DE69030955T2

DE69030955T2 - Nukleinsäureverstärkung

Info

Publication number: DE69030955T2
Application number: DE69030955T
Authority: DE
Inventors: Cheryl Davey; Graham Henderson; Lawrence Malek; Roy Sooknanan
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1990-08-23
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2010-08-24
Also published as: WO1991002818A1; JPH04507197A; JP2648802B2; FI100192B; EP0487628B1; FI920766A0; AU647411B2; KR960005737B1; CA2065003A1; EP0487628A1; DK0487628T3; ATE154644T1; AU6336590A; CA2065003C; NZ235009A; US5130238A; ES2104611T3; DE69030955D1

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nucleinsäuresequenz.
Das Nachweisen einer in einer Probe vorhandenen spezifischen Nucleinsäurensequenz durch Prüfen einer Probe mit einer komplementären Sequenz von Nucleinsäuren stellt ein bekanntes diagnostisches Verfahren dar. Nucleinsäuren sind bei der Bindung an komplementäre Nucleinsäuren sehr spezifisch und deshalb nützlich, wenn es darum geht, zu bestimmen, ob eine spezifische Nucleinsäure in einer Probe anwesend ist. Die Sequenz der nachzuweisenden spezifischen Nucleinsäure muss bekannt sein, danach wird eine Probe mit der zur spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementären Nucleinsäuresequenz konstruiert.
In dieser Erfindung bezeichnet der Begriff "spezifische Nucleinsäuresequenz" eine einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäure, die amplifiziert werden soll; der Begriff "Probe" bezeichnet ein Nucleinsäure enthaltendes Gemisch; "ausreichend komplementär" bedeutet, dass zwischen zwei Nucleinsäuren, einem Primer und einer Matrize, eine spezifische Interaktion stattfinden kann, was bei richtiger Tonenstärke und Temperatur eine effiziente primerabhängige und von der Matrize vorgegebene DNA-Synthese erlaubt. "DMSO" bezeichnet Dimethylsulfoxid von einer Reinheit, die ausreicht, um ohne Nebenwirkungen auf verwendete Substrate oder Enzyme in genetischen molekularen Reaktionen verwendet werden zu können; anstelle von DMSO können auch andere äquivalente Alkylsulfoxide verwendet werden. "BSA" bezeichnet Rinderserumalbumin mit einer für die Verwendung in molekularbiologischen Reaktionen geeigneten Qualität, das in diesem Fall frei von DNasen, DNA-Einzelstrangbruch- Aktivität, RNasen und Proteasen sein sollte. Anstelle von BSA können auch andere funktionelle äquivalente und ähnlich geeignete Trägerproteine verwendet werden.
Da Nucleinsäureproben sehr spezifisch sind, ist es in gewissen Situationen besser, anstelle des durch die Nucleinsäuresequenz hergestellten Proteins die Nucleinsäuresequenz selbst zu testen. Beispielsweise wäre ein diagnostisches Verfahren, das für die Bestimmung der Anwesenheit von infektiösen Partikeln des Hepatitis B- Virus allein auf Proteinnachweis basiert, unzuverlässig, da hohe Anteile an nicht-infektiösen Antigenpartikeln anwesend sind, die kein DNA-Genom besitzen. In einem weiteren Beispiel kann der in präkanzerösen oder gutartigen Gebärmutterhals-Tumoren nachgewiesene Papillomavirus nur durch Hybridisation von Nucleinsäure erkannt werden. Auch der spezifische genetische Aufbau eines AIDS-Virus festigt die Annahme, dass ein auf der Anwesenheit einer AIDS- Virus-spezifischen Nucleinsäuresequenz basierender Assay für die Diagnose besser geeignet ist.
Die grösste Schwierigkeit und Einschränkung bei der Anwendung bestehender Nucleinsäuresequenzen besteht bei der Kopienzahl. Beispielsweise ist in einem Virus oder einer Zelle eine einzelne Kopie eines bestimmten Gens vorhanden. Aus dieser einen Kopie können mehrere Genprodukte, entweder RNA oder ein Protein entstehen. Aus diesem Grund werden bei Diagnosetechniken oft Proteine untersucht, da aus der nachzuweisenden spezifischen Nucleinsäuresequenz mehrere tausend Kopien dieses Proteins entstehen können.
Die natürlich auftretende hohe Anzahl ribosomaler RNA, bis 100'000 Kopien pro Zelle, wird von Genprobe benützt, um unter Verwendung von Nucleinsäureproben die Diagnose bestimmter bakterieller Krankheitserreger wie Legionella und Mycoplasma zu erleichtern. Dieses Verfahren kann jedoch bei nicht-zellulären Krankheitserregern wie Viren oder bei untersuchten Nucleinsäuresequenzen mit niedriger Kopiezahl nicht verwendet werden. Die Kopiezahl stellt insbesondere bei der Entwicklung eines Nucleinsäureprobe-Verfahrens zum Nachweis von AIDS-Viren ein Problem dar, wo ein integriertes Provirus in weniger als einem von zehntausend peripheren Blutlymphozyten anwesend ist. Wenn die bestimmte Nucleinsäuresequenz, die in einer Probe anwesend sein soll, amplifiziert werden kann, kann damit das Problem der Kopienzahl umgangen und die Proben können sofort verwendet werden.
In einer normalen biologischen Probe, die nur wenige Zellen und folglich nur wenige Kopien eines bestimmten Gens enthält, muss ein Amplifikationsvorgang angewendet werden, um das Problem der Kopienzahl zu lösen.
Ein Amplifikationsverfahren besteht darin, die Probe "auswachsen" zu lassen, das heisst, die Bedingungen so zu gestalten, dass das in der Probe anwesende lebende biologische Material sich selber replizieren kann. Die Replikation kann die Anzahl der Nucleinsäuresequenzen auf ein nachweisbares Niveau erhöhen. In der Nahrungsmittelindustrie müssen beispielsweise beim Untersuchen von verarbeiteten Nahrungsmitteln auf das giftige Salmonellen-Bakterium Nahrungsmittelproben einige Tage inkubiert werden, um die Anzahl der Nucleinsäurekopien zu erhöhen. In klinischen Proben müssen sich Krankheitserreger ebenfalls über eine längere Zeit durch Auswachsen vermehren können. Das am 28. Juli 1987 veröffentlichte US- Patent Nr. 4,683,195 der Cetus Corporation und das ebenfalls am 28. Juli 1987 veröffentlichte US-Patent Nr. 4,683,202 der Cetus Corporation betreffen beide ein Verfahren zur Amplifikation einer in einer Probe vorhandenen Nucleinsäure-Zielsequenz. Das US-Patent Nr. 4,683,195 betrifft ein Verfahren, in dem eine Probe, von der vermutet wird, dass sie eine DNA-Zielsequenz enthält, mit Oligonucleotid-Primern behandelt wird, so dass ein Primer- Extensionsprodukt synthetisiert wird, das wiederum als Matrize dient, was eine Amplifikation der DNA-Zielsequenz ergibt. Das Primer-Extensionsprodukt wird in der bevorzugten Ausführungsform durch Wärmedenaturierung von der Matrize getrennt. Auf ähnliche Weise betrifft das US-Patent Nr. 4,683,202 ein Verfahren zur Amplifikation einer DNA-Zielsequenz mit zwei getrennten komplemetären Strängen. Das Verfahren beinhaltet Primer-Behandlung der Stränge, um die Extensionsprodukte zu synthetisieren, das Trennen der Primer-Extensionsprodukte von den Matrizen und das darauffolgende Verwenden der Primer-Extensionsprodukte als Matrizen.
Beide obigen US-Patente verlangen eine manuelle oder mechanische Beteiligung und mehrschrittige Arbeitsvorgänge durch den Anwender beim Amplifikationsvorgang und beschränken sich auf die DNA- Amplifikation. In den Schritten dieser Patente muss de Anwender die Probe wärmen, kühlen, geeignete Enzyme zugeben und danach die Schritte wiederholen. Durch die Temperaturveränderungen verlieren die Enzyme ihre Aktivität. Deshalb muss der Anwender das Amplifikationsgemisch während dem Amplifikationsverfahren wiederholt mit Aliquoten des geeigneten Enzyms anreichern.
Ausserdem findet in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 jeder Zyklus des Amplifikationsprozeses durch die Synthese einer zweiten Matrize von einer ersten Matrize, wobei die zweite Matrize wiederum verwendet wird, um die erste zu synthetisieren, statt. Dieser Vorgang wird wiederholt, womit jeder Zyklus des Amplifikationsverfahrens auf der Synthese eines Produkts aus einem Substrat basiert.
Trotz der im Stand der Technik offenbarten Amplifikationsverfahren besteht ein Bedarf an Verbesserungen im Amplifikationsverfahren. Es würde bevorzugt, wenn das Amplifikationsverfahren eine geringere Beteiligung und Manipulation durch den Anwender benötigen und sich nicht auf DNA beschränken würde. Ausserdem wäre es von Vorteil, wenn die Amplifikation bei relativ konstanter Umgebungstemperatur stattfinden würde, damit die am Verfahren beteiligten Enzyme nicht beeinflusst werden. Es wäre angebrachter, wenn eine Matrize verwendet werden könnte, um in jedem Zyklus des Amplifikationsprozesses aus einem Substrat mehr als ein Produkt zu bilden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Amplifikationsverfahren von einzelsträngiger RNA (ssRNA), einzelsträngiger DNA (ssDNA) oder doppelsträngiger DNA (dsDNA), was zweckmässig ist und weniger Beteiligung und Manipulationen des Anwenders verlangt als konventionelle Amplifikationsverfahren. Die Amplifikation findet bei einer relativ konstanten Umgebungstemperatur statt. Ausserdem bildet jeder Zyklus des Verfahrens aus einer Antisense-RNA-Matrize mehrere Kopien des Produkts. Das Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Menge einer spezifischen Nucleinsäure zu erhöhen, womit das Problem der Kopienzahl umgangen wird. Daher können Sondenassays sofort durchgeführt werden. Das Amplifikationsverfahren kann auch als Ersatz für konventionelle Klonierverfahren verwendet werden, um die Reinheit einer spezifischen Nucleinsäuresequenz zu erhöhen.
Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifizierung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz verwendet. Das Verfahren beinhaltet die Synthese einzelsträngiger RNA, einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA. Die einzelsträngige Antisense-RNA ist eine erste Matrize für einen zweiten Primer. Die einzelsträngige DNA ist eine zweite Matrize für einen ersten Primer. Die doppelsträngige DNA ist eine dritte Matrize für die Synthese vieler Kopien der ersten Matrize. Eine Sequenz des ersten oder zweiten Primers ist ausreichend komplementär zu einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäurensequenz, und eine Sequenz des ersten oder zweiten Primers ist mit einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend homolog. Ein zweiter Primer bindet an das 3'-Ende der ersten RNA-Matrize und bildet die zweite DNA- Matrize. Ein 3'-Ende des ersten Primers hybridisiert mit dem 3'- Ende der zweiten DNA-Matrize. Die zweite Matrize wird von der ersten Matrize entfernt und wird verwendet, um einen komplementären DNA-Strang zu bilden. Die sich daraus ergebende Duplex-DNA dient als dritte Matrize zur Synthese von vielen ersten Matrizen, die wiederum den oben beschriebenen Zyklus wiederholen.
Gemäss einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nucleinsäuresequenz verwendet. Das Verfahren beinhaltet:
a) Hybridisieren eines ersten Primers an eine erste Matrize. Der erste Primer hat eine DNA-Sequenz, die zu einer RNA-Sequenz der ersten Matrize ausreichend komplementär ist;
b) Synthetisieren einer ersten DNA-Sequenz, die kovalent an den ersten Primer gebunden und zur ersten RNA-Sequenz der ersten Matrize komplementär ist. Die erste DNA-Sequenz und der erste Primer umfassen eine zweite Matrize;
c) Trennen der ersten Matrize von der zweiten Matrize, um die Hybridisierung eines zweiten Primers zu erlauben;
d) Hybridisieren des zweiten Primers an die zweite Matrize. Der zweite Primer hat eine DNA-Sequenz, die zu der DNA-Sequenz der zweiten Matrize ausreichend komplementär ist. Der zweite Primer verfügt ebenfalls über eine komplementäre Sequenz eines Promotors und eine komplementäre Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle für eine RNA-Polymerase;
e) Synthetisieren einer zweiten DNA-Sequenz, die kovalent an den zweiten Primer gebunden und zu der DNA-Sequenz der zweiten Matrize komplementär ist, und Synthetisieren einer dritten DNA-Sequenz, die kovalent an die zweite Matrize gebunden und zu der DNA-Sequenz des zweiten Primers komplementär ist. Die zweite und dritte DNA- Sequenz, der zweite Primer und die zweite Matrize umfassen eine dritte Matrize;
f) Synthetisieren von vielen Kopien der RNA-Sequenz der ersten Matrize von der dritten Matrize.
