DE68926484T2

DE68926484T2 - RNS-Template mit endverbundener Sonde und Verfahren zur Verwendung

Info

Publication number: DE68926484T2
Application number: DE68926484T
Authority: DE
Inventors: James E Stefano
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-10-02
Publication date: 1996-12-05
Anticipated expiration: 2009-10-03
Also published as: DE68929385T2; EP0361983B1; JP3276955B2; DE68926484D1; DE68929385D1; EP0707076A1; EP0361983A2; EP0361983A3; US5472840A; JPH02257898A; EP0707076B1; US5763171A

Description

Diese Erfindung betrifft den Nachweis von im klinischen und Nahrungsmittelbereich vorkommenden Organismen und besonders neue RNA-Matrizen- Sondenkonstruktionen, die in RNA-gerichteten RNA-Polymerase-Amplifikations-Hybridisierungstests verwendet werden.
Der Nachweis geringer Mengen pathogener Organismen in Körperflüssigkeiten und Nahrungsmitteln ist für Diagnose, Behandlung und Prävention einer Krankheit äußerst wichtig. Bisherige Verfahren zum Nachweis dieser Organismen schließen ihre Isolierung und in vitro-Züchtung oder den direkten Nachweis eines für den Organismus spezifischen Analyten ein. Diese Analyte können entweder das Nucleinsäuregenom des Organismus, eine durch Transkription seines Genoms während der Züchtung produzierte Ribonucleinsäure oder Proteine oder Metaboliten sein, die von dem infizierenden Organismus spezifisch produziert oder im Wirt durch den infizierenden Organismus hervorgerufen werden.
Die Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von spezifischen Nucleinsäuren in einer Probe sind gut verstanden und verwenden das gleiche allgemeine Prinzip, nämlich die eine hohe Affinität aufweisende Wechselwirkung zwischen einem Nucleinsäurestrang, der eine spezifische Nucleotidsequenz trägt und einem anderen Nucleinsäurestrang mit der komplementären Sequenz, wobei ein Hybrid oder eine doppelsträngige Struktur entsteht. Die Bildung dieser Hybride kann sehr spezifisch ("stringent") gestaltet werden, wenn die Hybridisierungsbedingungen so eingestellt werden, daß nur genau komplementäre Sequenzen hybridisieren. Wenn die gesamte Nucleinsäure einer Probe auf einem festen Träger wie einer Nitrozellulosemembran immobilisiert ist, kann die Gegenwart einer spezifischen Zielsequenz in der Probe durch Bindung einer eine nachweisbare Einheit tragenden, komplementären Nucleinsäure-"Sonde" ermittelt werden. Diese Einheiten können radioaktive Elemente, fluoreszierende Verbindungen oder Liganden sein, die durch Proteinkonjugate, die katalytische Aktivitäten tragen, die gefärbte, lumineszierende oder fluoreszierende Produkte erzeugen können, erkannt werden. Nach Entfernung der nicht-hybridisierenden Sonde durch Waschen des Trägers wird die Menge an Zielsequenz durch die Menge an nachweisbarer vorhandener Einheit ermittelt.
In der Praxis ist die Empfindlichkeit dieser Tests durch die Zahl an markierten Einheiten begrenzt, die physikalisch in die Sondennucleinsäure eingeschlossen werden können. Bei radioaktiv-markierten Sonden liegt die praktische Grenze bei etwa 10&sup4; Zielmolekülen. Zur Erreichung dieser Empfindlichkeit sind jedoch Sonden mit einer sehr hohen spezifischen Aktivität erforderlich, die nachteiligerweise eine sehr begrenzte nützliche Lebenszeit besitzen, sowie einen mehrere Tage dauernden Nachweisschritt (d. h., Autoradiographie) erfordern. Weitere Markierungsverfahren, die einen fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder enzymatischen Nachweis verwenden, sind trotz ihrer größeren Schnelligkeit nicht empfindlicher als Isotop-markierte Sonden. Da die meisten klinisch interessanten Organismen nicht mehr als 50 000 Kopien einer zur Verwendung als Zielsequenz geeigneten Nucleinsäure enthalten, besteht der Nutzen dieser Verfahren nur im Nachweis einer großen Zahl von Organismen. Die Zahl an infektiösen Erregern in klinischen Proben oder Nahrungsmitteln ist jedoch oft nur gering (1 bis 10 pro Probe). Es gibt daher einen Bedarf an Verfahren, mit denen diese geringen Mengen nachgewiesen werden können.
Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Verbesserung der Empfindlichkeit von Nucleinsäurehybridisierungstests.
Ein Verfahren zum Nachweis von geringen DNA-Mengen betrifft die Verwendung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase zur direkten Replikation der DNA-Zielsequenz zur Erhöhung seiner Zahl auf leicht nachweisbare Mengen. Dieses Verfahren wird als "Polymerasekettenreaktion" (PCR) bezeichnet. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. und Arnheim, N., "Enzymatic Amplification of Beta-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230 (1985), 1350-1354,; Saiki, R. K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. und Erlich, H. A., "Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase", Science 239 (1988), 487-491; Erlich, H. A., Gelfand, D. H. und Saiki, R. K., "Specific DNA Amplification", Nature 331(1988), 461; und Mullis et al., European Patent Application Nos. 200362 und 201184 (vgl. ferner die US-Patente 4,683,195 und 4,683,202). Im PCR-Verfahren werden zwei DNA-Oligonucleotide mit spezifischen, getrennten Stellen mit durch Wärmebehandlung getrennten komplementären Strängen von Zielsequenz-DNA hybridisiert. Die angelagerte(n) Sonde(n) wird (werden) anschließend zum Primen der Synthese des (der) komplementären Strangs (Stränge) mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase verwendet, wobei zwei doppelsträngige Kopien der Zielsequenz erhalten werden. Nach der Synthese werden die Stränge in den erhaltenen Duplex-DNA-Produkten durch Wärmebehandlung erneut getrennt, die Oligonucleotidsonden (in großem Überschuß vorhanden) erneut sowohl an die Zielsequenz als auch an die replizierten Stränge angelagert und weiter mit der Polymerase inkubiert. Da sowohl die Zielsequenz-DNA als auch die durch enzymatische Verlängerung der Oligonucleotidsonden erzeugten DNA-Stränge als Matrizen für die Primer-gesteuerte Replikation dienen, verdoppelt sich die Menge an spezifischem DNA-Produkt mit jedem Zyklus, wobei eine große Zahl an Produktsträngen (beispielsweise eine Million Kopien) erzeugt wird.
Die Durchführung dieses Verfahrens ist dadurch begrenzt, daß als Zielsequenz der Amplifikation DNA (im Gegensatz zu RNA) erforderlich ist und falsche Positive auftreten, die durch Hybridisierung von Sonden mit homologen Stellen auf einer zufällig ahliliche Replikationsprodukte erzeugenden Nicht-Zielsequenz-DNA produziert werden. Trotz des sehr empfindlichen Nachweises der Zielsequenz-DNA ist ferner die Bestimmung der Zahl der in der Probe vorhandenen Zielsequenzen ohne signifikante Erhöhung der Komplexität des Tests nur schwer durchzuführen. Da die Zahl der infektiösen Erreger zur Festlegung des Behandlungsprotokolls der Erkrankung oft wichtig ist, weist dieses Amplifikationsverfahren einen einschränkenden Nachteil auf, da es qualitative statt quantitative Ergebnisse liefert.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von Verfahren und Sonden, die in quantitativen Tests vorteilhafter verwendet werden können.
Ein weiteres Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Nucleinsäurenachweises ist die Verwendung einer Hybridisierungssonde, die an ein RNA- Molekül gekoppelt oder darin eingeschlossen ist, das durch eine RNA-gerichtete RNA- Polymerase repliziert werden kann (d. h. - eine Matrize dafür ist). Beispielsweise werden eine Reihe von Verfahren zur Erzeugung von RNA-Sonden durch Derivatisierung von MDV-1-RNA, einer 221 Nucleotide aufweisenden RNA-Matrize für die RNA-abhängige RNA-Polymerase Qβ-Replikase, von Chu, B. C. F., Kramer, F. R. und Orgel, L. E., "Synthesis of an Amplifiable Reporter RNA for Bioassays", Nucl. Acids Res. 14 (1986), 5591-5603; Lizardi, P. M., Guerra, C. E., Lomeli, H., Tussie-Luna, I. und Kramer, F. R., "Exponential Amplification of Recombinant-RNA Hybridization Probes", Bio/Technology 6 (Oktober 1988), 1197-1203; und europäische Patentanmeldung 0 266 399 (EP-Anmeldung Nr.87 90 3131.8) bereitgestellt. Das replizierbare RNA-Sondenkonstrukt kann vorteilhaft in einem empfindlichen Hybridisierungstest wie dem von Ranki et al., US-Patent 4,563,419, Soderlund, G. B., US-Patent 2,169,403, Stabinsky, US-Patent 4,751,177, und Syvanenen et al., Nucl. Acids Res. 14, 5. 5037-5048, beschriebenen verwendet werden. Nach der Hybridisierung wird das mit der Zielsequenz assoziierte RNA-Sonden-chimäre Molekül, repliziert, wobei RNA-Mengen erzeugt werden, die durch eine Reihe von Verfahren leicht nachgewiesen werden können (beispielsweise durch Fluoreszenz unter Verwendung eines Farbstoffs wie Ethidiumbromid oder Propidiumiodid). Da sich die Zahl der MDV-1-RNA-Matrizen der Qβ-Replikase alle 20 Sekunden in vitro verdoppelt, erhöht sich die Zahl an RNA-Molekülen innerhalb weniger Minuten bei einer einzigen Temperatur exponentiell (beispielsweise milliardenfach) und steigt weiter bei dieser Geschwindigkeit, bis die Zahl an Matrizen die Zahl an aktiven Enzymmolekülen in der Reaktion übersteigt. Danach erhöht sich die Menge an Matrizen-RNA linear mit der Zeit. Daher steht in Reaktionen, sofern ein ausreichender Zeitraum zum Erreichen dieser linearen Phase zur Verfügung ist (beispielsweise 15 Minuten für 100 Moleküle), die Menge an amplifiziertem RNA-Produkt in direktem Zusammenhang mit dem Logarithmus der Zahl an anfänglich zugesetzten Matrizen-RNAs (Lizardi et al., a.a.O.). Da die anfängliche Zahl an Matrizen-Sonden proportional zur Menge an Zielsequenzen ist, kann die in der untersuchten Probe vorhandene Zahl an Zielsequenzen im Gegensatz zu den sogenannten PCR-Amplifikationsverfahren über einen sehr weiten Bereich vorteilhaft quantifiziert werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt nutzt die Eigenschaften dieser RNA-Matrizen für die RNA-abhängige RNA-Polymerase Q-beta-Replikase aus.
Bisher gab es eine begrenzte Zahl von Verfahren zur Bindung der replizierbaren RNA an eine Sonde. Aus Gründen der Nützlichkeit dienen diese Sonden-RNA- Konstrukte entweder direkt als Matrizen für die Replikase, oder die Sondeneinheit wird vor der Replikation entfernt. In einem Verfahren wird die Sonde über eine Cystamineinheit, die eine vor der Replikation spaltbare Disulfid (-S-S-)-Bindung enthält, an die RNA gekoppelt (Chu et al., a.a.O.). Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß mehrere Syntheseschritte erforderlich sind, die die Arbeitskosten für die Produktion dieser Sonden erhöhen. Ferner werden diese Disulfidbindungen, wie es dem Fachmann leicht verständlich ist, durch in vielen biologischen Proben natürlich vorkommende Reduktionsmittel (beispielsweise Glutathion) zu früh gespalten.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Vermeidung der Einschränkungen, die durch diese Disulfidbindungskonstruktionen verursacht werden.
In einem weiteren Verfahren kann die Sondensequenz in die Sequenz der replizierbaren RNA eingeschlossen werden (Lizardi et al., a.a.O.). Die Fremd-RNA- Sequenz in vielen dieser Konstrukte schadet jedoch entweder der Fähigkeit der RNA zur effizienten Replikation, oder sie wird während der Replikation spontan deletiert. In einer Sammlung von acht derartigen Konstrukten wurden beispielsweise zwei zuverlässig repliziert, sechs replizierten jedoch wenig oder es wurde die Sondensequenz während der Replikation deletiert. Da diese Deletionsereignisse die Replikationsgeschwindigkeit beeinflussen und zeitlich zufällig erfolgen, kann die in der linearen Phase der Amplifikation erhaltene Menge an RNA-Produkten nicht zur Beurteilung der Menge an Zielsequenzen herangezogen werden. In vielen Organismen kann ferner aufgrund eines hohen Grades an Sequenzhomologie zwischen der Zielsequenz und den Nucleinsäuren in nicht-infiziertem Material nur eine begrenzte Zahl an Sequenzen (beispielsweise eine oder zwei) als Hybridisierungszielsequenz verwendet werden. Daher schränkt die zusätzliche Notwendigkeit einer stabilen und effizienten Replikation der Sondensequenz die allgemeine Verwendung dieses Verfahrens ein.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von Sonde-Matrizen-RNA-Konstruktionen und Verfahren, die diese Einschränkung überwinden.
