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KR101507505B1 - 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 - Google Patents

제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 Download PDF

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KR101507505B1
KR101507505B1 KR20130042873A KR20130042873A KR101507505B1 KR 101507505 B1 KR101507505 B1 KR 101507505B1 KR 20130042873 A KR20130042873 A KR 20130042873A KR 20130042873 A KR20130042873 A KR 20130042873A KR 101507505 B1 KR101507505 B1 KR 101507505B1
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Abstract

본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법 또는 컴퓨터 프로세서를 이용한 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 동정방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 임신 초기 예방 외에는 효과적인 예방방법이 없는 유전질환에 대한 조기 진단방법으로서, 특정 유전자의 특정 염기 반복서열 이상이 문제되는 다양한 우성 유전 또는 열성 유전질환의 진단 방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, DDMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수에 따라, 보인자, 제 1 위험군 내지 제 3 위험군의 대상으로 분류하여 향후 발생될 증후와 관련된 적절한 조치가 가능하다. 특히, 본 발명의 방법은 태아에 대한 보인자 또는 질환 이환 정도를 수치적으로 제공하여 질환의 위험도를 정확히 파악할 수 있다.

Description

제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법{A Method for Diagnosing Myotonic Dystrophy Type 1}
본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법에 관한 것이다.
제 1 형 근긴장성 이영양증은 한국인에서 가장 흔히 발생하는 유전성 근육질환으로, 근육긴장증(myotonia)과 진행성 근력 약화를 특징으로 하는 상염색체 우성 유전질환이다. 이 질환은 근육과 관련된 증상과 함께, 심장, 눈, 내분비기관, 소화기관 및 중추신경계 등 여러 기관의 이상을 초래하는 특징을 가진다(Harper PS et al., DG M. Myotonic dystrophy, in Engel AG, Franzini-Armstrong C (eds): Myology (ed3). In. New York: NY, McGraw Hill Professional, 2004:1039-76). 원인 유전자에 따라 제 1 형 및 제 2 형 근육긴장성 이영양증(DM type 1, 2, DM1, DM2)으로 분류된다. 제 1 형 근긴장성 이영양증은 DMPK (Dystrophia Myotonica Protein Kinase)를 부호화하는 19번 염색체에 존재하는 유전자의 3' 비번역 부위에서 CTG 삼염기 서열이 비정상적으로 증가하여 발현되며, 제 2 형 근긴장성 이영양증는 3번 염색체의 장완(3q21)에 위치하는 징크 핑거 단백질 9 (ZNF9) 유전자의 인트론 1의 CCTG 사염기의 불안정한 확장에 의해 발생한다.
특히, 제 1 형 근긴장성 이영양증은 성인이 된 이후에 신체적 장애가 나타나며, 이에 따라 이미 증상이 발현한 환자 또는 질환이 진단된 환자의 가족에 대해서 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단이 시행되어 왔다. 종래에는 DMPK 유전자의 변이정도를 분자생물학적 방법을 이용해 확인함으로써 질환을 진단하는 방법이 연구되어 왔으며, 주로 PCR 또는 서든블럿을 이용한 방법이 사용되었다.
한편, 제 1 형 근긴장성 이영양증은 특별한 증상이 없으나, 20-30대의 성인기에 증상이 발현되므로, 상염색체우성 형태로 자손에게 유전되므로 조기 진단 및 예방이 중요하다. 종래 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법은 이미 증상이 발현한 환자 또는 질환이 진단된 환자의 가족에 대해서 진단이 시행되어 왔으나, 이 질환은 보인자의 판단 및 후손에게 유전될 위험성을 판단하는 것이 더욱 중요하다.
