JP2650159B2 - 核酸増幅方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、特定核酸配列の増幅方法に係る。
発明の背景 標本中に存在する特定の核酸配列を検出するために核
酸の相補的配列で標本をプローブすることは公知の診断
方法で使用されている。核酸と相補的核酸との結合は高
度に特異的であり、従って標本中に特定の核酸が存在す
るか否かを有効に判定し得る。このためには、検出すべ
き特定核酸配列が既知であり該特定配列に相補的な核酸
配列をもつプローブを構築することが必要である。
酸の相補的配列で標本をプローブすることは公知の診断
方法で使用されている。核酸と相補的核酸との結合は高
度に特異的であり、従って標本中に特定の核酸が存在す
るか否かを有効に判定し得る。このためには、検出すべ
き特定核酸配列が既知であり該特定配列に相補的な核酸
配列をもつプローブを構築することが必要である。
本願において、「特定核酸配列」なる用語は、増幅さ
せるべき一重鎖または二重鎖の核酸を意味する。「標
本」なる用語は、複数の核酸を含有する混合物を意味す
る。「十分に相補的な」なる用語は、２つの核酸即ちプ
ライマーと鋳型とが特異的に相互作用でき所与のイオン
強度条件及び温度条件下にプライマー依存性で鋳型依存
性のDNA合成を有効に行なうことを意味する。
せるべき一重鎖または二重鎖の核酸を意味する。「標
本」なる用語は、複数の核酸を含有する混合物を意味す
る。「十分に相補的な」なる用語は、２つの核酸即ちプ
ライマーと鋳型とが特異的に相互作用でき所与のイオン
強度条件及び温度条件下にプライマー依存性で鋳型依存
性のDNA合成を有効に行なうことを意味する。
核酸プローブは高度に特異的であるため、いくつかの
場合には、核酸配列によって産生されるタンパク質より
もむしろ核酸配列自体をプローブするほうが好ましい。
例えば、タンパク質検出だけに基づく診断方法では、Ｂ
型肝炎ウィルスの感染性粒子の存在に関して信頼できる
診断を下すことができない。その理由は、DNAゲノムの
欠失した非感染性抗原粒子が有意レベルで存在するから
である。別の例では、前癌性または良性の子宮頚部腫瘍
中に検出されるヒト乳頭腫ウイルスの種々のサブタイプ
は核酸プローブハイブリダイゼーションを使用したとき
にのみ識別できる。またエイズの微生物学的研究から
も、エイズ特異的核酸配列の存在に基づくアッセイが最
良の診断方法であることが確認された。
場合には、核酸配列によって産生されるタンパク質より
もむしろ核酸配列自体をプローブするほうが好ましい。
例えば、タンパク質検出だけに基づく診断方法では、Ｂ
型肝炎ウィルスの感染性粒子の存在に関して信頼できる
診断を下すことができない。その理由は、DNAゲノムの
欠失した非感染性抗原粒子が有意レベルで存在するから
である。別の例では、前癌性または良性の子宮頚部腫瘍
中に検出されるヒト乳頭腫ウイルスの種々のサブタイプ
は核酸プローブハイブリダイゼーションを使用したとき
にのみ識別できる。またエイズの微生物学的研究から
も、エイズ特異的核酸配列の存在に基づくアッセイが最
良の診断方法であることが確認された。
既存の核酸プローブ技術の使用に伴う最大の困難及び
既存のプローブ技術の実用性に限界がある理由は、コピ
ー数の問題にある。例えば、１つのウイルスまたは細胞
中に通常は特定遺伝子の単一コピー（single copy）が
存在する。この１つのコピーがRNAまたはタンパク質の
ごとき遺伝子産生物のコピーを多数生成し得る。このた
め、検出すべき核酸の特定配列がタンパク質の数千もの
コピーを生じ得るので、診断方法においてはタンパク質
をプローブする技術がしばしば使用されてきた。
既存のプローブ技術の実用性に限界がある理由は、コピ
ー数の問題にある。例えば、１つのウイルスまたは細胞
中に通常は特定遺伝子の単一コピー（single copy）が
存在する。この１つのコピーがRNAまたはタンパク質の
ごとき遺伝子産生物のコピーを多数生成し得る。このた
め、検出すべき核酸の特定配列がタンパク質の数千もの
コピーを生じ得るので、診断方法においてはタンパク質
をプローブする技術がしばしば使用されてきた。
レジオネラ（Legionella）及びマイコプラズマ（Myco
plasma）のごときある種の細菌性病原体の診断を核酸プ
ローブを用いて容易に行なうために、細胞当り100,000
コピーにのぼる多数の天然リボソームRNAが遺伝子プロ
ーブ（GenProbe）法によって使用されてきた。しかしな
がら、この戦略は、ウイルスのごとき非細胞性病原体に
は使用できない。核酸プローブを用いたエイズウイルス
検出方法の開発ではコピー数が特に問題になる。何故な
らこの場合、組み込まれたプロウイルスは10,000個の末
梢血リンパ球のうち１個未満のリンパ球中に存在し得る
からである。従って、標本中に存在すると予想される特
定核酸配列を増幅できれば、コピー数の問題が解決され
プローブアッセイをより容易に使用できる。
plasma）のごときある種の細菌性病原体の診断を核酸プ
ローブを用いて容易に行なうために、細胞当り100,000
コピーにのぼる多数の天然リボソームRNAが遺伝子プロ
ーブ（GenProbe）法によって使用されてきた。しかしな
がら、この戦略は、ウイルスのごとき非細胞性病原体に
は使用できない。核酸プローブを用いたエイズウイルス
検出方法の開発ではコピー数が特に問題になる。何故な
らこの場合、組み込まれたプロウイルスは10,000個の末
梢血リンパ球のうち１個未満のリンパ球中に存在し得る
からである。従って、標本中に存在すると予想される特
定核酸配列を増幅できれば、コピー数の問題が解決され
プローブアッセイをより容易に使用できる。
少数の細胞しか含まず従って特定遺伝子の少数コピー
しか含まない正常生物標本においては、コピー数の問題
を解決するために増幅方法を利用する必要がある。
しか含まない正常生物標本においては、コピー数の問題
を解決するために増幅方法を利用する必要がある。
１つの増幅方法は、標本の「十分な増殖」を行なうこ
と、即ち標本中に存在する生きた生物物質が自然に複製
できるように条件を整えることである。核酸配列の量を
複製によって検出可能レベルまで増加させる。例えば食
品産業では、加工食品の有害細菌Sallmonellaを検査す
るために、食品標本を何日間もインキュベートして核酸
量を増加させる必要がある。臨床標本では、病原体の数
を増加させるために標本をかなりの期間にわたって増殖
させる必要がある。
と、即ち標本中に存在する生きた生物物質が自然に複製
できるように条件を整えることである。核酸配列の量を
複製によって検出可能レベルまで増加させる。例えば食
品産業では、加工食品の有害細菌Sallmonellaを検査す
るために、食品標本を何日間もインキュベートして核酸
量を増加させる必要がある。臨床標本では、病原体の数
を増加させるために標本をかなりの期間にわたって増殖
させる必要がある。
1987年７月28日付けCetus Corporationの米国特許第
4,683,195号及び1987年７月28日付けのCetus Corporati
onの米国特許第4,683,202号は夫々、標本中に含まれる
標的核酸配列の増幅方法を開示している。米国特許第4,
683,195号に記載された方法は、標的核酸配列を含有す
ると予想される標本をオリゴヌクレオチドプライマーで
処理してプライマー伸長産生物を合成し、該産生物を鋳
型として標的核酸配列を増幅させる方法である。好適実
施例では熱変性を用いてプライマー伸長産生成物を鋳型
から分離している。また、米国特許第4,683,202号に記
載の方法は、異なる２つの相補鎖をもつ標的核酸配列の
増幅方法である。この方法では、鎖をプライマーで処理
して伸長産生物を合成し、プライマー伸長産生物を鋳型
から分離し、次にプライマー伸長産生物を鋳型として使
用する。
4,683,195号及び1987年７月28日付けのCetus Corporati
onの米国特許第4,683,202号は夫々、標本中に含まれる
標的核酸配列の増幅方法を開示している。米国特許第4,
683,195号に記載された方法は、標的核酸配列を含有す
ると予想される標本をオリゴヌクレオチドプライマーで
処理してプライマー伸長産生物を合成し、該産生物を鋳
型として標的核酸配列を増幅させる方法である。好適実
施例では熱変性を用いてプライマー伸長産生成物を鋳型
から分離している。また、米国特許第4,683,202号に記
載の方法は、異なる２つの相補鎖をもつ標的核酸配列の
増幅方法である。この方法では、鎖をプライマーで処理
して伸長産生物を合成し、プライマー伸長産生物を鋳型
から分離し、次にプライマー伸長産生物を鋳型として使
用する。
前出の２つの米国特許はいずれも、増幅方法において
ユーザーが手動的または機械的に介入しかつ多段階操作
を行なう必要がある。これらの特許に含まれる操作段階
では、ユーザーが標本を加熱し、冷却し、適当な酸素を
添加し、次いで諸段階を繰り返す必要がある。温度変化
は酵素を失活させる。従ってユーザーは増幅過程の際に
適当な酵素のアリコートを増幅混合物に繰り返し補充す
る必要がある。
ユーザーが手動的または機械的に介入しかつ多段階操作
を行なう必要がある。これらの特許に含まれる操作段階
では、ユーザーが標本を加熱し、冷却し、適当な酸素を
添加し、次いで諸段階を繰り返す必要がある。温度変化
は酵素を失活させる。従ってユーザーは増幅過程の際に
適当な酵素のアリコートを増幅混合物に繰り返し補充す
る必要がある。
米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号によれば更
に、増幅方法の各サイクルでは第１鋳型から第２鋳型が
合成され、次に第２鋳型を用いて第１鋳型が合成され
る。このようにしてこの手順が繰り返されるが、増幅方
法の各サイクルは１つの基質から１つの産生物の合成に
基づいている。
に、増幅方法の各サイクルでは第１鋳型から第２鋳型が
合成され、次に第２鋳型を用いて第１鋳型が合成され
る。このようにしてこの手順が繰り返されるが、増幅方
法の各サイクルは１つの基質から１つの産生物の合成に
基づいている。
従来技術に開示された増幅方法にかかわりなく、増幅
方法の改良が必要とされている。ユーザーの介入が少な
く操作が少ない増幅方法が好ましい。更に、増幅方法に
関与する酵素の活性に影響を与えないように増幅が比較
的一定の室温で行なわれるのが有利である。増幅方法の
各サイクル毎に１つの鋳型を使用して１つの基質から２
つ以上の産生物を生成することができれば更に好都合で
あろう。
方法の改良が必要とされている。ユーザーの介入が少な
く操作が少ない増幅方法が好ましい。更に、増幅方法に
関与する酵素の活性に影響を与えないように増幅が比較
的一定の室温で行なわれるのが有利である。増幅方法の
各サイクル毎に１つの鋳型を使用して１つの基質から２
つ以上の産生物を生成することができれば更に好都合で
あろう。
発明の概要 本発明は、ユーザーによる介入及び操作が従来の増幅
方法よりも少ない有利な増幅方法に係る。増幅が比較的
一定の室温で行なわれる。更に、この方法の各サイクル
では１つの基質からその産生物の複数コピーが産生され
る。本発明の増幅方法は、特定核酸の量を増加させこれ
によりコピー数の問題を解決するために使用され得る。
従って、プローブアッセイの使用がより容易になる。ま
た、特定核酸配列の純度を向上させるために本発明の増
幅方法を従来のクローニング方法に代替して使用するこ
とも可能である。
方法よりも少ない有利な増幅方法に係る。増幅が比較的
一定の室温で行なわれる。更に、この方法の各サイクル
では１つの基質からその産生物の複数コピーが産生され
る。本発明の増幅方法は、特定核酸の量を増加させこれ
によりコピー数の問題を解決するために使用され得る。
従って、プローブアッセイの使用がより容易になる。ま
た、特定核酸配列の純度を向上させるために本発明の増
幅方法を従来のクローニング方法に代替して使用するこ
とも可能である。
本発明の１つの態様に従って特定核酸配列の増幅方法
が使用される。この方法は、一重鎖RNA、一重鎖DNA及び
二重鎖DNAの合成を含む。一重鎖RNAは第１プライマー用
第１鋳型である。一重鎖DNAは第２プライマー用第２鋳
型である。二重鎖DNAは第１鋳型の複数コピー合成用第
３鋳型である。第１または第２のプライマーの配列は特
定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第
２のプライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相
同である。第１プライマーの３′の末端は相補鎖上の第
２プライマーの３′の末端に向けて方向付けされてい
る。
が使用される。この方法は、一重鎖RNA、一重鎖DNA及び
二重鎖DNAの合成を含む。一重鎖RNAは第１プライマー用
第１鋳型である。一重鎖DNAは第２プライマー用第２鋳
型である。二重鎖DNAは第１鋳型の複数コピー合成用第
３鋳型である。第１または第２のプライマーの配列は特
定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１または第
２のプライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相
同である。第１プライマーの３′の末端は相補鎖上の第
２プライマーの３′の末端に向けて方向付けされてい
る。
本発明の別の態様に従って特定核酸配列の増幅方法が
使用される。この方法は以下の段階を含む。
使用される。この方法は以下の段階を含む。
（ａ）第１プライマーを第１鋳型にハイブリダイズす
る。第１プライマーは第１鋳型のRNA配列に十分に相補
的なDNA配列をもつ。
る。第１プライマーは第１鋳型のRNA配列に十分に相補
的なDNA配列をもつ。
（ｂ）第１プライマーに共有結合し第１鋳型のRNA配列
に相補的な第1DNAを合成する。第1DNA配列及び第１プラ
イマーが第２鋳型を構成する。
に相補的な第1DNAを合成する。第1DNA配列及び第１プラ
イマーが第２鋳型を構成する。
（ｃ）第２プライマーのハイブリダイゼーションを行な
わせるために第１鋳型を第２鋳型から分離する。
わせるために第１鋳型を第２鋳型から分離する。
（ｄ）第２プライマーを第２鋳型にハイブリダイズす
る。第２プライマーは第２鋳型のDNA配列に十分に相補
的なDNA配列をもつ。第２プライマーはまたRNAポリメラ
ーゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部
位のアンチセンス配列とをもつ。
る。第２プライマーは第２鋳型のDNA配列に十分に相補
的なDNA配列をもつ。第２プライマーはまたRNAポリメラ
ーゼ用のプロモーターのアンチセンス配列と転写開始部
位のアンチセンス配列とをもつ。
（ｅ）第２プライマーに共有結合し第２鋳型のDNA配列
に相補的な第2DNA配列を合成し、第２鋳型に共有結合し
第２プライマーのDNA配列に相補的な第3DNA配列を合成
する。第２及び第３のDNA配列及び第２プライマー第２
鋳型が第３鋳型を構成する。
に相補的な第2DNA配列を合成し、第２鋳型に共有結合し
第２プライマーのDNA配列に相補的な第3DNA配列を合成
する。第２及び第３のDNA配列及び第２プライマー第２
鋳型が第３鋳型を構成する。
（ｆ）第３鋳型から第１鋳型のRNA配列の複数コピーを
合成する。
合成する。
第１または第２のプライマーの配列は特定核酸配列に
十分に相補的であり、第１または第２のプライマーの配
列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１プラ
イマーの３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３′末
端に向かって方向付けされている。
十分に相補的であり、第１または第２のプライマーの配
列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。第１プラ
イマーの３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３′末
端に向かって方向付けされている。
本発明の別の方法では、第２プライマーDNAが第２鋳
型のDNA配列に十分に相補的な配列を３′末端にもつ。
第２プライマーは５′末端にRNAポリメラーゼ用のプロ
モーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセ
ンス配列とをもつ。
型のDNA配列に十分に相補的な配列を３′末端にもつ。
第２プライマーは５′末端にRNAポリメラーゼ用のプロ
モーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチセ
ンス配列とをもつ。
本発明の更に別の方法では、第２鋳型に共有結合した
第3DNA配列は第２プライマーの５′末端のDNA配列に相
補的である。
第3DNA配列は第２プライマーの５′末端のDNA配列に相
補的である。
本発明の別の方法においても特定核酸配列の増幅方法
が使用される。該方法では、第１プライマーと第２プラ
イマーとリボヌクレアーゼＨとRNA依存性DNAポリメラー
ゼとDNA依存性DNAポリメラーゼとRNAポリメラーゼとリ
ボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボヌクレオシド三
リン酸とを標本と混合する。第１プライマーDNAは第１
鋳型RNAに十分な相補的は配列をもつ。第２プライマーD
NAは、RNAポリメラーゼによって基質として認識される
第２鋳型DNAに十分に相補的な配列とプロモーターのア
ンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを
もつ。第１プライマーまたは第２プライマーの配列は、
特定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１プライ
マーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列
に十分に相同である。第１プライマーの３′末端は相補
鎖上の第２プライマーの３′末端に向かって方向付けさ
れている。
が使用される。該方法では、第１プライマーと第２プラ
イマーとリボヌクレアーゼＨとRNA依存性DNAポリメラー
ゼとDNA依存性DNAポリメラーゼとRNAポリメラーゼとリ
ボヌクレオシド三リン酸とデオキシリボヌクレオシド三
リン酸とを標本と混合する。第１プライマーDNAは第１
鋳型RNAに十分な相補的は配列をもつ。第２プライマーD
NAは、RNAポリメラーゼによって基質として認識される
第２鋳型DNAに十分に相補的な配列とプロモーターのア
ンチセンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを
もつ。第１プライマーまたは第２プライマーの配列は、
特定核酸配列の配列に十分に相補的であり、第１プライ
マーまたは第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列
に十分に相同である。第１プライマーの３′末端は相補
鎖上の第２プライマーの３′末端に向かって方向付けさ
れている。
本発明の更に別の方法においても特定核酸配列の増幅
方法が使用される。この方法では、第１プライマーと第
２プライマーとトリ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼと
大腸菌リボヌクレアーゼＨとバクテリオファージT7 RNA
ポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオキシボ
ヌクレオシド三リン酸とを標本に添加する。第１プライ
マーDNAは第１鋳型RNAに十分に相補的な配列をもつ。第
２プライマーDNAはT7 RNAポリメラーゼによって基質と
して認識される第２鋳型DNAに十分に相補的な配列とプ
ロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチ
センス配列とを含む。第１プライマーまたは第２プライ
マーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相補的であ
り、第１プライマーまたは第２プライマーの配列は特定
核酸配列の配列に十分な相同である。第１プライマーの
３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３′末端に向か
って方向付けされている。
方法が使用される。この方法では、第１プライマーと第
２プライマーとトリ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼと
大腸菌リボヌクレアーゼＨとバクテリオファージT7 RNA
ポリメラーゼとリボヌクレオシド三リン酸とデオキシボ
ヌクレオシド三リン酸とを標本に添加する。第１プライ
マーDNAは第１鋳型RNAに十分に相補的な配列をもつ。第
２プライマーDNAはT7 RNAポリメラーゼによって基質と
して認識される第２鋳型DNAに十分に相補的な配列とプ
ロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアンチ
センス配列とを含む。第１プライマーまたは第２プライ
マーの配列は特定核酸配列の配列に十分に相補的であ
り、第１プライマーまたは第２プライマーの配列は特定
核酸配列の配列に十分な相同である。第１プライマーの
３′末端は相補鎖上の第２プライマーの３′末端に向か
って方向付けされている。
具体例 本発明は特定核酸配列の増幅方法に係る。増幅はDNA
及びRNAの交互合成を含み第１図に概略的に示されてい
る。この方法においては、一重鎖RNAが一重鎖DNAに変換
され、該一重鎖DNAが出発一重鎖RNAの複数コピー合成用
の機能性鋳型に変換される。第１プライマー及び第２プ
ライマーが増幅方法で使用される。第１プライマーまた
は第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に
相補的であり、第１プライマーまたは第２プライマーの
配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。いくつ
かの場合、例えば特定核酸配列が二重鎖DNAの場合に
は、第１プライマーと第２プライマーとの双方が特定核
酸配列の配列に十分に相補的で且つ十分に相同である。
及びRNAの交互合成を含み第１図に概略的に示されてい
る。この方法においては、一重鎖RNAが一重鎖DNAに変換
され、該一重鎖DNAが出発一重鎖RNAの複数コピー合成用
の機能性鋳型に変換される。第１プライマー及び第２プ
ライマーが増幅方法で使用される。第１プライマーまた
は第２プライマーの配列は特定核酸配列の配列に十分に
相補的であり、第１プライマーまたは第２プライマーの
配列は特定核酸配列の配列に十分に相同である。いくつ
かの場合、例えば特定核酸配列が二重鎖DNAの場合に
は、第１プライマーと第２プライマーとの双方が特定核
酸配列の配列に十分に相補的で且つ十分に相同である。
RNAオリゴヌクレオチドプライマー（第１プライマ
ー）をRNA（第１鋳型）にハイブリダイズさせRNA依存性
DNAポリメラーゼを用いて第１プライマーから相補鎖DNA
（第1DNA配列）を合成することによって一重鎖DNAに変
換される。例えば第１鋳型の加水分解とRNA−DNAハイブ
リッドに特異的なリボヌクレアーゼ（例えばリボヌクレ
アーゼＨ）を使用し、得られた一重鎖DNA（第２鋳型）
を第１鋳型から分離する。第２鋳型はRNA合成可能な形
態に変換される。この変換は、第２鋳型の３′末端に十
分に相補的な配列を３′末端に含み５′末端に向かって
プロモーターのアンチセンス鎖と転写開始部位のアンチ
センス配列とを含む配列をもつ合成オリゴヌクレオチド
（第２プライマー）をハイブリダイズし、第２鋳型を鋳
型として用いて第２プライマーの３′末端に共有結合し
た第2DNA配列を合成し、DNA依存性DNAポリメラーゼを用
い第２プライマーを鋳型として用いて第２鋳型の３′末
端に共有結合した第3DNA配列を合成することによって行
なわれる。得られた第２鋳型の機能性誘導体が第３鋳型
であり、これを使用し、第２プライマーによって規定さ
れるプロモーター及び転写開始部位に特異的なRNAポリ
メラーゼを用いて第１鋳型であるRNAの複数コピーを合
成する。サイクルを繰り返すことによって、新しく合成
された第１鋳型の各々が更に第２鋳型及び第３鋳型のコ
ピーに変換され得る。また、サイクルの繰り返しがユー
ザーの介入または操作を不要とする。
ー）をRNA（第１鋳型）にハイブリダイズさせRNA依存性
DNAポリメラーゼを用いて第１プライマーから相補鎖DNA
（第1DNA配列）を合成することによって一重鎖DNAに変
換される。例えば第１鋳型の加水分解とRNA−DNAハイブ
リッドに特異的なリボヌクレアーゼ（例えばリボヌクレ
アーゼＨ）を使用し、得られた一重鎖DNA（第２鋳型）
を第１鋳型から分離する。第２鋳型はRNA合成可能な形
態に変換される。この変換は、第２鋳型の３′末端に十
分に相補的な配列を３′末端に含み５′末端に向かって
プロモーターのアンチセンス鎖と転写開始部位のアンチ
センス配列とを含む配列をもつ合成オリゴヌクレオチド
（第２プライマー）をハイブリダイズし、第２鋳型を鋳
型として用いて第２プライマーの３′末端に共有結合し
た第2DNA配列を合成し、DNA依存性DNAポリメラーゼを用
い第２プライマーを鋳型として用いて第２鋳型の３′末
端に共有結合した第3DNA配列を合成することによって行
なわれる。得られた第２鋳型の機能性誘導体が第３鋳型
であり、これを使用し、第２プライマーによって規定さ
れるプロモーター及び転写開始部位に特異的なRNAポリ
メラーゼを用いて第１鋳型であるRNAの複数コピーを合
成する。サイクルを繰り返すことによって、新しく合成
された第１鋳型の各々が更に第２鋳型及び第３鋳型のコ
ピーに変換され得る。また、サイクルの繰り返しがユー
ザーの介入または操作を不要とする。
増幅方法は、適当な反応条件下に適当な酵素、プライ
マー及び補因子に適当な鋳型核酸を添加することによっ
て開始される。この鋳型核酸は、均質で連続的な増幅が
可能な形態であり、第１図に示すサイクルにおける中間
体として機能する。増幅方法では前躯体（プライマー、
リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸）の正味（net）の消費及び産生物（RNA及び
DNA）の正味の蓄積が生じる。RNA及びDNAの合成過程
は、検出に十分なレベルの核酸が合成されるまで非同時
的に進行する。増幅過程は例えば標識前躯体からの標識
産生物の合成によって追跡され得る。
マー及び補因子に適当な鋳型核酸を添加することによっ
て開始される。この鋳型核酸は、均質で連続的な増幅が
可能な形態であり、第１図に示すサイクルにおける中間
体として機能する。増幅方法では前躯体（プライマー、
リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸）の正味（net）の消費及び産生物（RNA及び
DNA）の正味の蓄積が生じる。RNA及びDNAの合成過程
は、検出に十分なレベルの核酸が合成されるまで非同時
的に進行する。増幅過程は例えば標識前躯体からの標識
産生物の合成によって追跡され得る。
増幅が、第１図に概略的に示すプロセスに付加または
代替して別のプロセスを含んでもよい。また、ある種の
逆産生性（counter productive）酵素反応が許容できる
低速度で発生してもよい。予想される非産生性副反応の
１つは、鋳型核酸の非存在下のRNA及び／またはDNAの合
成である。かかるRNA及び／またはDNA産物を所望産生物
から識別するためには、特定核酸配列の２つのプライミ
ング部位間にのみ検出される特定配列の有無を判定すれ
ばよい。
代替して別のプロセスを含んでもよい。また、ある種の
逆産生性（counter productive）酵素反応が許容できる
低速度で発生してもよい。予想される非産生性副反応の
１つは、鋳型核酸の非存在下のRNA及び／またはDNAの合
成である。かかるRNA及び／またはDNA産物を所望産生物
から識別するためには、特定核酸配列の２つのプライミ
ング部位間にのみ検出される特定配列の有無を判定すれ
ばよい。
第１プライマーは、第１鋳型の３′末端に十分に相補
的は配列を３′末端にもつオリゴデオキシリボヌクレオ
チドである。第１プライマーの３′末端の配列は、所与
のイオン強度条件及び温度条件下に第1DNA配列を特異的
効率的に合成するために十分な特定の長さ及び塩基組成
をもつ。第１サイクルにおいて第１プライマーは第１鋳
型の３′末端の内部の領域に十分に相補的であり得る。
その後のサイクルにおいて、第１プライマーの５′末端
は第１鋳型の３′末端に相補的であろう。第１プライマ
ーの一部または全部が天然デオキシリボヌクレオチド以
外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から構成さ
れてもよいと考えられる。第１サイクルで第１プライマ
ーの５′末端は第１鋳型に相補的でない配列を含んでい
てもよい。非相補的配列は、固定化可能な核酸に相補的
であってもよく、または検出容易なリポーターのごとき
有用な非核酸成分と結合可能であってもよい。または、
非相補的配列が、プロモーターのアンチセンス配列とRN
A合成に使用できる転写開始部位のアンチセンス配列と
を含んでいてもよい。このRNAは、第１鋳型に相補的で
あり別の増幅サイクルで中間体として使用され得る。
的は配列を３′末端にもつオリゴデオキシリボヌクレオ
チドである。第１プライマーの３′末端の配列は、所与
のイオン強度条件及び温度条件下に第1DNA配列を特異的
効率的に合成するために十分な特定の長さ及び塩基組成
をもつ。第１サイクルにおいて第１プライマーは第１鋳
型の３′末端の内部の領域に十分に相補的であり得る。
その後のサイクルにおいて、第１プライマーの５′末端
は第１鋳型の３′末端に相補的であろう。第１プライマ
ーの一部または全部が天然デオキシリボヌクレオチド以
外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から構成さ
れてもよいと考えられる。第１サイクルで第１プライマ
ーの５′末端は第１鋳型に相補的でない配列を含んでい
てもよい。非相補的配列は、固定化可能な核酸に相補的
であってもよく、または検出容易なリポーターのごとき
有用な非核酸成分と結合可能であってもよい。または、
非相補的配列が、プロモーターのアンチセンス配列とRN
A合成に使用できる転写開始部位のアンチセンス配列と
を含んでいてもよい。このRNAは、第１鋳型に相補的で
あり別の増幅サイクルで中間体として使用され得る。
第２プライマーは第２鋳型の３′末端に十分に相補的
は配列を３′末端に含むオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドである。第２プライマーは所与のイオン強度条件及び
温度条件下に第２及び第３のDNA配列を特異的効率的に
合成せしめるに十分な特定の長さ及び塩基組成をもつ。
更に、第２プライマーは機能性プロモーターのアンチセ
ンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む。
この配列は、第3DNA配列の合成用鋳型として使用された
とき、RNAポリメラーゼの特異的効率的結合と所望部位
での転写開始と行なわせるに十分な情報を含む。プロモ
ーター配列は機能性プロモーターのアンチセンス鎖に由
来してもよい。転写開始部位は天然RNA転写物の５′末
端配列に由来してもよい。好適実施態様においては、第
２プライマーの５′末端配列は、AATTCTAATACGACTCACTA
TAGGGAGである。この配列は、T7 RNAポリメラーゼ用の
プロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアン
チセンス配列とを含む。または、別のファージRNAポリ
メラーゼ用の転写開始部位とプロモーターとを使用して
もよい。更に、プロモーター機能に関係しない配列が、
第２プライマーの５′末端に含まれるかまたは第２鋳型
にハイブリダイズする３′末端の配列と転写開始部位と
の間に含まれていてもよい。第２プライマーの一部また
は全部が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオ
チドまたはヌクレオチド類似体から構成されてもよい。
は配列を３′末端に含むオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドである。第２プライマーは所与のイオン強度条件及び
温度条件下に第２及び第３のDNA配列を特異的効率的に
合成せしめるに十分な特定の長さ及び塩基組成をもつ。
更に、第２プライマーは機能性プロモーターのアンチセ
ンス配列と転写開始部位のアンチセンス配列とを含む。
この配列は、第3DNA配列の合成用鋳型として使用された
とき、RNAポリメラーゼの特異的効率的結合と所望部位
での転写開始と行なわせるに十分な情報を含む。プロモ
ーター配列は機能性プロモーターのアンチセンス鎖に由
来してもよい。転写開始部位は天然RNA転写物の５′末
端配列に由来してもよい。好適実施態様においては、第
２プライマーの５′末端配列は、AATTCTAATACGACTCACTA
TAGGGAGである。この配列は、T7 RNAポリメラーゼ用の
プロモーターのアンチセンス配列と転写開始部位のアン
チセンス配列とを含む。または、別のファージRNAポリ
メラーゼ用の転写開始部位とプロモーターとを使用して
もよい。更に、プロモーター機能に関係しない配列が、
第２プライマーの５′末端に含まれるかまたは第２鋳型
にハイブリダイズする３′末端の配列と転写開始部位と
の間に含まれていてもよい。第２プライマーの一部また
は全部が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオ
チドまたはヌクレオチド類似体から構成されてもよい。
本発明で使用される酵素はすべて、いくつかの実用規
格を充足させる必要がある。酵素または酵素調製物の各
々は、ある種のDNAポリメラーゼ及び一重鎖または二重
鎖に特異的なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレア
ーゼにおいてしばしばみられる５′−または３′−のエ
キソヌクレアーゼ活性のような有害なデオキシリボヌク
レアーゼ（「DNase」）活性を有していてはならない。
酵素または酵素調製物の各々は、RNA及びDNAのハイブリ
ッドに特異的で好適なリボヌクレアーゼ活性（例えばリ
ボヌクレアーゼＨ）の添加を除いて、有害なリボヌクレ
アーゼ（「RNase」）活性を有してはならない。更に各
酵素は、その他の酵素過程、及びRNAまたはDNA鋳型にオ
リゴクレオチドプライマーをハイブリダイズするような
非酵素過程で使用される一般的な反応条件下で適当な程
度に活性でなければならない。
格を充足させる必要がある。酵素または酵素調製物の各
々は、ある種のDNAポリメラーゼ及び一重鎖または二重
鎖に特異的なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレア
ーゼにおいてしばしばみられる５′−または３′−のエ
キソヌクレアーゼ活性のような有害なデオキシリボヌク
レアーゼ（「DNase」）活性を有していてはならない。
酵素または酵素調製物の各々は、RNA及びDNAのハイブリ
ッドに特異的で好適なリボヌクレアーゼ活性（例えばリ
ボヌクレアーゼＨ）の添加を除いて、有害なリボヌクレ
アーゼ（「RNase」）活性を有してはならない。更に各
酵素は、その他の酵素過程、及びRNAまたはDNA鋳型にオ
リゴクレオチドプライマーをハイブリダイズするような
非酵素過程で使用される一般的な反応条件下で適当な程
度に活性でなければならない。
本発明で使用されるDNA依存性RNAポリメラーゼは、プ
ロモーターと指称される特定DNA配列に結合できかつプ
ロモーターに極めて近接した所定の開始部位でRNAのin
vitro合成を特異的に開始し得るいかなる酵素でもよ
い。プロモーター及び開始部位が第２プライマーの一部
を形成する。更に、RNAポリメラーゼは、適当な時間内
に鋳型の機能性コピー当たり数個のRNAコピーを合成し
得ることが必要である。好適実施態様では、バクテリオ
ファージT7 RNAポリメラーゼが使用される。更に別の、
バクテリオファージRNAポリメラーゼ、例えばファージT
3、ファージφ II、Salmonellaファージsp6またはPseud
omonasファージgh−１の使用も可能である。また別の実
施態様では、原核細胞または真核細胞DNA依存性RNAポリ
メラーゼを使用してもよい。別のRNAポリメラーゼを使
用する場合には、第２プライマーのプロモーターを配列
及び開始配列を特定RNAポリメラーゼの鋳型特異性に従
って適宜変更する必要がある。
ロモーターと指称される特定DNA配列に結合できかつプ
ロモーターに極めて近接した所定の開始部位でRNAのin
vitro合成を特異的に開始し得るいかなる酵素でもよ
い。プロモーター及び開始部位が第２プライマーの一部
を形成する。更に、RNAポリメラーゼは、適当な時間内
に鋳型の機能性コピー当たり数個のRNAコピーを合成し
得ることが必要である。好適実施態様では、バクテリオ
ファージT7 RNAポリメラーゼが使用される。更に別の、
バクテリオファージRNAポリメラーゼ、例えばファージT
3、ファージφ II、Salmonellaファージsp6またはPseud
omonasファージgh−１の使用も可能である。また別の実
施態様では、原核細胞または真核細胞DNA依存性RNAポリ
メラーゼを使用してもよい。別のRNAポリメラーゼを使
用する場合には、第２プライマーのプロモーターを配列
及び開始配列を特定RNAポリメラーゼの鋳型特異性に従
って適宜変更する必要がある。
本発明で使用されるRNA依存性DNA依存性DNAポリメラ
ーゼはオリゴデオキシボヌクレオチドプライマー及びRN
A鋳型からDNAを合成し得るいかなる酵素でもよい。この
酵素は更に、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性及びRNase
H活性を含んでいてもよい。好適実施態様においては、
トリ筋芽細胞ウイルスポリメラーゼ（「AMV逆転写酵
素」）が使用される。更に、RNA依存性DNAポリメラーゼ
が別のレトロウイルス、例えばモロニー（Maloney）マ
ウス白血病ウイルスに由来してもよい。または別の真核
細胞RNA依存性DNAポリメラーゼを使用してもよい。
ーゼはオリゴデオキシボヌクレオチドプライマー及びRN
A鋳型からDNAを合成し得るいかなる酵素でもよい。この
酵素は更に、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性及びRNase
H活性を含んでいてもよい。好適実施態様においては、
トリ筋芽細胞ウイルスポリメラーゼ（「AMV逆転写酵
素」）が使用される。更に、RNA依存性DNAポリメラーゼ
が別のレトロウイルス、例えばモロニー（Maloney）マ
ウス白血病ウイルスに由来してもよい。または別の真核
細胞RNA依存性DNAポリメラーゼを使用してもよい。
本発明で使用されるDNAポリメラーゼは、オリゴデオ
キシリボヌクレオチドプライマーとDNA鋳型とからDNAを
合成し得るいかなる酵素でもよい。この酵素は多くの種