Es wird berichtet, daß die Bindung der Sondensequenz entweder an den 3'- oder 5'-Terminus der Matrizen-RNAs über die üblicherweise in RNAs vorkommende Phosphodiesterbindung trotz ihrer leichten Erreichbarkeit durch einige Verfahren die Replikation stark hemmt. Durch Ligierung eines kurzen Oligoribonucleotids A&sub1;&sub0; an das 5'-terminale Nucleotid der MDV-1-RNA verliert die RNA beispielsweise ihre Fähigkeit zur exponentiellen Replikation (Miele, Dissertation (pH. D. thesis), Columbia- Universität, 1982). Die Bindung von weiteren Nucleotiden an den 3'-Terminus von anderen Matrizen-RNAs hemmt in ähnlicher Weise ihre Replikation durch die Qβ- Replikase. Das Anfügen von 10 bis 20 Cytidylatresten an den 3'-Terminus der Qβ- Phagen-RNA beseitigt beispielsweise seine Matrizenaktivität (Gillis E., Devos, R. und Seurinck-Opsomer, C., Arch. Int. Physiol. Biochem. 84 (1976), 392-393); das Anfügen eines kürzen Oligoadenylatstrangs hat eine ähnliche Wirküng (Gilvarg, C., Jockusch, H. und Weissmann, C., Biochem. Biophys. Acta 414 (1975), 313-8; vgl. ferner Devos, R., van-Emmelo, J., Seurinck-Opsomer, C., Gillis, E. und Fiers, W., Biochim. Biophys. Acta. 447 (1976), 319-27). In WO 87/06270 von Chu et al. wird offenbart, daß die Bindung eines Affinitätsmoleküls an die RNA-Matrize möglich ist, sofern sie über eine Purinbindung erfolgt, so daß sie vor der Replikation einem sauren Spaltungsverfahren zur Abspaltung von Purin unterzogen werden kann. Im Stand der Technik wurde jedoch nachgewiesen, daß dieses Verfahren nicht funktioniert, und daher wurde dieses Verfahren nicht zur Bindung von Sondensequenzen an die replizierbare RNA verwendet.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung neuer Sonden und Verfahren zu ihrer Verwendung, die eine größere Flexibilität bei der Anordnung der Nucleinsäuresonden-Sequenzen in bezug auf die Matrizen der autokatalytischen RNA-Polymerase ermöglichen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung von replizierbaren RNA-Matrizen, die an den 5'-Terminus der replizierbaren RNA gebundene, zielsequenzspezifische Nucleinsäure-Sondensequenzen verwenden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung von Sonden und Verfahren zu ihrer Verwendung, die an den 3'-Terminus der replizierbaren Qβ-RNA gebundene, zielsequenzspezifische Nucleinsäuresonden einschließen.
Foster und Symons (Cell, 50 (1987), 9-16) und Uhlenbeck (Nature, 328 (1987), 596-600) beschrieben in Pflanzenvirusoiden und anderswo gefundene RNA- Sequenzen mit der einzigartigen Eigenschaft, in Gegenwart von divalenten Kationen autokatalytisch gespalten zu werden. Eine dieser Strukturen, die hier nachstehend als Hammerkopf ("hammer-head")-Struktur bezeichnet wird, schließt die Verbindung von drei doppelsträngigen Helices in einem Bereich von definierter und absoluter Sequenzkonservierung ein. Uhlenbeck zeigte, daß die "Domänen" dieser Struktur auf getrennten RNA-Molekülen liegen können, sofern sie sich durch Hybridisierung aneinanderlagern. W. Gerlach (Adeleide, Australia) verwendete eine RNA, die einen Teil dieser Struktur trug, um eine weitere, überhaupt nicht-verwandte, die restlichen Elemente tragende RNA zu spalten, wodurch gezeigt wurde, daß in vitro die Botschaft für die Chloramphenicol-Acetyltransferase als Zielsequenz der Spaltung verwendet werden kann, indem geeignete RNA-Sequenzen zur Bildung der richtigen Struktur gewählt werden.
Diese Hammerkopf ("hammer-head")-ähniichen Strukturen erhielten den Namen "Ribozyme", die hier verwendete Bezeichnung, da eine der beiden RNAs in der Reaktion wie ein wirklicher Katalysator während der Reaktion nicht verbraucht wird und zur Spaltung einer unbegrenzten Zahl von Substrat-RNAs verwendet werden kann.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung von Sonden und Verfahren zu ihrer Verwendung, die replizierbare RNA-Matrizen zusammen mit Ribozymen zum Nachweis von Zielsequenzpolynucleotiden verwenden.
Wie der Fachmann erkennen kann, ist jedes Verfahren, in dem eine Hybridisierungssonde amplifiziert wird, durch den Hintergrund begrenzt, der durch Replikation von Sondenmolekülen produziert wird, die im Hybridisierungsverfahren ungeachtet der Gegenwart der Zielsequenz vorhanden sind, da sogar ein einziges Matrizen- RNA-Molekül zu einem nachweisbaren Produkt führen kann. In einem eine replizierbare RNA-Sonde verwendenden Hybridisierungstest mit einer auf Nitrozellulose immobilisierten Zielsequenznucleinsäure wurde beispielsweise festgestellt, daß ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenz 10&sup5; Sondenmoleküle gebunden wurden (Lizardi et al., a. a. 0.). Dieser Hintergrund begrenzt die Empfindlichkeit dieser Tests, da in gleicher oder geringerer Zahl vorhandene Zielsequenzen nicht signifikant zur Ausbeute des amplifizierten Produkts beitragen und daher nicht zuverlässig bestimmt werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung einer RNA-Matrizen-Sondenkonstruktion und Verfahren, die auf Beschränkungen durch den Hintergrund weniger empfindlich sind.
Eine Vorgehensweise zur Reduktion dieses Hintergrunds verwendet ein Verfahren, durch das der Zielsequenz-Sonden-Komplex reversibel an den Träger gebunden wird ("reversibles Zielsequenzfangen"). Nach Hybridisierung und Immobilisierung wird der Komplex vom Träger eluiert, der dann mit der nicht-spezifisch gebundenen Sonde verworfen wird. Der Komplex wird anschließend von einem frischen Träger erneut gefangen. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, um eine signifikante Reduktion (beispielsweise eine 10&sup9;fache) der Menge an nicht-hybridisierter Sonde zu erreichen (vgl. europäische Patentanmeldung Nr.87 30 9308.2 von Collins für eine genauere Beschreibung dieses Zielsequenz-Zyklus-Verfahrens).
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung von Konstrukten und Sonden, die in diesen reversiblen Zielsequenzfangverfahren verwendet werden können.
Gemäß den erfindungsgemäßen Prinzipien und Aufgaben wird eine Sonde bereitgestellt, die eine ein 3'- und 5'-Ende aufweisende und durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbare RNA-Matrize umfaßt, wobei die Sonde ferner eine erste und zweite Nucleinsäure-Sondensequenz an den oder nahe den jeweiligen Enden der RNA-Matrize umfaßt und so angepaßt ist, daß nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenznucleinsäure ein Ribozym gebildet wird, wobei das Ribozym nach der Spaltung die RNA-Matrize in einer replizierbaren Form freisetzt. Diese Sonde kann die Merkmale in den Ansprüchen 9 bis 14 aufweisen.
Diese Sonde kann in einem Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenznucleinsäure init einer ersten und zweiten Nucleinsäuresequenz in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Zielsequenznucleinsäure enthält, verwendet werden, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) den Erhalt der Zielsequenznucleinsäure in einzelsträngiger Form, sofern notwendig;
(b) weiterhin die Bereitstellung einer Sonde, die umfaßt:
(i) eine RNA-Matrize mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist;
(ii) eine erste Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe dem 5'- Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der ersten Nucleinsäuresequenz der Zielsequenznucleinsäure (erste Zielsequenz) komplementär ist; und
(iii) eine zweite Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe dem 3'-Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der zweiten Nucleinsäuresequenz der Zielsequenznucleinsäure (zweite Zielsequenz) komplementär ist; und
(c) Inkontaktbringen der Probe mit der Sonde unter Bedingungen, die das Zustandekommen einer Hybridisierung zwischen der ersten bzw. zweiten Nucleinsäure- Sondensequenz und der ersten bzw. zweiten Zielsequenz zur Bildung eines die Sequenzen der Sonde umfassenden Ribozyms erlauben;
(d) Induktion der Ribozym-Spaltung, die die RNA-Matrize von der Zielsequenznucleinsäure freisetzt;
(e) Ermöglichung der Replikation der freigesetzten RNA-Matrize; und
(f) Nachweis der replizierten RNA-Matrize als Anzeichen für die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenznucleinsäure in der Probe.
Im Schutzbereich der Erfindung ist ferner auch ein Verfahren zum Nachweis einer Zielsequenznucleinsäure mit einer ersten und zweiten Nucleinsäuresequenz in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Zielsequenznucleinsäure enthält, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) den Erhalt der Zielsequenznucleinsäure in einzelsträngiger Form, sofern notwendig;
(b) weiterhin die Bereitstellung einer ersten Sonde, die umfaßt:
(i) eine RNA-Matrize mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist; und
(ii) eine erste Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe einem Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der ersten Nucleinsäuresequenz der Zielsequenznucleinsäure (erste Zielsequenz) komplementär ist;
(c) zusätzliche Bereitstellung einer zweiten Sonde, die umfaßt:
(i) eine zweite Nucleinsäure-Sondensequenz, die im wesentlichen zu der zweiten Nucleinsäuresequenz der Zielsequenznucleinsäure (zweite Zielsequenz) komplementär ist;
(ii) eine dritte Sequenz am oder nahe einem Ende der zweiten Sonde, die im wesentlichen zu einem Teil der ersten Sonde komplementär ist;
(d) gleichzeitiges oder getrenntes Inkontaktbringen der Probe mit der ersten und zweiten Sonde unter Bedingungen, die das Zustandekommen einer Hybridisierung zwischen der ersten bzw. zweiten Sondensequenz und der ersten bzw. zweiten Zielsequenz und zwischen der ersten und zweiten Sonde zur Bildung eines Sequenzen der ersten und zweiten Nucleinsäuresonde umfassenden Ribozyms erlauben;
(e) Induktion der Ribozym-Spaltung, die die RNA-Matrize von der Zielsequenznucleinsäure freisetzt;
(f) Ermöglichung der Replikation der freigesetzten RNA-Matrize; und
(g) Nachweis der replizierten RNA-Matrize als Anzeichen für die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenznucleinsäure.
Diese Verfahren können die in den Ansprüchen 3 bis 7 beschriebenen Schritte aufweisen.
Sonden zur erfindungsgemäßen Verwendung können in einem Kit bereitgestellt werden, der gegebenenfalls Verwendungshinweise einschließt.
Dieser Kit kann die in Anspruch 16 beschriebenen Merkmale aufweisen.
Die durch eine Sequenzverlängerung am 5'-Ende von MDV-1 erzeugte Inhibition wird in der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet, wobei ein ternäres Hybrid, das sich zwischen einer eine 5'-Sondenverlängerung tragenden replizierbaren RNA, einer zweiten RNA-Sonde und einer Zielsequenz-RNA bildet, eine autokatalytische RNA-Struktur (Ribozym) hervorbringt, die die 5'-Verlängerung von der replizierbaren RNA-Sonde abspaltet, diese gleichzeitig in eine effizient replizierende Form umwandelt und ihre Freisetzung von dem Träger bewirkt. Dieses Verfahren ist weniger bevorzugt, da es zur Erzeugung einer aktiven Ribozymstruktur eine das spezifische Sequenzelement 5'-GAAA-3' enthaltende Zielsequenz-RNA benötigt. Die charakteristische Unfähigkeit der Sondenmoleküle, vor ihrer spezifischen Bindung an die Zielsequenz zu replizieren, führte zu ihrer Bezeichnung als "intelligente" (smarte) Sonden, da sie ein weiteres Verfahren zur Reduktion des Hintergrunds in Hybridisierungstests liefern. Die Ribozym-Struktur ist die "zirküläre" Struktur, die im eingerahmten Teil von Figur 1A genauer dargestellt ist. Der Pfeil zeigt die Stelle, wo die Spaltung in Gegenwart von divalenten Kationen wie Mangan, Magnesium oder Calcium erfolgt.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine nicht-spezifische Sequenz zwischen der Sonde und der replizierbaren RNA-Sequenz angeordnet. Die Sequenz dieses "Spacer"-Elements kann vorteilhaft verändert werden, so daß die Nachweisgrenze (d. h. - die kleinste Zahl an Molekülen, die nach der Inkubation mit Qβ-Replikase zu einem nachweisbaren Produkt führt) optimal eingestellt werden kann. Ein Verfahren zur Erzeugung und Wahl einer optimalen Spacersequenz, das von einer Population von sonst identischen RNA-Konstrukten ausgeht, die einen definierten Bereich einer Zufallssequenz zwischen der replizierbaren RNA und den Sondensequenzelementen tragen, wird bereitstellt.