Im anderen Falle beinhaltet das Amplifikationsverfahren gemäss der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte. Schritt (A) schafft ein einzelnes einen ersten Oligodeoxynucleotid-Primer enthaltendes Reaktionsmedium, wobei der erste Primer eine Sequenz umfasst, die ein funktioneller Promotor ist; einen zweiten Oligodesoxynucleotid-Primer, wobei der zweite Primer ein zu einem funktionellen Promotor komplementäres 5'-Endsegment umfasst; eine RNA-gelenkte DNA-Polymerase; eine DNA-gerichtete DNA-Polymerase; eine DNA- gerichtete RNA-Polymerase; eine Ribonuclease, die RNA aus einem BNA/DNA-Hybrid entfernt, ohne einzel- oder doppelsträngige RNA oder DNA zu hydrolisieren; Ribonucleosid- und Desoxyribonucleosidtriphosphate; und eines der Reagenzien DMSO oder BSA. Schritt (B) stellt als Zusatz zum Reaktionsmedium eines oder mehrere der folgenden Materialien zur Verfügung: (1) ein einzelsträngiges RNA- Molekül, das (a) eine Sense-RNA-Sequenz umfasst, die an ihrem 3'- Ende an einen Teil des 3'-Endes des zweiten Primers hybridisiert; oder (b) eine Antisense-RNA-Sequenz, die an ihrem 3'-Ende durch den ersten Primer hybridisiert wird, (2) ein einzelsträngiges DNA- Molekül, das (a) eine den zweiten Primer bindende DNA-Sequenz umfasst, die an ihrem 3'-Ende an das 3'-Ende des zweiten Primers hybridisiert; oder (b) eine promotorkomplementäre DNA-Sequenz, die eine 5'-Endsequenz umfasst, die zu einem funktionellen Promotor komplementär ist; oder (c) eine den ersten Primer bindende DNA- Sequenz, die an ihrem 5'-Ende durch den ersten Primer hybridisiert wird, (3) ein denaturiertes doppelsträngiges DNA-Molekül, das ein amplifizierbares Segment und einen funktionellen Promotor umfasst, wobei der funktionelle Promotor an das Segment anliegt und so orientiert ist, dass er die Transkription des Segments kontrolliert. Schritt (C) schafft Bedingungen, durch die wenigstens ein Bestandteil der aus einem Teil des RNA-Moleküls, dem einzelsträngigen DNA-Molekül und dem doppelsträngigen DNA-Molekül bestehenden Gruppe als Matrize verwendet wird, um eine oder mehrere Kopien der Antisense-RNA-Sequenz zu bilden und worin die Antisense-RNA-Sequenz einen Zyklus im Reaktionsmedium auslöst, der die folgenden Schritte umfasst: (1) Hybridisieren des ersten Primers an eine Region des 3'-Endes der Antisense-RNA-Sequenz; (2) Bilden eines RNA/DNA- Hybriden durch die RNA-gelenkte DNA-Polymerase, wobei das RNA/DNA- Hybrid ein kovalent an das 3'-Ende des ersten Primers gebundenes erstes DNA-Segment umfasst, um ein zweites DNA-Segment zu bilden, wobei das erste DNA-Segment zu wenigstens einem Teil der Antisense-RNA-Sequenz komplementär ist; (3) Ablösen des zweiten DNA- Segments vom RNA/DNA-Hybriden durch die Aktion der Ribonuclease auf wenigstens einem Teil der Antisense-RNA-Sequenz; (4) Hybridisieren des 3'-Endes des zweiten DNA-Segments mit dem 3'-Ende des zweiten Primers, um ein Duplikat zu bilden, das durch die DNA- gerichtete DNA-Polymerase bearbeitet wird, (a) um ein drittes DNA- Segment zu produzieren, das kovalent an das 3'-Ende des zweiten Primers gebunden ist und zum ersten DNA-Segment komplementär ist, und (b) ein viertes DNA-Segment, das das dritte DNA-Segment und den ersten Primer umfasst, und (c) ein fünftes DNA-Segment, das kovalent an das 3'-Ende deszweiten DNA-Segments gebunden ist und das zum nicht-duplexierten 5'-Ende des zweiten Primers komplementär ist, und (d) ein sechstes DNA-Segment, das das zweite DNA- Segment und das fünfte DNA-Segment umfasst; und (5) Herstellen von (a) einer Vielzahl RNA-Sequenzen, die der Antisense-RNA-Sequenz durch die Aktion der RNA-Polymerase auf dem Duplikat entsprechen und (b) von einer Vielzahl DNA-Sequenzen, die dem vierten DNA- Segment und dem sechsten DNA-Segment entsprechen.
Eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist zu einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend komplementär und eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist mit einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend homolog. Ein 3'-Ende des ersten Primers ist auf komplementären Strängen gegen ein 3'-Ende des zweiten Primers gerichtet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung verfügt der zweite DNA-Primer an seinem 3'-Ende über eine Sequenz, die zu der DNA- Sequenz der zweiten Matrize ausreichend komplementär ist. Der zweite Primer verfügt an seinem 5'-Ende über eine komplementäre Sequenz eines Promotors und eine komplementäre Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle für eine RNA-Polymerase.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die kovalent an die zweite Matrize gebundene dritte DNA-Sequenz zu der DNA- Sequenz am 5'-Ende des zweiten Primers komplementär.
In einer anderen Ausführung der Erfindung wird ein Verfahren zum Amplifizieren einer spezifischen Nucleinsäuresequenz verwendet. Das Verfahren beinhaltet das Kombinieren eines ersten Primers, eines zweiten Primers, Ribonuclease H, einer RNA-gericheteten DNA- Polymerase, einer DNA-gerichteten DNA-Polymerase, einer RNA- Polymerase, Ribonucleosidtriphosphaten und Desoxyribonucleotidtriphosphaten mit einer Probe. Der erste DNA-Primer verfügt über eine Sequenz, die zu einer ersten RNA-Matrize ausreichend komplementär ist. Der zweite DNA-Primer verfügt über eine Sequenz, die zu einer zweiten DNA-Matrize ausreichend komplementär ist, und über eine komplementäre Sequenz eines Promotors und eine komplementäre Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle, die von der RNA- Polymerase als Substrat erkannt werden. Eine Sequenz des ersten Primers oder des zweiten Primers ist zu einer spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend komplementär, und eine Sequenz des ersten Primers oder des zweiten Primers ist mit einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäure ausreichend homolog. Ein 3'-Ende des ersten Primers ist auf komplementären Strängen gegen ein 3'-Ende des zweiten Primers orientiert.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifizierung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz verwendet. Bei dem Verfahren werden ein erster Primer, ein zweiter Primer, Vogel-Myoblastosisvirus-Polymerase, E.coli-Ribonuclease H, Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase, Ribonucleosidtriphosphate und Desoxyribonucleotidtriphosphate zu einer Probe gegeben. Der erste DNA- Primer verfügt über eine Sequenz, die zu einer ersten RNA-Matrize ausreichend komplementär ist. Der zweite DNA-Primer verfügt über eine Sequenz, die zu einer zweiten DNA-Matrize ausreichend komplementär ist und über eine komplementäre Sequenz eines Promotors und eine komplementäre Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle, die durch die T7-RNA-Polymerase als Substrat erkannt werden. Eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist zu einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend komplementär, und der erste oder der zweite Primer ist mit einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend homolog. Ein 3'-Ende des ersten Primers ist auf komplementären Strängen gegen ein 3'-Ende des zweiten Primers orientiert.
Die Erfindung betrifft weiter ein Set zur Amplifikation von Nucleinsäuremolekülen, das folgende Elemente umfasst: (a) ein Gefäss mit einer Lösung eines ersten Oligonucleotid-Primers, (b) ein Gefäss mit einer Lösung eines zweiten Oligonucleotid-Primers, (c) ein Gefäss mit einer Lösung einer Ribonuclease, die RNA in einem RNA/DNA-Hybriden hydrolisiert, ohne einzel- oder doppelsträngige RNA oder DNA anzugreifen, (d) ein Gefäss mit einer Lösung einer RNA-gelenkten DNA-Polymerase, (e) ein Gefäss mit einer Lösung von DNA-gerichteter RNA-Polymerase, (f) ein Gefäss mit einer Lösung von DNA-gerichteter DNA-Polymerase, (g) ein Gefäss mit einer Lösung aus Ribonucleosidtriphosphaten, (h) ein Gefäss mit einer Lösung aus Desoxyribonucleotidtriphosphaten, (i) ein Gefäss mit einer DMSO-Lösung, und (j) einen Gefäss mit einer BSA-Lösung.
Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure geschaffen, worin das DMSO in einer Konzentration von 0 - 30% und das BSA in einer Konzentration von 5 - 2500 lg/ml vorliegt. Das DMSO kann auch in einer Konzentration von 0 - 30 % und das BSA in einer Konzentration von 50 - 500 lg/ml vorliegen. Ausserdem kann DMSO in einer Konzentration von 5 -15 µg/ml und BSA in einem Konzentrationsbereich von 50 - 500 µg/ml zur Verfügung gestellt werden.
Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Amplifikation mit DMSO und BSA im Vergleich zur Amplifikation ohne DMSO oder BSA wenigstens 10mal gesteigert. In einer anderen Ausführung ist sie wenigstens 1000mal höher als die Amplifikation ohne DMSO oder BSA. In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung beträgt die Steigerung gegenüber der Amplifikation ohne DMSO oder BSA minestens das 10&sup4;-fache. In einer weiteren Ausführung ist sie wenigstens 10&sup6; mal höher als ohne DMSO oder BSA. In noch einer anderen Ausführung liegt die Effizienz wenigstens 10&sup8; mal höher als ohne DMSO oder BSA.
Die Zeichnungen, die Ausführungsformen der Erfindung darstellen, zeigen:
Figur 1a: eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Nucleinsäurenamplifikation;
Figur 1b: ein Beispiel des Verfahrens zur Nucleinsäurenamplifikation, das mit einem (+)Sense-Molekül beginnt;
Figur 1c: ein Beispiel des Verfahrens zur Nucleinsäurenamplifikation, das mit einer dsDNA beginnt, die mit einer Restriktions- Endonuclease geschnitten und danach denaturiert wurde;
Figur 1d: ein Beispiel des Verfahrens zur Nucleinsäurenamplifikation, das mit einer denaturierten dsDNA beginnt;
Figur 2: die synthetischen Oligonucleotid-DNA-Sequenzen, die zum Testen des Amplifikationsverfahrens benutzt werden: Figur 2A zeigt die GAG-Testsequenz, Figur 2B die GAG2-Testsequenz;
Figur 3: ein Autoradiogramm einer PAGE-Analyse von Amplifikationsreaktionen unter Verwendung unterschiedlicher Primerkonzentrationen;
Figur 4: ein Autoradiogramm einer PAGE-Analyse von Amplifikationsreaktionen unter Verwendung unterschiedlicher Matrizenkonzentrationen;
Figur 5: ein Autoradiogramm einer Dot-Blot-Hybridisierung von Amplifikationsreaktionen;
Figur 6: ein Autoradiogramm einer PAGE-Analyse einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung von Restriktionsfragmenten als Matrizen;
Figur 7: ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel zur Titration von Amplifikationsreaktionen ohne Zielsequenzen (keine Matrize) unter Verwendung von 0 - 20% DMSO mit einer Auswirkung auf nichtspezifische Produkte (NSP).
Figur 8: ein mit Ethidiumbromid angefärbtes Agarosegel von Amplifikationsreaktionen ohne Matrizen (oM) und mit 10&sup4; Kopien einer Matrize unter Verwendung von 0% (-) und 15% (+) DMSO, was die Eliminierung von NSP anzeigt.
Figur 9: ein Autoradiogramm einer Slot-Blot Hybridisierungsanalyse von Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von 0% (-) und 15% (+) DMSO ohne Matrizen (oM) und 10³ und 10&sup4; Matrizenkopien, was eine verbesserte Vermehrung und Empfindlichkeit anzeigte.
Figur 10A: ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel von Amplifikationsreaktionen ohne Matrize (oM) und 10&sup4; Matrizenkopien unter Verwendung von 50 lg/ml BSA, 0% DMSO und 0 % BSA, 15% DMSO und 50 lg/ml BSA, 15% DMSO und 100 lg/ml BSA, und 15% DMSO, was eine verbesserte Empfindlichkeit der Kombination von BSA und DMSO für das Nachweisen einer amplifizierter Matrize anzeigte.
Figur 10B: ein Autoradiogramm einer Slot-Blot-Hybridisierungsanalyse von Amplifikationsreaktionen ohne Matrize (oM) und 10&sup4; Matrizenkopien unter Verwendung von 50 lg/ml BSA, 0% DMSO und 0% BSA, 15% DMSO und 50 lg/ml BSA, 15% DMSO und 100 lg/ml BSA, wobei 15% DMSO eine verbesserte Empfindlichkeit der Kombination von BSA und DMSO für das Nachweisen einer amplifizierten Matrize und bei der Verwendung von DMSO alleine ein verbesserte Vermehrung anzeigte.
Figur 11: ein Autoradiogramm einer Slot-Blot-Hybridisierungsanalyse von Amplifikationsreaktionen ohne Matrize (oM) und 10³ und 10&sup4; Matrizenkopien unter Verwendung von 15% DMSO allein und 15% DMSO und 100 lg/ml BSA, was eine verbesserte Empfindlichkeit der Kombination von BSA und DMSO für das Nachweisen einer amplifizierten Matrize und bei der Verwendung von DMSO alleine eine verbesserte Reproduzierbarkeit anzeigte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nucleinsäuresequenz. Zur Amplifikation gehört die alternierende Synthese von DNA und RNA und wird in den Figuren 1a bis 1d im allgemeinen und speziellen erläutert. In diesem Verfahren wird einzelsträngige Antisense(-)-RNA in einzelsträngige DNA umgewandelt, welche wiederum in dsDNA umgewandelt wird und zu einer funktionellen Matrize für die Synthese einer Vielzahl Kopien der ursprünglichen einzelsträngigen RNA wird. Im Amplifikations- Verfahren werden ein erster und ein zweiter Primer verwendet. Eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist zu einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend komplementär, und eine Sequenz des ersten oder des zweiten Primers ist mit einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz ausreichend homolog. In einigen Fällen sind der erste und der zweite Primer ausreichend komplementär zu und ausreichend homolog mit einer Sequenz der spezifischen Nucleinsäuresequenz, beispielsweise dann, wenn die spezifische Nucleinsäuresquenz eine doppelsträngige DNA ist.