따라서, 가임기 여성 및 태아에게 있어서의 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단이 중요하며, 본 발명의 진단방법은 질환의 이환 가능성 및 중증도를 예측하여 보다 적극적인 대비를 할 수 있도록 한다. 제 1 형 근긴장성 이영양증은 유전병으로서 임신 초기 예방 외에는 효과적인 예방방법이 없으므로 이에 대한 진단 방법의 확보가 필요한 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 조기 진단을 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, DMPK 유전자의 CTG 반복서열이 증가된 대립유전자를 가지고 있는 보인자 또는 증상이 경미한 환자가 자녀를 출산하였을 때 CTG 반복서열이 증폭되어 질환이 발생함을 이용하여, 임산부, 가임기 여성 또는 신생아의 대상집단으로부터 보인자 또는 경미한 증상을 가진 환자를 선별검사로 찾아낸 후 태아에 대한 검사를 시행하여 질환 이환 여부를 판정하는 진단 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1) 환자의 컴퓨터-실행(computer-implemented) 동정방법(identification method)을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음의 단계를 포함하는 DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체(individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 진단검사는 상기 대상집단의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, (ⅰ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자(allele)가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자(homozygote)인 경우, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 각각 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자(heterozygote)인 경우 양성으로 판단하며, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 경우 음성으로 판단하고, (ⅲ) 그 외의 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단하며; 및
(b) 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서, 상기 제 2 진단검사는 상기 단계 (a)의 양성 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, (ⅰ) 상기 제 1 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성으로 판단되었으나, 제 2 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 경우 음성으로 판단하고, (ⅱ) 상기 제 1 진단검사의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
본 발명자들은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 조기 진단을 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, DMPK 유전자의 CTG 반복서열이 증가된 대립유전자를 가지고 있는 보인자 또는 증상이 경미한 환자가 자녀를 출산하였을 때 CTG 반복서열이 증폭되어 질환이 발생함을 이용하여, 임산부, 가임기 여성 또는 신생아의 대상집단으로부터 보인자 또는 경미한 증상을 가진 환자를 선별검사로 찾아낸 후 태아에 대한 검사를 시행하여 질환 이환 여부를 판정하는 진단방법을 개발하였다.
본 발명의 진단방법은 상염색체 우성질환(autosomal dominant disorder)인 제 1 형 근긴장성 이영양증 뿐만 아니라, 유전자의 이상을 통해 이환되는 다른 유전질환의 선별에도 적용될 수 있으며, 이로써 유전질환의 진행에 따른 합병증 또는 후천적 획득 장애에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 진단방법은 ‘제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 진단방법’으로 기재되어 있으나, 이는 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 방법’또는 ‘체외로 분리된 동물의 생물학적 시료 내 DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 확인하는 단계를 포함하는 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법’으로도 표현될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “생물학적 시료”는 체외로 분리된 동물의 생체 시료로서, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 세포, 모발 또는 조직 시료를 의미하며, 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 모발 또는 구강점막세포이다. 한편, 진단 대상(subect)이 태아인 경우, 상기 생물학적 시료는 융모막, 양수, 태반 또는 제대혈을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “핵산”은 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
아래에서 이와 같은 본 발명의 방법에 따른 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법에 대하여 구체적으로 설명한다:
단계 (a) : 제 1 진단검사
우선, 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체(individual)를 선별한다.
상기 제 1 진단검사는 상기 대상집단의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시된다. 즉, DMPK 유전자 3‘ 비번역부위에 대한 증폭반응을 통하여 CTG 서열의 반복 여부 및 반복 회수를 측정할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “증폭반응”이란 유전자(gene) 또는 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 유전자 또는 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 본 발명의 진단방법에는 전통적인 PCR 방법 뿐 아니라, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시킨, 터치다운(touchdown) PCR(24), 핫 스타트(hot start) PCR(25, 26), 네스티드(nested) PCR(2) 및 부스터(booster) PCR(27)을 이용할 수 있다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR을 사용할 수도 있다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 진단 방법은 상술한 유전자 증폭방법 이외에 혼성화법(hybridization), 면역분석법(immunoassay) 또는 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 진단방법에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 반복 서열에 대하여 상보적인 서열을 가진다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 반복 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 반복 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 방법에서 CTG 서열반복은 상술한 중합효소연쇄반응의 반응결과물을 유전자스캔 분석(GeneScan Genetic Analysis)함으로써 확인할 수 있다. 유전자스캔 분석에서 두 개의 피크(peak)가 관찰되는 경우 두 개의 대립유전자가 모두 확인된 이형접합자(heterozygote)로 판단하며, 한 개의 피크가 관찰되면 동형접합자(homozygote)로 판단한다.
