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CN109715670A - 对muc1特异性的嵌合抗原受体(car)及其使用方法 - Google Patents

对muc1特异性的嵌合抗原受体(car)及其使用方法 Download PDF

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CN109715670A
CN109715670A CN201780043589.5A CN201780043589A CN109715670A CN 109715670 A CN109715670 A CN 109715670A CN 201780043589 A CN201780043589 A CN 201780043589A CN 109715670 A CN109715670 A CN 109715670A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
cell
sequence
certain embodiments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780043589.5A
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English (en)
Inventor
E.奥斯特塔
D.谢洛克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wave Cedar Treatment Co
Original Assignee
Wave Cedar Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wave Cedar Treatment Co filed Critical Wave Cedar Treatment Co
Publication of CN109715670A publication Critical patent/CN109715670A/zh
Pending legal-status Critical Current

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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
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    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
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    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
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Abstract

本申请公开了MUC1‑CAR组合物和使用这些组合物靶向MUC1蛋白的方法，包括CARTyrin组合物，其中表达被靶向的MUC1蛋白的细胞可例如被细胞毒性T细胞寻靶并杀死。

Description

对MUC1特异性的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
相关申请
本申请要求临时申请USSN 62/362,744 (2016年7月15日提交)、USSN 62/405,179(2016年10月6日提交)和USSN 62/423,991 (2016年11月18日提交)的权益，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。
并入序列表
命名为“POTH-005_001WO_SeqList.txt”的文本文件的内容，其于2017年7月13日创建，文本文件大小为91 KB，通过引用以其整体并入本文。
本公开内容的领域
本公开内容涉及分子生物学，且更特别地涉及以高亲和性(affinity)和亲合力(avidity)特异性地结合目标蛋白的支架蛋白。
背景
能够以高亲和性和亲合力识别和结合于特定目标蛋白的试剂的发现一直是生物制药业关注的焦点。虽然单克隆抗体已用于这个目的，仍然需要比抗体更小、更易溶解和更稳定的更有效的试剂。
概述
本公开内容提供组合物和使用这些组合物以高亲和性和亲合力识别并结合特定目标蛋白，优选地，MUC1的方法。
本公开内容提供Centyrin组合物和使用这些组合物以高亲和性和亲合力识别并结合特定目标蛋白，优选地，MUC1的方法。Centyrin可以被结合到本公开内容的嵌合抗原受体的抗原识别区。在本公开内容的某些优选的实施方案中，MUC1是MUC1 C-末端结构域(MUC1-C)。本公开内容的组合物可特异性地靶向MUC1-C的胞外域(ECD)序列，所述序列在蛋白水解裂解后保留在细胞表面，随后释放N-末端亚基。
本公开内容的包含抗-MUC1 Centyrin的Centyrin组合物或包含抗-MUC1Centyrin的CAR (即，抗-MUC1 CARTyrin)可以被结合到转座子或载体(如病毒性载体)，以及任选地可以被结合到细胞中。通过接触和/或结合本公开内容的Centyrin组合物修饰的细胞可特异性地靶向MUC1-哺乳动物细胞。通过接触和/或结合本公开内容的Centyrin组合物修饰的细胞可包括，但不限于免疫细胞(如T-细胞)和细胞毒性免疫细胞。包含本公开内容的Centyrin和CARTyrin的细胞可接触本公开内容的Centyrin和CARTyrin组合物，且任选地可经核转染以增加编码Centyrin或CARTyrin的序列的摄取。本公开内容的Centyrin和CARTyrin可由DNA序列、RNA序列，或其组合编码。在某些实施方案中，本公开内容的Centyrin和CARTyrin组合物包含编码Centyrin或CARTyrin的DNA或RNA序列，任选地，结合到转座子序列，和转座酶中，任选地由RNA序列编码。在这种方法的某些实施方案中，转座子是具有编码Centyrin或CARTyrin的序列的质粒DNA转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggyBac™(SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ IDNO: 59序列的两个或更多个位置30、165、282或538的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ ID NO: 59序列的位置30、165、282或538中3个或多于3个位置的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 59序列的以下位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含SEQ ID NO:59序列的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 59序列的氨基酸序列组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含与以下氨基酸序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 60)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置327的氨基酸取代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置450的氨基酸是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，和在SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 79的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO: 59的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
本公开内容提供含有至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列的蛋白支架，其中支架能够结合人MUC1。在本公开内容的蛋白支架的某些实施方案中，至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域源自人蛋白。例如，人蛋白可包含生腱蛋白-C。
本公开内容的共有序列可包含，基本由或由以下序列组成：LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQID NO: 1)。带下划线的序列表示一个功能环，可以对其进行修饰以生成变体FN3结构域序列。本公开内容的变体FN3结构域可包含在以下环内一个或多个位置修饰的共有序列：(a)包含在共有序列的位置13-16的氨基酸残基TEDS (SEQ ID NO: 64)或由它们组成的A-B环；(b) 包含在共有序列的位置22-28的氨基酸残基TAPDAAF (SEQ ID NO: 65)或由它们组成的B-C环；(c) 包含在共有序列的位置38-43的氨基酸残基SEKVGE (SEQ ID NO: 66)或由它们组成的C-D环；(d) 包含在共有序列的位置51-54的氨基酸残基GSER (SEQ ID NO: 67)或由它们组成的D-E环；(e) 包含在共有序列的位置60-64的氨基酸残基GLKPG (SEQ ID NO:68)或由它们组成的E-F环；(f) 包含在共有序列的位置75-81的氨基酸残基KGGHRSN (SEQID NO: 69)或由它们组成的F-G环；或(g) (a)-(f)的任何组合。
本公开内容的蛋白支架可包含至少5、至少10或至少15个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在某些实施方案中，本公开内容的蛋白支架包含15个纤连蛋白III型(FN3)结构域。
本公开内容的蛋白支架可包含两个或更多个纤连蛋白III型(FN3)结构域，其中每个FN3结构域的序列是相同的。本公开内容的蛋白支架可包含两个或更多个纤连蛋白III型(FN3)结构域，其中每个FN3结构域的序列是不同的。
本公开内容的蛋白支架可包含两个或更多个纤连蛋白III型(FN3)结构域，其中每个FN3结构域的序列不同于支架中的每一个其它的FN3结构域。
本公开内容提供VHH组合物和使用这些组合物识别且以高亲和性和亲合力结合特定目标蛋白，优选MUC的方法。VHH组合物包含抗-MUC1抗体的两个重链可变区。在某些实施方案中，VHH组合物包含抗-MUC1抗体的两个重链可变区，其中VHH的互补-决定区(CDR)是人序列。VHH组合物可结合到本公开内容的嵌合抗原受体的抗原识别区。在本公开内容的某些优选的实施方案中，MUC1是MUC1 C-末端结构域(MUC1-C)。本公开内容的组合物可特异性地靶向MUC1-C的胞外域(ECD)序列，其在蛋白水解裂解后保留在细胞表面，随后释放N-末端亚基。
包含抗-MUC1 VHH的VHH组合物或本公开内容的抗-MUC1 VHH的CAR可以被结合到转座子或载体(如病毒性载体)，且任选地可以被结合到细胞中。通过接触和/或结合本公开内容的VHH组合物修饰的细胞可特异性地靶向MUC1-表达细胞。通过接触和/或结合本公开内容的VHH组合物修饰的细胞可包括，但不限于免疫细胞(如T-细胞)和细胞毒性免疫细胞。包含本公开内容的VHH或CAR (包含VHH)的细胞可能已接触本公开内容的VHH或CAR (包含VHH)组合物，并且任选地可经核转染以增加编码本公开内容的VHH或CAR (包含VHH)组合物序列的摄取。本公开内容的VHH或CAR (包含VHH)组合物可由DNA序列、RNA序列，或其组合编码。在某些实施方案中，本公开内容的VHH或CAR (包含VHH)组合物包含编码VHH或CAR (包含VHH)的DNA或RNA序列、任选地，结合到转座子序列，和转座酶，任选地由RNA序列编码。在这种方法的某些实施方案中，转座子是具有编码VHH或CAR的序列的质粒DNA转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
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541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ IDNO: 59序列的两个或更多个位置30、165、282或538的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ ID NO: 59序列的位置30、165、282或538中3个或多于3个位置的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ ID NO: 59序列的以下位置30、165、282和538的每一个氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，SEQID NO: 59序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含SEQ ID NO:59序列的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 59序列的氨基酸序列组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 60)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，氨基酸取代 at 位置240of SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 59是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 600的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 600的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置327的氨基酸取代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置372的氨基酸取代氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO:59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，和在SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，在SEQ ID NO:59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO: 59的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代.