In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform wird ein Sondenpaar konstruiert, das benachbarte Stellen in der Zielsequenznucleinsäure bindet. Eine Sonde des Paars umfaßt vorzugsweise eine Qβ-RNA-Matrize, die entweder eine 3β- oder eine 5'-Verlängerung aufweist, die ein durch eine Spacersequenz von der replizierbaren RNA getrenntes Sondensequenzelement trägt. Die zweite Sonde umfaßt ein Oligonucleotid, das an ein Freisetzungsmittel gekoppelt ist, das eine Nuclease umfaßt, die ein Ribozym ist (oder ein Affinitätsreagens, das wiederum die Nuclease binden kann), das die endonucleolytische Spaltung innerhalb der Spacersequenz der ersten Sonde steuert. Die Nuclease ist idealerweise ein beliebiges Mitglied einer Klasse von Ribozymen, die inaktiv sind, bis ein für ihre Aktivität essentieller Cofaktor zugesetzt wird. Beide Sonden können vorteilhaft in einem Hybridisierungstest verwendet werden, in dem die Zielsequenznucleinsäure zusammen mit den gebundenen Sonden immobilisiert ist. Nach dem Wegspülen des größten Teils der nicht-gebundenen Sonden wird der für die Aktivität des Ribozyms erforderliche Cofaktor zugesetzt, wodurch die Spaltung und Freisetzung der eine kurze Verlängerung tragenden, replizierbaren RNA in die Lösung bewirkt wird. Diese RNA kann anschließend durch die Qβ-Replikase vorteilhaft amplifiziert werden.
Eine Reihe von weiteren Ausführungsformen von diese verlängerten Qβ- Matrizen verwendenden intelligenten (smarten) Sondensystemen werden bereitgestellt.
Während die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Sonden zielsequenzspezifische RNA-Sequenzen sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der replizierbaren RNA-Matrize verwenden, arbeitet auch in diesen Bereichen die vorliegende Erfindung mit DNA-Sonden, allerdings wird es einfach zu verstehen sein, daß die Konstruktion und Produktion einer gemischten erfindungsgemäßen DNA-RNA-Sonde schwerer ist. Die zur Bildung des Ribozyms erforderlichen Sequenzen müssen jedoch aus RNA (und wie in der in Figur 1A dargestellten Ribozym-Struktur genauer angegeben) sein, damit sich die gewünschte Ribozymstruktur bildet und induzierbar gespalten wird. Diese Spaltung erfolgt in der am meisten bevorzugten Ausführungsform in Gegenwart von Magnesium, das auch als Cofaktor der Qβ-Replikase-gerichteten Replikation der RNA- Matrize, idealerweise eine Midivariante, dient. Obwohl Magnesium wirksam ist, ist es weniger bevorzugt, da sich die Matrizen-Spezifität verändern kann und daher die Replikation nicht mit der gewünschten Genauigkeit erfolgt.
Die am meisten bevorzugte RNA-Matrize ist MDV-1 oder eine Midivariante, eine 221 Nucleotide umfassende RNA, die von Chu et al., WO 87/06270, beschrieben und in mit dem Bakteriophagen Qβ infizierten Zellen gefunden wurde. MDV-1 ist eine übliche Verunreinigung von Qβ-Replikasepräparation. Die Qβ-Replikase wirkt auf (d.h. repliziert) RNA-Matrizen, die bestimmte Primär- und Sekündärstrukturen wie MDV-1- oder andere Strukturen aufweisen. MDV-1 hat anscheinend, während es zusammen mit dem Qβ-RNA-Genom repliziert wird, keine bekannte Funktion. Es ist ferner bekannt, daß es eine natürliche Veränderlichkeit an den 5'- und 3'-Termini zeigt, die üblicherweise einfach als Anfügen oder Deletion eines GC-Paars in Erscheinung tritt, wobei zur Erläuterung in den Figuren 1 und 2 4 GC-Paare und in den Figuren 3 und 4 3 GC-Paare dargestellt sind.
Die stärker bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemaßen Sonde verwenden eine relativ "kurze" zielsequenzspezifische Sondensequenz am 3'-Terminus der RNA-Matrize. Am stärksten bevorzugt weist diese zielsequenzspezifische Sequenz eine Länge von etwa 4 bis etwa 12 Basen und idealerweise eine Länge von etwa 5 Basen auf. Diese relativ geringe Länge wird bevorzugt, da sie nach der Spaltung des Ribozyms die Dissoziation der replizierbaren RNA-Matrize von der Zielsequenz bei einer üblichen Spaltungstemperatur von etwa 55 ºC begünstigt.
Der Fachmann erkennt natürlich leicht, daß die Zunahme der Länge der zielsequenzspezifischen Sondensequenz am 5'-Terminus der replizierbaren RNA-Matrize üblicherweise eine Erhöhung der Zielsequenzspezifität bewirkt. Eine ausreichende Länge dieser Sonde ist ferner von großem Vorteil, so daß der Versuch einer Replikation der Matrize zu einem eine weitere Replikation verhindernden Matrizenzusammenbruch (template collapse) führt, wenn die zielsequenzspezifische 5'-terminale Sonde noch gebunden ist. Wenn andererseits sowohl die zielsequenzspezifischen 5'-terminalen als auch 3'-terminalen Sonden kürze Sonden sind, z. B. nur 5 Nucleotide lang, dann besteht in dieser Ausführungsform die Möglichkeit einer konstanten Bildung und Umsatz von Ribozymen, was zu einer noch schnelleren Spaltung von replizierbaren RNA-Matrizen führt. Der Nachteil dieser Ausführungsform im Vergleich zur am meisten bevorzugten Ausführungsform, die eine zielsequenzspezifische 5'-terminale Sequenz von bedeutend größerer Länge verwendet, besteht darin, daß ein gewisser Verlust an Zielsequenzspezifität zu erwarten ist.
Die am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Sonde umfaßt eine Midivariante als RNA-Matrize mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende und mit einer 5'- terminalen Leaderverlängerung, die eine zu einer ersten Zielnucleinsäuresequenz komplementäre, zielsequenzspezifische, erste Nucleinsäure-Sondensequenz umfaßt, auf die ein 5'-UC-3' folgt, und weiter mit einer 3'-terminalen Verlängerung (trailer extension), die 5'-CUGANGA-3' umfaßt, auf die eine zu einer zweiten Zielnucleinsäuresequenz komplementäre, zweite Nucleinsäure-Sondensequenz folgt, und die Midivariante weist am meisten bevorzugt die Sequenz auf, die in der Darstellung von Figur 1A am 5'-Ende mit GGGGACC... beginnt und am 3'-Ende mit ...GUUCCCC endet. Alternativ weist die Midivariante in einer anderen bevorzugten Ausführungsform eine Deletion eines der vier Cs am in Figur 1A dargestellten 3'-Ende auf, wodurch sich das U (am 3'-Ende und gerade noch in der in Figur 1A dargestellten Box) mit einem G paaren kann, worauf sich der Stamm "gerade ausrichten" kann, wodurch die Möglichkeit der Isomerisierung in einem derartigen Stamm beseitigt wird, was sonst zu einer Fehlpaarung entlang des übrigen Stammes führen würde. Diese Fehlpaarung würde schließlich eine Fehlinformation erzeugen und damit zur Inaktivität des Ribozyms führen, einem Ereignis, das zu vermeiden ist.
Eine alternative bevorzugte Ausführungsform (in Figur 2 dargestellt) verwendet eine Sondenkonstruktion, in der in der bevorzugten Ausführungsform die für die RNA-Zielsequenz spezifische, erste Nucleinsäure-Sondensequenz an die 5'-Leadersequenz der replizierbaren RNA-Matrize angefügt wird. Im Gegensatz zur am meisten bevorzugten Ausführungsform schließt jedoch der 3'-Terminus der replizierbaren RNA- Matrize keine zielsequenzspezifische Nucleinsäure-Sondensequenz ein. Stattdessen wird eine zweite Sonde, die eine für eine zweite RNA-Zielsequenz spezifische, zweite Nucleinsäure-Sondensequenz, die Hälfte der Ribozymstruktur und eine für einen Teil der 5'-RNA-Matrizenstammsequenz spezifische, dritte Nucleinsäure-Sondensequenz umfaßt, verwendet. Wie bei der am meisten bevorzugten Ausfühmngsform führt die Hybridisierung von beiden Sonden mit der RNA-Zielsequenz zur Bildung eines spaltbaren Ribozyms, in dem die RNA-Zielsequenz eine erforderliche 5'-GAAA-3'- Sequenz liefert.
Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Inkontaktbringen der erfindungsgemäßen bevorzugten Sondenkonstruktionen mit einzelsträngiger Zielsequenznucleinsäure unter Bedingungen, die eine Hybridisierung der ersten und zweiten Nucleinsäure-Sondensequenzen mit den ersten bzw. zweiten Zielsequenzen (mit der intervenierenden Sequenz 5'-GAAA-3') ermöglichen, wobei ein Ribozym gebildet wird. Dieses Ribozym wird anschließend vorteilhaft gespalten, beispielsweise indem es mit einem divalenten Kation, das aus der Gruppe von Mangan, Magnesium und Calcium ausgewählt wird, in Kontakt gebracht wird. Die RNA-Matrize, idealerweise die MDV-1-Midivariante, wird anschließend vorteilhafterweise von der Zielsequenznucleinsäure freigesetzt, da die "kurze" zweite Nucleinsäure-Sondensequenz am 3'-Ende der RNA-Matrize eine unzureichende Länge für eine stabile Hybridisierung mit der RNA-Zielsequenz aufweist. Die freigesetzte RNA-Matrize kann anschließend durch die Qβ-Replikase vorteilhaft repliziert und die replizierte RNA-Matrize als Anzeichen für die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenznucleinsäure nachgewiesen werden. Das optimale Verfahren schließt einen Trennungsschritt vor der Induktion der Spaltung ein, wobei die nicht-hybridisierte Sonde entfernt wird und daher nicht als eine verfügbare Matrize im Amplifikationszyklus durch die Qβ-Replikase zur Verfügung stehen kann. Die Entfernung kann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Immobilisierung des Sonden-Zielsequenz-Hybridisierungskomplexes über eine weitere ungelöste zielsequenzspezifische Sonde, die selbst direkt oder indirekt auf einer festen Oberfläche wie einem Fangkügelchen, Eintauchstreifen etc. immobilisiert ist. Diese sogenannten "Sandwich"-Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und müssen hier nicht genauer erläutert werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Ein genaueres Verständnis der Prinzipien, Ziele und anderen erfindungsgemäßen Gesichtspunkte kann durch ein Studium der beigefügten Figuren erhalten werden:
Figur 1A erläutert die am meisten bevorzugte Ausführungsform, in der die Hybridisierung einer Midivariante mit einer RNA-Zielsequenz gezeigt wird, wobei ein Ribozym (die in der Box enthaltene "zirkuläre" Struktur) gebildet wird, das die Spaltungsstelle zeigt;
Figur 1B zeigt die erhaltenen Spaltprodukte, die durch Zugabe eines divalenten Kations zum Sonden-Zielsequenz-Komplex von Figur 1A erhalten werden;
Figur 2 zeigt eine alternative Ausführungsform, in der eine eine RNA-Matrize und eine 5'-terminale, zielsequenzspezifische Sequenz umfassende erste Sonde mit der RNA-Zielsequenz hybridisiert und in der eine zweite Sondensequenz sowohl mit der RNA-Zielsequenz als auch mit einer 5'-terminale Stammsequenz der RNA-Matrize der ersten Sonde hybridisiert, wobei ein Ribozym gebildet wird;
Figur 3 zeigt als graphische Darstellung das allgemeine Konstruktionsschema eines cDNA-Clons, der zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Sonden verwendet wird;
Die Figuren 4A und 4B zeigen graphisch die Verwendung des in Figur 3 produzierten cDNA-Clons in einer Vektorkonstruktion zur Produktion der am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Sonde; und
Die Figuren 5A und 5B stellen die am meisten bevorzugte Ausführungsform graphisch dar, die ein Paar von Sonden verwendet, von denen eine die über ein spaltbares Spacerelement an eine zielsequenzspezifische Sonde gebundene Midivariante 1 umfaßt.
Zur Untersuchung der Ergebnisse von Miele (a.a.O.) und anderen wurde ein Satz von rekombinanten MDV-1-RNAs, die 3'-terminale Verlängerungen von unterschiedlichen Längen trugen, durch Transkription eines von Lizardi et al. (a.a.O.) beschriebenen cDNA-Clons erzeugt, der mit Restriktionsenzymen, deren Spaltungsstellen stromabwärts der MDV-cDNA vorkommen, unterschiedlich gespalten wurde. Es wurde überraschend festgestellt, daß im Gegensatz zur allgemeinen Lehre der Literatur eine Verlängerung der rekombinanten RNA-Matrize am 3'-Terminus von 183 Nucleotiden eine ausreichende Replikation ermöglichte, so daß die amplifizierten RNA-Produkte nachgewiesen werden konnten, wenn nur 10&sup4;-Moleküle, die diese 3'-Verlängerungen trugen, zur Inituerung einer Qβ-Replikasereaktion verwendet wurden. Die amplifizierten RNA-Produkte waren gleich groß wie die RNA, der eine 3'-Verlängerung fehlte, was anzeigte, daß die 3'-Verlängerung nicht zusammen mit dem Matrizen-Teil des Moleküls repliziert wurde. Dieses überraschende und vollständig unerwartete Ergebnis hat signifikante Auswirkungen auf die Verwendung der replizierbaren RNAs als Sonden in amplifizierten Hybridisierungstests, da es eine größere Flexibilität bei der Anordnung der Sondensequenzen auf der replizierbaren RNA ermöglicht.