본 발명의 방법에 따르면, (ⅰ) DMPK의 2개 대립유전자(allele)가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자(homozygote)인 경우, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 각각 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자(heterozygote)인 경우 양성으로 판단하며, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 경우 음성으로 판단하고, (ⅲ) 그 외의 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
단계 (b) : 제 2 진단검사
이어, 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별한다. 제 2 진단검사는 단계 (a)의 양성 개체에 대한 정밀검사를 실시하는 단계로서, 상기 단계 (a)의 양성 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제 2 진단검사는 DNA-DNA 혼성화법인 서든블롯 또는 삼염기 반복-증폭법(triplet repeat-primed PCR, TP PCR)을 이용할 수 있다.
삼염기 반복-증폭법에 대한 자세한 내용은, Radvansky 외, Effect of Unexpected Sequence Interruptions to Conventional PCR and Repeat Primed PCR in Myotonic Dystrophy Type 1 Testing, Diagnostic Molecular Pathology (2011); 및 국제특허 공개공보 WO 2011/097503에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법에 따르면, (ⅰ) 상기 제 1 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성으로 판단되었으나, 제 2 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 경우 음성으로 판단하고, (ⅱ) 상기 제 1 진단검사의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 선별된 양성 개체가 임산부인 경우 태아에 대한 제 3 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계 (c)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 제 3 진단검사는 상기 태아의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, (ⅰ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 경우 음성으로 판단하고, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 진단방법은 상기 제 3 진단검사의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회-49회인 경우 근긴장성 이영양증의 보인자로 판단하고, 50회-99회인 경우 경증 질환 발생 가능성이 높은 경우로서 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 판단하며; 100회-999회인 경우 전형적인 제1형 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높은 경우로서 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 판단하고; 1000회 이상인 경우 선천성 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높은 경우로서 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 제 1 위험군은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 발병 가능성이 100% 이나 20대부터 70대에 발병하며 증상이 경미하고 백내장 등의 합병증이 나타날 수 있는 집단이고, 제 2 위험군은 발병 가능성이 100% 이나 10대부터 30대에 발병하며 전형적인 근긴장증과 근육 위약이 나타나고, 백내장, 부정맥 등의 합병증이 대부분 나타나는 집단이며, 제 3 위험군은 발병 가능성이 100% 이면서 신생아 시기에 근긴장도 저하, 호흡 곤란, 지능 지체 등이 나타날 수 있으며, 대개 10세 이전에 전형적인 근긴장증이 발생하는 집단을 의미한다.
태아에 대한 제 3 진단검사는 융모막, 양수, 제대혈 등으로부터 핵산(DNA)를 분리하는 과정을 포함하며, 분리된 핵산으로부터 태아의 DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위한 PCR 또는 써든블롯 검사 과정을 포함한다. 또한, 태아의 정확한 CTG 반복서열 확인을 위해 임산부 및 생물학적 부친의 DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열 횟수를 확인하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1) 환자의 컴퓨터-실행(computer-implemented) 동정 방법(identification method)을 제공한다:
(a) 컴퓨터 프로세서를 이용하여, 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체(individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 선별은 (ⅰ) DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase)의 2개 대립유전자(allele)의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자(homozygote)인 개체, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 각각 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자(heterozygote)인 개체를 양성 개체로 선별하며, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 개체를 음성 개체로 선별하고, (ⅲ) 그 외의 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별하며; 및
(b) 컴퓨터 프로세서를 이용하여, 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서, 상기 제 2 선별은 (ⅰ) 상기 제 1 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성 개체로 판단되었으나, 제 2 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 개체를 음성 개체로 선별하고, (ⅱ) 상기 제 1 선별의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별한다.