本公开内容提供scFv组合物和使用这些组合物以高亲和性和亲合力识别和结合特定目标蛋白，优选MUC1的方法。ScFv组合物包含抗-MUC1抗体的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，scFv组合物包含抗-MUC1抗体的重链可变区和轻链可变区，其中scFv的互补-决定区(CDR)是人序列。ScFv组合物可结合到本公开内容的嵌合抗原受体的抗原识别区。在本公开内容的某些优选的实施方案中，MUC1是MUC1 C-末端结构域(MUC1-C)。本公开内容的组合物可特异性地靶向MUC1-C的胞外域(ECD)序列，其在蛋白水解裂解后保留在细胞表面，随后释放N-末端亚基。
包含抗-MUC1 scFv或包含本公开内容的抗-MUC1 scFv的CAR的ScFv组合物可以被结合到转座子或载体(如病毒性载体)，且任选地可以被结合到细胞中。通过接触和/或结合本公开内容的scFv组合物修饰的细胞可特异性地靶向MUC1-表达细胞。通过接触和/或结合本公开内容的scFv组合物修饰的细胞可包括，但不限于免疫细胞(如T-细胞)和细胞毒性免疫细胞。包含本公开内容的scFv或CAR (包含scFv)的细胞可能已接触本公开内容的scFv或CAR (包含scFv)组合物，并且任选地可经核转染，以增加编码本公开内容的scFv或CAR (包含scFv)组合物的序列的摄取。本公开内容的scFv或CAR (包含scFv)组合物可由DNA序列、RNA序列，或其组合编码。在某些实施方案中，本公开内容的scFv或CAR (包含scFv)组合物包含编码scFv或CAR (包含scFv)的DNA或RNA序列，任选地，结合到转座子序列，和转座酶中，任选地由RNA序列编码。在这种方法的某些实施方案中，转座子是具有编码scFv或CAR(包含scFv)的序列的质粒DNA转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座子是具有序列编码抗原受体的质粒DNA转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
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541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
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541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ IDNO: 59序列的两个或更多个位置30、165、282或538的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ ID NO: 59序列的位置30、165、282或538中3个或多于3个位置的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ ID NO: 59序列以下位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，SEQID NO: 59序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含或由SEQ IDNO: 59序列的氨基酸序列组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
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481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 60)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的以下一个或多个位置的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、 177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在以下一个或多个位置的氨基酸取代：46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置327的氨基酸取代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的以下一个或多个位置的氨基酸取代：103、194、372、375、450、509和570。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括那些实施方案 其中piggyBac™转座酶可包含SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，和SEQ ID NO:59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和SEQ ID NO: 59的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1B” CAR。“F1B” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 4)的重链可变区和包含氨基酸序列DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 5)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1B-HL” CAR。“F1B-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含重链可变区的序列和包含轻链可变区的序列之间的接头) EVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 6)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1B-LH” CAR。“F1B-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列的接头)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“K2B” CAR。“K2B” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列
QVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 8)的重链可变区和包含氨基酸序列DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 9)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“K2B-HL” CAR。“K2B-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含重链可变区的序列和包含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 10)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“K2B-LH” CAR。“K2B-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 11)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“K2A” CAR。“K2A” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列QIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTP (SEQ ID NO: 12)的重链可变区和包含氨基酸序列DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTV (SEQ ID NO:13)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“K2A-HL” CAR。“K2A-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含重链可变区的序列和包含轻链可变区的序列之间的接头
QIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTPGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTV (SEQ ID NO: 14)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“K2A-LH” CAR。“K2A-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列的接头
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTP (SEQ ID NO: 15)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1A” CAR。“F1A” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 16)的重链可变区和包含氨基酸序列NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 17)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1A-HL” CAR。“F1A-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1A-LH” CAR。“F1A-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 19)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1C” CAR。“F1C” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSA (SEQ ID NO: 20)的重链可变区和包含氨基酸序列
SIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 21)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1C-HL” CAR。“F1C-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 22)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“F1C-LH” CAR。“F1C-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
SIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSA (SEQ ID NO: 23)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“M1B” CAR。“M1B” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 24)的重链可变区和包含氨基酸序列DIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 25)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“M1B-HL” CAR。“M1B-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“M1B-LH” CAR。“M1B-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
DIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 27)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“M1A” CAR。“M1A” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARYYRSAWFAYWGQGTLVSVSA (SEQ ID NO: 28)的重链可变区和包含氨基酸序列
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 29)的轻链可变区。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“M1A-HL” CAR。“M1A-HL” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARYYRSAWFAYWGQGTLVSVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 30)。
本公开内容的MUC1 scFv CAR可包含“M1A-LH” CAR。“M1A-LH” CAR包含含有单链抗体的抗原识别区，所述抗体具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARYYRSAWFAYWGQGTLVSVSA (SEQ ID NO: 31)。
本公开内容的蛋白支架可以选自小于或等于10-9M，小于或等于10-10M，小于或等于10-11M，小于或等于10-12M，小于或等于10-13M，小于或等于10-14M，和小于或等于10-15M的KD的至少一个亲和力结合人MUC1。KD可通过任何手段，包括但不限于表面等离子体共振测定。
本公开内容提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中抗原识别区包含至少一个依据前述权利要求的任一项的蛋白支架；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。在某些实施方案中，胞外结构域可进一步包含信号肽。可供选择地，或者另外，在某些实施方案中，胞外结构域可进一步包含抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链。
本公开内容提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中抗原识别区包含Centyrin、VHH和scFv的至少一个，其特异性地结合人MUC1的序列；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。在某些实施方案中，抗原识别区包含至少一个Centryin。在某些实施方案中，抗原识别区包含至少一个VHH。在某些实施方案中，抗原识别区包含至少一个scFv。
在本公开内容的CAR的某些实施方案中，信号肽可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在本公开内容的CAR的某些实施方案中，信号肽可包含编码人CD8α信号肽的序列。人CD8α信号肽可包含含有MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列。人CD8α信号肽可包含含有MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列或与包含MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。人CD8α信号肽可由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca的核酸序列编码。
在本公开内容的CAR的某些实施方案中，跨膜结构域可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在本公开内容的CAR的某些实施方案中，跨膜结构域可包含编码人CD8α跨膜结构域的序列。CD8α跨膜结构域可包含含有IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 33)的氨基酸序列或与包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 33)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。CD8α跨膜结构域可由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc的核酸序列编码。
在本公开内容的CAR的某些实施方案中，胞内结构域可包含人CD3ζ胞内结构域。