Beispiel 1

Herstellung eines Ribozyms: Qβ-Matrizen-RNA-Sonden-Chimäre

Das in Figur 1 dargestellte RNA-Konstrukt wird durch das nachstehend beschriebene Verfahren hergestellt. Zwei synthetische Oligonucleotidprimer werden durch dem Fachmann vertraute Verfahren hergestellt. Der erste Primer enthält einen Strang mit mehreren für anschließende Konstruktionen (vgl. Figur 4A) verwendeten Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, der mit einem Teil verbunden ist, der zur Sequenz nahe dem letzten 3'-Nucleotid A des Plusstrangs der midivarianten RNA, eine Matrize für die Enzym-Qβ-Replikase, komplementär ist, dieses jedoch nicht enthält. Wie dem Fachmann bekannt ist, muß die genaue Länge einer zu diesem Bereich der RNA komplementären Sequenz ausreichend sein, um ein intermolekulares Hybrid zu bilden und die intramolekulare Basenpaarung, die in diesem Bereich in der midivarianten RNA vorhanden ist, zu ersetzen. Das zweite Oligonucleotid enthält in der Anordnung vom 5'- zum 3'-Ende die Sequenz, die einen Strang des Promotors für eine in Transkriptionrichtung gelesene DNA-abhängige RNA-Polymerase umfaßt. Hier ist es der vom Bakteriophagen T7 codierte Promotor für die RNA-Polymerase, einem hoch effizienten Enzym, obwohl, wie dem Fachmann bekannt ist, auch die Promotoren für andere RNA-Polymerasen verwendet werden können. Diesem Sequenzelement folgt in 3'- Richtung eine Spaltstelle für eine Restriktionsendonuclease, die einen versetzten Bruch in doppelsträngiger DNA erzeugt und ein überstehendes, einzelsträngiges, verlängertes 3'-Ende zurückläßt In diesem Beispiel ist dieses Enzym ApaI und seine Sequenz überlappt teilweise den Promotor der T7-RNA-Polymerase. An diese Stelle schließt sich eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuclease an, die aus einer beliebigen Klasse von Enzymen stammen kann, die eine Sequenz erkennen und die DNA in einem Bereich 3'-seitig zum Sequenzelement spalten und eine versetzte Spaltung und ein überstehendes, einzeisträngiges, verlängertes 5'-Ende zurücklassen. Diese Erkennungssequenz wird so angeordnet, daß die Spaltung des endgültigen DNA-Vektorkonstrukts in einem Strang so gesteuert wird, daß sie unmittelbar vor der die midivariante RNA codierenden Sequenz erfolgt. In diesem Beispiel (vgl. Figur 4A) ist dies die Stelle für die Restriktionsendonuclease EarI, die die Sequenz CTCTTCN erkennt, wobei N ein beliebiges Nucleotid ist, und die DNA im gleichen Strang nach dem Nucleotid N und drei Nucleotide weiter im komplementären Strang spaltet. Schließlich folgt dieser Sequenz eine andere Sequenz, die zu der nahe dem 5'-Terminus der midivarianten RNA (MDV-1-RNA) liegenden und diese einschließenden Sequenz homolog ist, wobei die midivariante RNA eine ausreichende Länge zur Anlagerung und zum Primen der Synthese eines zweiten Strangprodukts, wie nachstehend beschrieben, aufweist, ausgenommen, daß Desoxyribonucleotide die in MDV-1 geftindenen Ribonucleotide ersetzen.
Das erste Oligonucleotid wird als Primer zur Synthese einer cDNA der midivarianten RNA verwendet, wie in Figur 3 dargestellt. MDV-1 wird durch eine ohne exogene Matrizen-RNA inituerte Qβ-Replikasereaktion erhalten. So werden große Mengen an MDV-1-RNA erzeugt, da alle durch irgendein Verfahren hergestellten Präparationen des Qβ-Replikase-Holoenzyms üblicherweise mit geringen Mengen dieser RNA verunreinigt sind. Jeweils 1 pmol des vorstehend beschriebenen ersten Oligonucleotids und der MDV-1-RNA werden vermischt und durch Erhitzen und langsames Abkühlen des Gemisches aneinandergelagert. Diese Primer-Matrizen-Kombination wird zur Inituerung einer Reaktion der reversen Transkriptase, so wie von Maniatis et al., A Cloning Manual beschrieben, verwendet. Nach Abschluß der Synthese des ersten Strangs wird die midivariante RNA durch milde alkalische Behandlung oder alternativ durch eine RNase H-Behandlung zerstört. Der zweite komplementäre Strang wird durch Anlagerung des Produkts dieser Reaktion an das vorstehend beschriebene zweite Oligonucleotid und dessen Verlängerung mit einer DNA-abhängigen DNA- Polymerase erzeugt. Dieses Produkt kann anschließend in einen selektierbaren, replizierbaren DNA-Vektor, so wie von Maniatis et al. beschrieben, doniert werden. Potentielle Clone werden auf die Gegenwart aller Restriktionsendonucleasestellen, die durch übliche Verfahren in die Oligonucleotide eingeschlossen werden, untersucht.
Nach der Vermehrung in und Reinigung von Bakterien wird die clonierte cDNA mit den Restriktionsendonucleasen ApaI und KpnI gespalten. Das kleinere Fragment wird durch Elektrophorese gereinigt und mit der Restriktionsendonuclease HinfI gespalten. Dieses Enzym spaltet die cDNA an der Stelle, die der Position 65 im MDV-1 entspricht. In der natürlich vorkommenden Population von MDV-1-RNAs kommt diese Stelle jedoch in nur einer Fraktion der Moleküle vor. Daher muß nach Clonen mit der geeigneten Sequenz gesucht werden. Danach werden die Hinf- Subfragmente an das Oligonucleotid 5'-pGA&sub1;&sub0;-3' ligiert, das an das Oligonucleotid 5'- pCT&sub1;&sub0;-3'angelagert war. Dieses Ligierungsgemisch wird mit ApaI und KpnI gespalten.
Das erhaltene Gemisch wird in das große Fragment ligiert, das durch Spaltung des vorstehend produzierten Vektors mit ApaI und KpnI erhalten wird. Dies erzeugt einen Clon, in dem die die Midivariante codierende DNA-Sequenz durch einen Strang von A- Resten unterbrochen wird. Beliebige Sequenzen können für den in diesem Beispiel verwendeten A&sub1;&sub0;-Bereich eingetauscht werden. Es ist jedoch bekannt, daß A&sub1;&sub0; während der Replikation von midivarianter RNA erhalten bleibt, wie es von Miele et al. (J. Mol. Biol. (1983), 281-295) beschrieben wird.
Nach der Vermehrung in und Reinigung von Bakterien wird die clonierte DNA von der vorstehenden Konstruktion in zwei getrennten Reaktionen gespalten (vgl. Figur 4A). In der ersten Reaktion wird das die vollständige midivariante RNA-cDNA tragende Segment mit den Enzymen EarI und SmaI ausgeschnitten. Dieses Spaltungsgemisch wird mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von Thymidintriphosphat behandelt, um drei Nucleotide vom 3'-Ende des Strangs, der die Sequenz im gleichen Sinn wie der MDV-1-plus-Strang trägt (z. B. der in Figur 1 dargestellte Strang, sein komplementärer Teil ist der Minusstrang, auch eine replizierbare RNA-Matrize), zu entfernen. Das erhaltene modifizierte Fragment wird durch Elektrophorese mittels Polyacrylamidgelen gereinigt. Die zweite Restriktionsspaltung wird mit den Enzymen ApaI und KpnI durchgefuhrt. Das größere der beiden Fragmente wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt.
Zwei Oligonucleotide werden synthetisiert. Das erste enthält vorteilhafterweise die Sequenz 5'-CCCCTGANGA-3', auf die mindestens vier Nucleotide folgen, die zur RNA-Zielsequenz 5'-seitig zum 5'-GAAA-3'-Element komplementär sind und mit der Sequenz 5'-GATC-3' enden. Das zweite Oligonucleotid enthält idealerweise die Sequenz 5'-CCCGA-3', auf die mindestens 4 Nucleotide der Sequenz 3'-seitig zum 5'- GAAA-3'-Element in der Zielsequenz folgen, ausgenommen, daß Desoxyribonucleotide die Ribonucleotide der Zielsequenz ersetzen. Diesem Element folgt vorteilhafterweise unmittelbar das Element 5'-GGGG-3'. Alle Oligonucleotide sind an ihrem 5'-Terminus durch die T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert.
Beide Oligonucleotide werden an das durch KpnI-ApaI-Spaltung von Vektor- DNA erhaltene große Fragment in einem Reaktionsgemisch ligiert, das T4-DNA-Ligase und ATP, wie beispielsweise von Maniatis et al. (ebenda) beschrieben, enthält. Das Ligierungsprodukt (vgl. Figur 4B) wird von den nicht-ligierten OligoNucleotiden durch Gelfiltration gereinigt. Das Ligierungsprodukt wird anschließend an das den modifizierten Terminus tragende kleine EarI-SmaI-Fragment ligiert. Das erhaltene, eine Lücke aufweisende Molekül wird durch Behandlung mit einer DNA-abhängigen DNA- Polymerase in einen vollständigen Doppelstrang überführt. Dieses Produkt kann vorteilhaft in Bakterien eingeführt und vermehrt werden.
Wie dem Fachmann bekannt ist, erzeugen diese Manipulationsschritte DNA- Clone, in denen der MDV-cDNA-Teil sowohl in seiner normalen als auch umgekehrten Orientierung relativ zur Richtung der Transkription durch die T7-RNA-Polymerase insertiert ist. Die Clone, die die MDV-cDNA in der Plusstrangorientierung (eine Orientierung, bei der durch Transkription eine den Plusstrang von MDV-1 enthaltende RNA erhalten wird) enthalten, werden durch Durchmustern auf eine geeignete Größe aufweisende Restriktionsendonuclease-Fragmente ermittelt, von denen bekannt ist, daß sie in der MDV-1-cDNA-Sequenz spalten.
Die von einem Clon mit MDV- 1 in der Plusstrangorientierung hergestellte DNA wird an einer Restriktionsstelle gespalten, die vom zweiten Sondenelement relativ zum Promotor entfernt ist. In diesem Beispiel ist dies die Restriktionsendonuclease DraI. Diese gespaltene DNA wird zur Erzeugung der RNA-Sonde vorteilhaft durch die T7-RNA-Polymerase in vitro unter Bedingungen, wie von Milligan et al. (Nucl. Acid. Res. 15 (1987), 8783-8798) beschrieben, transkribiert.