본 발명의 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 컴퓨터-실행(computer-implemented) 동정 방법은 상술한 본 발명의 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법과 동일하게, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 방법을 이용한 동정방법으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어 “컴퓨터 프로세서”는 실험자에 의해 수행된 다수 개체의 DMPK 유전자의 CTG 반복 서열과 관련된 다수의 진단정보를 처리하는 장치로서, 실험자에 의해 데이터베이스에 입력된 다수의 진단정보를 일정 기준에 의거하여 분류할 수 있다.
본 발명의 동정방법은 상기 제 2 선별(단계 (b))이후에 제 2 선별에서 양성으로 선별된 태아에 대하여 다양한 정보를 프로파일링하는 제 3 선별 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 즉, 제 2 선별에서 양성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성, 중증도, 형질, 임상양상, 분포, 질병 경과 및 관련 합병증에 대한 프로파일을 생성시키고, 음성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성, 보인자 여부 및 CTG 서열의 반복 회수에 대한 프로파일을 생성시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 동정방법은 상기 제 3 선별진단검사의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회-49회인 개체를 근긴장성 이영양증의 보인자로 선별하고, 50회-99회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 선별하며, 100회-999회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 선별하고, 1000회 이상인 경우 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 선별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 제 1 선별 내지 제 3 선별에 의한 결과를 화면표시기가 있는 컴퓨터 프로세서의 화면에 표시하는 단계 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법 또는 컴퓨터 프로세서를 이용한 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 동정방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 방법은 임신 초기 예방 외에는 효과적인 예방방법이 없는 유전질환에 대한 조기 진단방법으로서, 특정 유전자의 특정 염기 반복서열 이상이 문제되는 다양한 우성 유전 또는 열성 유전질환의 진단 방법에 적용될 수 있다.
(c) 본 발명의 방법에 따르면, DMPK 유전자 3‘ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수에 따라, 보인자, 제 1 위험군 내지 제 3 위험군의 대상으로 분류하여 향후 발생될 증후와 관련된 적절한 조치가 가능하다.
(d) 특히, 본 발명의 방법은 태아에 대한 보인자 또는 질환 이환 정도를 수치적으로 제공하여 질환의 위험도를 정확히 파악할 수 있다.
도 1은 임산부 또는 가임기 여성을 대상으로 본 발명의 진단방법에 의한 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 신생아 대상으로 본 발명의 진단방법에 의한 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 컴퓨터-실행(computer-implemented) 동정 방법에 의한 데이터 베이스의 흐름을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 임산부 또는 가임기 여성 대상의 제 1 형 근긴장성 이영양증 선별검사
DNA 시료 준비
연세대학교 강남 세브란스 병원(서울, 대한민국)을 내원한 임산부 또는 가임기 여성을 대상으로 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단을 실시하였으며, 상기 대상집단으로부터 혈액 샘플을 채취하여 진단에 이용하였다. 로슈(Roche)사의 ‘High Pure PCR Template Preparation Kit’를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상기 혈액 샘플로부터 DNA를 분리하였으며, 추출된 DNA는 검사에 사용하기 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)
DMPK 유전자 3’비번역부위(untranslated region, UTR)의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위해, 상기 대상집단으로부터 분리한 DNA를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 DMPK 유전자내의 CTG 반복서열을 선택적으로 증폭할 수 있는 프라이머로서 그 서열은 다음과 같다:
DM1-F: 5'-GAA GGG TCC TTG TAG CCG GGA A - 3’(서열목록 제 1 서열)
DM1-R: 5'-FAM-GGA GGA TGG AAC ACG GAC GG - 3’ (서열목록 제 2 서열)
상기 프라이머에는 증폭산물의 크기를 확인할 수 있도록 형광물질인 플로레신(Fluorescein, FAM)을 부착하였다. 상기 정방향 프라이머 2.5 μL, 역방향 프라이머 2.5 μL, DNA 시료 1 μL(~300 ng), 증류수, dNTP 4 μL, 포름아미드 1.5 μL 및 Expanded High Fidelity 0.5 μL를 혼합하여, ① 95℃(5분, 1 회); ② 94℃(1분) - 60℃(1분) - 72℃(1분) (28회); ③ 60℃(60분)의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
상기 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DMPK 유전자의 증폭산물을 모세관 전기영동법을 이용하여 크기를 분석하였다. 10 배로 희석한 PCR 증폭산물 1 μL와 포름아미드 10 μL, 및 ROX 스탠다드 0.3 μL를 혼합하여, 95℃에서 2분간 가열한 후, 얼음 위에서 즉시 냉각하여, ABI 3130xl 유전 분석기(Applied Biosystems, 미국)에 장착한 후, 모세관 전기영동을 수행하였다. 유전자스캔 분석 프로그램(GeneScan Analysis program)을 이용하여, 혼합된 ROX 스탠다드의 크기와 비교함으로써 증폭산물을 크기를 결정하였다.
