 40 Einheiten T4-DNA-Ligase und Inkubation für eine Stunde bei 37°C, was für dieses Protein geeignet war, durchgeführt.
Das Assay aus diesem Beispiel wurde ebenfalls mit T4-DNA-Ligse an Proben, die bekannte Mengen von HIV-infizierten Zellen enthielten, durchgeführt. Um die Spezifität und die Empfindlichkeit dieses Assays an klinischen Proben zu demonstrieren, wurden humane periphere Lymphozyten mit HIV infiziert. Diese infizierten Zellen wurden seriell mit nicht-infizierten humanen peripheren Lymphozyten verdünnt. Es wurden acht Reaktionsgefäße bereitet. die unterschiedliche Mengen infizierter Zellen enthielten, beispielsweise 600.000, 60.000, 6.000, 600, 60, 6, 0 und 0. Jedes dieser Reaktionsgefäße wies die gleiche Gesamtzahl an Zellen auf, beispielsweise 600.000. Die Gefäße wurden zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. 240 Mikroliter 5 M GuSCN wurden in jedes Gefäß zugegeben. Die Gefäße wurden dann für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Nach der Lysis wurden 40 Mikroliter aus jedem Gefäß einem Assay unterzogen. Eine 60 Mikroliter-Lösung enthaltend alle vier Sonden wurde dem Lysat zugegeben. Die Zugabe dieser Lösung reduzierte die GuSCN-Konzentration im Lysat auf 2 M. Die Hybridisierung und alle nachfolgenden Reaktionen wurden durchgeführt wie im vorangehenden Absatz beschrieben ist.
C. Amplifikation
Die Reportermoleküle, umfassend ligierte binäre Sonden, wurden dann durch Inkubation mit Qβ-Replikase amplifiziert. Es ist nicht erforderlich, die Reportermolekül – Target-Hybride vor der Amplifikation durch Schmelzen voneinander zu trennen. Eine alle Komponenten der Replikationsreaktion enthaltende Mischung wurde in jedes der acht Gefäße zugegeben. Die finale Reaktionsmischung (120 Mikroliter) war 45 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgCl₂, 400 Mikromolar ATP, 400 Mikromolar GTP, 400 Mikromolar UTP, 400 Mikromolar alpha- P³²-CTP und enthielt 50 Mikrogramm pro Milliliter Qβ-Replikase. Jede Reaktion wurde bei 37°C inkubiert und 4 Mikroliter-Proben wurden jeder Reaktion von der 10. bis zur 31. Minute der Inkubation in einminütigen Abständen entnommen. Jede Probe wurde mit einer 45-Mikroliter-Stopplösung (120 mM NaCl, 20 mM EDTA und 3 Mikrogramm pro ml Proteinase K) vermischt. Diese Lösung stoppt die Replikation, indem sie die erforderlichen Magnesiumionen abkapselt. Die Stopplösungen wurden vor Zugabe der Proben in Titerplatten angeordnet. Die RNA in jeder gestoppten Reaktion wurde von den nicht eingebauten Nukleosidtriphosphaten getrennt durch Präzipitation der RNA in einer sauren Lösung (360 mM Phosphorsäure, 20 mM Natriumpyrophosphat und 2 mM EDTA), Einfangen des Niederschlags auf einer Blotting-Membran (Zeta Probe, Biorad) und nachfolgendes Waschen der Membran mit der sauren Lösung. Die RNA auf den Blots wurde mittels Autoradiographie visualisiert.
D. Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen, dass T4-DNA-Ligase eine "effiziente Ligase" zur Verwendung in Assays gemäß der vorliegenden Erfindung ist. 4 zeigt ein typisches Ergebnis des oben beschriebenen Assays für eine Verdünnungsreihe von Molekülen der HIV-Integrase-RNA. 4 ist ein Autoradiogramm. Jede Reihe repräsentiert das Signal einer gegebenen Probe über die Zeit, wie angezeigt. Die Intensität eines jeden Dots in 4 ist proportional zu der Menge an RNA, die zum Zeitpunkt der Entnahme der Probe im Gefäß anwesend war. Der Zeitpunkt, zu dem die RNA zuerst im Autoradiogramm zu sehen ist, hing von der Anzahl der anwesenden Targets ab. Je größer die Anzahl der Targets war, desto früher erschien das Signal. Für jede 10-fachen Abnahme der Anzahl der Targets ist eine Verzögerung von mindestens etwa zwei Minuten zu verzeichnen. Bereits nur 100 Targetmoleküle erzeugten ein deutliches Signal. Zehn Targetmoleküle, oder gar keine Targetmoleküle, erzeugten kein Signal, nicht einmal nach zusätzlichen acht Minuten der Inkubation (nicht gezeigt). Einhundert Moleküle HIV-RNA waren deutlich detektierbar; jede darunter liegende Anzahl erzeugte überhaupt kein Signal.