Beispiel 2

Zusammenbau eines bimolekularen Ribozym-Sondensatzes

Der in Beispiel 1 beschriebene cDNA-Clon wird mit den Enzymen ApaI und EarI gespalten und das große Fragment vom vorstehend beschriebenen kleinen Fragment vollkommen gereinigt. Ein Oligonucleotid mit der Sequenz 5'-CCCGA-3', der sich 4 bis 50 Nucleotide, die zur Sequenz unmittelbar 3'-seitig eines 5'-GAAA-3'-Elements in der Zielsequenz identisch sind, anschließen, auf die wiederum die Sequenz 5'-GGCC-3' folgt, wird durch ein beliebiges, dem Fachmann bekanntes Verfahren synthetisiert. Dieses Oligonucleotid wird an das große Restriktionsfragment angelagert und mit diesem ligiert und der erhaltene einzelsträngige Bereich der Lücke durch die Wirkung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase zum Doppelstrang ergänzt. Diese DNA wird in Bakterien eingeführt und dort vermehrt. Nach der Reinigung von den Bakterien kann sie mit der Restriktionsendonuclease SmaI gespalten und anschließend als Matrize in einer in vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase verwendet werden.
Die zweite Sequenzsonde kann durch Konstruktion einer synthetischen DNA- Matrize für die T7-RNA-Polymerase erzeugt werden, wie von Milligan et al. (Nucl. Acid. Res. 15 (1987), 8783-8798) beschrieben, wobei ein Strang dieser Matrize an seinem 5'-Ende mit mindestens 4 Nucleotiden der Sequenz vom Bereich 5'-seitig zum 5'- GAAA-3'-Element in der Zielsequenz beginnt, ausgenommen, daß Desoxyribonucleotide die in der Zielsequenz gefundenen Ribonucleotide ersetzen, worauf die Sequenz
folgt, wobei N ein beliebiges Nucleotid anzeigt. Der andere Strang der Matrize ist ein Oligonucleotid mit der Sequenz
Diese beiden Oligonucleotide werden vorzugsweise vermischt und in vitro transkribiert, wie von Milligan et al. (ebenda) beschrieben. Das Produkt kann durch ein beliebiges, dem Fachmann vertrautes Verfahren leicht gereinigt werden.

Beispiel 3

Replikation von 3'-terminale Verlängerungen tragenden modifizierten MDV-1-RNAs

Ein cDNA-Clon von MDV-1, der dem in Beispiel 1 beschriebenen entsprach, wurde von F. R. Kramer vom Public Health Research Institute, New York City, erhalten und enthielt einen Promotor der T7-RNA-Polymerase und eine modifizierte MDV-1cDNA-Sequenz, in der das Sequenzelement
das 3'-Nucleotidsegment ersetzte, das die Nucleotide 64 bis 66 in der natürlich vorkommenden MDV-1-RNA codiert, woran sich die Sequenz 5'-GGGAATTC-3' anschloß. Diese gesamte Sequenz wurde zwischen die HindIII-Stelle und die EcoRI- Stelle von pSP64 cloniert (Melton et al., Nucl. Acid. Res. Bd. 12, S. 7035-7056). Dieses Plasmid wurde mit den Restriktionsendonucleasen SmaI, EcoRI, AluI und PvuII getrennt gespalten und jede der gespaltenen Präparationen durch T7-RNA-Polymerase unter den von Milligan et al. beschriebenen Bedingungen in vitro transkribiert. Die in diesen Reaktionen produzierten RNAs wurden durch denaturierende Polyacrylamid- Gelelektrophorese gereinigt. Dieses Verfahren fuhrte zur Erzeugung von modifizierten MDV-1-Molekülen, die entweder keine in der natürlich vorkommenden MDV-1-RNA gefundene Verlängerung über den 3'-Terminus hinaus oder eine 3'-seitige Verlängerung von 7 Nucleotiden, 24 Nucleotiden oder 183 Nucleotiden trugen.
Mit den gereinigten RNAs wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt, und 10&sup4; Moleküle wurden zum Primen einer Qβ-Replikasereaktion verwendet, wie von Chu et al. (Nucl. Acid. Res. 14 (1986), 5591-603) beschrieben, ausgenommen, daß die Qβ- Replikase vom Expressionsclon der Replikase, der von Biebricher et al. (Nature 321 (1986), 89-91) beschrieben und von C. Biebricher (Max Plank-Institut) physikalisch erhalten wurde, gereinigt war. Nach 30 Minuten wurden 2 µl von jedem Reaktionsgemisch mit 18 µl 95% Formamid vermischt, 5 Minuten bei 100ºC erhitzt und durch Elektrophorese auf einem 8% Polyacrylamidgel, das 8,3 M Harnstoff enthielt, getrennt. Die replizierten rekombinanten RNAs wurden von der die Enzympräparation verunreinigenden und ebenfalls replizierten MDV-1-RNA aufgrund ihrer größeren Länge unterschieden, die von der die Nucleotide 64 bis 66 ersetzenden längeren Sequenz herrührte, was wiederum eine geringere elektrophoretische Mobilität zur Folge hatte. Das rekombinante RNA-Produkt stellte etwa 50%, 86%, 72% und 15% der Gesamt- RNA dar, wenn die Umsetzung mit den modifizierten MDV-1-RNAs initiiert wurde, die entweder keine 3'-seitige Verlängerung oder die 7 Nucleotide, 24 Nucleotide bzw. 183 Nucleotide lange Verlängerung trugen. Alle so produzierten rekombinanten RNAs hatten die gleiche Größe wie die rekombinante RNA, der eine Verlängerung am 3'- Terminus fehlte, was anzeigte, daß die 3'-seitige Verlängerung selber nicht mit dem Rest des Moleküls repliziert wird. Dieses Experiment wurde mit einigen 3'-terminalen Verlängerungen von unterschiedlicher Sequenz mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt.

Beispiel 4

Test auf eine Zielsequenznucleinsäure unter Verwendung einer Ribozymsonde

Zwei Desoxyribo-Oligonucleotide mit den nachstehenden Sequenzen
und
werden synthetisiert.
Diese werden in den in Beispiel 1 beschriebenen cDNA-Vektor cloniert, und die gereinigte clonierte DNA wird nach der Spaltung mit der Restriktionsendonuclease DraI durch T7-RNA-Polymerase transkribiert. Das RNA-Produkt mit der richtigen Größe wird durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
1 pmol (10&supmin;¹² mol) dieser RNA wird mit menschlichem Gesamtblut von mit dem menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) infizierten Patienten, normalem menschlichem Blut oder einer Probe hybridisiert, die in einem Sandwich- Hybridisierungstest, wie von Ranki et al. (ebenda) beschrieben, in Gegenwart von 2,5 M Guanidinthiocyanat und einem pmol eines synthetischen Desoxyribo-Oligonucleotids mit der Sequenz
auf die Gegenwart von HIV-1 getestet werden soll. Unter allgemeiner Bezugnahme auf Figur 1A wird das Hybrid an einen festen Träger durch Hybridisierung des dA150-Strangbereichs im Oligonucleotid mit dem immobilisierten Polydesoxythymidin, beispielsweise in der Vertiefung einer Polystyrolmikrotiterplatte (oder einem Fangkügelchen, wie in Figur 1A dargestellt), die gemäß den Verfahren von Collins et al., EPA 87 30 9308.2 und EPA 88 31 2135.2 beschichtet war, gebunden. Die Platte wird 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach die nicht-gebundene Sonden enthaltenden Inhalte abgesaugt und verworfen werden und die Vertiefung wiederholt mit einem 0,5 M Guanidinthiocyanat enthaltenden Puffer gewaschen wird. Die Vertiefung wird anschließend mit einem 90 mM Tris-HCl (pH 7,5) enthaltenden Puffer gewaschen, und 50 µl des gleichen Puffers, der allerdings zusätzlich 14 mM MgCl&sub2; enthielt, werden zur Induktion der Ribozymspaltung in die Vertiefung eingefuhrt und 15 Minuten bei 50ºC inkubiert. Der die gespaltene und freigesetzte Sonde (vgl. Figur 1B) enthaltende Inhalt der Vertiefung wird zur Replikation in eine andere Vertiefung transferiert. 5 µl einer Lösung, die jeweils 4 mM ATP, GTP, CTP und UTP enthält, werden 10 µCi α³²P-CTP und 1 µg Qβ-Replikase zugesetzt und die Platte 25 Minuten bei 37ºC inkubiert. 2 µl der Inhalte der Vertiefungen werden entfernt und zu 18 µl 95% Formamid, 0,05% Xylolcyanol, 0,05% Bromphenolblau zugesetzt, um die Replikation zu beenden. 5 µl davon werden in die Vertiefung eines denaturierenden 8% Polyacrylamidgels gegeben und die replizierten RNAs durch Elektrophorese getrennt, bis der Xylolcyanol- Farbstoff das Gel der Länge nach durchwandert hat. Ein Röntgenfilm wird drei Stunden dem Gel exponiert und anschließend als letzter Nachweisschritt entwickelt. Das größere RNA-Produkt mit der gleichen Länge wie die Zahl der Nucleotide zwischen der dem nicht verlängerten 5'-Terminus der natürlich vorkommenden MDV-1-RNA entsprechenden Sequenz und dem nicht verlängerten 3'-Terminus der MDV-1-RNA, wobei die Länge des in die Hinf-Stelle, wie in Beispiel 1 beschrieben (in diesem Fall 10 Nucleotide), insertierten Sequenzelements eingeschlossen ist, zeigt die Gegenwart des HIV-1-Virus oder seiner Messenger-RNA in der Blutprobe. Es ist ferner leicht erkennbar, daß durch sorgfältiges Timing der Replikationsphase und Vergleichen der Ergebnisse mit einer geeigneten Kontrolle ein Zusammenhang zwischen der Menge an replizierter RNA und der Menge an Zielsequenz-RNA in der ursprünglichen Probe hergestellt werden kann, wodurch quantitative Ergebnisse erhalten werden.
Wie leicht zu verstehen ist, können andere Verfahren zum Nachweis der replizierten RNA verwendet werden, wobei immunologische Verfahren, die für RNA- DNA-Hybride (erforderlich ist z. B. die Zugabe von fur die replizierten RNA- Sequenzen spezifischen DNA-Oligonucleotiden) spezifische Antikörper verwenden, oder alternativ die Verwendung von Ethidiumbromid, dessen Fluoreszenz durch die Gegenwart der RNA-Polymere erhöht wird, eingeschlossen sind.