다중중합효소 연쇄반응(Multuplex polymerase chain reaction)
상기 유전자스캔 검사결과 한 개의 피크가 확인된 경우, 정상 동형접합체 대립유전자에서 비롯된 결과인지 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 한쪽 정상 이형접합체 대립유전자에 의한 결과인지 확인하기 위하여 반정량 다중중합효소 연쇄반응법을 수행하였다.
DMPK 유전자의 정량을 위한 기준 유전자로서 아멜로제닌 (Amelogenin) 유전자(GenBank accession No. NM_001143.1)를 사용하여 다중중합효소 연쇄반응법을 시행하였다. 아멜로제닌 유전자는 항상 일정한 양을 가지는 유전자로 동형접합체 또는 이형접합체의 값을 가질 수 있는 DMPK 유전자를 상대적으로 비교 정량하기에 적절한 표준물질로 사용될 수 있다. 반정량 다중중합효소 연쇄반응법의 반응조건 및 방법에 대해서는 대한민국 등록특허 제10-1117798호에 자세히 기재되어 있다.
반정량 다중중합효소 연쇄반응법의 구성물과 농도 및 반응조건은 다음과 같다:
< 프라이머 >
DMPK-GS-F: 5'-FAM-GAAGGGTCCTTGTAGCCGGGAA-3' (서열목록 제 1 서열)
DMPK-GS-R: 5'-GGAGGATGGAACACGGACGG-3' (서열목록 제 2 서열)
아멜로제닌-GS-F: 5'-FAM-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3' (서열목록 제 3 서열)
아멜로제닌-GS-R: 5'-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3' (서열목록 제 4 서열)
중합효소 반응은 dNTP(200 mM), MgCl2(1.25 mM), Expanded high fidelity 버퍼(Roche Diagnostic) 2.5 μL, Expanded high fidelity (Roche Diagnostic) 0.75 μL, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 5%, 프라이머: 각각 400 nM, DNA 시료: 1 ng의 조성으로, ① 95℃(5분, 1 회); ② 94℃(1분) - 60℃(1분) - 72℃(1분) (28회); ③ 60℃(60분)의 반응조건으로 수행하였다.
PCR 증폭산물을 이용한 유전자 스캔을 위하여, HiDi 포름아미드(Applied Biosystems, 미국) 900 μL과 500 ROX size standard (Applied Biosystems) 30 μL을 혼합하여 ROX 표준물질을 제조하였다.
ROX 표준물질 10 μL와 상기 얻어진 증폭산물 1 μL의 혼합물을 95℃에서 2분간 가열한 후, 얼음 위에서 즉시 냉각하여, ABI 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)에 장착한 후, 모세관 전기영동을 시행하였다. GeneScan Analysis program(Applied Biosystems)을 이용하여 혼합된 ROX 스탠다드와 비교하여 증폭산물의 크기 및 양을 결정하였다.