在本公开内容的CAR的某些实施方案中，至少一个共刺激结构域可包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40胞内段，或其任何组合。在本公开内容的CAR的某些实施方案中，至少一个共刺激结构域可包含CD28和/或4-1BB共刺激结构域。CD28共刺激结构域可包含含有RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列或与包含RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。CD28共刺激结构域可由包含cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg (SEQ ID NO: 35)的核酸序列编码。4-1BB共刺激结构域可包含含由KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列或与包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 36)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。4-1BB共刺激结构域可由包含aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 37)的核酸序列编码。4-1BB共刺激结构域可位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。
在本公开内容的CAR的某些实施方案中，铰链可包含源自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在本公开内容的CAR的某些实施方案中，铰链可包含源自人CD8α序列的序列。铰链可包含含由TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 38)的人CD8Α氨基酸序列或与包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ IDNO: 38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。人CD8α铰链氨基酸序列可由包含actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac (SEQID NO: 70)的核酸序列编码。
本公开内容提供一种包含本公开内容的蛋白支架和至少一种药学上可接受的载体的组合物。
本公开内容提供一种本公开内容的嵌合抗原受体和至少一种药学上可接受的载体。
本公开内容提供包含本公开内容的蛋白支架的转座子。
本公开内容提供一种包含本公开内容的CAR的转座子。
本公开内容的转座子可包含用于表达转座子的细胞的鉴定、富集和/或分离的选择基因。示例性选择基因编码为细胞生存和存活所必需的任何基因产物(如转录子(transcript)、蛋白、酶)。示例性选择基因编码对于赋予对药物挑战的抗药性至关重要的任何基因产物(如转录子、蛋白、酶)，在选择基因编码的基因产物的不存在下，细胞对于药物挑战是敏感的(或者可能对细胞是致命的)。示例性选择基因在缺乏为细胞生存和/或存活所必需的一种或多种营养素的细胞培养基中(在选择基因的不存在下)，编码为生存和/或存活所必需的任何基因产物(如转录子、蛋白、酶)。示例性选择基因包括，但不限于neo(赋予对新霉素的抗药性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、TYMS(编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)，和NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)。
本公开内容的转座子可包含诱导型前凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中，本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，配体结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 40)的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含具有取代位置36的苯丙氨酸(F)的缬氨酸(V) (F36V)的FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽，包括AP20187和/或AP1903两种合成药物。
在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 41)的氨基酸或包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 42)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限切酶位点。
在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可供选择地，或者另外，在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 43)的氨基酸序列或包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ IDNO: 44)的核酸序列编码。
在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽，诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 45)的氨基酸序列或包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 46)的核酸序列编码。
本公开内容的转座子可包含至少一个自切肽，其位于，例如，本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin和本公开内容的选择基因的一个或多个之间。本公开内容的转座子可包含至少一个自切肽，其位于例如本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin和本公开内容的诱导型前凋亡多肽的一个或多个之间。本公开内容的转座子可包含至少两个自切肽，第一个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游，而第二个自切肽位于例如本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。
至少一个自切肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽，或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列或与包含EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQID NO: 48)的氨基酸序列或与包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca (SEQ ID NO: 49)的核酸序列。E2A肽可包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列或与包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列或与包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ IDNO: 52)的氨基酸序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 52)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列或与包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ IDNO: 55)的氨基酸序列或与包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 55) )的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。
本公开内容的转座子可包含第一个和第二个自切肽，第一个自切肽位于，例如，本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin的一个或多个的上游，第二个自切肽位于例如本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin的一个或多个的下游。第一个和/或第二个自切肽可包含例如T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽，或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列或与包含EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48)的氨基酸序列或与包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca (SEQ ID NO: 49)的核酸序列。E2A肽可包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列或与包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列或与包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ IDNO: 52)的氨基酸序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 52)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列或与包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ IDNO: 55)的氨基酸序列或与包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 55)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。
本公开内容提供一种包含本公开内容的转座子的组合物。在某些实施方案中，组合物可进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。编码转座酶的序列可以是mRNA序列。
本公开内容的转座子可包含piggyBac转座子。本公开内容的转座酶可包含piggyBac转座酶或相容酶(compatible enzymes)。特别地，在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含与以下序列之间有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™(PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 59序列的位置30、165、282或538的两个或更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 59序列的位置30、165、282或538的3个或多于3个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 59序列的以下位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含SEQ ID NO:59序列的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 59序列的氨基酸序列组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含与以下氨基酸序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 60)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的以下一个或多个位置的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、 177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置327的氨基酸取代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可以包含在SEQ ID NO:59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBac™转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可以包含在SEQ IDNO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，和在位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，在SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO: 59的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
本公开内容提供包含本公开内容的CAR的载体。在某些实施方案中，载体是病毒性载体。载体可以是重组载体。
本公开内容的病毒性载体可包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。病毒性载体可包含从腺病毒相关病毒分离或衍生的序列(AAV)。病毒性载体可包含重组AAV (rAAV)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包含两个或更多个反向末端重复(ITR)序列，其位于编码本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin的序列的顺式(cis)紧邻处。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括，但不限于所有血清型(如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8，和AAV9)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括，但不限于自补AAV (scAAV)和含有一种血清型的基因组和另一种血清型的衣壳的AAV杂种(如AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括，但不限于rAAV-LK03。
本公开内容的病毒性载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞存活或生存有害的化合物，且其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本公开内容的示例性选择基因可包括，但不限于neo(赋予对新霉素的抗药性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、TYMS(编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)或其任何组合。
本公开内容的病毒性载体可包含诱导型前凋亡多肽，其包含(a) 配体结合区，(b)接头，和(c) 前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中，本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽，配体结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 40)的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽，其具有取代位置36的苯丙氨酸(F)的缬氨酸(V) (F36V)，包含AP20187和/或AP1903两种合成药物。
在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 41)的氨基酸或包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 42)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限切酶位点。
在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可供选择地，或者另外，在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 43)的氨基酸或包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 44)的核酸序列编码。