Beispiel 5

Ein Paar von Sonden gegen HIV- 1, dem Verursacher des erworbenen menschlichen Immunschwächesyndroms, wurde erzeugt. Zwei Paare von partiell komplementären Oligonucleotiden mit den folgenden Sequenzen
wurden erzeugt.
Jedes dieser Oligonucleotidpaare (1A und 1B; 2A und 2B) wurde angelagert und separat zwischen die EcoRI-Stelle und die SmaI-Stelle des im vorstehenden Experiment verwendeten Plasmids geclont. Nach der Clonierung wurden die gereinigten Plasmid-DNAs mit EcoRI gespalten und mit T7-RNA-Polymerase transkribiert, wobei zwei RNAs erzeugt wurden, die 3-seitige Verlängerungen trugen, die teilweise zur gleichen Sequenz in HIV-1 komplementär waren. In der RNA, die von dem mit dem ersten Paar von Oligonucleotiden erhaltenen Clon produziert wurde, waren die Sequenz der replizierbaren RNA und die Sondensequenz durch das Spacer-Sequenzelement
getrennt. Im zweiten Clon wurde ein Spacer mit der Sequenz
erzeugt. Von jeder der RNAs wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt und Aliquots verwendet, um die Qβ-Replikasereaktionen zu initiieren, die 1 µg Qβ-Replikase, 90 mM Tris-HCl, 14 mM MgCl&sub2; und jeweils 400 µM ATP, GTP, CTP und UTP enthielten. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurden die Reaktionen durch Zugabe von EDTA bei einer Konzentration von 20 mM und Ethidiumbromid bei einer Konzentration von 1 µg/ml beendet. Die Fluoreszenz der Ethidiumbromid-RNA-Komplexe wurde über einem Ultraviolett-Transilluminator beobachtet. Das amplifizierte RNA-Produkt wurde in Reaktionen beobachtet, die mit mindestens 10&sup4; vom ersten Clon erzeugten Molekülen und 10² vom zweiten Clon erzeugten Molekülen initiiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Sequenzbereich, der zum 3'-Ende der replizierbaren RNA-Sequenz (d. h. - dem Spacer) unmittelbar benachbart war, die Empfindlichkeit des Sondennachweises stark beeinflußt. Anschließende Experimente zeigten, daß eine Erhöhung der Reaktionszeit die größte Verdünnung, die ein durch Fluoreszenz nachweisbares Produkt lieferte, nicht beeinflußte.
Diese Ergebnisse liefern eine praktische Anleitung zur Verwendung von replizierbaren RNAs, die 3'-seitige Sequenzverlängerungen als Sonden für den empfindlichen Nachweis von Nucleinsäuren tragen. Durch die richtige Wahl der Spacersequenz können RNA-Sonden mit einer wesentlich größeren Empfindlichkeit zum Nacheis der Zielsequenznucleinsäure erzeugt werden. Umgekehrt kann für einige Zielsequenznucleinsäuren, die in einem Infektionserreger in großen Mengen vorhanden sind (d. h. - ribosomale RNA, die in bis zu 50 000 Kopien pro Organismus vorhanden ist), ein relativ niedrige Nachweisgrenzen verleihender Spacerbereich verwendet werden, um vorteilhaft den Hintergrund zu vermeiden, der sonst durch Amplifikation von geringeren Mengen von nicht-spezifisch gebundenen Sonden erzeugt wird. Bei einer zahlenmäßigen Reduktion auf mindestens eine Größenordnung unter der Nachweisgrenze liegende Mengen können beispielsweise unter Verwendung der Hintergrund-Reduktionsverfahren, wie von Collins (a.a.O.) beschrieben, nicht-spezifisch gebundene Sonden kein nachweisbares Signal produzieren. Daher können erfindungsgemäße Sonden, die geeignete Spacersequenzen umfassen, vorteilhaft verwendet werden, um die Kosten, Komplexität und Häufigkeit von falsch-positiven Reaktionen in diesen Tests zu reduzieren.
Wie nun erkennbar sein dürfte, können eimge Verfahren zur Erzeugung dieser Konstrukte verwendet werden, wobei die Verwendung der T4-RNA-Ligase (Stefano, a.a.O.) und die Transkription von cDNA-Clonen, wie im vorstehenden Beispiel beschrieben, eingeschlossen sind. Es kann positiv bewertet werden, daß die Verwendung der T4-RNA-Ligase vorteilhaft die Erzeugung von Konstrukten ermöglicht, in denen die Sondenverlängerung entweder aus RNA oder DNA besteht.
Da die Qβ-Replikase die Synthese des Tochterstrangs am 3'-Ende der MDV-1-RNA-Matrize initiiert und üblicherweise das Kopieren der Matrize in einer 3'- nach 5'-Richtung (der Matrize) fortsetzt, bis der 5'-Terminus erreicht ist, erzeugen 5'-seitige Verlängerungen tragende Matrizenmoleküle Tochterstrangprodukte (z. B. einen Minusstrang der Matrize), die 3'-terminale Verlängerungen tragen, die wiederum gemäß vorstehender Beobachtungen repliziert werden (z. B. ignoriert die Qβ-Replikase die an das Ende angehängten 3'-Sequenzen). Wie für den Fachmann erkennbar ist, können diese Sonden auch in Hybridisierungstests verwendet werden. Wie es jetzt ferner erkennbar ist, kann die Wirküng der Spacersequenz zur Einstellung der Empfindlichkeit dieser Sonden in ähnlicher Weise vorteilhaft verwendet werden.
Ein wichtiger Vorteil geht aus der vorliegenden Erfindung hervor, die eine zusätzliche Verwendung für intelligente Sondensysteme aufweist, die die Zielsequenzgerichtete Spaltung der 5'-seitigen oder 3'-seitigen Sequenzverlängerungen verwenden, da diese Verfahren die genaue und vollständige Entfernung dieser Sequenzen nicht bereitstellen müssen. Beispielsweise und wie zuvor beschrieben kann eine Sonde erzeugt werden, die Verlängerungen sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende trägt, deren Hybridisierung mit der Zielsequenz eine Ribozymstruktur produziert, die die Spaltung der Verlängerung am 5'-Ende von der RNA steuert. Eine kürze Verlängerung am 3'- Ende bleibt auf dem Molekül erhalten.
Eine am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist graphisch in den Figuren 5A und 5B dargestellt, in denen ein eine Verlängerung tragendes Sondenmolekül mit einer gelösten Zielsequenz hybridisiert wird. Kurz davor, danach oder gleichzeitig damit wird eine zweite Oligonucleotidsonde mit der zur ersten Sonde benachbarten Zielsequenz hybridisiert. Die zweite Oligonucleotidsonde wird an eine Nuclease gekoppelt, die ein Ribozym ist und einen Cofaktor (beispielsweise ein divalentes Kation) für seine Aktivität benötigt. Nach der Hybridisierung wird der Komplex auf einem festen Träger gefangen, wie von Ranki et al. (a.a.O.), Soderlund (a.a.O.), Stabinsky (a.a.O.) und/oder Syvanenen (a.a.O.) beschrieben. Nach der Abtrennung, beispielsweise durch Wegwaschen, des größten Teils der nicht-spezifisch gebundenen Sonden, wird der Cofaktor für die Ribozymaktivität zugesetzt. Das Ribozym, das an den Terminus der Sonde nahe der ersten Sonde bei der Hybridisierung an ihre Zielsequenz gekoppelt ist, spaltet den Spacer auf der ersten Sonde, wodurch eine replizierbare Einheit in die Lösung freigesetzt wird. Wie vorstehend beschrieben, kann die Spacersequenz vorteilhaft gewählt werden, um die Replikation bis zur Spaltung maximal zu hemmen. Weitere Varianten dieses Verfahrens sind erkennbar. Diese Sondenpaare können beispielsweise eine replizierbare RNA einschließen, anstatt eine Verlängerung am 5'-Ende und eine Nuclease-gekoppelte Sonde zu tragen, in der eine Ribozymsequenz 5'-seitig zum Sondensequenzelement vorhanden ist.
Ein beliebiges Ribozym kann als Mittel zur Spaltung vorteilhaft verwendet werden, beispielsweise die von Haselhoff und Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591, Uhlenbeck, Nature 328 (1987), 596-600, Cech (europäische Patentanmeldung WO 88/04300, 16. Juni 1988), Sharmeen et al., J. Virol. 63 (1989), 1428-1430 oder Hampel und Tritz, J. Cell. Biochem., Suppl. 12D, Abst. #N212, (1988), S. 31, beschriebenen. Ribozyme weisen den signifikanten Vorteil auf, daß die das Ribozym tragende zweite Sonde in einem einzigen Schritt durch Transkription eines DNA- Oligonucleotids von geeigneter Sequenz effizient produziert werden kann, wie es von Mulligan (a.a.O.) beschrieben wird, wodurch Kosten und Arbeitsaufwand zur Herstellung dieser Reagenzien reduziert werden können. Diese bevorzugten Reagenzien produzieren ferner vorteilhaft spezifische Spaltungsereignisse, die zu einem RNA- Produkt mit definierten Replikationseigenschaften führen.
Ein weiteres Verständnis kann durch das Studium der nachstehenden, zusätzlichen, genauen Beispiele erhalten werden:

Beispiel 6

Nachweis der Chlamydia trachomatis-RNA

Zwei Oligonucleotide mit den Sequenzen
und
wurden an ein EcoRI-gespaltenes MDV-cDNA-Konstrukt, das zu dem von Lizardi (a.a.O.) beschriebenen ähnlich war, angelagert und mit diesem ligiert. Dieser cDNA-Clon unterschied sich von denen von Lizardi et al. beschriebenen dadurch, daß die interne Insertion eine Bindungsstelle für das Hüllprotein des Phagen R17 codierte. Diese cDNA wurde von F. R. Kramer, Public Health Research Institute, N. Y., erhalten. Die Oligonucleotide wurden in einer Orientierung ligiert, daß die anschließende Spaltung mit EcoRI in bezug auf den Promotor der T7-RNA-Polymerase stromabwärts des Oligonucleotids erfolgte. Das gespaltene Plasmid wurde mit T7-RNA-Polymerase unter von Mulligan et al. (a.a.O.) beschriebenen Bedingungen in vitro transkribiert und das Transkriptionsprodukt mit korrekter Länge durch Blektrophorese auf 8,3 M Harnstoff enthaltenden Polyacrylamidgelen isoliert.
Ein Fangoligonucleotid mit der Sequenz
die zu einem Bereich in der ribosomalen 165-RNA von Chlamydia (Palmer et al., Chlamydial Infections (Oriel et al., Hrsg.) Cambridge Univ. Press, 1986, S.89-92) komplementär war, wurde synthetisiert und mit einem etwa 150 dA-Reste umfassenden Terminus unter Verwendung der terminalen Desoxynucleotidyltransferase (Supertechs), wie von Collins (a.a.O.) beschrieben, versehen.
Unterschiedlich viele, Formalin-fixierte, Elementarkörper von Chlamydia trachomatis wurden in einer Lösung von 1,0 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) und 1,6% Sarkosin (Sigma) mit einem Endvolumen von 35 µl 15 Minuten bei 65ºC lysiert. 35 µl eines Puffers, der 340 ng/ml endverlängertes Fang-Oligonucleotid und 100 ng/ml der Transkriptionsprodukt-Sonde enthielt, wurden anschließend zugesetzt, und eine Hybridisierung in der Lösungsphase wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. 50 µl einer 0,06% (Gew./Vol.) Suspension von mit Oligo-dT derivatisierten, magnetischen Kügelchen, die gemäß Collins (a.a.O.) in 4% BSA, 10 mM EDTA, 0,2% Sarkosin, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 und 0,05% Bronopol hergestellt wurden, wurden anschließend zugesetzt und zum Einfangen der Zielsequenz-Sonden-Hybride auf den Kügelchen für weitere 5 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Nach dem Einfangen wurden bei 37ºC 0,2 ml einer 1 M Guanidinthiocyanat (GuSCN, Fluka), 10 mM EDTA, 0,04 M Tris-HCl, pH 7,8, 0,5% Sarkosin, 0,2% BSA und 0,1 % Entschäumer (Thomas) enthaltenden "Waschlösung" zugesetzt. Der Inhalt der Röhrchen wurde mit einem Vortex-Gerät gemischt, und die Röhrchen wurden anschließend in ein Magnetfeld gegeben (vorzugsweise gemäß EPC 88 31 0810.2 mit dem Titel "Magnetic Separation Device and Methods for Use"). Die Kügelchen wurden zur Seite der Röhrchen gezogen und die flüssige Phase durch Absaugen aus den Röhrchen entfernt. Weitere 0,2 ml warme Waschlösung wurden zugesetzt und die Kügelchen mit Hilfe des Vortex-Geräts resuspendiert und im Magnetfeld gesammelt. Die Kügelchen wurden ein weiteres Mal mit einem weiteren Aliquot der Waschlösung gewaschen. Die gesammelten, vom Überstand befreiten Kügelchen wurden anschließend in 50 µl Puffer, der 3,25 M GuSCN, 65 mM EDTA, 0,04 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,5% Sarkosin und 0,5% BSA enthielt, resuspendiert und 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Zielsequenz-MDV-Sonden-Fangsonden-Hybride freizusetzen. Die magnetischen Kügelchen wurden wie zuvor gesammelt und die Überstände entfernt und in einen frischen Satz von Röhrchen transferiert, die jeweils 50 µl einer frischen Kügelchensuspension enthielten, um die Hybride wieder einzufangen, wie vorstehend beschrieben. Diese Kügelchen wurden dreimal in der gleichen Weise wie der erste Satz gewaschen, die Hybride freigesetzt und durch einen dritten Satz von Kügelchen wieder eingefangen. Dieser Satz von Kügelchen wurde dreimal in der gleichen Weise und weitere dreimal mit 0,2 ml einer Lösung, die 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0, und 0,5 % NP-40 enthielt, gewaschen.
Die gesammelten, gewaschenen Kügelchen wurden in 50 µl Puffer, der aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,5% NP-40 bestand, resuspendiert und zur Elution der Komplexe 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden mittels eines Magnetfelds gesammelt und die die eluierten Komplexe enthaltenden Überstände in einen frischen Satz von Röhrchen transferiert.
Jeweils 10 µl Kügelchen-Eluat wurden einem Satz von Röhrchen zugesetzt, die 13 µl einer Lösung von 173 mM Tris-HCl, pH 7,5, 27 mM MgCl&sub2; und jeweils 0,77 mM ATP, GTP, CTP und UTP (Pharmacia) enthielten. 2 µl QB-Replikase (1,2 µg), die gemaß DiFrancesco (a.a.O.) gereinigt wurde, wurden zugesetzt und die Röhrchen 12 Minuten bei 37ºC inkubiert. 5 µl 20 mM EDTA und 32 µg/ml Propidiumiodid (Sigma) wurden anschließend zur Beendigung der Replikation zugesetzt. 50 µl von jeder beendeten Reaktion wurden in getrennte Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit U-förmigem Boden (Nunc) transferiert. Die Platte wurde über einem ultravioletten Transilluminator, dessen Emissionsmaximum bei 365 nm war, unter Verwendung eines Wratten #29- Filters auf einen Polaroid -Typ 667 Film photographiert. Die Exponierung wurde eingestellt, um die offensichtliche Fluoreszenz in einer nur den Reaktionspuffer und Propidiumiodid enthaltenden Kontrollvertiefung zu minimieren. Der vorstehend beschriebene Test wurde mit Dreifachproben jeder Verdünnung des Elementarkörpers durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Die Zahl an "+"-Symbolen gibt die beobachtete relative Fluoreszenz wieder. "-" gibt an, daß die Fluoreszenz nicht höher als die der Kontrollvertiefungen ist. Einfacher Körper Fluoreszenz Hybridisierungsreaktion
Wie im vorstehenden Experiment beobachtet, hatte der Test eine Empfindlichkeit von etwa 10³ Elementarkörpern.

Beispiel 7

Nachweis der HIV-1-mRNA

Der Test von Beispiel 6 wurde wiederholt, ausgenommen, daß die Fangsonde durch drei, zu konservierten Bereichen in der HIV-1-RNA komplementäre Sonden substituiert wurde. Die Nachweis-MDV-Sonde war wie in Beispiel 5 beschrieben und enthielt die Spacersequenz
Dieser Test zeigte eine Empfindlichkeit von 1 000 HIV-1-RNA-Molekülen.

Beispiel 8

Wahl von Sonden, die optimal replizierende Spacersequenzen enthalten

Eine Bank aus Matrizen-DNAs kann durch Synthese eines Oligonucleotids erzeugt werden, das in der 5'- zu 3'-Richtung enthält: (1) eine kurze Sequenz (beispielsweise 40 Nucleotide), die mit der Zielsequenz identisch ist, (2) ein kürzer Bereich (15 Nucleotide) einer Zufallssequenz und (3) eine Sequenz, die zu den 30 Nucleotiden am 3'-Ende der MDV-1-RNA komplementär ist. Das Zufallssequenzelement kann durch Zugabe von allen vier blockierten Nucleotiden wahrend der Synthese des Oligonucleotids leicht erzeugt werden, einem Verfahren, das mit gegenwärtig verfugbaren automatischen Synthesegeräten leicht durchgeführt werden kann. Ein zweites, zu den 19 Nucleotiden am 5'-Ende des ersten Nucleotids komplementäre Oligonucleotid wird anschließend synthetisiert. Dieses wird an das erste Nucleotid angelagert und mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase verlängert, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment zu produzieren. Dieses Fragment wird anschließend mit dem Restriktionsenzym BstEII gespalten und das Spaltprodukt, wie von Lizardi (a.a.O.) beschrieben, an ein zuvor mit BstEII gespaltenes Fragment eines MDV-cDNA- Clons ligiert. 2 pmol Ligierungsprodukt werden anschließend durch T7-RNA-Polymerase transkribiert, um eine Population von RNAs, die 10¹² unterschiedliche Spacersequenzen enthielten, zu erzeugen.
Moleküle innerhalb der Population von RNAs, die am effizientesten die Replikation initiieren, werden vorteilhafter durch eines von zwei Verfahren ausgewählt: elektrophoretische Verzögerung der Qβ-Matrizen-RNAs, die an ihre naszierenden, initiierten Tochtersträngen (Milis et al., Biochem. 19 (1980), 228-236) hybridisieren, oder Isolierung des stabilen Komplexes, der sich zwischen der Qβ-Replikase und den die Initiation eines Tochterstrangs steuernden Matrizen-RNAs bildet. Ein Beispiel des letzten Verfahrens wird nachstehend beschrieben.
2 pmol RNA, die Zufallssequenzspacer tragen, werden mit 5 pmol (1,2 µg) Qβ-Replikase 5 Minuten bei 37ºC in 25 µl 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 14 mM MgCl&sub2; inkubiert. 5 µl des gleichen Puffers, der jeweils 2,4 mM GTP und ATP enthält, werden zugesetzt und die Inkubation weitere 5 Minuten fortgesetzt. 5 µl Puffer, der 40 pmol MDV-1-RNA enthält, werden anschließend zugesetzt und die Inkubation 2 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wird auf 0ºC abgekühlt und auf einen 2,2 ml 10 bis 30% Glyceringradienten in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 mM MgCl&sub2;, der auf 0ºC vorgekuhlt war, gegeben. Der Gradient wird bei 55K Upm in einem TLS-55-Rotor (Beckman Instruments, Pab Alto, CA) 6 Stunden bei 4ºC zentrifugiert. Der Enzym:RNA-Komplex, der 40% schneller als freie RNA sedimentiert, wird gesammelt, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Diese Population ist an RNAs angereichert, die durch die Qβ-Replikase effizient repliziert werden können. Zur weiteren Anreicherung dieser Population wird zunächst eine cDNA-Bank dieser Population konstruiert. Ein zum Sondenbereich komplementäres Oligonucleotid wird zum Primen der Synthese einer einzelsträngigen cDNA-Population unter Verwendung der reversen Transkriptase (Maniatis et al., a. a. 0.) verwendet. Ein zweites Oligonucleotid wird synthetisiert, das in 5'- zur 3'-Richtung enthält (1) eine Restriktionsenzymsequenz, die die Clonierung der Duplex-cDNA ermöglicht, (2) die Sequenz eines Promotors fur die T7- RNA-Polymerase und (3) die Sequenz der ersten 22 Nucleotide der MDV-1-RNA. Dieses Oligonucleotid und das zum Primen der Synthese des ersten Strang-cDNA- Produkts verwendete Oligonucleotid werden in einer PCR-Reaktion verwendet, um 1 pmol einer Duplex-DNA unter Verwendung der Erststrang-cDNA als Matrize zu erzeugen. Dieses Produkt wird durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und durch T7-RNA-Polymerase transkribiert, um eine RNA-Population zu erzeugen, die wiederum dem Komplexbildungs-Sedimentationsprotokoll unterzogen wird. Dieses Verfahren kann so oft wie gewünscht wiederholt werden, wie jedoch erkannt werden wird, konvergiert es auf einen begrenzenden Anreicherungsgrad. Der Anreicherungsgrad nach jedem Selektionszyklus wird durch Clonieren der Duplex-cDNAS in Plasmidvektoren und durch Untersuchung der Empfindlichkeit des Nachweises der durch Transkription von mehreren (beispielsweise 12) dieser Clone produzierten, zufällig aus Produkten jedes Selektionszyklus gewählten RNAs bestimmt.
Die Empfindlichkeit des Nachweises der clonierten RNAs kann wie nachstehend beschrieben ermittelt werden. Die Plasmid-DNA von jedem Clon wird durch Standardverfahren gereinigt. Jede wird mit einem Restriktionsenzym unmittelbar stromabwärts der cDNA gespalten und durch die T7-RNA-Polymerase transkribiert, um ein RNA-Produkt, dem die Vektorsequenz fehlt, zu produzieren. Diese RNA wird entweder durch Gelelektrophorese oder durch Einfangen auf magnetischen Oligo-dT- Kügelchen, wie im in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, mit einem ein dA&sub1;&sub5;&sub0;-Ende aufweisenden DNA-Oligonucleotid der gleichen Sequenz als Zielsequenz gereinigt, ausgenommen, daß keine sekündäre Fangsonde verwendet wird. Mit jedem der gereinigten Transkripte wird mit Wasser eine Verdünnungsreihe hergestellt und, wie in Beispiel 6 beschrieben, den Qβ-Reaktionen Aliquots (10 µl) zugesetzt. Die Reaktionen werden 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt, beendet und die minimale Zahl an zur Beobachtung des Produkts erforderlichen Sonden bei der größten noch Fluoreszenz produzierenden Verdünnung ermittelt. Dieses Verfahren wird für Clone, die von jedem Zyklus des Selektionsverfahrens erhalten werden, wiederholt.
Es ist leicht erkennbar, daß das vorstehend beschriebene Verfahren auch zur Isolierung von RNAs verwendet werden kann, die nach der Hybridisierung mit der Zielsequenz effizient replizieren. Dies wird einfach durchgeführt, indem zunächst vor der Bildung des Initiationskomplexes die Population an RNAs mit einer synthetischen Zielsequenz hybridisiert wird. Wie ferner zu erkennen ist, können Mitglieder einer derartigen Population Moleküle enthalten, die nach einer Hybridisierung mit einer Zielsequenz effizienter replizieren als wenn sie frei sind. Diese Moleküle sind bevorzugte Sonden zur Verwendung in Hybridisierungstests, da die Moleküle, die im Hybridisierungsverfahren nicht-spezifisch gebunden werden, wesentlich weniger effizient repliziert werden.