類のDNAポリメラーゼに関連する５′−または３′−エ
キソヌクレアーゼ活性を有していてはならない。好適実
施態様ではAMV逆転写酵素が使用されるが、５′−また
は３′−のエキソヌクレアーゼ活性が本来欠如したDNA
依存性DNAポリメラーゼも使用できる。このようなポリ
メラーゼの例は、いくつかの真核細胞DNAポリメラー
ゼ、例えばDNAポリメラーゼαまたはβ、子ウシ胸線の
ごとき哺乳類組織から単離されるDNAポリメラーゼであ
る。普通なら不適当なDNAポリメラーゼも、DNAポリメラ
ーゼ遺伝子の変性と適当な宿主細胞中での変性ポリメラ
ーゼの発現とを順次行なうかまたDNAポリメラーゼタン
パク質を化学的に修飾することによって不要なエキソヌ
クレアーゼ活性を除去すれば有用になる。変性型のDNA
ポリメラーゼは、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ（Kl
enow）フラグメントから調製されてもよくまたはバクテ
リオファージT7 DNAポリメラーゼから調製されてもい。
好適実施態様においては、RNA依存性DNAポリメラーゼ活
性とDNA依存性DNAポリメラーゼ活性との双方が同じ酵素
によって与えられるので、前記のごとき変性型のDNA依
存性DNAポリメラーゼ活性は、RNA依存性DNAポリメラー
ゼに起因する活性の補足として付加されることが理解さ
れよう。
キシリボヌクレオチドプライマーとDNA鋳型とからDNAを
合成し得るいかなる酵素でもよい。この酵素は多くの種
類のDNAポリメラーゼに関連する５′−または３′−エ
キソヌクレアーゼ活性を有していてはならない。好適実
施態様ではAMV逆転写酵素が使用されるが、５′−また
は３′−のエキソヌクレアーゼ活性が本来欠如したDNA
依存性DNAポリメラーゼも使用できる。このようなポリ
メラーゼの例は、いくつかの真核細胞DNAポリメラー
ゼ、例えばDNAポリメラーゼαまたはβ、子ウシ胸線の
ごとき哺乳類組織から単離されるDNAポリメラーゼであ
る。普通なら不適当なDNAポリメラーゼも、DNAポリメラ
ーゼ遺伝子の変性と適当な宿主細胞中での変性ポリメラ
ーゼの発現とを順次行なうかまたDNAポリメラーゼタン
パク質を化学的に修飾することによって不要なエキソヌ
クレアーゼ活性を除去すれば有用になる。変性型のDNA
ポリメラーゼは、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ（Kl
enow）フラグメントから調製されてもよくまたはバクテ
リオファージT7 DNAポリメラーゼから調製されてもい。
好適実施態様においては、RNA依存性DNAポリメラーゼ活
性とDNA依存性DNAポリメラーゼ活性との双方が同じ酵素
によって与えられるので、前記のごとき変性型のDNA依
存性DNAポリメラーゼ活性は、RNA依存性DNAポリメラー
ゼに起因する活性の補足として付加されることが理解さ
れよう。
本発明で使用され得るRNase Hは相補的DNAにアニール
されるRNAを加水分解し得るいかなる酵素でもよい。こ
の酵素は、一重鎖または二重鎖のRNAまたはいかなるDNA
も加水分解してはならない。好適実施態様においては、
大腸菌RNase Hを使用する。更に別のRNase H酵素、例え
ば子ウシ胸腺RNase Hの使用も可能である。RNase HはAM
V逆転写酵素の固有活性であるから、好適実施態様では
大腸菌RNase HにAMV逆転写酵素のRNase Hが付加され
る。また第１鋳型から第２鋳型を分離し得る別のいかな
る酵素を使用してもよい。
されるRNAを加水分解し得るいかなる酵素でもよい。こ
の酵素は、一重鎖または二重鎖のRNAまたはいかなるDNA
も加水分解してはならない。好適実施態様においては、
大腸菌RNase Hを使用する。更に別のRNase H酵素、例え
ば子ウシ胸腺RNase Hの使用も可能である。RNase HはAM
V逆転写酵素の固有活性であるから、好適実施態様では
大腸菌RNase HにAMV逆転写酵素のRNase Hが付加され
る。また第１鋳型から第２鋳型を分離し得る別のいかな
る酵素を使用してもよい。
DNA合成及びRNA合成の双方にとって必要な緩衝液及び
補因子を入れた反応容器で前記酵素とプライマーとを一
緒に混合する。更に当業者に公知のごとくDNA及びDNA鋳
型にプライマーを特異的にハイブリダイズさせるための
適当なイオン条件及び反応温度を与える。反応混合物
は、増幅方法を妨害する物質、例えば酵素の活性を大幅
に阻害するかプライマーと鋳型とのハイブリダイズを妨
害するかまたは核酸中間体及び産生物を非産生的に分解
させる物質を含んでいてはならない。
補因子を入れた反応容器で前記酵素とプライマーとを一
緒に混合する。更に当業者に公知のごとくDNA及びDNA鋳
型にプライマーを特異的にハイブリダイズさせるための
適当なイオン条件及び反応温度を与える。反応混合物
は、増幅方法を妨害する物質、例えば酵素の活性を大幅
に阻害するかプライマーと鋳型とのハイブリダイズを妨
害するかまたは核酸中間体及び産生物を非産生的に分解
させる物質を含んでいてはならない。
増幅方法の応用に役立つと思われるいくつかの検出手
順を説明する。本増幅方法で合成された核酸の検出手段
が記憶の手順に限定されないこと、別の検出方法の使用
が可能であることが理解されよう。
順を説明する。本増幅方法で合成された核酸の検出手段
が記憶の手順に限定されないこと、別の検出方法の使用
が可能であることが理解されよう。
検出手順の１つの実施態様においては、反応混合物に
標識前駆体を添加し得る。当業者に公知の方法を用いて
標識前躯体から分離できる標識産生物の定量分析または
定性分析によって増幅が検出される。
標識前駆体を添加し得る。当業者に公知の方法を用いて
標識前躯体から分離できる標識産生物の定量分析または
定性分析によって増幅が検出される。
標識前躯体は、RNA合成を検出するリボヌクレオシド
三リン酸でもよく、またDNA合成を検出するデオキシヌ
クレオシド三リン酸またはオリゴヌクレオチドプライマ
ーでもよい。標識のタイプは放射性同位体でもよく、ま
たはビオチンのごとき有用な化学基、発色団、蛍光発色
団または抗体に結合し得るハプテンでもよく、またはタ
ンパクまたは酵素でもよい。標識産生物は溶解度、電荷
またはサイズに基づいて標識前躯体から分離されてもよ
い。更に、標識DNAまたはRNAを、相補配列を含み固定化
することが可能な核酸にハイブリダイズしてもよい。
三リン酸でもよく、またDNA合成を検出するデオキシヌ
クレオシド三リン酸またはオリゴヌクレオチドプライマ
ーでもよい。標識のタイプは放射性同位体でもよく、ま
たはビオチンのごとき有用な化学基、発色団、蛍光発色
団または抗体に結合し得るハプテンでもよく、またはタ
ンパクまたは酵素でもよい。標識産生物は溶解度、電荷
またはサイズに基づいて標識前躯体から分離されてもよ
い。更に、標識DNAまたはRNAを、相補配列を含み固定化
することが可能な核酸にハイブリダイズしてもよい。
別の実施態様においては、増幅方法の産生物が固定化
担体に結合され、相補配列を含む核酸プローブにハイブ
リダイズされ、さらに溶液中に残存する非ハイブリダイ
ズ核酸プローブから分離され得る。産生物たるDNAまた
はRNAは、踈水的、静電的または共有的相互作用のよう
な安定な相互作用によって固体担体に直接結合されても
よい。更に、産生物は、固定化タンパク質（例えばアビ
ジンまたはストレプトアジビン）に結合させるごとき増
幅方法では、その産生物中に取り込まれ得るビオチンの
ようなある種の化学基を含んでもよい。更に産生物は、
相補配列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリ
ダイズされてもよい。核酸プローブは、ハイブリダイゼ
ーション条件下に結合を生起しかつ非ハイブリダイズ核
酸プローブの除去に使用される条件下で持続的に結合さ
せるために増幅方法の産生物と十分に安定な相互作用を
形成する相補配列を含む。好適実施態様において、相補
配列は第１プライマー配列と第２プライマー配列との間
に存在する特定核酸配列の配列部分に由来する。核酸プ
ローブは、一重鎖DNAまたはRNAでもよく、または一重鎖
にできる二重鎖DNAまたはRNAでもよく、またはデオキシ
リボヌクレオチド及び／またはリボヌクレオチドから構
成され得るオリゴヌクレオチドでもよい。更に、核酸プ
ローブは、適当な条件下にDNA産物またはRNA産物に共有
結合し得る化学基を含んでいてもよい。放射性同位体、
ビオチンのごとき有用な化学基、発色団、蛍光発色団ま
たは抗体に結合し得るハプテンで核酸プローブを標識し
てもよい。核酸プローブは更に、タンパク質またはホス
ファターゼ、ペルオキシダーゼのごとき酵素との複合体
を形成し得る。核酸プローブは更にプローブをin vitro
複製し得るある種の配列を含んでいてもよい。
担体に結合され、相補配列を含む核酸プローブにハイブ
リダイズされ、さらに溶液中に残存する非ハイブリダイ
ズ核酸プローブから分離され得る。産生物たるDNAまた
はRNAは、踈水的、静電的または共有的相互作用のよう
な安定な相互作用によって固体担体に直接結合されても
よい。更に、産生物は、固定化タンパク質（例えばアビ
ジンまたはストレプトアジビン）に結合させるごとき増
幅方法では、その産生物中に取り込まれ得るビオチンの
ようなある種の化学基を含んでもよい。更に産生物は、
相補配列を含み固定化することが可能な核酸にハイブリ
ダイズされてもよい。核酸プローブは、ハイブリダイゼ
ーション条件下に結合を生起しかつ非ハイブリダイズ核
酸プローブの除去に使用される条件下で持続的に結合さ
せるために増幅方法の産生物と十分に安定な相互作用を
形成する相補配列を含む。好適実施態様において、相補
配列は第１プライマー配列と第２プライマー配列との間
に存在する特定核酸配列の配列部分に由来する。核酸プ
ローブは、一重鎖DNAまたはRNAでもよく、または一重鎖
にできる二重鎖DNAまたはRNAでもよく、またはデオキシ
リボヌクレオチド及び／またはリボヌクレオチドから構
成され得るオリゴヌクレオチドでもよい。更に、核酸プ
ローブは、適当な条件下にDNA産物またはRNA産物に共有
結合し得る化学基を含んでいてもよい。放射性同位体、
ビオチンのごとき有用な化学基、発色団、蛍光発色団ま
たは抗体に結合し得るハプテンで核酸プローブを標識し
てもよい。核酸プローブは更に、タンパク質またはホス
ファターゼ、ペルオキシダーゼのごとき酵素との複合体
を形成し得る。核酸プローブは更にプローブをin vitro
複製し得るある種の配列を含んでいてもよい。
分子クローニング技術によって進歩した典型的核酸処
理方法によって本増幅方法の産生物を分析することが可
能である。１つの方法では、合成DNAを制限エンドヌク
レアーゼで分解し、電気泳動法で分離し、当業界で公知
の方法で検出することによって特定DNA配列の合成を検
出し得る。別の方法では、RNA依存性DNAポリメラーゼと
第１プライマーとジデオキシヌクレオシド三リン酸とを
用いたDNA合成によって、増幅RNAの配列を決定し得る
（Stoflet等、1988）。更に別の方法では、本増幅方法
で使用したDNA依存性RNAポリメラーゼと３′−デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸とを用いたRNA合成によって
増幅された第３鋳型の配列を決定し得る（Axelrod ＆ K
ramer、1985）。別の方法においては増幅RNAがin vitro
翻訳され得るポリペプチドをコードするであろう。in v
itro翻訳されたポリペプチド産生物は抗体を用いて分析
され得る。
理方法によって本増幅方法の産生物を分析することが可
能である。１つの方法では、合成DNAを制限エンドヌク
レアーゼで分解し、電気泳動法で分離し、当業界で公知
の方法で検出することによって特定DNA配列の合成を検
出し得る。別の方法では、RNA依存性DNAポリメラーゼと
第１プライマーとジデオキシヌクレオシド三リン酸とを
用いたDNA合成によって、増幅RNAの配列を決定し得る
（Stoflet等、1988）。更に別の方法では、本増幅方法
で使用したDNA依存性RNAポリメラーゼと３′−デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸とを用いたRNA合成によって
増幅された第３鋳型の配列を決定し得る（Axelrod ＆ K
ramer、1985）。別の方法においては増幅RNAがin vitro
翻訳され得るポリペプチドをコードするであろう。in v
itro翻訳されたポリペプチド産生物は抗体を用いて分析
され得る。
特定核酸配列を合成すると予想されるかまたは含有す
ることが判明している標本を、均質な連続増幅が可能な
鋳型核酸の形態で反応混合物に添加する。この反応混合
物は第１図のサイクル中のいかなる中間体でもよい。特
に、鋳型核酸は、第２プライマーの３′末端に存在する
配列と十分に相同の配列を５′末端に含み、かつ第１プ
ライマーに十分に相補的な配列を含む一重鎖RNAでもよ
い。この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第１鋳型とし
て機能するであろう。または、中型核酸は、第２プライ