Wie angegeben war die Mindestanzahl von Targets, die in diesem Assay unter Verwendung von T4-DNA-Ligase detektiert werden konnten, einhundert Moleküle. Wir haben durch andere Experimente bestimmt, dass die Ligationseffizienz bei zehn Prozent plus oder minus zwei Prozent lag. Aufgrund unserer Erfahrung und der 7 schätzen wir, dass die Ligationseffizienz von E. coli-DNA-Ligase in diesem Assay bei etwa einem Prozent liegt, wir haben jedoch deren Effizienz nicht durch anderweitige Experimente bestimmt. Die oben erwähnte Verbesserung der Synthese von Sonde 9, die die Ligationseffizienz verdreifacht, wird die Empfindlichkeit dieses Assays noch weiter verbessern, doch zur Bestimmung, ob eine in Frage kommende Ligase eine in Assays gemäß der vorliegenden Erfindung nützliche "effiziente Ligase" ist, werden die in diesem Beispiel tatsächlich benutzten Sonden verwendet.
Die 5 und 6 zeigen die Ergebnisse von Assays gemäß diesem Beispiel mit T4-DNA-Ligase auf HIV-infzierte humane periphere Lymphozyten enthaltenden Proben. Die 5 und 6 sind Autoradiogramme, wie im Zusammenhang mit 4 beschrieben. Gemeinsam betrachtet zeigen die Ergebnisse der beiden Experimente, dass in einer 100.000 nicht-infizierte Zellen enthaltenden Probe eine infizierte Zelle detektiert werden kann und dass in Proben, die keine infizierten Zellen enthalten, kein Signal zu sehen ist. In beiden Experimenten enthielt jede Probe eine Gesamtanzahl von 100.000 Zellen. Im ersten Experiment (5) zeigen die Ergebnisse einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Anzahl infizierter Zellen in einer Probe und dem Zeitpunkt des Erscheinens des Signals. Je größer die Anzahl an infizierten Zellen war, desto früher erschien das Signal. Daher ist dieses Assay sowohl quantitativ als auch qualitativ. Die beiden Kontrollen, von denen jede 100.000 nicht-infizierte Zellen (und keine infizierten Zellen) enthielt, erzeugte kein Signal. Das Gefäß, das eine infizierte Zelle enthielt, erzeugte allerdings ebenfalls kein Signal. Wir nahmen an, dass die Probe nach der Lysis nicht komplett durchgemischt wurde. Die lysierten Proben sind äußerst viskos (aufgrund der Anwesenheit von zellulärer DNA) und da sich in dem 240 Mikroliter-Volumen des Lysats nur etwa sechs infizierte Zellen befanden, bestand eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass in der aus der Probe für das Assay entnommenen 40 Mikroliter-Probe keine HIV-RNA enthalten war. Um eine derartige Möglichkeit auszuschließen, wurden die Proben eingefroren, wieder aufgetaut und dann äußerst gründlich durchmischt, bevor sie im nächsten Experiment verwendet wurden. Das Assay wurde mit diesen gut durchgemischten Proben wiederholt. Die als die unteren sechs Proben in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass unsere Annahme korrekt war und dass nach angemessenem Durchmischen das Gefäß, das die Nukleinsäure von etwa einer infizierten Zelle enthielt, ein starkes Signal mit einer angemessenen Verzögerungszeit lieferte.
Es war ein weiteres Ziel des zweiten Experiments, die Anzahl der Moleküle von HIV-RNA in jeder infizierten Zelle zu schätzen. Zu diesem Zweck bereiteten wir zwei Standards vor. Standard 1, das erste Standardgefäß, enthielt 1.000.000 HIV-Integrase-mRNA-Transkripte. Standard 2, das zweite Lysat aus 100.000 nicht infizierten Zellen und 1.000.000 Moleküle der HIV-Integrase-mRNA-Transkripte. Die Ergebnisse des Experiments, die als die oberen beiden Proben in 6 gezeigt sind, zeigen, dass die Anwesenheit des Lysats aus den nicht infizierten Zellen nur einen geringfügigen Quenching-Effekt liefert. Aus dem von diesem internen Standard erhaltenen Signal konnten wir abschätzen, dass jede infizierte Zelle etwa 3.000 HIV-Targetmoleküle enthielt.