기준유전자로 사용된 아멜로제닌에 대한 DMPK 유전자의 상대 정량값을 구하여, 동형접합체임을 이미 알고 있는 정상 시료의 정량값과 비교함으로써, 시험된 시료에서 얻어진 결과가 동형접합체에서 증폭된 결과인지 환자의 정상 이형접합체 대립유전자가 증폭된 결과인지 확인하였다.
서든블롯( Southern blot analysis )
상기 유전자스캔 분석 결과, 양성으로 판단된 개체에 대하여 서든블롯을 이용한 정밀검사를 수행하였다. 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 아가로스 젤 상에서 분리한 후, 상기 아가로스 젤을 니트로셀룰로스 필터에 흡착시켜 DNA를 필터 상에 고정하였다. 이어, 상기 필터를 방사성 동위원소(32P)로 표지한 프로브(서열목록 제 5 서열)와 혼성화(hybridization)한 후, 필름을 X-선에 노출시켜 방사선으로 감광된 밴드를 확인하였다.
확인 결과, 정상적인 크기의 9 kb 또는 10 kb 크기의 밴드 한 개가 관찰되거나, 9 kb와 10 kb 크기의 밴드 2개가 관찰되는 경우 양쪽 대립유전자가 모두 정상 범위 삼염기 반복서열 횟수를 포함하는 것으로 판단하였다. 또한, 9kb 또는 10 kb 크기의 정상 대립유전자 한 개와, 10 kb 보다 큰 크기의 밴드가 함께 확인되는 경우, 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자로 확진하였다.
CTG 서열 반복- primed 중합효소연쇄반응( CTG repeat - primed PCR )
상기 유전자스캔 분석 결과, 양성으로 판단된 개체에 대하여 CTG서열 반복-primed 중합효소연쇄반응을 이용한 정밀검사를 수행하였다.
DMPK 유전자 3’비번역부위(untranslated region, UTR)의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위해, 상기 대상집단으로부터 분리한 DNA를 이용하여 CTG서열 반복-primed 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 DMPK 유전자내의 CTG 반복서열을 보다 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로서 그 서열은 다음과 같다:
DMPK-P1-F: 5'-FAM-GGGGCTCGAAGGGTCCTTGT-3' (서열목록 제 6 서열)
DMPK-P4CAG-R: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGACAGCAGCAGCAGCAGCAG-3' (서열목록 제 7 서열)
DMPK-P3-R: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' (서열목록 제 8 서열)
상기 정방향 프라이머 P1-F 2 μL, 역방향 프라이머 P4CAG-R 0.5 uL, 역방향 프라이머 P3-R 1.5 μL, DNA 시료 1 μL(~300 ng), 증류수, dNTP 4 μL, betaine 1M 및 Expanded High Fidelity 0.5 μL를 혼합하여, ① 95℃(15분, 1 회); ② 94℃(1분) - 65 ℃(1분) - 72 ℃(2분) (34회); ③ 72℃(15분)의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
상기 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DMPK 유전자의 증폭산물을 모세관 전기영동법을 이용하여 크기를 분석하였다. 10 배로 희석한 PCR 증폭산물 1 μL와 포름아미드 10 μL, 및 ROX 스탠다드 0.3 μL를 혼합하여, 95℃에서 2분간 가열한 후, 얼음 위에서 즉시 냉각하여, ABI 3130xl 유전 분석기(Applied Biosystems, 미국)에 장착한 후, 모세관 전기영동을 수행하였다. 유전자스캔(GeneScan) 분석 프로그램을 이용하여, 혼합된 표준물질의 크기와 비교함으로써 증폭산물을 크기를 결정하였다.
제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 선별
상기 유전자스캔 분석 결과 및 정밀검사 결과를 이용하여, 다음과 같이 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자를 선별하였다:
<제 1 선별>
① 유전자스캔 분석 결과에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 두 개의 피크(peak)가 관찰되어 두 개의 대립유전자가 모두 확인된 이형접합자(heterozygote)인 경우 선별검사 음성으로 판정하였다.