マーの少なくとも３′末端と十分に相補的な配列を３′
末端に含みかつ第１プライマーの３′末端に存在する配
列に十分に相互の配列を含む一重鎖DNAでもよい。この
形態の鋳型核酸は本増幅方法では第２鋳型として機能す
るであろう。または鋳型核酸は、一方の鎖が５′末端に
第２プライマーの完全配列を含みかつ第１プライマーと
十分に相補的な配列を含む二重鎖DNAでもよい。二重鎖D
NAは本増幅方法では第３鋳型として機能する。
ることが判明している標本を、均質な連続増幅が可能な
鋳型核酸の形態で反応混合物に添加する。この反応混合
物は第１図のサイクル中のいかなる中間体でもよい。特
に、鋳型核酸は、第２プライマーの３′末端に存在する
配列と十分に相同の配列を５′末端に含み、かつ第１プ
ライマーに十分に相補的な配列を含む一重鎖RNAでもよ
い。この形態の鋳型核酸は本増幅方法では第１鋳型とし
て機能するであろう。または、中型核酸は、第２プライ
マーの少なくとも３′末端と十分に相補的な配列を３′
末端に含みかつ第１プライマーの３′末端に存在する配
列に十分に相互の配列を含む一重鎖DNAでもよい。この
形態の鋳型核酸は本増幅方法では第２鋳型として機能す
るであろう。または鋳型核酸は、一方の鎖が５′末端に
第２プライマーの完全配列を含みかつ第１プライマーと
十分に相補的な配列を含む二重鎖DNAでもよい。二重鎖D
NAは本増幅方法では第３鋳型として機能する。
鋳型核酸の調製は本増幅方法の一部を構成しないが、
増幅方法の応用に役立つと思われる鋳型核酸形成手順の
幾つかの例を以下に説明する。しかしながら鋳型核酸形
成手順が記載の種々の手順に限定されることなく別の方
法も使用できることは理解されよう。
増幅方法の応用に役立つと思われる鋳型核酸形成手順の
幾つかの例を以下に説明する。しかしながら鋳型核酸形
成手順が記載の種々の手順に限定されることなく別の方
法も使用できることは理解されよう。
鋳型核酸形成手順の１つの例においては、第１鋳型と
して機能し得る鋳型核酸は、天然由来RNAであるかまた
は当業界で公知の部位特異的加水分解法（Shibahara
等、1987）を用いてより大きいRNA分子から生成され得
るRNAフラグメントであり得る。
して機能し得る鋳型核酸は、天然由来RNAであるかまた
は当業界で公知の部位特異的加水分解法（Shibahara
等、1987）を用いてより大きいRNA分子から生成され得
るRNAフラグメントであり得る。
別の例においては、第２鋳型として機能し得る鋳型核
酸は、第２プライマーの３′末端に十分に相補的な配列
に直接つながり（flanking）、制限エンドヌクレアーゼ
で消化し得る部位をもつ二重鎖DNAから調製され得る。
酸は、第２プライマーの３′末端に十分に相補的な配列
に直接つながり（flanking）、制限エンドヌクレアーゼ
で消化し得る部位をもつ二重鎖DNAから調製され得る。
更に別の例においては、第２鋳型として機能し得る鋳
型核酸は、DNA合成を阻止し得るオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズさせた一重鎖DNAまたはRNAから調製され
る。この素子オリゴヌクレチオドは適当な条件下に鋳型
に共有結合し得る化学基を含んでもよい。第１プライマ
ーを使用してこの阻止された鋳型からDNAを合成すると
第２鋳型と同じ３′末端をもつ合成DNAが得られる。出
発鋳型がRNAのとき、得られるDNA−RNAハイブリッドは
鋳型核酸として直接使用され得る。出発鋳型がDNAのと
き、得られた第２鋳型のコピーは化学的または熱的変性
方法によって出発鋳型から分離され得る。
型核酸は、DNA合成を阻止し得るオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズさせた一重鎖DNAまたはRNAから調製され
る。この素子オリゴヌクレチオドは適当な条件下に鋳型
に共有結合し得る化学基を含んでもよい。第１プライマ
ーを使用してこの阻止された鋳型からDNAを合成すると
第２鋳型と同じ３′末端をもつ合成DNAが得られる。出
発鋳型がRNAのとき、得られるDNA−RNAハイブリッドは
鋳型核酸として直接使用され得る。出発鋳型がDNAのと
き、得られた第２鋳型のコピーは化学的または熱的変性
方法によって出発鋳型から分離され得る。
別の例においては、第３鋳型として機能する鋳型核酸
は、第２プライマーを用いてDNAまたはRNA鋳型からDNA
合成された一重鎖DNAまたはRNAから調製される。得られ
た合成DNAを化学的または熱的変性方法を用いて出発鋳
型から分離する。更に、化学的または酵素的方法を用い
てRNA鋳型を加水分解する。得られた一重鎖DNAは５′末
端に共有結合した第２プライマーの配列をもちかつ第１
プライマーに十分に相補的は配列を含む。一重鎖DNAに
第１プライマーをハイブリダイズし、さらに第１プライ
マーに共有結合しかつ一重鎖DNAに相補的なDNA配列を合
成することによって、この一重鎖DNAを転写機能をもつ
二重鎖DNAに変換し得る。
は、第２プライマーを用いてDNAまたはRNA鋳型からDNA
合成された一重鎖DNAまたはRNAから調製される。得られ
た合成DNAを化学的または熱的変性方法を用いて出発鋳
型から分離する。更に、化学的または酵素的方法を用い
てRNA鋳型を加水分解する。得られた一重鎖DNAは５′末
端に共有結合した第２プライマーの配列をもちかつ第１
プライマーに十分に相補的は配列を含む。一重鎖DNAに
第１プライマーをハイブリダイズし、さらに第１プライ
マーに共有結合しかつ一重鎖DNAに相補的なDNA配列を合
成することによって、この一重鎖DNAを転写機能をもつ
二重鎖DNAに変換し得る。
さら別の例においては、化学的、熱的または任意に酵
素的方法を用いて二重鎖DNA、二重鎖RNAまたはDNA−RNA
ハイブリッドから一重鎖DNAまたはRNA鋳型を得ることが
できる。次に、前述の鋳型核酸形成手順のいずれかを用
い、得られた一重鎖DNAまたはRNAから第１、第２または
第３の鋳型として機能する鋳型核酸を生成する。また、
第１プライマー及び核酸の一方の鎖が関与する手順と第
２プライマー及び核酸の他方の（相補）鎖が関与する別
の手順とを同時に使用して鋳型核酸を調製することも可
能である。
素的方法を用いて二重鎖DNA、二重鎖RNAまたはDNA−RNA
ハイブリッドから一重鎖DNAまたはRNA鋳型を得ることが
できる。次に、前述の鋳型核酸形成手順のいずれかを用
い、得られた一重鎖DNAまたはRNAから第１、第２または
第３の鋳型として機能する鋳型核酸を生成する。また、
第１プライマー及び核酸の一方の鎖が関与する手順と第
２プライマー及び核酸の他方の（相補）鎖が関与する別
の手順とを同時に使用して鋳型核酸を調製することも可
能である。
材料及び方法 材料 Applied Biosystems380A DNAシンセサイザーを使用し
てオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド
合成に使用したカラム、ホスフォラミジット（phosphor
amidites）及び試薬はTech−nical Marketing Associat
esを介してApplied Biosystems,Inc.から入手した。ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動泳びDEAEセルロースロマ
トグラフィーを順次用いてオリゴヌクレオチドを精製し
た。放射性同位体［α−32P］UTP（800Ci/mmol）はAmer
shamから入手した。DNAを分離及び結合させる酵素はNew
England Biolabsから購入した製造業者の使用説明書通
りに使用した。DNAポリメラーゼ１（Klenow）の大フラ
グメントを含む調製物もNew England Biolabsから購入
した。RNasin及びT7 RNAポリメラーゼはBio/Can Scient
ific Inc.を介してPromege Biotesから購入した。逆転
写酵素及びRNase HはPharmaciaから入手した。プロテイ
ナーゼＫはBoehringer Mannheim Canadaから入手した。
すべての形質転換に大腸菌HB101株（ATCC33694）を使用
した。プラスミドpUC19（Norrander等、1983）はBethes
de Research Laboratoriesから購入した。
てオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド
合成に使用したカラム、ホスフォラミジット（phosphor
amidites）及び試薬はTech−nical Marketing Associat
esを介してApplied Biosystems,Inc.から入手した。ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動泳びDEAEセルロースロマ
トグラフィーを順次用いてオリゴヌクレオチドを精製し
た。放射性同位体［α−32P］UTP（800Ci/mmol）はAmer
shamから入手した。DNAを分離及び結合させる酵素はNew
England Biolabsから購入した製造業者の使用説明書通
りに使用した。DNAポリメラーゼ１（Klenow）の大フラ
グメントを含む調製物もNew England Biolabsから購入
した。RNasin及びT7 RNAポリメラーゼはBio/Can Scient
ific Inc.を介してPromege Biotesから購入した。逆転
写酵素及びRNase HはPharmaciaから入手した。プロテイ
ナーゼＫはBoehringer Mannheim Canadaから入手した。
すべての形質転換に大腸菌HB101株（ATCC33694）を使用
した。プラスミドpUC19（Norrander等、1983）はBethes
de Research Laboratoriesから購入した。
DNAの単離及び配列決定 50μg/mlのアンピシリンを含むYT培地（Miller、197
2）で大腸菌形質転換媒体を増殖させた。高速沸騰法（H
olmes ＆ Quigley、1981）によってプラスミドDNAを精
製した。すべての構築に使用したDNAフラグメント及び
ベクターを低融点アガロース電気泳動で分離し、フェノ
ール抽出及びエタノール沈殿によって溶解アガロースか
ら精製した（Mania−tis等、1982）。ジデオキシ法（Sa
nger等、1977）の修正方法（Hattori等、1985）を用い
てプラスミドDNA配列決定した。反応開始のために−20
ユニバーサルプライマー（New England Biolabs）を使
用した。
2）で大腸菌形質転換媒体を増殖させた。高速沸騰法（H
olmes ＆ Quigley、1981）によってプラスミドDNAを精
製した。すべての構築に使用したDNAフラグメント及び
ベクターを低融点アガロース電気泳動で分離し、フェノ
ール抽出及びエタノール沈殿によって溶解アガロースか
ら精製した（Mania−tis等、1982）。ジデオキシ法（Sa
nger等、1977）の修正方法（Hattori等、1985）を用い
てプラスミドDNA配列決定した。反応開始のために−20
ユニバーサルプライマー（New England Biolabs）を使
用した。
TCA沈殿 増幅反応のアリコート（５μ）20μの10mMのEDTA
中で制止し、一定時間おきのすべての標本の収集が終わ
るまで氷上に維持した。次に制止された標本をガラスフ
ィルターディスクに塗布し、直ちに氷冷５％トリクロロ
酢酸（TCA）−１％のピロリン酸ナトリウム中に浸し込
み、10分間ときどき撹拌した。次に氷冷５％TCAで５分
間ずつ２回洗浄し、95％エタノールで更に２回洗浄し、
凍結によって乾固した。液体シンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定した。
中で制止し、一定時間おきのすべての標本の収集が終わ
るまで氷上に維持した。次に制止された標本をガラスフ
ィルターディスクに塗布し、直ちに氷冷５％トリクロロ
酢酸（TCA）−１％のピロリン酸ナトリウム中に浸し込
み、10分間ときどき撹拌した。次に氷冷５％TCAで５分
間ずつ２回洗浄し、95％エタノールで更に２回洗浄し、
凍結によって乾固した。液体シンチレーションカウンタ
ーで放射活性を測定した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動 標本（１〜６μ）を４〜５μのホルムアミド染料
（90％脱イオンホルムアミド、10mMのTrisHCl（pH8.
0）、1mMのEDTA、キシレンシアノール及びブロモフェノ
ールブルー）と混合し、電圧印加前（pre−run）の12cm
長さの７％変性ポリアクリルアミドゲルに塗布した。ブ
ロモフェノールブルー染料が底部に到達するまでゲルに
350ボルトを印加した。いくつかの場合にはオートラジ
オグラフィーにかける前にゲルを固定しかつ乾燥した。
固定は10％メタノール−７％酢酸中で15分間洗浄して行
った。この方法で分離されたRNA産物のプロフィルはオ
ートラジオグラフィーによって室温で可視化した。
（90％脱イオンホルムアミド、10mMのTrisHCl（pH8.