Die (-) RNA wird in eine einzelsträngige DNA umgewandelt, indem ein Oligonucleotid-Primer (der erste Primer) an das 3'-Ende der RNA (die erste Matrize) hybridisiert wird und indem ein komplementärer Strang der DNA vom ersten Primer (die erste DNA-Sequenz) unter Verwendung einer RNA-gelenkten DNA-Polymerase synthetisiert wird. Die sich daraus ergebende einzelsträngige DNA (die zweite Matrize) wird von der ersten Matrize beispielsweise durch Hydrolyse der ersten Matrize unter Verwendung einer Ribonuclease getrennt, die für RNA-DNA-Hybride (zum Beispiel Ribonuclease H) spezifisch ist. Die zweite Matrize wird so umgewandelt, dass sie RNA synthetisieren kann, indem sie mit einem synthetischen oligonucleotid (den zweiten Primer) hybridisiert, der an seinem 3'-Ende eine Sequenz, die zum 3'-Ende der zweiten Matrize ausreichend komplementär ist, und gegen sein 5'-Ende eine Sequenz mit einem komplementären Strang eines Promotors und einer Antisensesequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle enthält, und indem sie eine kovalent an das 3'-Ende des zweiten Primers gebundene zweite DNA- Sequenz unter Verwendeung der zweiten Matrize als Matrize synthetisiert, und indem sie eine kovalent an das 3'-Ende der zweiten Matrize gebundene dritte DNA-Sequenz unter Verwendung des zweiten Primers als Matrize synthetisiert, unter Verwendung DNA- gerichteter DNA-Polymerase. Das daraus hervorgehende funktionelle Derivat der zweiten Matrize, die eine dritte Matrize ist, wird für die Synthese von mehreren RNA-Kopien verwendet, die erste Matrize unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die durch den vom zweiten Primer definierten Promotor und die Transkriptionsinitiationsstelle spezifisch ist. Jede neu synthetisierte erste Matrize kann durch Wiederholung des Zyklus in weitere Kopien der zweiten und der dritten Matrize umgewandelt werden. Darüberhinaus verlangt die Wiederholung des Zyklus keine Beteiligung oder Manipulation durch den Anwender.
Das Amplifikationsverfahren beginnt mit der Zugabe einer geeigneten Nucleinsäurematrize zu den geeigneten Enzymen, Primern und Kofaktoren unter geeigneten Reaktionsbedingungen. Diese Nucleinsäurematrize liegt in einer Form vor, die homogen und kontinuerlich amplifizieren und als Zwischenprodukt im in Figur 1a gezeigten Zyklus funktionieren kann. Zum Amplifikationsverfahren gehört der Nettoverbrauch von Vorläufern (Primer, Ribonucleosidtriphosphate und Deoxyribonucleotidtriphosphate) und die Nettoakkumulation von Produkten (RNA und DNA). Das Verfahren der RNA- und DNA-Synthese findet solange asynchron statt, bis ausreichende Mengen Nucleinsäuren synthetisiert wurden, um nachgewiesen werden zu können. Der Amplifikationsvorgang kann beispielsweise durch die Synthese eines markierten Produkts von einem markierten Vorläufer überwacht werden.
Die Amplifikation kann zusätzlich zu oder anstelle des in Figur 1a allgemein erklärten Verfahrens ein anderes Verfahren beinhalten. Es sind auch gewisse kontraoproduktive Enzymreaktionen möglich, die mit zulässig niedriger Häufigkeit auftauchen. Zu den möglichen nicht-produktiven Nebenreaktionen gehört die Synthese von RNA und/oder DNA in Abwesenheit einer zugegebenen Nucleinsäurematrize.
Solche RNA- und/oder DNA-Produkte können von den gewünschten Produkten unterschieden werden, indem bestimmt wird, ob eine spezifische Sequenz, die nur zwischen den zwei Initationsstellen der spezifischen Nucleinsäuresequenz gefunden wird, anwesend ist.
Der erste Primer ist ein oligonucleotid, der an seinem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die zum 3'-Ende der ersten Matrize ausreichend komplementär ist. Die Sequenz am 3'-Ende des ersten Primers verfügt über eine bestimmte Länge und Basenzusammensetzung, um unter gegebenen Ionenstärke- und Temperatur-Bedingungen eine spezi fische und effiziente Synthese der DNA-Sequenz zu erlauben. Der erste Primer kann zu einer inneren Region des 3'-Endes der ersten Matrize des ersten Zyklus ausreichend komplementär sein. In anschliessenden Zyklen ist das 5'-Ende des ersten Primers komplementär zum 3'-Ende der ersten Matrize. Der erste Primer kann teilweise oder ganz aus Nucleotiden oder anderen Nucleotidanalogen als den natürlichen Deoxyribonucleotiden zusammengesetzt sein. Das 5'- Ende des ersten Primers kann Sequenzen enthalten, die zur ersten Matrize im ersten Zyklus nicht komplementär sind. Die nichtkomplementären Sequenzen können zu einer Nucleinsäure komplementär sein, die immobilisiert sein kann oder an die eine nützliche nicht-Nucleinsäurekomponente, wie beispielsweise ein Reporter gebunden werden kann, um das Nachweisen zu vereinfachen. Im anderen Fall können die nicht-komplementären Sequenzen eine komplementäre Sequenz eines Promotors und eine komplementäre Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle, die zur RNA-Synthese verwendet werden könnte, beinhalten. Diese RNA wäre zur ersten Matrize komplementär und könnte in einem anderen Amplifikationszyklus als Zwischenprodukt verwendet werden.
Der zweite Primer ist ein oligodesoxyribonucleotid, der an seinem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die zum 3'-Ende der zweiten Matrize ausreichend komplementär ist. Der zweite Primer verfügt über eine bestimmte Länge und Basenzusammensetzung, um unter den gegebenen Ionenstärke- und Temperatur-Bedingungen von eine spezifische und effiziente Synthese der zweiten und der dritten DNA-Sequenz zu erlauben. Zusätzlich enthält der zweite Primer die Antisensesequenz eines funktionellen Promotors und die Antisensesequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle. Wenn diese Sequenz als Matrize für die Synthese der dritten DNA-Sequenz verwendet wird, enthält sie ausreichende Informationen, um eine spezifische und effiziente Bindung von RNA-Polamerase und die Transkriptionsinitiation an der gewünschten Stelle zu erlauben. Die Promotorsequenz kann vom Antisensestrang eines funktionellen Promotors abgeleitet werden. Die Transkriptionsinitiationsstelle kann von der 5'-Endsequenz eines natürlichen RNA-Transkripts abgeleitet werden. In einer bevorzugten Ausführung lautet die 5'-Endsequenz des zweiten Primers AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG. Zu dieser Sequenz gehört die Antisensesequenz des Promotors und die Antisensesequenz der Transkriptionsinitiationsstelle für die T7-RNA-Polymerase. Es können auch die Transkriptionsinitiationsstelle und der Promotor für eine andere Phagen-Polymerase-RNA verwendet werden. Ausserdem können Sequenzen, die mit der Promotorfunktion nichts zu tun haben, am 5'-Ende des zweiten Primers oder zwischen der Transkriptionsinitiationsstelle und der Sequenz am 3'-Ende, das an die zweite Matrize hybridisiert, eingeschlossen werden. Der zweite Primer kann teilweise oder ganz aus Nucleotiden oder anderen Nucleotidanalogen als natürlich Desoxyribonucleotide zusammengesetzt sein.
Alle in dieser Erfindung verwendeten Enzyme sollten bestimmte praktische Bedingungen erfüllen. Jedes Enzym oder Enzympräparat sollte frei sein von schädlichen Desoxyribonuclease-Aktivitäten ("DNase"), wie beispielsweise die 5'- oder 3'-Exonuclease- Aktivitäten, die oft mit bestimmten DNA-Polymerasen und einzeloder doppelsträngigen spezifischen Exonucleasen oder Endonucleasen assoziert werden. Jedes Enzym oder Enzympräparat sollüe frei sein von nachteiligen Ribonuclease-Aktivitäten ("RNase"), mit Ausnahme der bevorzugten Zugabe einer Ribonuclease-Aktivität, die für RNA- und DNA-Hybride (beispielsweise Ribonuclease H) spezifisch sind. Ausserdem sollte jedes Enzym unter den üblichen Reaktionsbedingungen, die für die anderen enzymatischen und nicht-enzymatischen Verfahren, wie die Hybridisierung von Oligonucleotid-Primern an die RNA- oder DNA-Matrizen, verwendet werden, in bestimmtem Masse aktiv sein.
Die in dieser Erfindung verwendete DNA-gerichtete RNA-Polymerase kann ein beliebiges Enzym sein, das sich an eine bestimmte Promotor genannte DNA-Sequenz binden und das spezifisch eine in vitro RNA-Synthese an einer definierten Initiationsstelle nahe des Promotors initiieren kann. Der Promotor und die Initiationsstelle sind ein Teil des zweiten Primers. Zusätzlich sollte die RNA- Polymerase mehrere RNA-Kopien über eine funktionelle Matrizenkopie in einer annehmbaren Zeit synthetisieren können. In der bevorzugten Ausführung wird die Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase benützt. Ausserdem können auch andere Bakteriophagen-RNA-Polymerasen wie T3-Phage, XII-Phage, Salmonella-Phage sp6 oder Pseudomonas-Phage gh-1 verwendet werden. In einer anderen Ausführung können andere prokaryotische oder eukaryotische DNA-gerichtete RNA-Polymerasen verwendet werden. Es wird darauf hingewiesen, dass, wenn andere RNA-Polymerasen verwendet werden, die entsprechend nötigen Veränderungen am Promotor und den Initiationssequenzen des zweiten Primers gemäss der Matrizenspezifität der bestimmten RNA-Polymerase vorgenommen werden müssen.
Die in dieser Erfindung verwendete RNA-gelenkte DNA-Polymerase kann ein beliebiges Enzym sein, das DNA von einem Oligodesoxyribonucleotid-Primer und einer RNA-Matrize synthetisieren kann. Ausserdem kann dieses Enzym Aktivitäten für DNA-gerichtete DNA- Polymerase und RNase H enthalten. In der bevorzugten Ausführung wird die Vogel-Myoblastosisvirus-Polymerase ("AMV Reverse Transkriptase"). Zusätzlich kann die RNA-gelenkte DNA-Polymerase aus einem anderen Retrovirus stammen, wie beispielsweise dem Maloney Mausleukämie-Virus. Auch andere eukariotische RNA-gelenkte DNA- Polymerasen können verwendet werden.
Die in dieser Erfindung verwendete DNA-gerichete DNA-Polymerase kann ein beliebiges Enzym sein, das DNA von einem Oligodesoxyribonucleotid-Primer und einer DNA-Matrize synthetisieren kann. Dieses Enzym sollte weder 5'- noch 3'-Exonuclease-Aktivitäten, die mit vielen DNA-Polymerase-Typen assoziiert sind, enthalten. In der bevorzugten Ausführung wird die AMV Reverse Transkriptase verwendet.
Es können jedoch auch andere DNA-gerichtete DNA-Polymerasen, denen die 5'- oder 3'-Exonuclease-Aktivitäten von Natur aus fehlen, verwendet werden. Zu diesen können bestimmte eukaryotische DNA- Polymerasen, wie DNA-Polymerase, oder jene DNA-Polymerasen, die aus Säugetiergewebe, wie Kälberthymus, isoliert werden können, gehören. Eine sonst ungeeignete DNA-Polymerase kann verwendbar gemacht werden, indem die unerwünschten Exonuclease-Aktivitäten durch Veränderung des DNA-Polymerasegens und nachfolgender Expression der veränderten Polymerase in einer geeigneten Wirtezelle entfernt wird oder indem das DNA-Polymeraseprotein chemisch modifiziert wird. Veränderte Versionen der DNA-Polymerase können aus dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I oder der Bakteriophagen-T7-DNA-Polymerase gewonnen werden. Es wird darauf hingewiesen, dass solche andere DNA-gerichtete DNA-Polymerase- Aktivitäten beigegeben werden, um die durch die RNA-gelenkte DNA- Polymerase erreichte Aktivität zu verstärken, da in der bevorzugten Ausführung die RNA-gelenkte und die DNA-gerichteten DNA- Polymerase-Aktivitäten durch das gleiche Enzym geliefert werden.
Die RNase H, die in dieser Erfindung verwendet werden kann, kann ein beliebiges Enzym sein, das eine RNA hydrolisieren kann, die an eine komplementäre DNA angelagert ist. Dieses Enzym soll einzeloder doppelsträngige RNA oder eine beliebige DNA nicht hydrolisieren können. In der bevorzugten Ausführung wird die E. coli-RNase H verwendet. Ausserdem können andere RNase H-Enzyme wie beispielsweise Kälberthymus-RNase H verwendet werden. Da die RNase H eine intrinisische Aktivität der AMV Reverse Transkriptase ist, wird die E.coli-RNase H in der bevorzugten Ausführung durch die RNase H der AMV Reverse Transkriptase ergänzt. Es kann auch jedes andere Enzym, das die zweite Matrize von der ersten Matrize trennen kann, verwendet werden.
Die oben erwähnten Enzyme und Primer werden in einem Reaktionsgefäss miteinander vermischt, das die für die DNA- und die RNA- Synthese benötigten Pufferlösungen und Kofaktoren enthält. Ausserdem müssen die ionischen Bedingungen und die Reaktionstemperatur mit der spezifischen Hybridisierung der Primer der DNA- und RNA- Matrizen übereinstimmen, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Das Reaktionsgemisch muss frei sein von Agenzien, die mit dem Amplifikationsverfahren interferieren würden, insbesondere Agenzien, die die Aktivität der Enzyme in grossem Masse hemmen, mit der Hybridisierung von Primern oder und Matrizen interferieren oder die Nucleinsäurenzwischenprodukte und -Produkte unproduktiv abbauen.
Die Beschreibung möglicher Nachweisschemata kann bei der Anwendung des Amplifikationsverfahrens nützlich sein. Es wird darauf hingewiesen, dass Schemata, die zum Nachweisen der im Amplifikationsverfahren synthetisierten Neucleinsäuren verwendet werden, nicht auf die in diesem Text beschriebenen begrenzt sind, und selbstverständlich können auch andere Verfahren verwendet werden.