② 유전자스캔 분석 결과에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되면 선별검사 양성으로 판정하였다. 또한, 34회 이하인 피크 한 개와 35회 이상인 피크 한 개가 각각 관찰되는 경우도 선별검사 양성으로 판정하였다. 선별검사 양성인 경우 정밀검사를 시행하였다. 정밀검사는 임산부 또는 가임기 여성의 혈액, 모발, 구강점막세포 등으로부터 분리한 DNA로부터 써든블롯 또는 CTG 반복서열 특이 primer를 이용한 PCR (CTG repeat-primed PCR) 등의 방법으로 시행하는 검사를 포함한다.
<제 2 선별>
③ 유전자스캔 분석 결과에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되었으나, 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되지 않은 경우 정밀검사 음성으로 판정하였다.
④ 유전자스캔 분석 결과에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되고 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견된 경우 정밀검사 양성으로 판정하였다. 또한, 선별검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되고 정밀검사에서도 재확인된 경우도 정밀검사 양성으로 판정하였다. 정밀검사 양성인 임산부의 경우 태아검사를 시행하였다.
실시예 2: 태아의 제 1 형 근긴장성 이영양증 선별검사
DNA 시료 준비 및 진단시험방법
상기 실시예 1에서 양성으로 판단된 임산부를 대상으로, 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단을 실시하였으며, 상기 임산부의 융모막, 양수 또는 제대혈의 샘플을 채취하여 진단에 이용하였다.
DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위한 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 스캔 분석, 서든블롯 및 CTG서열 반복-primed 중합효소연쇄반응은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제 1 형 근긴장성 이영양증 태아의 선별
① 태아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 35회 이상으로 증가된 대립유전자가 관찰되지 않으면 태아검사 음성으로 판정하였고, 제1형 근긴장성 이영양증 위험은 낮다고 판정하였다.
② 태아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 35회 이상으로 증가된 대립유전자가 관찰되면 태아검사 양성으로 판정하였고 제1형 근긴장성 이영양증 위험은 높다고 판정하였다.
③ 태아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 35-49회 범위에 해당될 경우 태아는 제1형 근긴장성 이영양증의 보인자로 판정하였고 질환 발생 가능성은 낮다고 판정하였다.
④ 태아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 50회 이상인 경우 태아의 제1형 근긴장성 이영양증 발생 가능성이 높다고 판정하였다.
⑤ 태아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 50-99회인 경우 경증 질환 발생 가능성이 높다고 판정하였고, 100-999회인 경우 전형적인 제1형 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높다고 판정하였으며, 1000회 이상인 경우 선천성 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높다고 판정하였다.
실시예 3: 신생아의 제 1 형 근긴장성 이영양증 선별검사
DNA 시료 준비 및 진단시험방법
연세대학교 강남 세브란스 병원(서울, 대한민국)을 출생 또는 내원한 신생아를 대상으로 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단을 실시하였으며, 상기 대상집단으로부터 혈액 샘플을 채취하여 진단에 이용하였다.
DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위한 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 스캔 분석, 서든블롯 및 CTG서열 반복-primed 중합효소연쇄반응은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제 1 형 근긴장성 이영양증 신생아의 선별
① 신생아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 두 개의 피크가 관찰되어 두 개의 대립유전자가 모두 확인된 이형접합자(heterozygote)인 경우 선별검사 음성으로 판정하였다.
② 신생아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되면 선별검사 양성으로 판정하였다. 또한, 34회 이하인 피크 한 개와 35회 이상인 peak 한 개가 각각 관찰되는 경우도 선별검사 양성으로 판정하였다. 선별검사 양성인 경우 정밀검사를 시행할 수 있다. 정밀검사는 신생아의 혈액, 구강점막세포, 모발 등으로부터 분리한 핵산(DNA)으로부터 써든블롯 또는 CTG 반복서열 특이 primer를 이용한 PCR (CTG repeat-primed PCR) 등의 방법으로 시행하는 검사를 포함한다.