0）、1mMのEDTA、キシレンシアノール及びブロモフェノ
ールブルー）と混合し、電圧印加前（pre−run）の12cm
長さの７％変性ポリアクリルアミドゲルに塗布した。ブ
ロモフェノールブルー染料が底部に到達するまでゲルに
350ボルトを印加した。いくつかの場合にはオートラジ
オグラフィーにかける前にゲルを固定しかつ乾燥した。
固定は10％メタノール−７％酢酸中で15分間洗浄して行
った。この方法で分離されたRNA産物のプロフィルはオ
ートラジオグラフィーによって室温で可視化した。
実施例１ gag試験系用オリゴヌクレオチドの設計及び合成 EcoR I部位と、T7ファージプロモーターと、T7 RNAポ
リメラーゼによる転写開始に必要な配列と、19bpのハイ
ブリダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション領域
１）とを含むように合成DNA配列を設計した（第2A
図）。これらの構成要素のクローニングに関与する47b
のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（T7H1.GAC）は第
１プライマーとしても機能する。ハイブリダイゼーショ
ン領域２はハイブリダイゼーション領域１から53bpを隔
てており長さ20bpである。この領域（H2.GAC）に対して
形成されるプライマーは20bのセンスオリゴヌクレオチ
ド鎖の重複でありクローニングには使用されない。ハイ
ブリダイゼーション領域全体を含む配列はエイズの原因
物質であるHTLV−IIIゲノムのgag部分の92bpのセグメン
トである。この特定遺伝子セグメントを選択した理由
は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想され
たこと及び２つのハイブリダイゼーション領域間に間隔
が比較的短いことにある。更に、クローニングを容易に
するために配列の末端にXba I部位を配置した。gag試験
配列はまた、組換え体のスクリーニングを容易にするSa
h I部位及びPst I部位を含む。
リメラーゼによる転写開始に必要な配列と、19bpのハイ
ブリダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション領域
１）とを含むように合成DNA配列を設計した（第2A
図）。これらの構成要素のクローニングに関与する47b
のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（T7H1.GAC）は第
１プライマーとしても機能する。ハイブリダイゼーショ
ン領域２はハイブリダイゼーション領域１から53bpを隔
てており長さ20bpである。この領域（H2.GAC）に対して
形成されるプライマーは20bのセンスオリゴヌクレオチ
ド鎖の重複でありクローニングには使用されない。ハイ
ブリダイゼーション領域全体を含む配列はエイズの原因
物質であるHTLV−IIIゲノムのgag部分の92bpのセグメン
トである。この特定遺伝子セグメントを選択した理由
は、プライマーが有効にハイブリダイズすると予想され
たこと及び２つのハイブリダイゼーション領域間に間隔
が比較的短いことにある。更に、クローニングを容易に
するために配列の末端にXba I部位を配置した。gag試験
配列はまた、組換え体のスクリーニングを容易にするSa
h I部位及びPst I部位を含む。
このフラグメントのクローイングにおいては合計４つ
のオリゴヌクレオチドを使用した。gag試験配列及びgag
2試験配列の構築に使用したN1.GAGはアンチセンス鎖を
完成させクローニング過程でのみ使用される。また、T7
4.PROはT7プロモーターのセンス鎖成分である。しかし
ながら、N2.GAGは双方の試験フラグメントの構築に使用
され、また増幅サイクルの２つの段階の中間体（第２鋳
型）として使用された。完全にクローニングされたgag
試験フラグメントはまた、増幅サイクルの中間体（第３
鋳型）を構成し得る。適当なベクター中でクローニング
されるとgag試験DNAはT7 RNAポリメラーゼによって転写
され、３つの段階に関与する増幅中間体として有用なRN
Aフラグメント（第１鋳型）を産生する。更にT7H1.GAG
及びH2.GAGは試験系のプライマーとしても機能する。
のオリゴヌクレオチドを使用した。gag試験配列及びgag
2試験配列の構築に使用したN1.GAGはアンチセンス鎖を
完成させクローニング過程でのみ使用される。また、T7
4.PROはT7プロモーターのセンス鎖成分である。しかし
ながら、N2.GAGは双方の試験フラグメントの構築に使用
され、また増幅サイクルの２つの段階の中間体（第２鋳
型）として使用された。完全にクローニングされたgag
試験フラグメントはまた、増幅サイクルの中間体（第３
鋳型）を構成し得る。適当なベクター中でクローニング
されるとgag試験DNAはT7 RNAポリメラーゼによって転写
され、３つの段階に関与する増幅中間体として有用なRN
Aフラグメント（第１鋳型）を産生する。更にT7H1.GAG
及びH2.GAGは試験系のプライマーとしても機能する。
gag2試験合成DNAフラグメント（第2B図）はT7プロモ
ーターを含まないが配列の残りの部分はgag試験配列と
同じであり、従ってN1.GAG及び2.GAGの双方がその構築
に関与した。アンチセンス鎖の完成に必要なオリゴヌク
レオチドをH1.GAGと指称する。一旦クローニングされる
と、gag2試験フラグメントはDNA制限フラグメントを鋳
型核酸として用いながら増幅を試験する鋳型として使用
できる。
ーターを含まないが配列の残りの部分はgag試験配列と
同じであり、従ってN1.GAG及び2.GAGの双方がその構築
に関与した。アンチセンス鎖の完成に必要なオリゴヌク
レオチドをH1.GAGと指称する。一旦クローニングされる
と、gag2試験フラグメントはDNA制限フラグメントを鋳
型核酸として用いながら増幅を試験する鋳型として使用
できる。
実施例２ gag試験プラスミドの構築 70mMのTris HCl（pH7.6）と10mMのMgCl2と5mMのDTTと
0.5mMのATPと５単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼとを
含む20μ反応物中でオリゴヌクレオチドT74.PRO及びN
1.GAG（各２μｇ）を別々に37℃で30分間リン酸化し
た。リン酸化したT74.PRO及びN1.GAG（各10μ）を各
１μｇの非リン酸化T7H1.GAG及びN2.GAGと３μの100m
MのTris HCl（pH7.8）−500mMのNaClと混合しgag試験ア
センブリ用の最終容量29μにした。gag2試験混合物は
10μのリン酸化N1.GAGと各１μｇの非リン酸化H1.GAG
及びN2.GAGと1.8μの100mMのTrisHCl（pH7.8）−500m
MのNaClとを最終容量18μ中に含んでいた。90℃で10
分間維持し10〜16時間でゆっくりと室温まで放冷するこ
とによってオリゴヌクレオチド混合物を別々にハイブリ
ダイズさせた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド
を結合するために50mMのTris HCl（pH7.8）と10mMのMgC
l2と20mMのDTTと1mMのATPと50μg/mlのBSAとを含む60μ
の反応物を使用した。gag試験反応物には400単位のT4
DNAリガーゼを添加し15℃で２時間インキュベートし
た。gag2試験反応物は200単位のT4 DNAリガーゼと供に1
4〜16時間インキュベートした。
0.5mMのATPと５単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼとを
含む20μ反応物中でオリゴヌクレオチドT74.PRO及びN
1.GAG（各２μｇ）を別々に37℃で30分間リン酸化し
た。リン酸化したT74.PRO及びN1.GAG（各10μ）を各
１μｇの非リン酸化T7H1.GAG及びN2.GAGと３μの100m
MのTris HCl（pH7.8）−500mMのNaClと混合しgag試験ア
センブリ用の最終容量29μにした。gag2試験混合物は
10μのリン酸化N1.GAGと各１μｇの非リン酸化H1.GAG
及びN2.GAGと1.8μの100mMのTrisHCl（pH7.8）−500m
MのNaClとを最終容量18μ中に含んでいた。90℃で10
分間維持し10〜16時間でゆっくりと室温まで放冷するこ
とによってオリゴヌクレオチド混合物を別々にハイブリ
ダイズさせた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド
を結合するために50mMのTris HCl（pH7.8）と10mMのMgC
l2と20mMのDTTと1mMのATPと50μg/mlのBSAとを含む60μ
の反応物を使用した。gag試験反応物には400単位のT4
DNAリガーゼを添加し15℃で２時間インキュベートし
た。gag2試験反応物は200単位のT4 DNAリガーゼと供に1
4〜16時間インキュベートした。
ポリリンカー領域内部の制限酵素部位で切断すること
によって直線化しておいたプラスミドpUC19と単離し精
製した合成DNAセグメントとを混合した。T4 DNAリガー
ゼを使用してgag試験配列をpUC19のEcoR I−Xba Iフラ
グメントに結合した。またgag2試験配列をSma I−Xba I
フラグメントに結合した。これらの反応後に得られた形
質転換体に由来のプラスミドDNAを使用して大腸菌を形
質転換し、制限分析によってスクリーニングし、配列解
析によって最終プラスミド（pGAG.TEST及びpGAGL2.TES
T）が正しいことを決定した。
によって直線化しておいたプラスミドpUC19と単離し精
製した合成DNAセグメントとを混合した。T4 DNAリガー
ゼを使用してgag試験配列をpUC19のEcoR I−Xba Iフラ
グメントに結合した。またgag2試験配列をSma I−Xba I
フラグメントに結合した。これらの反応後に得られた形
質転換体に由来のプラスミドDNAを使用して大腸菌を形
質転換し、制限分析によってスクリーニングし、配列解
析によって最終プラスミド（pGAG.TEST及びpGAGL2.TES
T）が正しいことを決定した。
実施例３ RNA増幅に対するプライマー濃度の影響 gag試験オリゴヌクレオチドから転写されたRNAを増幅
するために使用された反応混合物（25μ）は50mMのTr
is HCl（pH8.45）と6mMのMgCNl2と40mMのKClと10mMのジ
チオスレイトールと0.5mMのNTP（ATP,CTP,GTP,UTP）と1
mMのdNTP（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）と20単位のRNasinと1
0単位のT7 RNAポリメラーゼと10単位のT7 RNAポリメラ
ーゼト10単位の逆転写酵素と0.4単位のRNase Hと10μCi
の［α−32P］UTPとを含有していた。２つの反応物は0.
5ng（0.015pmoles）のN2.GAGを含み、一方他の２つの反
応物は鋳型を含んでいなかった。プライマーT7H1.GAG及
びH2.GAGの各々を最終濃度3.4μＭまたは0.3μＭでN2.G
AG含有または鋳型非含有の反応物に添加した。反応物を
42℃で２時間インキュベートした。30分毎にTCA不溶cpm
の取込みを測定することによってRNA総合成量をモニタ
した。鋳型依存性RNA合成に対するプライマー濃度の影
響を表Ｉに示す。等量の合成RNAを含有する各反応のア
リコートをPAGE及びオートラジオグラフィーによって分
析した（第３図、反応と同じ番号レーン１〜４）。
するために使用された反応混合物（25μ）は50mMのTr
is HCl（pH8.45）と6mMのMgCNl2と40mMのKClと10mMのジ
チオスレイトールと0.5mMのNTP（ATP,CTP,GTP,UTP）と1
mMのdNTP（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）と20単位のRNasinと1
0単位のT7 RNAポリメラーゼと10単位のT7 RNAポリメラ
ーゼト10単位の逆転写酵素と0.4単位のRNase Hと10μCi
の［α−32P］UTPとを含有していた。２つの反応物は0.
5ng（0.015pmoles）のN2.GAGを含み、一方他の２つの反
応物は鋳型を含んでいなかった。プライマーT7H1.GAG及
びH2.GAGの各々を最終濃度3.4μＭまたは0.3μＭでN2.G
AG含有または鋳型非含有の反応物に添加した。反応物を
42℃で２時間インキュベートした。30分毎にTCA不溶cpm
の取込みを測定することによってRNA総合成量をモニタ
した。鋳型依存性RNA合成に対するプライマー濃度の影
響を表Ｉに示す。等量の合成RNAを含有する各反応のア
リコートをPAGE及びオートラジオグラフィーによって分
析した（第３図、反応と同じ番号レーン１〜４）。
反応１は最大量の同位体取込みを示したが、対照鋳型
である反応２も高い取込み率（反応１の73％）を示し、
極めて類似した電気泳動プロフィルを示した。従って、
高濃度プライマー存在中の増幅においては鋳型が全く存
在しなくても、予想されたサイズと等しいサイズのRNA
転写物が産生される。1/10のプライマー濃度の標本を使
用して得られた結果は顕著な違いを示した。反応３で産
生されたRNAの量は反応４の2.6倍であるが、反応３にお
いては質実的に全部の転写物が予想されたサイズの単一
バンド中に検出され、反応４においては60〜70bを上回
るフラグメントは検出されなかった。従ってプライマー
濃度はRNA増幅の正確度及び効率に重要な役割を果た
す。
である反応２も高い取込み率（反応１の73％）を示し、
極めて類似した電気泳動プロフィルを示した。従って、
高濃度プライマー存在中の増幅においては鋳型が全く存
在しなくても、予想されたサイズと等しいサイズのRNA
転写物が産生される。1/10のプライマー濃度の標本を使
用して得られた結果は顕著な違いを示した。反応３で産
生されたRNAの量は反応４の2.6倍であるが、反応３にお
いては質実的に全部の転写物が予想されたサイズの単一
バンド中に検出され、反応４においては60〜70bを上回
るフラグメントは検出されなかった。従ってプライマー
濃度はRNA増幅の正確度及び効率に重要な役割を果た
す。
増幅系による産生が予想されるフラグメントのサイズ
を示すために試験プラスミドからの転写によって対照RN
A転写物を調製した（第３図のレーン０）。pGAG.TESTを
Xba Iで切断して直線化し、プロテイナーゼＫで処理し
（Maniatis等、1982）、フェノール抽出し、エタノール
沈殿した。次にT7 RNAポリメラーゼを製造業者の使用説
明書通りに使用し、0.5μｇの得られたフラグメントを1
0μgCi［α−32P］UTPを含有する25μの反応混合物中
で転写した。
を示すために試験プラスミドからの転写によって対照RN
A転写物を調製した（第３図のレーン０）。pGAG.TESTを
Xba Iで切断して直線化し、プロテイナーゼＫで処理し
（Maniatis等、1982）、フェノール抽出し、エタノール
沈殿した。次にT7 RNAポリメラーゼを製造業者の使用説
明書通りに使用し、0.5μｇの得られたフラグメントを1
0μgCi［α−32P］UTPを含有する25μの反応混合物中
で転写した。
実施例４ RNA増幅に対する鋳型濃度の影響 gag試験オリゴヌクレオチドから転写されたRNAを増幅
するために使用された50μの標準反応混合物は、0.34
μＭのT7H1.GAGと0.34μＭのH2.GAGと50μＭのTris HCl
（pH8.45）と6mMのMgCl2と40mMのKClと10mMのDTTと0.5m
MのNTPと1mMのdNTPと40単位のRNasinと20単位のT7 RAN
ポリメラーゼと20単位の逆転写酵素と0.8単位のRNase H
と10〜20μCi［α−32P］UTPとを含有し、1ngから1fgの