在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽，诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 45)的氨基酸序列或包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 46)的核酸序列编码。
本公开内容的病毒性载体可包含至少一个自切肽。在一些实施方案中，载体可包含至少一个自切肽，其中自切肽位于CAR和选择基因之间。在一些实施方案中，载体可包含至少一个自切肽和其中第一个自切肽位于CAR的上游和第二个自切肽位于CAR的下游。本公开内容的病毒性载体可包含至少一个自切肽，其位于例如本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽。本公开内容的病毒性载体可包含至少两个自切肽，第一个自切肽位于例如本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游，而第二个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。自切肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽，或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列或与包含EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQID NO: 48)的氨基酸序列或与包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GGATCTGGAGAGGGAAGGGGAAGCCTGCTGACCTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGACCA (SEQ ID NO: 49)的核酸序列。E2A肽可包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列或与包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列或与包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ IDNO: 52)的氨基酸序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 52)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列或与包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ IDNO: 55)的氨基酸序列或与包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 55)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。
本公开内容提供包含本公开内容的CAR的载体。在某些实施方案中，载体是纳米粒子。本公开内容的示例性纳米粒子载体包括，但不限于核酸(如RNA、DNA、合成核苷酸、修饰合成核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、修饰氨基酸，或其任何组合)、聚合物(如多聚体)、胶束、脂质(如脂质体)、有机分子(如碳原子、片材、纤维、管)、无机分子(如磷酸钙或金)或其任何组合。纳米粒子载体可以被动地或主动地穿过细胞膜。
本公开内容的纳米粒子载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞存活或生存有害的化合物和其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本公开内容的示例性选择基因可包括，但不限于neo(赋予对新霉素的抗药性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、TYMS(编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)或其任何组合。
本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型前凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中，本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽，配体结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 40)的核酸序列编码。在某些实施方案中，对可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽(具有取代位置36的苯丙氨酸(F)的缬氨酸(V) (F36V)的配体结合区有特异性的诱导剂包含AP20187和/或AP1903两种合成药物。
在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 41)的氨基酸或包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 42)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限切酶位点。
在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可供选择地，或者另外，在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在诱本公开内容的导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 43)的氨基酸或包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO:44)的核酸序列编码。
在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽，诱导型前凋亡多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 45)的氨基酸序列或包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 46)的核酸序列编码。
本公开内容的纳米粒子载体可包含至少一个自切肽。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中自切肽位于CAR和纳米粒子之间。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于CAR的上游和第二个自切肽位于CAR的下游。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于CAR和纳米粒子之间，而第二个自切肽位于CAR的下游。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于CAR和纳米粒子之间和第二个自切肽位于CAR的下游，例如，CAR和选择基因之间。本公开内容的纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其位于例如本公开内容的蛋白支架、VHH、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的纳米粒子载体可包含至少两个自切肽，第一个自切肽位于例如本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游，而第二个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。自切肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽，或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列或与包含EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48)的氨基酸序列或与包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有GGATCTGGAGAGGGAAGGGGAAGCCTGCTGACCTGTGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGACCA (SEQ ID NO: 49)的核酸序列。E2A肽可包含含有QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列或与包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列或与包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 52)的氨基酸序列或与包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 52)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列或与包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 53)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列或与包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO: 54)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 55)的氨基酸序列或与包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP ((SEQ ID NO: 55)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。
本公开内容提供一种包含本公开内容的载体的组合物。
本公开内容提供包含本公开内容的蛋白支架的细胞。
本公开内容提供包含本公开内容的CAR的细胞。
本公开内容提供包含本公开内容的转座子的细胞。
本公开内容提供包含本公开内容的载体的细胞。
在某些实施方案中，包含本公开内容的CAR、转座子，或载体的细胞可在细胞表面上表达CAR。细胞可以是任何类型的细胞。优选地，细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞(如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。优选地，免疫细胞是T-细胞。细胞可以是人工抗原呈递细胞，其可以任选地用来刺激和扩增本公开内容的修饰免疫细胞或T细胞。细胞可以是肿瘤细胞，其可以任选地用作人工或修饰的抗原呈递细胞。
可用于过继治疗的本公开内容的修饰细胞可以是自体的。可用于过继治疗的本公开内容的修饰细胞可以是同种异体的。
本公开内容提供一种制备本公开内容的蛋白支架的方法，其包括(a) 修饰共有序列的一个或多个氨基酸和(b) 选择选择性地结合人MUC1的蛋白支架。在这个方法的某些实施方案中，修饰步骤包括定点诱变、随机诱变，或其组合。随机诱变可包含，例如，易错聚合酶链反应(PCR)、DNA改组(shuffling)或其组合。这个方法的修饰和选择步骤可根据需要重复多次。例如，本公开内容的蛋白支架可根据此方法的某些实施方案，通过亲和力成熟来识别。
本公开内容提供一种在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)的方法，其包括：(a)获得细胞群，(b) 使细胞群与包含本公开内容的CAR或编码CAR的序列的组合物，在足以使CAR转移穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件下接触，从而产生；(c) 在适合编码CAR的序列的整合条件下培养修饰的细胞群；和(d) 从修饰的细胞群扩增和/或选择至少一个在细胞表面上表达CAR的细胞。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，细胞群可包含白细胞和/或CD4+和CD8+白细胞。细胞群可包含优化比例的CD4+和CD8+白细胞。优化比例的CD4+与CD8+粒的细胞并不在体内自然发生。细胞群可包含肿瘤细胞。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，在足以转移CAR或编码CAR的序列、转座子或载体越过(b)的细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件下，可包括以下至少一种：在指定电压下一个或多个电流脉冲的施加、缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中，缓冲剂可包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种补充因子可包含(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合；(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c) 细胞培养基；(d) 细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e)修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合可包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5，或其任何组合。细胞培养基可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包含TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)，或其任何组合。这样的抑制剂的实例可包括Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，适合于整合编码CAR的序列的条件包括以下至少一种：缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中，缓冲剂可包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种补充因子可包含(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合；(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c) 细胞培养基； (d) 细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合可包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5，或其任何组合。细胞培养基可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包含包括TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-3β(GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)，或其任何组合。这样的抑制剂的实例可包括Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增和选择步骤序贯发生。扩增可在选择之前发生。扩增可在选择之后发生，且任选地，进一步的(即第二)选择可在扩增之后发生。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增和选择步骤可同时发生。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增可包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与抗原接触，以通过CAR刺激至少一个细胞，从而产生扩增细胞群。抗原可在基质表面上呈递。基质可具有任何形式，包括，但不限于表面、孔、珠或其中的多个，和基质。基质可进一步包含顺磁性或磁性组分。在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，抗原可在基质表面上呈递，其中基质是磁珠，和其中磁体可以用来从修饰和扩增的细胞群去除或分离磁珠。抗原可在细胞或人工抗原呈递细胞表面上呈递。本公开内容的人工抗原呈递细胞可包括，但不限于肿瘤细胞和干细胞.