③ 신생아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되었으나 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되지 않은 경우 정밀검사 음성으로 판정하였다.
④ 신생아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되고 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견된 경우 정밀검사 양성으로 판정하였다. 또한, 선별검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되고 정밀검사에서 재확인된 경우도 정밀검사 양성으로 판정하였다.
⑤ 신생아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 35-49회 범위에 해당될 경우 신생아는 제1형 근긴장성 이영양증의 보인자로 판정하고 질환 발생 가능성은 낮다고 판정하였다.
⑥ 신생아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3’-UTR 부위의 반복 서열 횟수가 CTG 반복서열이 50회 이상인 경우 제1형 근긴장성 이영양증 발생 가능성이 높다고 판정하였다. 또한, 50-99회인 경우 경증 질환 발생 가능성이 높다고 판정하였고, 100-999회인 경우 전형적인 제1형 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높으며, 1000회 이상인 경우 선천성 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높다고 판정하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (10)

  1. 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음의 단계를 포함하는 DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 방법:
    (a) 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체(individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 진단검사는 상기 대상집단의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3’ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, (ⅰ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자(allele)가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자(homozygote)인 경우, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 각각 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자(heterozygote)인 경우 양성으로 판단하며, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 경우 음성으로 판단하고, (ⅲ) 그 외의 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단하며; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서, 상기 제 2 진단검사는 상기 단계 (a)의 양성 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3’ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, (ⅰ) 상기 제 1 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성으로 판단되었으나, 제 2 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 경우 음성으로 판단하고, (ⅱ) 상기 제 1 진단검사의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 선별된 양성 개체가 임산부인 경우 태아에 대한 제 3 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계 (c) 를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서, 상기 제 3 진단검사는 상기 태아의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3’ 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, (ⅰ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 경우 음성으로 판단하고, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 제 3 진단검사의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회-49회인 경우 근긴장성 이영양증의 보인자로 판단하고, 50회-99회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 판단하며, 100회-999회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 판단하고, 1000회 이상인 경우 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 세포, 모발 또는 조직 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 융모막, 양수, 태반 또는 제대혈인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 진단검사는 혼성화법, 유전자 증폭방법, 면역분석 방법 또는 마이크로어레이를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 다음을 포함하는 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1) 환자의 컴퓨터-실행(computer-implemented) 동정 방법(identification method):
    (a) 컴퓨터 프로세서를 이용하여, 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체(individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 선별은 (ⅰ) DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase)의 2개 대립유전자(allele)의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자(homozygote)인 개체, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 각각 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자(heterozygote)인 개체를 양성 개체로 선별하며, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 개체를 음성 개체로 선별하고, (ⅲ) 그 외의 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별하며; 및
    (b) 컴퓨터 프로세서를 이용하여, 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서, 상기 제 2 선별은 (ⅰ) 상기 제 1 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성 개체로 판단되었으나, 제 2 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 개체를 음성 개체로 선별하고, (ⅱ) 상기 제 1 선별의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별한다.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 동정방법은 상기 단계 (b)에서 선별된 양성 개체가 임산부인 경우, 컴퓨터 프로세서를 이용하여 태아에 대한 제 3 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서, 상기 제 3 선별은 (ⅰ) DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 개체를 음성 개체로 선별하고, (ⅱ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별하는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 동정방법은 컴퓨터 프로세서를 이용하여 양성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성, 중증도, 형질, 임상양상, 분포, 질병 경과 및 관련 합병증에 대한 프로파일을 생성시키고, 음성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성, 보인자 여부 및 CTG 서열의 반복 회수에 대한 프로파일을 생성시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 동정방법은 컴퓨터 프로세서를 이용하여 상기 제 3 선별의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회-49회인 개체를 근긴장성 이영양증의 보인자로 선별하고, 50회-99회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 선별하며, 100회-999회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 선별하고, 1000회 이상인 경우 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동정방법.
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