範囲の種々の量の鋳型（N2.GAG）を含有し、１つの反応
は鋳型を含有しない。反応を42℃で３時間インキュベー
トし、インキュベーションの開始から30分毎にTCA不溶c
pmの取込みを測定することによってRNA総合成量モニタ
した。表IIに示すように、RNA総合成量は鋳型のすべて
の被検濃度において鋳型非含有の対照より多い。RNA総
合成量は鋳型濃度の低下に伴って減少する。の減少は定
量的ではない。出発鋳型当たりのRNAの増幅度は一般
に、鋳型濃度が低いほど大きい。1fgのN2.GAG鋳型から
0.8μｇのRNAが合成されると８×108倍の増幅度が得ら
れたことになる。1fgの102−b N2.GAGオリゴヌクレオチ
ドは約２×104分子を示す。 表II N2.GAGからの３時間後のRNA増幅 反応 鋳型 合成RNA（μｇ） 増幅倍率 １ 1ng 3.5 3.5×103 ２ 100pg 4.4 4.4×104 ３ 10pg 4.1 4.1×105 ４ 1pg 3.0 3.0×106 ５ 100fg 2.7 2.7×107 ６ 10fg 1.9 1.9×108 ７ 1fg 0.78 7.8×108 ８ − 0.046 − 反応３時間後に合成されたRNAを各鋳型濃度毎にPAGE
で分析した（第４図、反応と同じ番号のレーン１〜
８）。約100bのRNAを示す主要バンドが鋳型1fg含有及び
鋳型非含有の反応を除く全ての反応に存在していた。1f
gの鋳型を含有する反応では３時間に100bの産生物を多
量に含んでいなかったが、RNA総合成量は鋳型非含有反
応より多く定性的な違いを示した。
するために使用された50μの標準反応混合物は、0.34
μＭのT7H1.GAGと0.34μＭのH2.GAGと50μＭのTris HCl
（pH8.45）と6mMのMgCl2と40mMのKClと10mMのDTTと0.5m
MのNTPと1mMのdNTPと40単位のRNasinと20単位のT7 RAN
ポリメラーゼと20単位の逆転写酵素と0.8単位のRNase H
と10〜20μCi［α−32P］UTPとを含有し、1ngから1fgの
範囲の種々の量の鋳型（N2.GAG）を含有し、１つの反応
は鋳型を含有しない。反応を42℃で３時間インキュベー
トし、インキュベーションの開始から30分毎にTCA不溶c
pmの取込みを測定することによってRNA総合成量モニタ
した。表IIに示すように、RNA総合成量は鋳型のすべて
の被検濃度において鋳型非含有の対照より多い。RNA総
合成量は鋳型濃度の低下に伴って減少する。の減少は定
量的ではない。出発鋳型当たりのRNAの増幅度は一般
に、鋳型濃度が低いほど大きい。1fgのN2.GAG鋳型から
0.8μｇのRNAが合成されると８×108倍の増幅度が得ら
れたことになる。1fgの102−b N2.GAGオリゴヌクレオチ
ドは約２×104分子を示す。 表II N2.GAGからの３時間後のRNA増幅 反応 鋳型 合成RNA（μｇ） 増幅倍率 １ 1ng 3.5 3.5×103 ２ 100pg 4.4 4.4×104 ３ 10pg 4.1 4.1×105 ４ 1pg 3.0 3.0×106 ５ 100fg 2.7 2.7×107 ６ 10fg 1.9 1.9×108 ７ 1fg 0.78 7.8×108 ８ − 0.046 − 反応３時間後に合成されたRNAを各鋳型濃度毎にPAGE
で分析した（第４図、反応と同じ番号のレーン１〜
８）。約100bのRNAを示す主要バンドが鋳型1fg含有及び
鋳型非含有の反応を除く全ての反応に存在していた。1f
gの鋳型を含有する反応では３時間に100bの産生物を多
量に含んでいなかったが、RNA総合成量は鋳型非含有反
応より多く定性的な違いを示した。
実施例５ RNA産物のハイブリダイゼーション分析 実施例４の手順の放射性標識UTPだけを削除して1pg〜
0.1fgの範囲の種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反
応を行なった。反応を42℃で３時間インキュベートし
た。30分毎に各反応からアリコートを採取しナイロン膜
（Amersham）に塗布した。これらの反応アリコートに含
まれていた核酸を紫外線照射によって固定した。最終濃
度50％v/vのホルムアミドと５×SSCと５×Denhardt溶液
（Mania−tis等1982;Southern等、1975）とから成り100
cm2当たり5mlに等しい量のプレハイブリダイゼーション
緩衝液中で膜を50℃で１時間プレハイブリダイズし、さ
らに比活性106cpm/mlの放射性標識プローブのハイブリ
ダイゼーション溶液を用いてハイブリダイズした。50％
のホルムアミド、５×SSC及び５×Denhardt溶液（Mania
tis等、1982;Southern等、1975）中でハイブリダイゼー
ションを50℃で16時間行なった。放射性標識プローブ
は、T4ポリヌクレオチドキナーゼと（α−32P）ATPとを
用いて５′末端を標識した合成オリゴヌクレチオド５′
GATCTGGGATAGAGTACATCCA3′であった。次に、２×SSCと
0.1％v/v SDS及び0.2×SSCと0.1％v/v SDSから成る洗浄
液を用い（Southern等、1975;Maniasis等、1982;Szosta
k等、1979）、50℃で最低２、３回以上は連続して膜を
洗浄した。
0.1fgの範囲の種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反
応を行なった。反応を42℃で３時間インキュベートし
た。30分毎に各反応からアリコートを採取しナイロン膜
（Amersham）に塗布した。これらの反応アリコートに含
まれていた核酸を紫外線照射によって固定した。最終濃
度50％v/vのホルムアミドと５×SSCと５×Denhardt溶液
（Mania−tis等1982;Southern等、1975）とから成り100
cm2当たり5mlに等しい量のプレハイブリダイゼーション
緩衝液中で膜を50℃で１時間プレハイブリダイズし、さ
らに比活性106cpm/mlの放射性標識プローブのハイブリ
ダイゼーション溶液を用いてハイブリダイズした。50％
のホルムアミド、５×SSC及び５×Denhardt溶液（Mania
tis等、1982;Southern等、1975）中でハイブリダイゼー
ションを50℃で16時間行なった。放射性標識プローブ
は、T4ポリヌクレオチドキナーゼと（α−32P）ATPとを
用いて５′末端を標識した合成オリゴヌクレチオド５′
GATCTGGGATAGAGTACATCCA3′であった。次に、２×SSCと
0.1％v/v SDS及び0.2×SSCと0.1％v/v SDSから成る洗浄
液を用い（Southern等、1975;Maniasis等、1982;Szosta
k等、1979）、50℃で最低２、３回以上は連続して膜を
洗浄した。
第５図は異なるインキュベーション時間で採取された
種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反応で行ったりハ
イブリダイゼーション分析の結果を示す。
種々の量のN2.GAG鋳型を含有する増幅反応で行ったりハ
イブリダイゼーション分析の結果を示す。
第５図の縦の列の各々は異なる時点を示し（１は30
分、２は60分、３は90分、４は120分、５は150分、６は
180分）、横の行の各々N2.GAG鋳型の種々の添加量を示
す（１は1pg、２は100fg、３は10fg、４は1fg、５は0.1
fg、６は鋳型非添加）。行１〜３（1pg〜10fg）におい
て標識プローブにハイブリダイズした核酸の増幅が観察
されたが、行４及び５（1fg及び0.1fg）においては特定
核酸に対するハイブリダイゼーション行６（鋳型非含
有）より盛んではなかった。行６の標識プローブの見掛
けの非特異的結合はDNAまたはRNA合成と関連すると推定
される。その理由はハイブリダイゼーションシグナルが
経時的に増加するからである。
分、２は60分、３は90分、４は120分、５は150分、６は
180分）、横の行の各々N2.GAG鋳型の種々の添加量を示
す（１は1pg、２は100fg、３は10fg、４は1fg、５は0.1
fg、６は鋳型非添加）。行１〜３（1pg〜10fg）におい
て標識プローブにハイブリダイズした核酸の増幅が観察
されたが、行４及び５（1fg及び0.1fg）においては特定
核酸に対するハイブリダイゼーション行６（鋳型非含
有）より盛んではなかった。行６の標識プローブの見掛
けの非特異的結合はDNAまたはRNA合成と関連すると推定
される。その理由はハイブリダイゼーションシグナルが
経時的に増加するからである。
実施例６ 鋳型としてのDNA制限フラグメントの使用 プラスミドpGAG2.TESTをMsp Iで切断し、プロテイナ
ーゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿に
よって精製し、５分間沸騰させて変性した。N2.GAGオリ
ゴヌクレオチドの代わりにMsp I分解したpGAG2.TESTを
鋳型として使用する以外は実施例４と同じ手順で増幅反
応を行い分析した。各反応に対するプラスミドの添加量
は55ng〜5.5pgの範囲であり、１つの反応には鋳型を添
加しなかった。実際の標本中に存在するはずの付加的DN
Aをシミュレートするために、同様に切断し精製し変性
した1ngの子ウシ胸腺DNAを含む別の反応も用意した。42
℃で３時間インキュベーション後にTCA沈殿及びPAGE分
析によってRNA合成を測定した。表IIIに示すように、鋳
型のすべての試験濃度でRNA総合成量は鋳型非含有対照
よりも多かった。実際の鋳型からRNA合成が総プラスミ
ドDNAの1.8％に相当することに基づいて増幅度を計算し
た。
ーゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿に
よって精製し、５分間沸騰させて変性した。N2.GAGオリ
ゴヌクレオチドの代わりにMsp I分解したpGAG2.TESTを
鋳型として使用する以外は実施例４と同じ手順で増幅反
応を行い分析した。各反応に対するプラスミドの添加量
は55ng〜5.5pgの範囲であり、１つの反応には鋳型を添
加しなかった。実際の標本中に存在するはずの付加的DN
Aをシミュレートするために、同様に切断し精製し変性
した1ngの子ウシ胸腺DNAを含む別の反応も用意した。42
℃で３時間インキュベーション後にTCA沈殿及びPAGE分
析によってRNA合成を測定した。表IIIに示すように、鋳
型のすべての試験濃度でRNA総合成量は鋳型非含有対照
よりも多かった。実際の鋳型からRNA合成が総プラスミ
ドDNAの1.8％に相当することに基づいて増幅度を計算し
た。
特定の初期鋳型濃度レベルからのRNA総合成量（増幅
度）は、合成オリゴヌクレオチド鋳型（表II）に比較し
て制限フラグメント（表III）が常に低い値を示した。
この理由は、使用条件下において制限フラグメントの相
補鎖との競合が生じるためであろう。
度）は、合成オリゴヌクレオチド鋳型（表II）に比較し
て制限フラグメント（表III）が常に低い値を示した。
この理由は、使用条件下において制限フラグメントの相
補鎖との競合が生じるためであろう。
３時間反応後に合成されたRNAをPAGEで分析した（第
６図、反応と同じ番号のレーン１〜６、11及び12）。反
応（レーン）１〜６には約100bのRNAを示す主要バンド
が存在していたが鋳型非含有反応（レーン11及び12）に
は該バンドが存在していなかった。レーン０のRNAは実
施例３の手順で調製した標準RNAである。１μｇのMsp I
−分解子ウシ胸腺DNAを添加した合成RNA（レーン２、４
及び６）または非添加合成RNA（レーン１、３及び５）
との間に見掛けの定性的差異はなかった。
６図、反応と同じ番号のレーン１〜６、11及び12）。反
応（レーン）１〜６には約100bのRNAを示す主要バンド
が存在していたが鋳型非含有反応（レーン11及び12）に
は該バンドが存在していなかった。レーン０のRNAは実
施例３の手順で調製した標準RNAである。１μｇのMsp I
−分解子ウシ胸腺DNAを添加した合成RNA（レーン２、４
及び６）または非添加合成RNA（レーン１、３及び５）
との間に見掛けの定性的差異はなかった。
実施例７ 鋳型としてのRNAフラグメントの使用 プラスミドpGAG.TESTをXba Iで切断し、プロテイナー
ゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によ
って精製した。T7 RNAポリメラーゼを用いて直線化した
pGAG.TESTプラスミドからN2.GAGに相補的な配列のRNAを
転写した。得られたRNAをDNase（Pro Mega BioTec）で
分解し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によって精
製した。実施例５の手順に従って精製RNAを増幅反応の
鋳型として使用した。夫々の反応には55ng〜5.5pgの範
囲の種々の量のRNAを添加しまた１つの反応には鋳型を
添加しなかった。42℃で３時間インキュベーション後、
実施例５の手順に従って標識オリゴヌクレオチドプロー
ブに対するハイブリダイゼーションによって特定RNAの
合成を判定した。
ゼＫで処理し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によ
って精製した。T7 RNAポリメラーゼを用いて直線化した
pGAG.TESTプラスミドからN2.GAGに相補的な配列のRNAを
転写した。得られたRNAをDNase（Pro Mega BioTec）で
分解し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によって精
製した。実施例５の手順に従って精製RNAを増幅反応の
鋳型として使用した。夫々の反応には55ng〜5.5pgの範
囲の種々の量のRNAを添加しまた１つの反応には鋳型を
添加しなかった。42℃で３時間インキュベーション後、
実施例５の手順に従って標識オリゴヌクレオチドプロー
ブに対するハイブリダイゼーションによって特定RNAの
合成を判定した。
実施例８ 鋳型としてのリボソームRNAの使用 内部配列の増幅 大腸菌16SリボソームRNA（rRNA）の一部に相補的なRN
A配列を増幅するために２つのプライマーを使用した。
一方のプライマーT7H18IB3.PR2（AATTCTAATACGACTCACTA
TAGGGAGTATTACCGCGGCTGCTG）は、T7プロモーターのアン
チセンス鎖と開始部位と16S rRNAに相補的な配列とを含
む。他方のプライマーRIBB.PR（AATACCTTTGCTCATTGAC
G）はプライマーとしてT7H1RIB3.PR2を使用し鋳型とし
て16S rRNAを使用して合成されたDNAに相補的である。
増幅の検出に使用できる第３の合成オリゴヌクレオチド
RIB5.PR（AGAAGCACCGGCTAAC）は増幅反応のRNA産物に相
補的である。該RNA産物は出発rRNA鋳型に相補的であ
る。
A配列を増幅するために２つのプライマーを使用した。
一方のプライマーT7H18IB3.PR2（AATTCTAATACGACTCACTA
TAGGGAGTATTACCGCGGCTGCTG）は、T7プロモーターのアン
チセンス鎖と開始部位と16S rRNAに相補的な配列とを含
む。他方のプライマーRIBB.PR（AATACCTTTGCTCATTGAC
G）はプライマーとしてT7H1RIB3.PR2を使用し鋳型とし
て16S rRNAを使用して合成されたDNAに相補的である。
増幅の検出に使用できる第３の合成オリゴヌクレオチド
RIB5.PR（AGAAGCACCGGCTAAC）は増幅反応のRNA産物に相
補的である。該RNA産物は出発rRNA鋳型に相補的であ
る。
反応混合物（25μ）は、50mMのTris HCl（pH8.45）
と6mMのMgCl2と40mMのKClと10mMのDTTと0.5mのNTPと1mM
のdNTPと20単位のRNasinと10単位のT7 RNAポリメラーゼ