In einer Ausführung kann dem Reaktionsgemisch ein markiertes Vorprodukt zugegeben werden. Die Amplifikation wird durch die quantitative oder qualitative Analyse der markierten Produkte bestimmt, die vom markierten Vorprodukt mittels bekannter Verfahren getrennt werden können. Ein markiertes Vorprodukt kann ein Ribonucleosidtriphosphat zum Nachweisen der RNA-Synthese, ein Desoxynucleosidtriphosphat oder ein oligonucleotidprimer zum Nachweis der DNA- Synthese sein. Der Markierungstyp kann ein Radioisotop oder eine geeignete chemische Gruppe wie Biotin, ein chromophober Stoff, ein Fluorphor oder ein Hapten sein, das sich an einen Antikörper oder wenn möglich an ein Protein oder ein Enzym binden kann. Die markierten Produkte können aufgrund ihrer Löslichkeit, Ladung oder Grösse von markierten Vorprodukten getrennt werden. Ausserdem kann die markierte DNA oder RNA mit einer Nucleinsäure hybridisiert werden, die eine komplementäre Sequenz enthält und immobilisiert werden kann.
In einer weiteren Ausführung können die Produkte des Amplifikationsprozesses an einen immobilisierten Support gebunden, mit einer eine komplementäre Sequenz enthaltenden Nucleinsäurenprobe hybridisiert und von der nicht hybridisierten Nucleinsäurensonde getrennt werden, die in der Lösung verbleibt. Die Produkte, DNA oder RNA können durch stabile Interaktion wie hydrophobe, elektrostatische oder kovalente Interaktion direkt an einen festen Support gebunden werden. Zudem können die Produkte bestimmte chemische Gruppen wie beispielsweise Biotin enthalten, die während des Amplifikationsprozesses in die Produkte inkorporiert werden können, um die Bindung an ein immobilisiertes Protein wie Avidin oder Streptavidin zu erlauben. Zusätzlich können die Produkte mit einer Nucleinsäure hybridisiert werden, die eine komplementäre Sequenz enthält und immobilisiert werden kann. Die Nucleinsäurensonde enthält eine komplementäre Sequenz, die mit einem Produkt des Amplifikationsverfahrens eine ausreichend stabile Interaktion bildet, um die Bindung bei den Hybridisationsbedingungen und die anhaltende Bindung bei Bedingungen, wie sie für die Entfernung der unhybridisierten Nucleinsäuresonde verwendet werden, zu erlauben. In der bevorzugten Ausführung wird die komplementäre Sequenz von dem Teil der spezifischen Nucleinsäurensequenz abgeleitet, die zwischen der Sequenz des ersten Primers und des zweiten Primers liegt. Die Nucleinsäurenprobe kann eine einzelstrangige DNA oder RNA oder eine doppelsträngige DNA oder RNA sein, die einzelsträngig gemacht werden kann, oder ein oligonucleotid, der aus Desoxyribonucleotiden und/oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sein kann. Zusätzlich kann die Nucleinsäurensonde eine chemische Gruppe enthalten, die sich unter den richtigen Bedingungen kovalent an ein Produkt DNA oder RNA binden kann. Die Nucleinsäureprobe kann mit einem Radioisotop oder einer geeigneten chemischen Gruppe wie Biotin, ein chromophober Stoff, ein Fluorphor oder Hapten, markiert werden, die an einen Antikörper binden können. Zusätzlich kann die Nucleinsäurensonde an ein Protein oder Enzym, beispielsweise eine Phosphatase oder Peroxidase konjugiert werden. Zudem kann die Nucleinsäureprobe Sequenzen enthalten, die eine in vitro- Replikation der Probe erlauben.
Die Produkte des Amplifikationsverfahrens können mittels Verfahren, die üblicherweise für mit Techniken des molekularen Klonierens angereicherten Nucleinsäuren verwendet werden, analysiert werden. In einer anderen Ausführung kann die Synthese einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verdauen der synthetisierten DNA mit einer Restriktionsendonuclease und nachfolgender Elektrophoresetrennung und bekannten Nachweisverfahren nachgewiesen werden. In einer anderen Ausführung kann die Sequenz amplifizierter RNA durch DNA- Synthese unter Verwendung einer RNA-gelenkten DNA-Polymerase, des ersten Primers und von Didesoxynucleosidtriphosphaten (Stoflet et al., 1988) bestimmt werden. In einer anderen Ausführung kann die Sequenz der amplifizierten dritten Matrize durch RNA-Synthese unter Verwendung der im Amplifikationsverfahren verwendeten DNA- gerichteten RNA-Polymerase und 3'-Desoxyribonucleotidtriphosphate (Axelrod & Kramer, 1985) bestimmt werden. In einer weiteren Ausführung kann die amplifizierte RNA ein Polypeptid codieren, das in vitro transkribiert werden kann. Das Polypeptidprodukt der in vitro-Translation kann durch Verwendung eines Antikörpers analysiert werden.
Eine Probe, von der angenommen wird oder bekannt ist, dass sie die spezifische Nucleinsäurensequenz enthält, wird zum Reaktionsgemisch in Form einer Nucleinsäurenmatrize zugegeben, die homogen und kontinuierlich amplifizieren kann und ein beliebiges Zwischenprodukt im in Figur 1 beschriebenen Zyklus sein kann. Die Nucleinsäurenmatrize kann insbesondere eine einzelsträngige RNA sein, die an ihrem 5'-Ende eine Sequenz aufweist, die zum 3'-Ende des zweiten Primers ausreichend homolog ist und eine Sequenz aufweist, die zum ersten Primer ausreichend komplementär ist. Eine Nucleinsäurenmatrize dieser Art funktioniert im Amplifikationsverfahren als erste Matrize. Die Nucleinsäurenmatrize kann auch eine einzelsträngige DNA sein, die an ihrem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die wenigstens zum 3'-Ende des zweiten Primers ausreichend komplementär ist und eine Sequenz enthält, die mit dem 3'-Ende des ersten Primers ausreichend homolog ist. Eine Nucleinsäurenmatrize dieser Art funktioniert im Amplifikationsverfahren als zweite Matrize.
Die Nucleinsäurenmatrize kann auch eine doppelsträngige DNA sein, deren einer Strang an seinem 5'-Ende die ganze Sequenz des zweiten Primers aufweist und eine zum ersten Primer ausreichend komplementäre Sequenz enthält. Die doppelsträngige DNA funktioniert im Amplifikationsverfahren als dritte Matrize.
Obwohl die Herstellung einer Nucleinsäurenmatrize kein Teil des Amplifikationsverfahrens ist, kann die Beschreibung möglicher Schemata zur Bildung von Nucleinsäurenmatrizen bei der Anwendung des Amplifikationsverfahrens hilfreich sein. Es wird darauf hingewiesen, dass sich die Schemen, die verwendet werden, um die Nucleinsäurenamtrize zu erhalten, nicht auf die hier beschriebenen Alternativen beschränken, und natürlich können auch andere Verfahren angewendet werden.
In einer Ausführung kann eine als erste Matrize funkionierende Nucleinsäurenmatrize eine natürlich auftretende RNA oder ein RNA- Fragment sein, das unter Verwendung bekannter stellenspezifischer Hydrolyseverfahren aus einem grösseren RNA-Molekül gebildet werden kann (Shibahara et al., 1987).
In einer anderen Ausführung kann die als eine zweite Matrize funktionierende Nucleinsäurenmatrize aus einer doppelsträngigen DNA durch Verdauen mit einer Restriktionsendonuclease, die über eine Stelle verfügt, die unmittelbar neben der zum 3'-Ende des zweiten Primers ausreichend komplementären Sequenz liegt, gebildet werden. Die sich daraus ergebenden doppelsträngigen DNA-Fragmente können danach mittels chemischer oder thermischer Denaturationsverfahren einzelsträngig gemacht werden.
In einer anderen Ausführung kann eine als zweite Matrize funktionierende Nucleinsäurenmatrize aus einer einzelstr:ngigen DNA oder RNA gebildet werden, an die ein Oligonucleotid hybridisiert wurde, der eine DNA-Synthese blockieren kann. Dieser blockierende Olignucleotid kann eine chemische Gruppe enthalten, die sich unter geeigneten Bedingungen kovalent an die Matrize binden kann. Die DNA- Synthese dieser blockierten Matrize kann unter Verwendung des ersten Primers eine synthetisierte DNA mit dem gleichen 3'-Ende wie die zweite Matrize ergeben. Wenn die ursprüngliche Matrize eine RNA ist, kann das entstandene DNA-RNA-Hybrid direkt als Nucleinsäurenmatrize verwendet werden. Wenn die ursprüngliche Matrize eine DNA ist, kann die entstandene Kopie der zweiten Matrize mittels chemischer oder thermischer Denaturierungsverfahren von der ursprünglichen Matrize getrennt werden.
In einer anderen Ausführung kann eine als eine dritte Matrize funktionierende Nucleinsäurenmatrize durch DNA-Synthese von der DNA- oder RNA-Matrize unter Verwendung des zweiten Primers aus einer einzelsträngigen DNA oder RNA gebildet werden. Die entstandene synthetisierte DNA kann dann unter Verwendung von chemischen oder enzymatischer Denaturierungsverfahren von der ursprünglichen Matrize getrennt werden. Ausserdem kann die RNA-Matrize mittels chemischer oder thermischer Denaturierungsverfahren hydrolisiert werden. Die Sequenz des zweiten Primers der entstandenen einzelsträngigen DNA ist kovalent an das 5'-Ende der letzteren gebunden, welche eine Sequenz enthält, die zum ersten Primer ausreichend komplementär ist. Die einzelsträngige DNA kann in eine für die Transkription funktionelle doppelsträngige DNA umgewandelt werden, indem der erste Primer an die einzelsträngige DNA hybridisiert und eine DNA-Sequenz, die kovalent an den ersten Primer gebunden und zu der einzelsträngigen DNA komplementär ist, synthetisiert wird.
In einer weiteren Ausführung kann eine einzelsträngige DNA oder RNA-Matrize mittels chemischer, thermischer oder, wenn möglich, emzymatischer Verfahren aus einer doppelsträngigen DNA, doppelsträngigen RNA oder einem DNA-RNA-Hybrid erhalten werden. Danach kann die entstandene DNA oder RNA unter Verwendung eines der oben erwähnten Schemata zur Bildung einer Nucleinsäurenmatrize verwendet werden, die als eine erste, zweite oder dritte Matrize funktionieren kann. Ausserdem können ein weiteres Schema, das den ersten Primer und einen Strang der Nucleinsäure beinhaltet und ein anderes Schemata, das den zweiten Primer und den anderen (komplementären) Strang der Nucleinsäure enthält, gleichzeitig zur Bildung von Nucleinsäurenmatrizen verwendet werden.
Unerwarteterweise wurde nachgewiesen, dass die Zugabe von DMSO und BSA in das Reaktionsmedium die Empfindlichkeit und Vermehrung des oben beschriebenen Amplifikationsverfahrens bedeutend erhöhte. Die Zielwerte der Kopienzahl im Bereich von 1 bis 10&sup6; ist unter Verwendung der vorliegenden beanspruchten Erfindung nachweisbar und isolierbar. DMSO in einer Endkonzentration zwischen 0% und 30% und BSA in einer Endkonzentration von 5 lg/ml bis 2500 lg/ml sind bei der Steigerung der Empfindlichkeit und Vermehrung des Amplifikationsverfahrens nützlich. In einer bevorzugten Ausführung werden BSA-Konzentrationen zwischen 50 lg/ml und 500 lg/ml und DMSO- Konzentrationen in einem Bereich zwischen 15% und 25% verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführung werden BSA- Konzentrationen im Bereich von 100 lg/ml und 300 lg/ml und DMSO- Konzentrationen im Bereich von 15% und 25% verwendet.
Die Verwendung von DMSO und BSA im Amplifikationsreaktionsgemisch liefert gegenüber Reaktionsmedien ohne DMSO und BSA eine verbesserte Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, wobei das Reaktionsgemisch alleine zum Nachweis und zur Isolation der angestrebten Nucleinsäuresequenzen ausreicht. Die Verwendung von DMSO und BSA im Reaktionsmedium eignet sich im Vergleich mit der Verwendung des blossen Reaktionsgemisches für eine 10fache Erhöhung des Ämplifikationsniveaus. In einer bevorzugten Ausführung wird die Amplifikation unter Verwendung von DMSO und BSA gemäss der beanspruchten Erfindung wenigstens um ein 100faches erhöht. In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Amplifikation unter Verwendung von DMSO und BSA gemäss der beanspruchten Erfindung wenigstens um ein 10'000faches erhöht. In noch einer anderen Ausführung wird die Amplifikation unter Verwendung von DMSO und BSA gemäss der beanspruchten Erfindung wenigstens um ein 10&sup6;faches erhöht. In einer weiteren Erfindung wird die Amplifikation auf diese Weise um ein 10&sup7;faches erhöht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführung der Amplifikation gemäss der hier beanspruchten Erfindung beträgt die Steigerung der Amplifikation wenigstens das 10&sup8;fache.
Ausserdem können neben DMSO und BSA andere spezfische Chemikalien zur Verstärkung (SPC) gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch die das Amplifikationsniveau im Vergleich mit Reaktionsmedien ohne SPC erhöht wird.
Es wurde weiter unerwarteterweise nachgewiesen, dass die Zugabe von DMSO in einem Bereich von 2 bis 20% zum Reaktionsgemisch des hier beanspruchten Amplifikationsverfahrens die Reproduzierbarkeit des Verfahrens ebenfalls verbessert, wie dies beispielsweise in Figur 3 dargestellt ist. Die Verwendung von DMSO alleine jedoch senkt das Amplifikationsniveau, welches zwischen 15% und 20% DMSO im Reaktionsmedium beginnt.