Ein Hinweis zur Vorsicht ist hier angebracht. Unser Labor wird für die Erforschung replizierbarer RNA-Moleküle verwendet, die leicht zu luftverunreinigenden Schadstoffen werden. In einem Test des oben beschriebenen Assays erhielten wir in einem der Gefäße ein von der Regel abweichendes Signal. Elektrophoretische Analyse der amplifizierten RNA zeigte, dass es nicht der Reporter war. Qβ-Replikase amplifiziert eine Reihe von RNAs und unsere Probe wurde verunreinigt.
Beispiel 2: Auswahl einer geeigneten Ligase
Wir haben ein äußerst empfindliches Screeningverfahren zur Identifizierung von RNA-gerichteten RNA-Ligase-Aktivitäten von in Frage kommenden Proteinen entwickelt. Mittels dieses Verfahrens haben wir mindestens zwei Proteine identifiziert, die in der Lage sind, RNA-gerichtete RNA-Ligation zu katalysieren. Im Folgenden wird dieses Screeningverfahren beschrieben.
Zehn Milliarden HIV-Integrase-mRNA-Moleküle wurden an einen großen Überschuss von binären RNA-Sonden und DNA-Fängersonden hybridisiert. Die Reportersonden-Hybride wurden dann gefangen, gewaschen und durch Inkubation mit RNase H in der in Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise von den Fängersonden gelöst. Das gelöste Material wurde in fünf Aliquots aufgeteilt. Ein in Frage kommendes Protein wurde zu vier der Aliquots zugegeben, so dass die fünf Aliquots enthielten: keine Ligase, T4-DNA-Ligase, T4-RNA-Ligase, E. coli-DNA-Ligase und eine aus dem thermophilen Organismus Thermus aquaticus isolierte DNA-Ligase. Das Reaktionsgemisch für die letzten beiden Ligasen enthielt ebenfalls 1 mM NAD, was ein notwendiger Co-Faktor ist. Die ersten vier Reaktionen wurden bei 37°C inkubiert, die letzte Reaktion hingegen wurde bei 55°C inkubiert. Alle Reaktionen wurden für eine Stunde inkubiert. Nach der Ligation wurden die ligierten binären Sonden durch Inkubation mit Qβ-Replikase für 15 Minuten bei 37°C amplifiziert. Die Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel fraktioniert.
7 stellt das daraus resultierende Autoradiogramm dar. Sie zeigt die Gelfraktion 50, die in jedem Aliquot den amplifizierten Reportermolekülen entspricht. T4-DNA-Ligase war ausreichend effizient, um für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Frage zu kommen. Sie katalysierte die Synthese der größten Menge an ligiertem Produkt. E. coli-DNA-Ligase funktionierte ebenfalls gut und wurde als in Frage kommend beurteilt. Die DNA-Ligase aus T. aquaticus führte zu einem Ergebnis, das mit bloßem Auge nicht von dem der Kontrolle ohne Ligase zu unterscheiden war. Sie funktionierte nicht, jedenfalls nicht effizient genug, um für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Frage zu kommen.
Wie oben angegeben, muss ein Protein, um als Ligase für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Frage zu kommen, Ergebnisse, d.h. amplifiziertes Produkt 50, liefern, bei denen mit bloßem Auge leicht zu erkennen ist, dass sie größer sind als das Produkt (Hintergrund) der Kontrolle ohne Ligase. Auf der Grundlage dieses extrem empfindlichen Verfahrens wählten wir die T4-DNA-Ligase als in Frage kommende Ligase für die Verwendung in unseren Assays. Sie wurde dem Assay aus Beispiel 1 unterzogen und es wurde gefunden, dass sie eine in Assays gemäß der vorliegenden Erfindung nützliche "effiziente Ligase" ist. Es wurde in der Tat gefunden, dass sie eine am meisten bevorzugte Ligase ist, die die Detektion von 100 Molekülen gestattete. Es wurde ebenfalls gefunden, dass diese Ligase insbesondere "effizient" für die Ligation von binären DNA-Sonden ist, die an ein RNA-Target hybridisiert sind.