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，其中转座子或载体包含选择基因，且其中选择步骤包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与选择基因赋予抗性的化合物接触，从而将表达选择基因的细胞识别为在选择中存活和将未能表达选择基因的细胞识别为未能在选择步骤中存活。
在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增和/或选择步骤可持续10-14天的时期，包括端点。
本公开内容提供一种包含用本公开内容的方法修饰、扩增和选择的细胞群的组合物。
本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物，其中CAR特异性地结合肿瘤细胞上的抗原。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是同种异体的。
本公开内容提供一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法，其包括给予所述受试者一种包含含有转座子或载体的细胞的组合物，所述组合物包含诱导型前凋亡多肽，其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。在某些实施方案中，细胞是自体的。在某些实施方案中，细胞是同种异体的。在这种方法的某些实施方案中，细胞疗法是过继性细胞疗法。在这种方法的某些实施方案中，改变细胞疗法包括终止细胞疗法。在这种方法的某些实施方案中，改变细胞疗法包括细胞疗法中提供的一部分细胞的损耗。在某些实施方案中，该方法进一步包括给予诱导剂抑制剂的步骤，以抑制细胞疗法的改变，从而恢复细胞疗法的功能和/或疗效。
本公开内容的改变细胞疗法的方法可被用来终止或抑制对例如，康复迹象或减轻疾病严重程度/进展的迹象、疾病缓解/停止的迹象，和/或不利事件的发生有反应的疗法。本公开内容的细胞疗法可通过抑制诱导剂恢复，病情的体征或症状应再次出现或加重和/或不利事件得到解决。
附图简述
图1是MUC1蛋白且特别是MUC1-C的C-末端胞外域的氨基酸序列(MUC1-C/ECD) (SEQ IDNO: 3)的示意图。
图2是描述人Tenasin的第3个FN3结构域的环结构的图表。
图3是描述使用CIS展示(见，isogenica.com/proprietary-technologies/cis-display)筛选和选择MUC1-结合Centyrin的过程的示意图。
图4是载体PB-EF1a的图。
图5是比较具有PB-EF1a的原代人T-细胞(核转染后第11天分析的)的GFP易位的一系列图，其中插入多克隆位点(MCS)的GFP (“模拟”)对比用超级piggyBac™酶(sBPo)共递送的PH-EF1a-GFP。
图6是描述本公开内容的示例性诱导型截短的半胱天冬酶9多肽的示意图。
图7是一系列流式细胞术绘图，描绘从活细胞区域(门控右下象限)移动到填充凋亡细胞的区域(左上象限)的细胞的丰度，其作为在细胞中诱导剂(AP1903)的递增剂量的函数，所述细胞经修饰以在核转染后第12天单独或与本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽(由通过piggyBac (PB)转座酶引入到细胞中的iC9构建体(也称为“安全开关”)编码)组合表达治疗剂(CARTyrin)。
图8是一系列流式细胞术绘图，描绘从活细胞区域(门控右下象限)移动到填充凋亡细胞的区域(左上象限)的细胞的丰度，其作为在细胞中诱导剂(AP1903)的递增剂量的函数，所述细胞经修饰以在核转染后第19天单独或与本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽(由通过piggyBac (PB)转座酶引入到细胞中的iC9构建体(也称为“安全开关”)编码)组合表达治疗剂(CARTyrin)。
图9是描述图7 (左图)或图8 (右图)所示的聚集结果的量化的一对图。特别地，这些图显示在第12天(图7和左图)或第19天(图8和右图)，iC9安全开关对细胞生存百分率的影响，所述细胞生存百分率作为对于每个修饰细胞类型的iC9开关诱导剂(AP1903)的浓度的函数。
图10A-B是描述MUC1异二聚体的结构的一对示意图。小图A描述在SEA结构域(海胆精子蛋白、肠激酶和agrin结构域)中经历自蛋白水解的过程，以生成两个亚基从而形成稳定的非共价异二聚体的MUC1。MUC1-N和MUC1-C命名被用来表示亚基在裂解后的位置，并将它们与用希腊文字再分类的基因亚型区分开。小图B提供MUC1-C亚基的细节。MUC1-C 55个氨基酸胞外域在位置36的天冬酰胺(B) (其为N36LT位点)上被糖基化。MUC1-C 72个氨基酸胞质结构域与多种效应器相互作用，足以诱导肿瘤发生转化。图转载自Kufe DW,Oncogene, 32(9):1073。
图11是描述示例性构建MUC1-scFv嵌合抗原受体(CAR)的示意图。图中所示的MUC1-scFv CAR具有包含(加下划线的部分标明接头序列)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSDVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 56)的氨基酸序列。
图12是描述示例性MUC1-C表达控制构建的示意图。图中所示的MUC1-C构建体具有包含：
MALPVTALLLPLALLLHAARPSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL (SEQ ID NO: 57)的氨基酸序列。
图13A是描述了全长MUC1 (PDB:2ACM)的带状(ribbon)结构或者预测的MUC1-C结构域结构的一对示意图。
图13B是一系列描述MUC1在不同细胞类型，包括K562细胞(永生化人慢性骨髓性白血病细胞)、Raji细胞(用作癌症模型的人造血细胞系)、经修饰以表达MUC1-C的Raji细胞、激活的T细胞和RPMI8226细胞(人外周血B细胞浆细胞瘤/骨髓瘤细胞系)中表达的图。对于K562细胞，染色对照峰出现在抗-MUC1-N Ab峰的左侧。对于Raji细胞，染色对照峰与抗-MUC1-N Ab峰重叠，然而，抗-MUC1-N Ab峰较高。对于经修饰以表达MUC1-C的Raji细胞，染色对照峰与抗-MUC1-N Ab峰重叠，然而，抗-MUC1-N Ab峰较高。对于激活的T细胞，染色对照峰出现在抗-MUC1-N Ab峰的左侧。对于RPMI8226细胞，染色对照峰出现在抗-MUC1-N Ab峰的左侧。
图14是描述MUC1-scFv CAR功能测定的图。对于沿着X-轴的每个MUC1-scFv，上面的检索表中提供的条件将从左到右演示(即，从左到右表示每个MUC1-scFv、8226；8226-MUC1-C；K562；K562-MUC1-C；Raji；Raji-MUC1-C)。MUC1-scFv功能由细胞在与MUC1-scFv沿x轴接触的每一条件下的脱粒程度来测量。脱粒被测定为CD107a-阳性(CD107a+)占总细胞的百分率。