Materialien

Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers von Applied Biosystems 380A synthetisiert. Die für die Oligonucleotid-Synthese verwendeten Säulen, Phosphoramidite und Reagenzien stammen über Marketing Fachpartner von der Applied Biosystems, Inc.. Die oligonucleotide wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese gefolgt von einer DEAE-Zellulosechromatographie gereinigt. Das Radioisotop [-32p] UTP (800 Ci/mmol) stammt von Amersham. Die Enzyme zum Verdauen und Lisieren der DNA wurden bei New England Biolabs bezogen und gemäss den Empfehlungen des Anbieters verwendet. Präparate des grossen Fragmentes der DNA- Polymerase 1 (Klenow) wurden ebenfalls bei New England Biotec bezogen. RNasin und die T7-RNA-Polymerase von Promega Biotec wurden über Bio/Can Scientific Inc. bezogen. Die Reverse Transkriptase und die RNase H stammen von Pharmacia. Der Lieferant für die Proteinase K war Boehringer Mannheim Canada. Für alle Transformationen wurde der E. coli-Stamm HB101 (ATCC 33694) verwendet. Das Plasmid pUC19 (Norrander et al., 1983) wurde bei Bethesda Research Laboratoires bezogen.

Isolierung und Sequenzierung von DNA

E. coli-Transformanten wurden auf 50 lg/ml Ampicillin enthaltendem YT-Medium (Miller, 1972) gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde mittels des schnellen Kochverfahrens (Holmes und Quigley, 1981) gereinigt. Die in allen Konstruktionen verwendeten DNA-Fragmente und Vektoren wurden durch Elektrophorese auf einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt getrennt und von der geschmolzenen Agarose durch Phenolextraktion und Ethanol-Fällung (Maniatis et al., 1982) gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer Modifikation (Hatton et al., 1985) des Didesoxyverfahrens (Sanger et al., 1977) sequenziert. Die Reaktionen wurden unter Verwendung des -20 universellen Primers (?) (New England Biolabs) durchgeführt.

TCA-Fällung

Aliquots (5 ml) der Amplifikationsreaktionen wurden in 20 ml 10 mM EDTA gequencht und auf Eis gestellt, bis alle Zeitpunkt-Proben gesammelt waren. Die gequenchten Proben wurden dann auf Glasfilterscheiben aufgetragen und sofort 10 Minuten unter gelegentlichem Rühren in eiskalten 5%-Trichloressig (TCA) - 1% Natriumpyrophosphat gegeben. Zwei fünfminütige Waschungen mit eiskaltem 5% TCA wurden gefolgt von zwei zusätzlichen Waschungen mit 95% Ethanol und Gefriertrocknung zur Trockene. Die Radioaktivität wurde in einem Flüssigscintillations-Zähler bestimmt.