と10単位のAMV逆転写酵素と0.4単位のRNase Hと0.34μ
ＭのT7H1RIB3.PR2と0.34μＭのRIB8.PRとを含有する。
と6mMのMgCl2と40mMのKClと10mMのDTTと0.5mのNTPと1mM
のdNTPと20単位のRNasinと10単位のT7 RNAポリメラーゼ
と10単位のAMV逆転写酵素と0.4単位のRNase Hと0.34μ
ＭのT7H1RIB3.PR2と0.34μＭのRIB8.PRとを含有する。
50ng〜50fgの範囲の種々の量の大腸菌rRNAを反応物に
添加する。１つの反応にはrRNAを添加しない。反応物を
42℃で３時間インキュベートし、インキュベーション開
始の30分、60分、120分及び180分後にアリコートを採取
する。アリコートの反応を制止し、ナイロン膜に固定
し、実施例５の手順で32Pで５′末端を標識したRIB5.PR
プローブにハイブリダイズする。
添加する。１つの反応にはrRNAを添加しない。反応物を
42℃で３時間インキュベートし、インキュベーション開
始の30分、60分、120分及び180分後にアリコートを採取
する。アリコートの反応を制止し、ナイロン膜に固定
し、実施例５の手順で32Pで５′末端を標識したRIB5.PR
プローブにハイブリダイズする。
実施例９ 鋳型としてのリボソームRNAの使用 ５′末端配列の増幅 ２つのプライマーを使用して大腸菌16S rRNAの一部に
相同のRNA配列を増幅する。一方のプライマーRIB12.PR
（TTACTCACCCGTCCGCC）は16S rRNAに相補的である。他
方のプライマーT7H1RIB5.PR（AATTCTAATACGACTCACTATAT
AGGGAGAAATTGAAGAGTTTGATCAT）は、プライマーとてRIB1
2.PRを使用し鋳型として16S rRNAを使用して合成された
DNAの３′末端に相補的である。増幅の検出に使用でき
る第３の合成オリゴヌクレオチドRIB11.PR（GTTCGACTTG
CATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCC）は増幅RNA産
物及び出発rRNA鋳型の双方に相補的である。（T7H1RIB
3.PR2及びRIB8.PRの代わりに）T7H1RIB5.PR及びRIB12.P
Rをプライマーとして使用し、（RIB5.PRの代わりに）RI
B11.PRをオリゴヌクレオチドプローブとして使用する以
外は実施例８と同様にしてrRNAの増幅反応と合成RNAの
検出とを行なう。
相同のRNA配列を増幅する。一方のプライマーRIB12.PR
（TTACTCACCCGTCCGCC）は16S rRNAに相補的である。他
方のプライマーT7H1RIB5.PR（AATTCTAATACGACTCACTATAT
AGGGAGAAATTGAAGAGTTTGATCAT）は、プライマーとてRIB1
2.PRを使用し鋳型として16S rRNAを使用して合成された
DNAの３′末端に相補的である。増幅の検出に使用でき
る第３の合成オリゴヌクレオチドRIB11.PR（GTTCGACTTG
CATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCC）は増幅RNA産
物及び出発rRNA鋳型の双方に相補的である。（T7H1RIB
3.PR2及びRIB8.PRの代わりに）T7H1RIB5.PR及びRIB12.P
Rをプライマーとして使用し、（RIB5.PRの代わりに）RI
B11.PRをオリゴヌクレオチドプローブとして使用する以
外は実施例８と同様にしてrRNAの増幅反応と合成RNAの
検出とを行なう。
上記では本発明を好適実施態様に基づいて詳細に説明
したが、本発明の要旨及び特許請求の範囲に包含される
多様な変更が可能であることは当業者に明らかであろ
う。
したが、本発明の要旨及び特許請求の範囲に包含される
多様な変更が可能であることは当業者に明らかであろ
う。
第１図は核酸増幅方法の全体図である。 第２図は増幅方法の試験に使用される合成オリゴヌクレ
オチドDNA配列を示し、第2A図はgag試験配列、第2B図は
gag2試験配列を示す。 第３図は種々のプライマー濃度を使用した増幅反応のPA
GE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第４図は種々の鋳型濃度を使用した増幅反応のPAGE分析
のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第５図は増幅反応に対するドット−ブロットハイブリダ
イゼーションのオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第６図は制限フラグメントを鋳型として使用した増幅反
応のPAGE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
オチドDNA配列を示し、第2A図はgag試験配列、第2B図は
gag2試験配列を示す。 第３図は種々のプライマー濃度を使用した増幅反応のPA
GE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第４図は種々の鋳型濃度を使用した増幅反応のPAGE分析
のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第５図は増幅反応に対するドット−ブロットハイブリダ
イゼーションのオートラジオグラムのＸ線写真を示す。 第６図は制限フラグメントを鋳型として使用した増幅反
応のPAGE分析のオートラジオグラムのＸ線写真を示す。
Claims (33)
- 【請求項１】試薬を順次添加することなく比較的に一定
した温度で特定の核酸配列を増幅するための方法であっ
て、 （Ａ）（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー、 （ii）RNAポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配
列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、 （iii）前記プロモーターを認識するDNA依存性RNAポリ
メラーゼ、 （iv）RAN依存性DNAポリメラーゼ、 （ｖ）DNA依存性DNAポリメラーゼ、 （vi）一重鎖または二重鎖のRNAまたはDNAを加水分解す
ることなくRNA−DNAハイブリッドのRNAを加水分解する
リボヌクレアーゼ、および （vii）リボヌクレオキシドトリホスフェートおよびデ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェート を含む単一の反応媒質を用意し、 （Ｂ） 前記特定核酸配列またはこの特定核酸配列と相
補的な配列を含むRNA第一鋳型からなるRNAを、増幅反応
サイクルが生起するような条件下で、前記反応媒質中に
提供し、しかる後、 （Ｃ） 前記特定核酸配列の所望の増幅を達成するのに
充分な時間前記条件を維持するステップからなる方法。 - 【請求項２】前記RNA第一鋳型が前記特定核酸配列を含
んでおり、ステップ（Ｂ）が前記反応溶媒質中に一重鎖
RNAを提供することを含んでおり、その結果、 （ｉ）前記第１のオリゴヌクレチオドプライマーが前記
一重鎖RNDとハイブリダイズし、 （ii）前記RNA依存性DNAポリメラーゼが前記一重鎖RNA
を鋳型として利用して前記第１オリゴヌクレオチドプラ
イマーを伸長することによってDNA第二鋳型を合成し、
それによりRNA−DNAハイブリッドを形成し、 （iii）前記リボヌクレアーゼが、前記RND−DNAハイブ
リッドを構成しているRNAを加水分解し、 （iv）前記第２オリゴヌクレオチドプライマーが前記DN
A第二鋳型とハイブリダイズし、 （ｖ）前記DNA依存性DNAポリメラーゼが前記第２オリゴ
ヌクレオチドプライマーを鋳型として利用して前記DNA
第二鋳型を伸長することによって機能性のRNAポリメラ
ーゼプロモーターを合成し、 （vi）前記DNA依存性RNAポリメラーゼが前記機能性プロ
モーターを認識し、かつ前記DNA第二鋳型を転写し、そ
れにより前記RNA第一鋳型のコピーを生成させる ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記第２オリゴヌクレチオドプライマーが
さらに前記DNA依存性RNAポリメラーゼに対する転写開始
部位のアンチセンス配列を含んでおり、前記転写開始部
位の前記アンチセンス配列が前記RNAポリメラーゼプロ
モーターの前記アンチセンス配列と機能可能なように結
合していることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがバクテリ
オファージT7 RNAポリメラーゼであり、転写開始部位
の前記アンチセンス配列及び機能性RNAポリメラーゼプ
ロモーターの前記アンチセンス配列が一緒になって次の
ヌクレオチド配列 AATTCTAATACGACTCATATAGGGAG を構成することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】ステップ（Ｂ）がさらに前記反応媒質にサ
ンプルを添加することを含んでおり、その際の条件は、
前記特定核酸配列またはこの特定核酸配列と相補的な配
列を含むRNA第一鋳型からなるRNAが前記サンプルによっ
て提供された場合に前記サイクルが生起するような条件
とすること、および、ステップ（Ｃ）の後にさらに前記
試薬（ｉ）、（ii）および（vii）のいずれかの消費ま
たは前記サイクルの産物の蓄積に関して前記反応媒質を
モニターするステップ（Ｄ）を含んでいることを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】ステップ（Ｄ）が前記サイクルの核酸産物
を検出することを含む請求項４に記載の方法 - 【請求項７】ステップ（Ｄ）が核酸プローブを使用して
前記核酸産物を検出することを含む請求項５に記載の方
法。 - 【請求項８】ステップ（Ｄ）が制限エンドヌクレアーゼ
と電気泳動分離を使用して前記核酸産物を検出すること
を含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】ステップ（Ｄ）が前記RNA第一鋳型の蓄積
をモニターすることを含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項１０】ステップ（Ｄ）が前記DNA第二鋳型の蓄
積をモニターすることを含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項１１】ステップ（Ｄ）が機能性のRNAポリメラ
ーゼプロモーターを含有するDNAをモニターすることを
含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項１２】ステップ（Ｄ）が前記RNA−DNAハイブリ
ッド中間体の蓄積をモニターすることを含む請求項５に
記載の方法。 - 【請求項１３】ステップ（Ｄ）がさらに、前記試薬
（ｉ）、（ii）および（vii）のいずれかの消費または
前記サイクルの産物の蓄積を、前記特定核酸配列および
それと相補的な前記配列が存在しない場合の前記反応媒
質中における前記試薬の消費または前記産物の蓄積に相
当する値と比較することを含む、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項１４】前記リボヌクレアーゼが大腸菌リボヌク
レアーゼＨおよびトリ骨髄芽球症ウィルスポリメラーゼ
のリボヌクレアーゼＨからなることを特徴とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１５】前記リボヌクレアーゼが子ウシ胸腺リボ
ヌクレアーゼＨであることを特徴とする請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１６】前記第１オリゴヌクレオチドプライマー
または前記第２オリゴヌクレオチドプライマーが、固定
化された支持体と可逆的に結合する、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１７】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがバクテ
リオファージRNAポリメラーゼである請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１８】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがバクテ
リオファージT7RNAポリメラーゼである請求項16に記載
の方法。 - 【請求項１９】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがバクテ
リオファージT3ポリメラーゼである請求項16に記載の方
法。 - 【請求項２０】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがバクテ
リオファージφ IIポリメラーゼである請求項16に記載
の方法。 - 【請求項２１】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがサルモ
ネラバクテリオファージsp6ポリメラーゼであることを
特徴とする請求項16に記載の方法。 - 【請求項２２】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがPseudo
monasバクテリオファージgh−１ポリメラーゼであるこ
とを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 【請求項２３】前記RNA依存性DNAポリメラーゼがレトロ
ウイルスリバーストランスクリプターゼであることを特
徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】前記レトロウイルスリバーストランスク
リプターゼがトリ骨髄芽球症ウイルスポリメラーゼであ
ることを特徴とする請求項22に記載の方法。 - 【請求項２５】前記レトロウイルスリバーストランスク
リプターゼがモロニー（Moloney）マウス白血病ウイル
スポリメラーゼであることを特徴とする請求項22に記載
の方法。 - 【請求項２６】前記DNA依存性RNAポリメラーゼがエキソ
ヌクレアーゼ活性をもたないことを特徴とする請求項１
に記載の方法。 - 【請求項２７】前記反応媒質中のDNAポリメラーゼがい
ずれもDNAエキソヌクレアーゼ活性もDNAエンドヌクレア
ーゼ活性ももたない、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２８】前記DNA依存性DNAポリメラーゼがトリ骨
髄芽球症ウイルスポリメラーゼである請求項１に記載の
方法。 - 【請求項２９】前記DNA依存性DNAポリメラーゼがDNAポ
リメラーゼαまたはDNAポリメラーゼβである請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３０】前記DNA依存性DNAポリメラーゼが子ウシ
胸腺DNAポリメラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３１】ステップ（Ｃ）が前記条件を30分〜４時
間維持することからなる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３２】さらに、前記サイクルのDNA産物をクロ
ーニングベクターに結合した後前記DNA産物をクローン
化するステップを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３３】さらに、前記サイクルの前記DNA産物が
コードしている産物を発現系で発現させるステップを含
む、請求項31に記載の方法。
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