图15是显示MUC1-C scFv-CAR识别不同表位的图和表。功能分析的结果在图中提供，其中MUC1-C scFv-CAR功能由细胞在与MUC1-scFv沿x轴接触的每一条件下的脱粒程度来测量。脱粒被测定为CD107a-阳性(CD107a+)占总细胞的百分率。图表概括了每个MUC1-CscFv-CAR在功能分析期间的相对活性。可能会得出以下几个初步结论：1) F1C-HL CAR对全长MUC1，包括在激活的T细胞上表达的全长MUC1反应，2) M1A-LH CAR对全长MUC1反应，并在较小程度上对在T细胞上表达的全长MUC1反应，和3) K2B-HL CAR只对裂解的、不脱落的MUC1-c有反应，而对全长MUC1没有反应。
图16是描述Muc1在不同癌症细胞系中表达的图。
图17是描述Muc1-结合CAR-T细胞对一组癌细胞系的活性评估结果的图。细胞系与CAR+ (M1A-LH；黑色柱)或模拟(灰色柱) T细胞共同-培养4-6小时。T细胞的脱粒通过对CD107a(对于脱粒的标记；左轴)进行FACS染色来评价。在右轴上，细胞系表面上的全长Muc1(Muc1 FL)的表达通过对Muc1-N进行FACS染色来评价，数据表示为MFI。此外，用ELISA检测每个细胞系的Muc1-N在细胞培养上清液中的脱落量，结果显示为Muc1单位/ml。
详细描述
本发明公开了组合物和使用这些组合物靶向MUC1蛋白的方法。在本公开内容的某些优选的实施方案中，MUC1是MUC1的C-末端序列的胞外域(MUC1-C/ECD)。
本发明公开了Centyrin组合物和使用这些组合物靶向MUC1蛋白的方法。在本公开内容的某些优选的实施方案中，MUC1是MUC1的C-末端序列的胞外域(MUC1-C/ECD)。
本公开内容的Centyrin特异性地结合于MUC，且优选地结合于MUC1的C-末端部分。本公开内容的方法的优选实施方案使用MUC1-C Centyrin粘合剂来重定向一种细胞毒性细胞类型，以介导MUC1-C+细胞的破坏。
本公开内容的Centyrin可用作人MUC1-特异性嵌合T细胞受体(或嵌合抗原受体，CAR)多肽的组分，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和胞外域，胞外域包含人MUC1结合区。MUC1结合区可以是Centyrin。结合区可包含与以下氨基酸序列有至少、至多或约70、75、80、85、90、95、96、97、98、99，或100%同一性的氨基酸序列LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ IDNO: 1)。
本发明公开了VHH组合物和使用这些组合物靶向MUC1蛋白的方法。在本公开内容的某些优选的实施方案中，MUC1是MUC1的C-末端序列的胞外域(MUC1-C/ECD)。
本公开内容的VHH特异性地结合于MUC，优选地，结合于MUC1的C-末端部分。本公开内容的方法的优选实施方案使用MUC1-C VHH粘合剂来重定向一种细胞毒性细胞类型，以介导MUC1-C+细胞的破坏。
本公开内容的嵌合抗原受体可包含人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BBor GM-CSFR的信号肽。本公开内容的铰链/间隔域可包含人CD8α、IgG4和/或CD4的铰链/间隔物/茎。本公开内容的细胞内结构域或胞内域可包含人CD3ζ的细胞内信号域和可进一步包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40胞内段，或其任何组合。示例性跨膜结构域包括，但不限于人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域。
本公开内容提供人MUC1-特异性嵌合抗原受体(CAR)、制备方法，和使用人MUC1-特异性CAR的方法。本公开内容也提供包含人MUC1-特异性CAR的细胞或通过人MUC1-特异性CAR修饰的细胞(重组细胞)。表达本公开内容的MUC1-特异性CAR的重组细胞显示出增强的体内持久性和抗肿瘤功效。表达本公开内容的MUC1-特异性CAR的重组细胞的抗肿瘤功效可能被基因修饰细胞，如T细胞、NK细胞、天然杀伤(NK)-样细胞(如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括来自G-CSF-动员的外周血的T细胞)、脐带血(UCB)衍生的赋予对MUC1特异性的T细胞，或其任何组合增强。T细胞特异性可通过编码本公开内容的MUC1-表达CAR的表达盒的电转移而实现。
本公开内容的MUC1-表达CAR.可以是包含一个或多个激活基序(例如胞内结构域)，例如CD3-ζ-衍生的激活结构域的嵌合受体。另外的T-细胞激活基序包括，但不限于4-1BB、CD28、CD40、MyD88、OX-40。本公开内容的T-细胞激活结构域也可包括4-1BB 跨膜和/或激活结构域。本公开内容的MUC1-表达CAR可包括编码区和/或为在人细胞和受试者中表达而优化的表达盒密码子。CAR表达盒可以游离基因维持或整合进重组细胞的基因组中。表达盒可包含在能够通过使用整合酶机制、病毒性载体，例如逆转录病毒或非病毒性载体例如转座子机制整合的核酸中。表达盒可包括在基于转座子的核酸中。表达盒可以是利用转座子和为了提高非-病毒性基因转移的转座酶的两组分piggyBac系统的部分。
支架蛋白
本公开内容的蛋白支架是基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白，编码或互补核酸、载体、宿主细胞、构成、组合、制剂、装置，以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施方案中，蛋白支架包含来自人生腱蛋白-C的多个FN3结构域的共有序列(此后为“生腱蛋白”)。在一个更优选的实施方案中，本发明的蛋白支架是15 FN3结构域的共有序列。本公开内容的蛋白支架可以被设计以结合各种分子，例如，细胞靶蛋白。在一个优选的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可以被设计以结合野生型和/或变异形式的MUC1、MUC1的C-末端序列或其胞外域(MUC1-C/ECD)的表位。
本公开内容的蛋白支架可包括另外的分子或部分，例如，抗体的Fc区，白蛋白结合结构域，或其它影响半衰期的部分。在进一步的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可结合于可编码蛋白支架的核酸分子。
本公开内容提供至少一种在宿主细胞中表达基于多个FN3结构域的共有序列的至少一个蛋白支架的方法，该方法包括在其中至少一个蛋白支架以可检测和/或可回收的量表达的条件下，如在此所述的培养宿主细胞。