Polyacrylamidgelelektrophorese

Proben (1 bis 6 ml) wurden mit 4-5 ml Formamidfarbstoff (90% deionisiertes Formamid, 10 mM TrisHCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, Xylencyanol und Bromphenolblau) gemischt und auf ein behandeltes 12 cm langes 7% denaturierendes Polyacrylamidgel nach einem Vorlauf des Gels appliziert. Die Gele wurden bei 350 Volt so lange laufengelassen, bis das Bromphenolblau das untere Ende erreicht hatte. In einigen Fällen wurden die Gele fixiert und vor der Autoradiographie getrocknet. Zum Fixieren gehört ein 15-minütiges Waschen in 10%- Methanol-7%-Eisessig. Die durch dieses Verfahren getrennten Profile der RNA-Produkte wurden bei Raumtemperatur durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Beispiel 1: Form und Synthese von Oligonucleotiden für ein Gag- Test-System

Eine synthetische DNA-Sequenz (Figur 2A) wurde so entworfen, dass sie eine EcoRI-Stelle, einen T7-Phagen-Promotor, eine für die Transkriptionsinitiation durch die T7-RNA-Polymerase nötige Sequenz und eine 19 Basenpaare Hybridisierungsregion (Hybridisierungsregion 1) enthielt. Das beim Klonieren dieser Elemente involvierte oligonucleotid des 47 b Antisense-Stranges (T7Hl.GAG) dient ebenfalls als erster Primer. Die Hybridisierungsregion 2 liegt 53 Basenpaare von der Hybridisierungsregion 1 entfernt und ist 20 Basenpaare lang. Der für diese Region entworfene Primer (H2.GAG) ist ein 20 b Oligonucleotidduplikat des Sensestranges und wird nicht für das Klonieren verwendet. Die Sequenz, die die Hybridisierungsregionen umspannt und beinhaltet, ist ein 92 Basenp are Segment des gag-Teils des HTLV-III-Genoms, dem Erreger von AIDS. Dieses spezifische Gensegment wurde deshalb ausgewählt, weil bekannt ist, dass die Primer effizient hybridisieren und weil die Entfernung zwischen den beiden Hybridisierungsregionen vergleichsweise kurz ist. Zudem wurde für ein einfacheres Klonieren eine XbaI-Stelle ans Ende der Sequenz plaziert. Die GAG- Testsequenz enthält ebenfalls SphI- und PstI-Stellen, was beim Screenen von Rekombinanten hilfreich sein kann.
Beim Klonieren dieses Fragments wurden insgesamt vier olignucleotide verwendet. Nl.GAG, das bei der Bildung der gag-Test- und der gag2-Testsequenz verwendet wurde, vervollständigt den Antisense- Strang und wird nur im Klonierverfahren verwendet. T74.PRO ist die Sensestrangkomponente des T7-Promotors. N2.GAG jedoch wurde bei der Bildung beider Testfragmente verwendet und ist in zwei Schrittten des Amplifikationszyklus ebenfalls als Zwischenprodukt (zweite Matrize) verwendet worden. Das gesamte klonierte GAG- Testfragment kann auch ein Zwischenprodukt (dritte Matrize) des Amplifikationszyklus darstellen. Wenn die GAG-Test-DNA einmal in einen geeigneten Vektor kloniert ist, kann sie durch die T7-RNA- Polymerase transkribiert und in ein RNA-Fragment (erste Matrize) umgewandelt werden, das als Amplifikationszwischenprodukt in drei der Schritte verwendet wird. Ausserdem dienen T7Hl-GAG und H2-GAG im Testsystem als Primer.
Das synthetische DNA-Fragment des gag2-Tests (Figur 2B) enthält den T7-Promotor nicht, dafür ist der Rest der Sequenz mit der gag- Testsequenz identisch, weshalb N1.GAG und N2.GAG in dessen Bildung involviert waren. Das zur Vervollständigung des Antisensestranges nötige Oligonucleotid wird als H1-GAG bezeichnet. Wenn das gag2- Testfragment einmal kloniert ist, kann als Matrize zum Testen der Amplifikation verwendet werden, unter Verwendung eines DNA- Restriktions fragments als Nukleinsäurenmatrize.

Beispiel 2: Bildung des GAG-Testplasmids

Die Olignucleotide T74.PRO und N1.GAG (je 2 mg) wurden einzeln in 20 ml Reaktionen, die 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinease enthalten, bei 37ºC 30 Minuten phosphoryliert. Das phosphorylierte T74.PRO und N1.GAG (je 10 ml) wurden mit je 1 mg unphdsphoryliertem T7H1.GAG und N2.GAG, 3 ml 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) - 500 mM NaCl zu einem Endvolumen von 29 ml für den GAG-Test gemischt. Das gag2- Testgemisch enthielt 10 ml phosphoryliertes N1.GAG, je 1 mg unphosphoryliertes H1.GAG und N2.GAG und 1,8 ml 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) - 500 mM NaCl in einem Endvolumen von 18 ml. Die Oligonucleotidgemische wurden einzeln hybridisiert, indem sie 10 Minuten bei 90ºC gehalten und danach während 10 bis 16 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurden. 60 ml Reaktionen, die 50 mM Tris- HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP und 50 lg/ml BSA enthielten, wurden verwendet, um die hybridisierten Olignucleotide aneinanderzubinden. 400 Einheiten T4-DNA-Ligase wurden zu der gag- Testreaktion gegeben, und die Mischung wurde bei 15ºC 2 Stunden inkubiert, während die GAG2-Testreaktion 14 bis 16 Stunden mit 200 Einheiten T4-DNA-Ligase inkubiert wurde.
Die isolierten und gereinigten synthetischen DNA-Segmente wurden mit pUC19-Plasmid gemischt, welches durch Verdauen der Restriktionsenzymstellen innerhalb der Polylinkerregion linearisiert worden waren. Die T4-DNA-Ligase wurde verwendet, um die GAG-Testsequenz in das EcoRI-XbaI-Fragment des pUC19 zu binden, während die gag2- Testsequenz an das SmaI-XbaI-Fragment gebunden wurde. Die nach diesen Reaktionen vor dem Transformanten erhaltene Plasmid-DNA wurde zur Transformation von E. coli verwendet, durch Restriktionsanalyse gescreent und die endgültigen Plasmide (PGAG.TEST und pGAG2-TEST) wurden mittels Sequenzanalyse als korrekt bestimmt.

Beispiel 3: Auswirkungen der Primerkonzentration auf die RNA- Amplifikation

Die Reaktionsgemische (25 ml), die verwendet wurden, um die von den Oligonucleotiden des gag-Tests transkribierte RNA zu amplifizieren, enthielten 50 mM Tris-HCl (pH 8,45), 6 mM MgCl&sub2;, 40 MM KCL, 10 MM Dithiothreitol, 015 mM NTP (ATP, CTP, GTP, UTP), 1 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 20 Einheiten RNasin, 10 Einheiten T7 RNA-Polymerase 10 Einheiten Reverse Transkriptase, 0,4 Einheiten RNase H und 10 mCi [-32p] UTP. Zwei der Reaktionen enthielten 0,5 ng (0,015 pmole) N2.GAG, während die beiden anderen Reaktionen keine Matrizen enthielten. Die Primer T7H1-GAG und H2-GAG wurden beide in Endkonzentrationen von 3,4 mM oder 0,34 mM zu Reaktionen gegeben, die entweder N2.GAG oder keine Matrize enthielten. Die Reaktionen wurden bei 42ºC 2 Stunden inkubiert. Die gesamte Synthese der RNA wurde überwacht, indem der Einbau von TCA- unlöslichen cpm in Intervallen von 30 Minuten bestimmt wurde. Die Auswirkung der primerkonzentration auf die matrizenabhängige RNA- Synthese wird in Tabelle 1 gezeigt. Von jeder Reaktion wurden Aliquots, die gleiche Mengen an synthetisierter RNA enthielten, mittels PAGE und Autoradiographie analysiert (Figur 3, die Bahnen 1 - 4 sind gleich numeriert wie die Reaktionen). Tabelle 1. RNA-Amplifikation von N2.GAG nach zwei Stunden
Es wurde nachgewiesen, dass die Reaktion 1 die höchste Einbaurate des Isotops ergab, während die Kontrolle ohne Matrize, Reaktion 2, ebenfalls eine hohe Rate (73% der Reaktion 1) ergab und ein sehr ähnliches elektrophoretisches Profil produzierte. Es scheint deshalb, dass in Anwesenheit hoher Primerkonzentrationen ein RNA- Transkript von ähnlicher Grösse wie jenes bei der Amplifikation erwarteten in Abwesenheit von Matrizen produziert wird. Die Verwendung von Proben mit lofach herabgesetzter Primerkonzentration ergab jedoch davon bedeutend abweichende Ergebnisse. Die in der Reaktion 3 produzierte RNA-Menge war 2,6 mal höher als jene der Reaktion 4, während aber in Reaktion 3 nahezu das gesamte Transkript in einer einzelne Bande der erwarteten Grösse nachgewiesen wurde, wurden in der Reaktion 4 keine Fragmente gefunden, die grösser als 60 bis 70 b waren. Die Primerkonzentration spielt somit bei der Genauigkeit und Wirksamkeit der RNA-Amplifikation eine wichtige Rolle.
Eine RNA-Transkriptkontrolle, die verwendet wurde, um die Grösse des im Amplifikationssystem erwarteten Fragments darzustellen (Bahn 0 der Figur 3) wurde mittels Transkription aus dem Testplasmid hergestellt. Der pGAG-TEST wurde durch Spalten mit XbaI Proteinase-K-behandelt (Maniatis et al., 1982), phenolextrahiert und mit Ethanol gefällt. Danach wurde anhand der Empfehlungen des Lieferanten T7-RNA-Polymerase zugegeben, um 0,5 mg des erhaltenen Fragments in einer 25 ml Reaktionsmischung mit 10 mCi [-32p] UTP zu transkribieren.

Beispiel 4: Auswirkungen der Matrizenkonzentration auf die RNA- Amplifikation

Das 50 ml Standard-Reaktionsgemisch, das verwendet wurde, um aus den GAG-Testoligonucleotiden transkribierte RNA zu amplifizieren, enthielt 0,34 mM T7H1-GAG, 0,34 mM H2.GAG, 50 mM Tris-HCl (pH 8,45), 6 mM MgCl&sub2;, 40 mM KCl, 10 mM DTT, 0,5 mM NTP, 1mM dNTP, 40 Einheiten RNasin, 20 Einheiten T7-RNA-Polymerase H und 10 - 20 mCi [-32p] UTP. Die Reaktionen enthielten Matrizenmengen (N2.GAG) zwischen 1 ng und 1 fg. Eine Reaktion enthielt keine Matrize. Die Reaktionen wurden bei 42ºC 3 Stunden inkubiert, während welcher Zeit die gesamte RNA-Synthe&e durch Bestimmen des Einbaus von TCA- unlöslichem cpm in Abständen von 30 Minuten überwacht wurde. Wie in Tabelle 2 gezeigt, lag für alle getesteten Matrizenkonzentrationen die gesamte RNA-Synthese höher als die Kontrolle ohne Matrize. Obwohl die gesamte RNA-Synthese im allgemeinen mit abnehmender Matrizenkonzentration zurückging, war dieser Rückgang der Synthese nicht quantitativ. Der Amplifikationsgrad der RNA pro Startmatrize erhöhte sich somit mit abnehmender Matrizenkonzentration. Die 8 x 10&sup8;-fache Amplifikation wurde durch die Synthese von 0,8 mg RNA von 1 fg N2.GAG-Matrize erreicht. Ein fg des 102-b N2.GAG-oligonucleotids entspricht ungefähr 2 X 10&sup4; Molekülen. Tabelle 2. RNA-Amplifikation von N2.GAG nach drei Stunden
Die nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden synthetisierte RNA wurde mittels PAGE für jede Matrizenkonzentration analysiert (Figur 4, Bahnen 1 - 8, gleich numeriert wie die Reaktionen). Ein Hauptband einer RNA von ungefähr 100 b war in allen Reaktionen ausser in jenen mit 1 fg Matrizen und keiner Matrize anwesend. Die Reaktionen mit 1 fg Matrizen verfügte nach drei Stunden über keinen grossen Anteil dieses 100 b Produktes, jedoch war die gesamte RNA- Synthese im Vergleich zur Reaktion ohne Matrize höher und qualitativ verschieden.