Referenzen
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Claims

Nulcleinsäurehybridisierungs-Diagnoseverfahren, um das Vorhandensein eines vorher ausgewählten RNA-Targets, das eine Zielsequenz enthält, in einer biologischen Probe zu bestimmen, umfassend die Schritte: (a) Inkubieren der Probe mit einem Paar RNA-Oligonukleotidsonden, komplementär zu unmittelbar angrenzenden Bereichen der Zielsequenz, wobei jede Sonde mindestens 15 Nukleotide komplementär zu der Zielsequenz enthält; (b) Selektives Ligieren von Sondenpaaren, die angrenzend gegen die Zielsequenz hybridisiert sind, mit einem Protein, das eine RNA-gerichtete RNA-Ligase ist; und (c) Detektieren, dass Ligation stattgefunden hat als ein Anzeichen für das Vorhandensein des RNA-Targets.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Diagnose von Krankheit oder Beschwerden in Menschen oder Tieren.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Detektieren von Pathogenen in biologischen Proben.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Detektieren eines Organismus oder Virus in Nahrung, landwirtschaftlichen Produkten, oder der Umwelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Sonde des Paares zusätzlich dazu dient, das Target auf der Oberfläche eines Festkörpers zu immobilisieren, und die andere des Paares einen detektierbaren Rest beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Schritt des Ligierens mit T4 DNA-Ligase durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Detektion, dass Ligation stattgefunden hat, das Amplifizieren der ligierten Sondenpaare, unter Verwendung einer RNA-gerichteten RNA-Polymerase, und das Detektieren des Amplifikationsprodukts umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Detektion weiter das Trennen von Sonde-Target-Hybriden durch reversiblen Target-Einfang vor dem Amplifizieren der ligierten Sondenpaare umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Sonden zusammen eine Oligonukleotidsequenz umfassen, die ein Template für eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase ist, und wobei die Sonde-Target-Hybride auf einer festen Oberfläche durch mindestens eine Fangsonde immobilisiert, und vor der Ligation gewaschen werden, und wobei die ligierten Sondenpaare vor dem Detektionsschritt mit einem Protein amplifiziert werden, das eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Ligierens unter Verwendung von T4 DNA-Ligase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei der Schritt des Amplifizierens unter Verwendung von Qβ-Replikase durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei weniger als 1000 Zielmoleküle in der Probe vorhanden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei weniger als 100 Zielmoleküle in der Probe vorhanden sind.
Kit aus Reagenzien zur Durchführung eins Nukleinsäurehybridisierungs-Diagnoseverfahrens für ein RNA-Target, das eine Zielsequenz enthält, umfassend: (a) ein Paar RNA-Oligonukleotidsonden, komplementär zu unmittelbar angrenzenden Bereichen der Zielsequenz, wobei jede Sonde mindestens 15 Nukleotide komplementär zur Zielsequenz enthält; (b) ein Protein, das eine RNA-gerichtete RNA-Ligase ist; und (c) eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase, wobei das Sondenpaar, wenn ligiert, ein Template für diese Polymerase ist.
Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Amplifizierung einer RNA-Zielsequenz durch Ligasekettenreaktion (LCR), wobei die Probe in Schritt (a) zusätzlich mit einem Paar Sonden, komplementär zu dem Paar Oligonuklotid-Sonden, inkubiert wird, und wobei die Probe mit den ligierten Sondenpaaren mehreren Zyklen aus Schmelzen, Inkubieren und Ligieren unterzogen wird, um exponentiell amplifizierte Produkte vor dem Detektionsschritt zu produzieren.
Verwendung eines Proteins, das eine RNA-gerichtete RNA-Ligase ist, und eines Paares RNA-Oligonukleotidsonden in einem Nukleinsäurehybridierungs-Diagnoseverfahren, um das Vorhandensein eines vorher ausgewählten RNA-Targets, das eine Zielsequenz enthält, in einer biologischen Probe zu bestimmen.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 16, um das Vorhandensein des vorher ausgewählten RNA-Targets zu bestimmen, zur Diagnose von Krankheit oder Beschwerden in Menschen oder Tieren, zum Detektieren von Pathogenen in biologischen Proben oder zur Detektion eines Organismus oder Virus in Nahrung, landwirtschaftlichen Produkten, oder der Umwelt.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 16 oder 17 in einer Nukleinsäure-Hybridisierung, die die Amplifikation von ligierten Sonden durch eine Ligase-Kettenreaktion beinhaltet.