本公开内容提供至少一个组合物，其包含(a) 基于多个FN3结构域的共有序列和/或如在此描述的编码核酸的蛋白支架；和(b)合适的和/或药学上可接受的载体或稀释剂。
本公开内容提供生成基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白，优选地，多个FN3结构域的共有序列，且更优选地，来自人生腱蛋白的多个FN3结构域的共有序列的蛋白支架文库的方法。通过在支架的部分，如环区中改变(通过突变)分子中特定位置的氨基酸或氨基酸的数量，制备连续几代的支架来形成支架文库。通过改变单环或同时改变多个环或支架分子的另外位置的氨基酸组成可生成支架文库。改变后的环可以相应地加长或缩短。这样的库可以生成以在每个位置包含所有可能的氨基酸，或设计出的氨基酸的子集。库成员可被用来通过展示进行筛选，如体外或CIS展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。
本公开内容的蛋白支架可包含一个或多个序列编码VHH、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、组合、制剂、装置，以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施方案中，蛋白支架包含VHH、全人VHH、嵌合VHH或人源化VHH。本公开内容的蛋白支架可以被设计以结合各种分子，例如，细胞靶蛋白。在一个优选的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可以被设计以结合野生型和/或变异形式的MUC1、MUC1的C-末端序列或其胞外域(MUC1-C/ECD)的表位。
本公开内容提供生成蛋白支架文库的方法，所述库包含一个或多个编码VHH、完全人VHH、嵌合VHH或人源化VHH的序列，其特异性地结合野生型和/或变异形式的MUC1、MUC1的C-末端序列或其胞外域(MUC1-C/ECD)的表位。通过在支架的部分，如一个或多个互补-决定区(CDR)，和优选每个可变区的第三CDR改变(通过突变)分子中特定位置的氨基酸或氨基酸的数量，制备连续几代的支架来形成支架文库。通过改变单个CDR的氨基酸组成或同时改变多个CDR或支架分子的另外的位置(如编码框架序列的一个或多个序列)可生成支架文库。改变后的CDR和/或框架序列可以相应地加长或缩短。这样的库可以生成以在每个位置包含所有可能的氨基酸，或设计出的氨基酸的子集。库成员库成员可被用来通过展示进行筛选，如体外或CIS展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。
本公开内容的蛋白支架提供增强的生物物理特性，如还原条件下的稳定性和高浓度时的溶解性；它们可在原核系统中表达和折叠，如大肠杆菌，在真核系统中，如酵母，和在体外转录/翻译系统中，如兔网织红细胞溶解系统。
本公开内容提供通过用靶标淘选本发明的支架文库并检测粘合剂，生成结合特定靶标的支架分子的方法。在其他相关方面，本公开内容包括可被用来生成或结合成熟的具有所需活性的蛋白支架的筛选方法，如，能够与具有某种亲和力的靶蛋白结合。亲和性成熟可以通过迭代诱变和选择使用系统完成，如噬菌体展示或体外展示。在此过程中的诱变可能是对特定支架残基的位点定向诱变，由于容易出错的PCR导致随机突变，DNA改组(shuffling)，和/或这些技术的组合的结果。
本公开内容提供基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白的共有序列的分离、重组和/或合成的蛋白支架，包括但不限于，源自哺乳动物的支架，以及组成和编码包含至少一个基于共有FN3序列的多核苷酸编码蛋白支架的核酸分子。本公开内容还包括，但不限于制备和使用这样的核酸和蛋白支架的方法，包括诊断和治疗组合物、方法和装置。
本公开内容的蛋白支架提供优于传统疗法的优势，如局部给予、口服，或越过血脑屏障的能力，在大肠杆菌中表达，使得蛋白的表达作为对比哺乳动物细胞表达能力(会被基因改造成结合多个目标或相同目标的多个表位的双特异性或串联分子)的函数的资源增加的能力，与药物、聚合物和探针结合的能力，可配制成高浓度的能力，和这样的分子有效穿透病变组织和肿瘤的能力。
而且，蛋白支架具有的许多抗体特性与它们模拟抗体的可变区的折叠有关。这种取向使FN3环能够与抗体相似地暴露于抗体互补决定区(CDR)。它们应该能够与细胞目标结合，且环可以改变，例如，亲和性成熟，以改善某些结合或相关的特性。
本公开内容的蛋白支架的6个环中的3个在拓扑上与抗体的互补决定区(CDR 1-3)，即抗原-结合区相对应，而其余的三个环以类似于抗体CDR的方式暴露在表面。这些环跨越SEQ ID NO: 1的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64，和75-81或在这些残基附近，如图2中所示。优选地，为了结合特异性和亲和力而改变在残基22-28、51-54和75-81或它们附近的环区。这些环区的一个或多个与其它环区和/或其它保持其作为主干部分的顺序的链任意排列以填充库，而强效粘合剂可从对特定蛋白目标具有高度亲和力的库中选择。一个或多个环区可与目标蛋白相互作用，类似于抗体CDR与蛋白质的相互作用。
本公开内容的支架可包含抗体模拟物。
术语“抗体模拟”旨在描述一种特异性地结合目标序列并具有与天然存在的抗体不同结构的有机化合物。抗体模拟物可包含蛋白、核酸，或小分子。本公开内容的抗体模拟物特异性地结合的目标序列可以是抗原。抗体模拟物可提供超过抗体的优越的特性，包括但不限于优越的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性(如对酶降解的抗性)，和较低的生产成本。示例性抗体模拟物包括，但不限于，affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin，和avimer (也称为亲合多聚物)、DARPin (设计的锚定蛋白(Ankyrin)重复蛋白)、Fynomer、Kunitz结构域肽，和单体。
本公开内容的affibody分子包含含有或由一个或多个无任何二硫键的α螺旋组成的蛋白支架。优选地，本公开内容的affibody分子包含或由3个α螺旋组成。例如，本公开内容的affibody分子可包含免疫球蛋白结合结构域。本公开内容的affibody分子可包含蛋白A的Z结构域。
本公开内容的Affilin分子包含通过修饰例如或者γ-B晶体蛋白或者泛素蛋白(ubiquitin)的暴露氨基酸产生的蛋白支架。Affilin分子在功能上模拟抗体与抗原的亲和性，但不要在结构上模仿抗体。在用来制备affilin的任何蛋白支架中，在正确-折叠的蛋白分子中的易接近溶剂或可能的结合配体(binding partners)的那些氨基酸被认为是暴露的氨基酸。这些暴露的氨基酸的任何一个或多个可被修饰 以特异性地结合目标序列或抗原。