Beispiel 5: Hybridisierungsanalyse von RNA-Produkten

Die Amplifikationsreaktionen mit Mengen von N2.GAG-Matrizen zwischen 1 pg bis 0,1 fg wurden wie in Beispiel 4 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass das radiomarkierte UTP weggelassen wurde. Die Reaktionen wurden bei 42ºC 3 Stunden inkubiert. In Abständen von 30 Minuten wurden Aliquoten aus jeder Reaktion entfernt und auf eine Nylonmembran (Amersham) aufgetragen. Die Nucleinsäuren in diesen Aliquotenreaktionen wurden ultraviolettem Licht ausgesetzt und so fixiert. Die Membran wurde bei 50ºC eine Stunde in einem Vorhybridisierungspuffer, der aus einer Endkonzentration von 50 % V/V-Formamid, 5 X SSC und 5 X Denhardt-Lösung (Maniatis et al, 1982; Southern et al, 1975) in einem Volumen entsprechend 5 ml Lösung pro 100 cm² vorhybridisiert und mit einer radiomarkierten Probe mit einer spezifischen Aktivität von 10&sup6; cpm/ml Hybridisierungslösung hybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 50ºC während 16 Stunden in 50% Formamid, 5 X SSC und 5 X Denhardt-Lösung (Maniatis et al, 1982; Southern et al, 1975) durchgeführt. Die radiomarkierte Probe war der synthetische Oligonucleotid 5'GATCTGGGATAGAGTACATCCA 3', der an seinem 5'-Ende unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase und (-32p) ATP markiert worden war. Danach wurde die Membran bei 50ºC in Serien von 2, 3 Min. Waschungen, die 2 X SSC, 0,1% V/V SDS und 0,2 x SSC, 0,1% V/V SDS (Southern et al, 1975; Maniatis et al, 1982; Szostak et al, 1979) enthielten, gewaschen.
Die Figur 5 zeigt die Ergebnisse der auf den Amplifikationsreaktionen durchgeführten Hybridisierungsanalyse, die verschiedene Mengen an N2.GAG-Matrizen enthielten, welche zu verschiedenen Inkubationszeiten geprüft worden waren.
Jede Säule in Figur 5 stellt einen anderen Zeitpunkt (1, 30 Min., 2, 60 Min.; 3, 90 Min.; 4, 120 Min.; 5, 150 Min.; 6, 180 Min.) dar und jede Reihe eine andere Menge der zugegebenen Matrize NZ. GAG (1, 1pg; 2, 100 fg; 3, 10 fg; 4, 1 fg; 5, 0,1 fg; 6, keine Matrize). Die Amplifikation von Nucleinsäuren, die an die markierte Probe hybridisieren, wurde bei den Reihen 1 - 3 (1 pg - 10 fg) beobachtet, jedoch war die Hybridisierung an spezifische Nucleinsäuren in den Reihen 4 und 5 (1 fg, 0,1 fg) nicht höher als in Reihe 6 (keine Matrize). Die offensichtlich unspezifische Bindung der markierten Probe in Reihe 6 scheint mit der DNA- oder RNA-Synthese in Zusammenhang zu stehen, da das Hybridisierungssignal mit fortschreitender Zeit ansteigt.

Beispiel 6: Verwendung des DNA-Restriktionsfragments als Matrize

Der Plasmid-pGAG2.TEST wurde mit MspI aufgeschlossen, mit Proteinase K behandelt, mittels Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt und durch fünfminütiges Kochen denaturiert. Die Amplifikationsreaktionen wurden durchgeführt und wie in Beispiel 4 analysiert, mit dem Unterschied, dass anstelle des N2.GAG- Olignucleotids der MspI-verdaute pGAG2.TEST als Matrize verwendet wurde. Die zu jeder Reaktion zugegebene Plasmidmenge variierte zwischen 55 ng und 5,5 pg und keiner Matrize. Um zusätzlich DNA, die in einer Probe vorhanden wäre, zu simulieren, enthielten alternierende Reaktionen 1 ng Kälberthymus-DNA, die auf gleiche Weise verdaut, gereinigt und denaturiert worden war. Nach dreistündiger Inkubation bei 42ºC wurde die RNA-Synthese mittels TCA- Niederschlag und PAGE-Analyse bestimmt. Wie in Tabelle 3 dargestellt, war bei den untersuchten Templatkonzentrationen die gesamte RNA-Synthese höher als die Kontrollen ohne Matrizen. Der Amplifkationsgrad wurde auf der Basis der RNA-Synthese aus der aktuellen Matrize, die 1,8% höher war als die gesamte Plasmid-DNA, berechnet.
Die gesamte RNA-Synthese (Amplifikationsgrad) einer speziellen Anfangs-Matrizenkonzentration war für das Restriktionsfragment (Tabelle 3) durchgehend tiefer als für die synthetische Oligonucleotidmatrize (Tabelle 2). Dies könnte an der Konkurrenz mit dem komplementären Strang der Restriktionsfragmentmatrize bei den verwendeten Bedingungen liegen. Tabelle 3. RNA-Amplifikation aus MspI-gespaltenem pGAG2.TEST
* Die Zahlen in Klammern bezeichnen äquivalente Mengen von N2.GAG.
** Die Zahlen in Klammern bezeichnen die RNA-Synthese in Anwesenheit von 1 mg MspI-gespaltener Kälberthymus-DNA.
Die RNA, die nach einer Reaktionszeit von drei Stunden synthetisiert worden war, wurde mittels PAGE analysiert (Figur 6, Bahnen 1 - 6, 11 und 12, auf gleiche Weise wie die Reaktionen numeriert). Das Hauptband einer RNA von ungefähr 100 b war in den Reaktionen (Bahnen) 1 - 6 vorhanden, jedoch abwesend in den Reaktionen ohne Matrizen (Bahnen 11 und 12). Die RNA in der Bahn 0 war eine Standard-RNA, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde. Es gab keine offensichtlichen qualitativen Unterschiede zwischen der synthetisierten RNA, unabhängig davon, ob sie den Zusatz von 1 lg mit MspI verdaute Kälberthymus-DNA enthielt (Bahnen 2, 4 und 6) oder nicht (Bahnen 1,3 und 5).

Beispiel 7: Verwendung des RNA-Restriktionsfragments als Matrize

Das Plasmid pGAG-TEST wird mit XbaI gespalten, mit Proteinase K behandelt und durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die RNA einer zu N2.GAG komplementären Sequenz wird aus dem linearisierten pGAG.TEST unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase transkribiert. Die daraus resultierende RNA wird durch Verdauen mit DNase (Promega Biotec, Madison, WI) gereinigt, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolfällung. Die gereinigte RNA wird als Matrize für die Amplifikationsreaktionen wie in Beispiel 5 beschrieben verwendet. Jeder Reaktion werden RNA-Mengen beigegeben, die zwischen 55 ng und 5,5 pg und keiner Matrize liegen. Nach einer dreistündigen Inkubation bei 42º C wird die Synthese spezifischer RNA durch Hybridisierung mit einer markierten Oligonucleotidprobe bestimmt, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist.

Beispiel 8: Verwendung von Ribosomen-RNA als Matrize Amplifikation interner Sequenzen

Zwei Primer werden zur Amplifikation von RNA-Sequenzen verwendet, die zu einem Teil der 16S ribosomalen RNA (rRNA) von E. coli komplementär sind. Einer dieser Primer T7HIRIB3.PR2 (AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGTATTACCGCGGCTGCTG) enthält den Antisensestrang des T7-Promotors und der Initiationsstelle und eine Sequenz, die zur 16S rRNA komplementär ist. Der andere RIB8.PR (AATACCTTTGCTCATTGACG) ist zu der DNA komplementär, die unter Verwendung des T7H1RIB3.PR2 als Primer und der 16S rRNA als Matrize synthetisiert wurde. Ein drittes synthetisches Oligonucleotid RIB5.PR (AGAAGCACCGGCTAAC), der den Nachweis der Amplifikation erlaubt, ist zu den RNA-Produkten komplementär, die wiederum zur ursprünglichen rRNA-Matrize komplementär sind.
Die Reaktionsgemische (25 ml) enthalten 50 mM TrisHCl (pH 8,45), 6 mM MgCl&sub2;, 40 mM KCl, 10 mM DTT, 0,5 mM NTP, 1 mM dNTP, 20 Einheiten AMV Reverse Transkriptase, 0,4 Einheiten RNase H, 0,34 lm T7H1RIB3.PR2 und 0,34 lm RIB8.PR.
Den Reaktionen wurde E. coli rRNA in Mengen zwischen 50 ng und 50 fg zugegeben. Eine Reaktion enthält keine zugegebene rRNA. Die Reaktionen werden bei 42ºC 3 Stunden inkubiert, während dieser Zeit werden die Aliquots nach 30, 60, 120 und 180 Minuten entnommen. Die Reaktionsaliquots werden gequencht, auf einer Nylonmembran fixiert und wie in Beispiel 5 beschrieben an die am 32p 5'- Ende markierte RIB5.PR-Probe hybridisiert.

Beispiel 9: Verwendung von Ribosomen-RNA als Matrize Amplifikation von 5'-Endsequenzen

Zwei Primer werden zur Amplifikation von RNA-Sequenzen verwendet, die mit einem Teil der E. coli-16S-rRNA homolog sind. Einer dieser Primer RIB12.PR (TTACTCACCCGTCCGCC) ist zur 16S-rRNA komplementär. Der andere Primer T7H1RIB5.PR (AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAA- ATTGAAGAGTTTGATCAT) ist zum 3'-Ende der DNA komplementär, die unter Verwendung des RIB12.PR als Primer und 16S-rRNA als Matrize synthetisiert wurde. Ein drittes synthetisiertes Oligonucleotid RIB11.PR (GTTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCC), das den Nachweis der Amplifikation erlaubt, ist zu den RNA-Produkten der Amplifikation und der ursprünglichen rRNA-Matrize komplementär. Die Amplifikationsreaktionen für rRNA und der Nachweise der synthetisierten RNA werden wie in Beispiel 8 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass T7HIRIB5.PR und RIB12.PR als Primer (anstelle von T7H1RIB3.PR2 und RIB8.PR) und RIB11.PR als Oligonucleotidprobe (anstelle von RIB5.PR) verwendet werden.
Obwohl bevorzugte Ausführungen dieser Erfindung detailliert beschrieben wurden, versteht es sich für den Fachmann, dass Veränderungen vorgenommen werden können, ohne jedöch vom Grundgedanken der Erfindung oder dem Umfang der Ansprüche abzuweichen.

Beispiel 10: Spezifische Verbesserung der Nucleinsäurenamplifikation unter Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) und Rinderserumalbumin (BSA).