Beispiel 9

Ein intelligentes Sondensystem zum Nachweis von HIV-1-RNA

Ein Oligonucleotid mit der Sequenz
wird synthetisiert. Ein zweites Oligonucleotid mit der Sequenz
wird synthetisiert. Die beiden Oligonucleotide werden aneinandergelagert und in einen cDNA-Clon einer rekombinanten MDV-RNA, wie von Lizardi et al. (a.a.O.) beschrieben, ligiert, der zuvor mit BstEII und EcoRI gespalten wurde. Der erhaltene Clon wird mit DraI gespalten und durch T7-RNA-Polymerase transkribiert. Das RNA- Produkt wird auf einem 6% Polyacrylamidgel, das 8,3 M Harnstoff enthält, gereinigt und nach der Sichtbarmachung entweder durch Autoradiographie oder UV-Beschattung aus dem Gel eluiert. Ein Matrizen-Oligonucleotid mit der Sequenz
für eine Ribozymsonde wird synthetisiert. 2 pmol dieses Produkts werden an eine äquimolare Menge "T7-Promotor-Primer" -Oligonucleotid (Promega) angelagert und durch T7-RNA-Polymerase, wie von Mulligan (a.a.O.) beschrieben, transkribiert, ausgenommen, daß α-³²P-CTP (1 Ci/mmol) in der Reaktionslösung enthalten ist, um das Produkt zur Sichtbarmachung durch Autoradiographie zu markieren. Das Transkriptionsprodukt wird mittels eines 10% Polyacrylamidgel, das 8,3 M Harnstoff enthält, gereinigt und eluiert. Jeweils 1 ng der vorstehenden RNAs wird einem HIV-1- Test, wie in Beispiel 7 beschrieben, zugesetzt. Nach dem letzten Waschen der Kügelchen, wie in Beispiel 6 beschrieben, werden die Kügelchen in 50 µl eines Elutionspuffers, der 200 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2; und 0,5% NP-40 enthält, resuspendiert. Die Kügelchen werden in diesem Puffer 10 Minuten bei 37ºC inkubiert und anschließend durch Einführen in ein Magnetfeld gesammelt. Die flüssige Phase wird gesammelt und in ein frisches Röhrchen transferiert. Die in 10 µl dieses Eluats vorhandene RNA wird in einer Qβ-Reaktion, wie in Beispiel 6 beschrieben, amplifiziert.
Für den Fachmann ist leicht zu erkennen, daß zahlreiche Modifikationen der vorstehenden Beschreibung und Beispiele der Sonde-Matrizen-Konstrukte und Testverfahren durchgeführt werden können, einschließlich beispielsweise der Sondenlängenveränderungen, Wahl von alternativen Midivarianten oder alternativer Sequenzen zusammen mit alternativen Ribozym-ähnlichen Strukturen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Zielnucleinsäure mit einer ersten und zweiten Nucleinsäuresequenz in einer Probe&sub1; von der angenommen wird, daß sie die Zielnucleinsäure enthält, umfassend:

(a) den Erhalt der Zielnucleinsäure in einzelsträngiger Form, sofern notwendig;

(b) weiterhin die Bereitstellung einer Sonde, umfassend:

(i) eine RNA-Matrize mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist;

(ii) eine erste Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe dem 5'-Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der ersten Nucleinsäuresequenz der Zielnucleinsäure (erste Zielsequenz) komplementär ist; und

(iii) eine zweite Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe dem 3'-Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der zweiten Nucleinsäuresequenz der Zielnucleinsäure (zweite Zielsequenz) komplementär ist;

(c) Inkontaktbringen der Probe mit der Sonde unter Bedingungen, die das Zustandekommen einer Hybridisierung zwischen der ersten bzw. zweiten Nucleinsäuresondensequenz und der ersten bzw. zweiten Zielsequenz zur Bildung eines die Sequenzen der Sonde umfassenden Ribozyms erlauben;

(d) Induktion der Ribozym-Spaltung, die die RNA-Matrize von der Zielnucleinsäure freisetzt;

(e) Ermöglichung der Replikation der freigesetzten RNA- Matrize; und

(f) Nachweis der replizierten RNA-Matrize als Anzeichen für die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielnucleinsäure in der Probe.

2. Verfahren zum Nachweis einer Zielnualeinsäure mit einer ersten und zweiten Nucleinsäuresequenz in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Zielnucleinsäure enthält, umfassend:

(a) den Erhalt der Zielnucleinsäure in einzeisträngiger Form, sofern notwendig;

(b) weiterhin die Bereitstellung einer ersten Sonde, umfassend:

(i) eine RNA-Matrize mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist; und

(ii) eine erste Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe einem Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der ersten Nucleinsäuresequenz der Zielnucleinsäure (erste Zielsequenz) komplementär ist;

(c) zusätzliche Bereitstellung einer zweiten Sonde, umfassend:

(i) eine zweite Nucleinsäure-Sondensequenz, die im wesentlichen zu der zweiten Nucleinsäurese quenz der Zielnucleinsäure (zweite Zielsequenz) komplementär ist; und

(ii) eine dritte Sequenz am oder nahe einem Ende der zweiten Sonde, die im wesentlichen zu einem Teil der ersten Sonde komplementär ist;

(d) gleichzeitiges oder getrenntes Inkontaktbringen der Probe mit der ersten und zweiten Sonde unter Bedingungen, die das Zustandekommen einer Hybridisierung zwischen der ersten bzw. zweiten Sondensequenz und der ersten bzw. zweiten Zielsequenz und zwischen der ersten und zweiten Sonde zur Bildung eines Sequenzen der ersten und zweiten Nucleinsäuresonde umfassenden Ribozyms erlauben;

(e) Induktion einer Ribozym-Spaltung, die die RNA- Matrize von der Zielnucleinsäure freisetzt;

(f) Ermöglichung der Replikation der freigesetzten RNA- Matrize; und

(g) Nachweis der replizierten RNA-Matrize als Anzeichen für die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielnuclein säure.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Spaltung durch das Inkontaktbringen des Ribozyms mit einem divalenten Kation, das Mn²&spplus;, Mg²&spplus; oder Ca²&spplus; ist, induziert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste und zweite Zielsequenz durch eine 5'-GAAA-3'umfassende Sequenz getrennt sind, die zweite Nucleinsäure- Sondensequenz eine Länge von mindestens etwa 4 Basen hat und die RNA-Matrize eine Midivariante ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiterhin umfassend die Trennung nicht-hybridisierter Sonde von hybridisierter Sonde im Anschluß an den Kontakt der Sonde mit der Zielnucleinsäure und vor der Spaltung.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend die Korrelierung des Grades an nachgewiesenen replizierten RNA-Matrizen mit der Menge an Zielnucleinsäure.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die erste Nucleinsäure-Sondensequenz mit der ersten Zielsequenz im Zustand der Hybridisierung verbleibt, während die Ribozym-Spaltung induziert wird.

8. Sonde, umfassend eine RNA-Matrize, die ein 3'- und ein 5'-Ende hat und durch eine RNA gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist, weiterhin umfassend eine erste und zweite Nucleinsäure-Sondensequenz an oder nahe den jeweiligen Enden der RNA-Matrize, und so angepaßt, daß nach Hybridisierung mit einer Zielnualeinsäure ein Ribozym gebildet wird, das bei Spaltung die RNA-Matrize in einer replizierbaren Form freisetzt.

9. Sonde nach Anspruch 8, wobei die Matrize MDV-1 ist.

10. Sonde nach Anspruch 8 oder 9, wobei die RNA-gerichtete BNA-Polymerase Q-beta-Replikase ist.

11. Sonde nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiterhin umfassend eine für eine Zielnucleinsäure nicht-spezifische Nucleinsäure-Spacersequenz, die zwischen dem 3'-Ende der RNA-Matrize und entweder der ersten oder zweiten Nucleinsäure-Sondensequenz gelegen ist.

12. Sonde nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielnucleinsäuresequenz mit einer ersten und zweiten Zielsequenz, umfassend:

(a) eine erste Nucleinsäure-Sondensequenz am 5'-Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der ersten Zielnucleinsäuresequenz komplementär ist; und

(b) eine zweite Nucleinsäure-Sondensequenz am 3'-Ende der RNA-Matrize, die im wesentlichen zu der zweiten Zielnucleinsäuresequenz komplementär ist.

13. Sonde nach Anspruch 12, bei der die erste und zweite Zielnucleinsäuresequenz durch eine 5'-GAAA-3'umfassende Sequenz getrennt sind und/oder die zweite Nucleinsäure- Sondensequenz eine Länge von mindestens etwa 4 Basen hat.

14. Sonde nach einem der Ansprüche 8 bis 13, bei der die Ribozymstruktur-Spaltung die zweite Nucleinsäure-Sondensequenz von der RNA-Matrize trennt.

15. Kit zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielnucleinsäuresequenz, umfassend:

(a) eine erste Sonde, umfassend eine RNA-Matrize mit einem 3'- und einem 5'-Ende, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist und eine erste Nucleinsäure-Sondensequenz am oder nahe ihrem 3'- oder 5'-Ende hat, wobei die erste Nucleinsäure- Sondensequenz im wesentlichen zu einer ersten Nucleinsäuresequenz der Zielnucleinsäure komplementär ist;

(b) eine zweite Sonde mit einem 3'- und einem 5'-Ende, umfassend eine zweite Nucleinsäure-Sondensequenz, die im wesentlichen zu einer zweiten Nucleinsäuresequenz der Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei die zweite Sonde weiterhin eine dritte Sequenz am oder nahe dem Ende entgegengesetzt zu dem der zweiten Nucleinsäure-Sondensequenz umfaßt und die dritte Sequenz im wesentlichen zu einem Teil der ersten Sonde komplementär ist; und wobei die erste und zweite Sonde bei Bindung an das Ziel ein Ribozym bilden, das fähig ist, die RNA-Matrize von der ersten Nucleinsäure-Sondensequenz in eine replizierbare Form zu spalten; und

(c) gegebenenfalls Anweisungen für die Verwendung der ersten und zweiten Sonde zum Nachweis der Zielnucleinsäure.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei die erste und zweite Zielnucleinsäuresequenz durch eine 5'-GAAA-3'umfassende Sequenz getrennt sind und/oder die zweite Nucleinsäure- Sondensequenz eine Länge von mindestens 4 Basen hat.