Das Nucleinsäurenamplifikationsverfahren wie es in den obigen Beispielen beschrieben wurde, wurde mit den folgenden Baktierienstämmen, Plasmiden und RNA-Matrizen durchgeführt. Ein pGEM-3-pol- Plasmid und ein pUC-pol-Plasmid, jedes ein 1450-Basenpaar Restriktionsfragment aus dem HIV 1 (Stamm HxB2) enthaltend, wurden aus einem BamH1EcoR1-Subklon, ein Geschenk von Dr. R. Gallo (NCI, NIH, Bethesda, Maryland) hergestellt. Dieses Restriktionsfragment enthält einen Teil des HIV1-gag-Gens und den Hauptteil des HIV1-pol- Gens. Der E. coli-Stamm HB101 wurde mit pGEM-3-pol-Plasmid oder dem pUC-pol-Plasmid transformiert. Die Plasmid-DNA wurde mittels in Maniatis et al. MOLECULAR CLONING - A LABARATORY MANUAL S. 86 Cold Spring Harbor Labaratory beschriebenen Verfahren hergestellt.
Um eine pol-RNA-Matrize zu erhalten, wurde das pGEM-3-pol-Plasmid mit EcoR1 linearisiert, mit Phenolchloroform extrahiert und in Ethanol gefällt. EcoR1 schneidet nur am Ende der inserierten pol- DNA. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der SP6 RNA- Polymerase (eine geeignete RNA-Polymerase ist bei Promega, Madison, WI erhältlich) gemäss dem Verfahren von Melton et al. Nucleic Acids Res. 12:7035 (1984) transkribiert. 5 Einheiten der RNasefreien DNase I (eine geeignete DNase 1 ist ebenfalls bei Promega, Madison, WI erhältlich) wurden zugegeben und das Gemisch bei 37ºC 15 Minuten inkubiert. Das RNA-Produkt wurde mit Phenolchloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die RNA-Ausbeute wurde spektrophotometrisch bestimmt.
Die Zugabe von DMSO in einer Endkonzentration ergab zwischen 0% und 20% zum für die Amplifikation verwendeten Reaktionsgemisch wie in Figur 7 gezeigt und ergab einen Rückgang nicht-spezifischer Produkte (NSP) aus den nicht-produktiven Nebenreaktionen. Die Figur 8 zeigt, dass unter Verwendung von 15% DMSO im Reaktionsmedium keine mit P1:P1 und P1:P2 bezeichnete NSP-Typen aus den Proben, die die Nicht-Zielsequenz enhielten, eliminiert wurden.
Die Anwesenheit von 15 % DMSO im Reaktionsmedium hatte zudem die Auswirkung, dass die Reproduzierbarkeit einer durch das beanspruchte Amplifikationsverfahren gelaufenen Probe wie im Slot-Blot in Figur 9 gezeigt, erhöht wurde. 10³ und 10&sup4; Kopien einer Zielsequenz wurden verwendet und das DMSO (durch "+" gekennzeichnet) verbesserte die Reproduzierbarkeit, wie die 5 Banden in jeder Bahn zeigen, sowie die Empfindlichkeit, wie dies durch den Vergleich der "+"- und "-"-Bahnen von 10³ Kopien der Zielsequenz dargestellt wird.
Wenn DMSO und BSA (geeignetes BSA ist bei Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, in spezieller Qualität für Molekularbiologie, erhältlich) beide im Reaktionsmedium verwendet wurden, nahmen Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bedeutend zu, wie dies in den Figuren 10A und 10B dargestellt ist, die eine verbesserte Amplifikation von 10&sup4; Kopien der Zielsequenz und eine erhöhte Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zeigen. BSA-Konzentrationen von 50 lg/ml und 100 lg/ml wurden mit einer DMSO-Endkonzentration von 15% verwendet. Dadurch wurde im Vergleich mit dem Reaktiongemisch ohne DMSO und BSA eine 100fach erhöhte Amplifikation erreicht, und grössere bis 10&sup8;-fache Verbesserungen wurden erwartet, und die Ergebnisse lassen den Nachweis und die Isolierung von kleinen Mengen wie beispielsweise einer einzigen Kopie vermuten.
In der Figur 11 wird im darin dargestellten Slot-Blot- Autoradiogramm die Amplifikation von RNA und DNA im Vergleich mit der An- und Abwesenheit von DMSO und BSA und im Vergleich mit der relativen Kopie-Anzahl einer Zielsequenz gezeigt. Die RNA und die DNA wurden unter Verwendung von DMSO und BSA im Reaktionsgemisch mit einer verbesserten Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit amplifiziert.

Claims

1. Einzelnes Reaktionsmedium, umfassend die folgenden Reagenzien:

(i) einen ersten Oligonucleotid-Primer,

(ii) einen zweiten Oligonucleotid-Primer, umfassend eine Antisense-Sequenz eines von einer RNA-Polymerase. erkannten Promotors,

(iii) eine DNA-gelenkte RNA-Polymerase, die den genannten Promotor erkennt,

(iv) ein oder mehrere Enzyme, die DNA-Polymerase- Aktivität aufweisen und eine Aktivität, die die RNA eines RNA/DNA-Hybriden hydrolisiert, ohne einzel- oder doppelsträngige RNA oder DNA zu hydrolisieren,

(v) Ribonucleosid- und Desoxyribonucleosidtriphosphate, und

(vi) ein Alkylsulfoxid.

2. Reaktionsmedium nach Anspruch 1, worin das genannte Alkylsulfoxid Dimethylsulfoxid (DMSO) ist.

3. Reaktionsmedium nach Anpruch 2, das 2 bis 15 % DMSO umfasst.

4. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das zusätzlich ein Trägerprotein umfasst.

5. Reaktionsmedium nach Anspruch 4, worin das Trägerprotein Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 5-2500 µg/ml ist.

6. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der erste oder der zweite Oligonucleotid-Primer reversibel an ein immobilisiertes Trägermaterial gebunden ist.

7. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die RNA-Polymerase eine Bakteriophagen-RNA-Polymerase ist.

8. Reaktionsmedium nach Anspruch 7, worin die RNA- Polymerase aus Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase, Bakteriophagen T3-Polymerase, Bakteriophagen-∅II-Polymerase, Salmonella- Bakteriophagen-sp6-Polymerase und Pseudomonas-Bakteriophagen-gh-1- Polymerase ausgewählt wird.

9. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der zweite Oligonucleotid-Primer zusätzlich eine operativ an die Antisense-Sequenz des Promotors geknüpfte Antisense-Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle für die RNA-Polymerase umfasst.

10. Reaktionsmedium nach Anspruch 9, worin die RNA- Polymerase eine Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase ist und worin die Antisense-Sequenzen zusammen die Nucleotidensequenz

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG

umfassen.

11. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Reagenz (iv) Escherichia coli-Ribonuclease H oder Kälberthymus-Ribonuclease H umfasst.

12. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Reagenz (iv) eine reverse Transcriptase eines Retrovirus umfasst.

13. Reaktionsmedium nach Anspruch 11, worin das Reagenz (iv) Moloney-Mausleukämievirus-Polymerase umfasst.

14. Reaktionsmedium nach Anspruch 11, worin das Reagenz (iv) Vogel-Myeloblastosevirus-Polymerase umfasst.

15. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Reagenz (iv) DNA-Polymerase α oder DNA-Polymerase β umfasst.

16. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Reagenz (iv) Kälberthymus-DNA-Polymerase umfasst.

17. Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das Reagenz (iv) keine Exonuclease-Aktivität besitzt.

. 18. Reaktionsmediumnach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Reagenz (iv) keine Exonuclease- und keine DNA- Endonuclease-Aktivität besitzt.

19. Set zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen, das eine Anzahl von Gefässen umfasst, die die in den Ansprüchen 1 bis 18 definierten Reagenzien enthalten.

20. Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nucleinsäuresequenz bei relativ konstanter Temperatur, das die Aufbewahrung von RNA, unter Bedingungen und während einer Zeit, die eine Amplifikation ermöglichen, in einem Reaktionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 18, umfasst, wobei die RNA eine erste RNA-Matrize umfasst, die wiederum die spezifische Nucleinsäuresequenz oder eine zur spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementäre Sequenz umfasst, so dass sich ein Zyklus ergibt, worin

(i) der erste Oligonucleotid-Primer mit der ersten RNA-Matrize hybridisiert,

(ii) das Reagenz (iv) die erste RNA-Matrize verwendet, um eine zweite DNA-Matrize durch Verlängerung des ersten Oligonucleotid- Primers zu synthetisieren, wobei ein RNA/DNA-Hybridzwischenprodukt gebildet wird, und das auch die RNA hydrolisiert, die das genannte RNA-DNA-Hybridzwischenprodukt umfasst,

(iii) der zweite Oligonucleotid-Primer mit der zweiten DNA-Matrize hybridisiert,

(iv) das Reagenz (iv) den zweiten Oligonucleotid- Primer als Matrize verwendet, um den von der RNA-Polymerase durch Verlängerung der zweiten DNA-Matrize erkannten Promotor zu synthetisieren, und

(v) die RNA-Polymerase den Promotor erkennt und die zweite DNA-Matrize transkribiert, wobei Kopien der ersten RNA-Matrize erzeugt werden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die erste RNA- Matrize die spezifische Nucleinsäuresequenz umfasst und worin die erste RNA-Matrize durch Zugabe einzelsträngiger RNA in das Reaktionsmedium erzeugt wird, so dass

(i) der erste oligonucleotid-Primer mit der einzelsträngigen RNA hybridisiert,

(ii) das Reagenz (iv) die einzelsträngige RNA als Matrize verwendet, um eine zweite DNA- Matrize durch Verlängerung des genannten ersten Oligonucleotid-Primers zu synthetisieren, wobei ein RNA/DNA-Hybrid entsteht, und die RNA des genannten RNA/DNA-Hybriden hydrolisiert,

(iv) das Reagenz (iv) den zweiten Oligonucleotid- Primer als Matrize verwendet, um den Promotor durch Verlängerung der genannten zweiten DNA-Matrize zu synthetisieren, und

(v) die RNA-Polymerase den Promotor erkennt und die zweite DNA-Matrize transkribiert.

22. Verfahren nach Anspruch 20, worin die erste RNA- Matrize eine zur spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementäre Sequenz umfasst, und die erste RNA-Matrize mittels Zugabe einzelsträngiger RNA erzeugt wird, so dass

(i) der zweite Oligonucleotid-primer mit der einzelsträngigen RNA hybridisiert,

(ii) das Reagenz (iv) die RNA als Matrize verwendet, um eine komplementäre DNA durch Verlängerung des genannten zweiten Primers synthetisiert, wobei ein RNA/DNA-Hybrid gebildet wird, und auch die RNA des RNA/DNA-Hybriden hydrolisiert wird,

(iii) der erste Oligonucleotid-Primer mit der komplementären DNA hybridisiert,

(iv) das Reagenz (iv) die komplementäre DNA als Matrize verwendet, um die zweite DNA-Matrize und den Promotor durch Verlängerung des ersten Oligonucleotid-Primers zu synthetisieren, und

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, das die Zugabe einer den Promotor enthaltenden DNA ins Reaktionsmedium umfasst, so dass die RNA-Polymerase die DNA transkribiert, wobei die einzelstrangige RNA synthetisiert wird.

24. Verfahren nach Anspruch 20, worin die erste RNA- Matrize durch die Zugabe einzelsträngiger DNA ins Reaktionsmedium erzeugt wird, die eine Antisense-Sequenz des Promotors umfasst, so dass

(i) der erste Oligonucleotid-Primer mit der einzelsträngigen DNA hybridisiert,

(ii) das Reagenz (iv) die einzelstrangige DNA als Matrize verwendet, um die zweite DNA-Matrize und den Promotor durch Verlängerung des ersten Oligonucleotid-Primers zu synthetisieren, und

(iii) die RNA-Polymerase den Promotor erkennt und die zweite DNA-Matrize transkribiert.

25. Verfahren nach Anspruch 20, worin die erste RNA- Matrize durch Einbringen einzelsträngiger DNA in das Reaktionsmedium erzeugt wird, die die zweite DNA-Matrize umfasst, so dass

(i) der zweite Oligonucleotid-Primer mit der einzelsträngigen DNA hybridisiert,

(ii) das Reagenz den zweiten Oligonucleotid- Primer als Matrize verwendet, um den Promotor durch Verlängerung der zweiten DNA- Matrize zu synthetisieren, und

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, das die Zugabe eines die einzelsträngige DNA umfassenden RNA/DNA-Hybriden ins Reaktionsmedium umfasst, so dass das Reagenz (iv) die RNA des genannten RNA/DNA-Hybriden hydrolisiert.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 26, das ausserdem die überwachung des Reaktionsmediums auf den Verbrauch eines der Reagenzien (i), (ii) und (v) oder auf Akkumulation eines beliebigen Produkts des Zyklus umfasst.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Überwachung den Nachweis eines Nucleinsäureprodukts des Zyklus umfasst.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin der Nachweis eine Nukleinsäuresonde oder Restriktions-Endonukleasen und elektrophoretische Trennung umfasst.

30. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Überwachung folgendes betrifft:

die Akkumulation der ersten RNA-Matrize;

die Akkumulation der zweiten DNA-Matrize;

den Promoter enthaltende DNA; und

die Akkumulation des RNA/DNA-Hybridzwischenprodukts.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, das weiterhin einen Vergleich des Verbrauchs oder der Akkumulation mit einem Wert umfasst, der den Verbrauch oder die Akkumulation in Abwesenheit der spezifischen Nucleinsäuresequenz und der dazu komplementären Sequenz darstellt.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 31, worin die ausreichende Zeitspanne zwischen 30 Minuten und 4 Stunden beträgt.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 32, zusätzlich das Lizieren eines DNA-Produkts des Zyklus in einen Klonierungsvektor und anschliessendes KIonen des DNA-Produkts umfasst.

34. Verfahren nach Anspruch 33, das zusätzlich das Exprimieren eines von dem DNA-Produkt codierten Produkt in einem Expressionssystem umfasst.