本公开内容的Affimer分子包含含有高度稳定的蛋白的蛋白支架，所述蛋白经改造以展示对特定目标序列提供高亲和力结合位点的肽环。本公开内容的示例性Affimer分子包含基于胱抑素蛋白或其三级结构的蛋白支架。本公开内容的示例性Affimer分子可能共享一个包含平放在一个反并行的β-片上面的α-螺旋的共有三级结构。
本公开内容的Affitin分子包含人工蛋白支架，例如，其结构可源自DNA结合蛋白(如DNA结合蛋白Sac7d)。本公开内容的Affitins选择性地结合目标序列，其可能是抗原的全部或部分。本公开内容的示例性Affitins通过使一个或多个氨基酸序列在DNA结合蛋白的结合表面上任意排列并将生成的蛋白置于核糖体的展示和选择中来制备。本公开内容的Affitins的目标序列可例如在基因组中或在肽、蛋白、病毒或细菌的表面上发现。在本公开内容的某些实施方案中，affitin分子可用作酶的特异性抑制剂。本公开内容的Affitin分子可包括耐热蛋白或其衍生物。
本公开内容的Alphabody分子也可被称为细胞穿透Alphabody (CPAB)。本公开内容的Alphabody分子包含结合各种目标序列(包括抗原)的小蛋白(一般少于10 kDa)。Alphabody分子能够到达和结合细胞内目标序列。在结构上，本公开内容的Alphabody分子包含形成单链α螺旋的人工序列(类似于天然存在的盘绕的线圈结构(coiled-coilstructures))。本公开内容的Alphabody分子可包含含有被修饰以特异性地结合目标蛋白的一个或多个氨基酸的蛋白支架。不管分子的结合特异性，本公开内容的Alphabody分子保持正确的折叠和热稳定性。
本公开内容的Anticalin分子包含在或者蛋白或者小分子中结合目标序列或位点的人工蛋白。本公开内容的Anticalin分子可包含源自人脂钙蛋白(lipocalin)的人工蛋白。本公开内容的Anticalin分子可用于代替，例如，单克隆抗体或其片段。Anticalin分子可显示出优于单克隆抗体或其片段的组织穿透性和热稳定性。本公开内容的示例性Anticalin分子可包含约180个氨基酸，具有大约20 kDa的质量。结构上，本公开内容的Anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的反平行β-链的桶状结构。在优选的实施方案中，本公开内容的Anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的8条反平行β-链的桶状结构。
本公开内容的Avimer分子包含特异性地结合于目标序列(其也可以是抗原)的人工蛋白。本公开内容的Avimer可识别相同目标内或不同目标内的多个结合位点。当本公开内容的Avimer识别不止一个目标时，avimer模拟双特异性抗体的功能。人工蛋白avimer可包含两个或更多个各自大约30-35个氨基酸的肽序列。这些肽可经由一个或多个接头肽连接。Avimer的一个或多个肽的氨基酸序列可源自膜受体的A结构域。Avimer具有可任选地包含二硫键和/或钙的刚性结构。本公开内容的Avimer可显示出与抗体比较的更大的热稳定性。
本公开内容的DARPin (设计的锚定蛋白(Ankyrin)重复蛋白)包含基因工程改造的重组体，或对目标序列具有高特异性和高亲和力的嵌合蛋白。在某些实施方案中，本公开内容的DARPin源自锚定蛋白(Ankyrin)，且任选地包含锚定蛋白(Ankyrin)的至少3个重复基序(也称为重复结构单元)。锚定蛋白(Ankyrin)介导高亲和力蛋白-蛋白相互作用。本公开内容的DARPin包含一个大的目标相互作用面。
本公开内容的Fynomer包含源自人Fyn SH3结构域，并经改造以结合具有同等亲和力和同等特异性的目标序列和分子作为抗体的小结合蛋白(约7 kDa)。
本公开内容的Kunitz结构域肽包含含由Kunitz结构域的蛋白支架。Kunitz结构域包含抑制蛋白酶活性的活性位点。结构上，本公开内容的Kunitz结构域包含一个富含二硫化物的α+β折叠。这种结构以牛胰腺胰蛋白酶抑制剂为例。Kunitz结构域肽识别特定蛋白结构并用作竞争性蛋白酶抑制剂。本公开内容的Kunitz结构域可包含艾卡拉肽(Ecallantide) (源自人脂蛋白相关凝血抑制剂(LACI))。
本公开内容的单体是大小与单链抗体相当的小蛋白(包含约94个氨基酸且具有约10 kDa的质量)。这些基因工程蛋白特别结合了包括抗原的目标序列。本公开内容的单体可特异性地靶向一个或多个不同的蛋白或目标序列。在优选的实施方案中，本公开内容的单体包含模拟人纤连蛋白的结构，和更优选地，模拟纤连蛋白的第十胞外III型结构域的结构的蛋白支架。纤连蛋白的第十胞外III型结构域，及其单体模拟物，含有7个形成桶的β片和3个对应于抗体3个互补决定区(CDR)每一侧上的暴露的环。与抗体可变结构域的结构形成对比，单体缺乏金属离子的结合位点以及中心的二硫键。多特异性单体可通过修改环BC和FG来优化。本公开内容的单体可包含adnectin。
这样一种方法可包括在需要症状、效果或机制的这样的调节、治疗、缓解、预防，或减少的细胞、组织、器官、动物或患者中给予有效量的包含至少一个支架蛋白的组合物或药物组合物。有效量可包含每次单独(如，大剂量)、多次或连续给予的约0.001-500 mg/kg，或每次单独、多次或连续给予达到0.01-5000 μg/ml血清浓度的血清浓度，或其中任何有效范围或值的量，如使用已知的(如在此描述的或相关领域已知的)方法进行和测定的。
嵌合抗原受体和CARTyrin
本公开内容提供包含至少一个Centyrin的嵌合抗原受体。本公开内容的嵌合抗原受体可包含不止一个Centyrin。例如双特异性CAR可包含特异性地结合两个不同的抗原的两个Centyrin。
本公开内容的Centyrin特异性地结合于抗原。包含一个或多个特异性地结合抗原的Centyrin的嵌合抗原受体可被用来引导细胞(如细胞毒性免疫细胞)的特异性以趋向特定抗原。
本公开内容的Centyrin可包含含有LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 1)的共有序列。
本公开内容的嵌合抗原受体可包含人CD4、CD8α，或GM-CSF的信号肽。本公开内容的铰链/间隔域可包含人CD8α、IgG4和/或CD4的铰链/间隔物/茎。本公开内容的细胞内结构域或胞内域可包含人CD3ζ的细胞内信号传导结构域并可进一步包含人4-1BB、CD28、CD40、MyD88和/或OX-40胞内段。示例性跨膜结构域包括，但不限于CD8或CD28跨膜结构域。
本公开内容通过将本公开内容的CAR和/或CARTyrin引入这些细胞，提供基因修饰细胞，如T细胞、NK细胞、NK-样细胞(包括细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括来自G-CSF-动员的外周血的T细胞)、脐带血(UCB)衍生的赋予对一个或多个抗原的特异性的T细胞。本公开内容的细胞可通过编码本公开内容的CAR或CARTyrin的转座子和包含本公开内容的编码转座酶的序列(优选地，本公开内容的编码转座酶的序列是mRNA序列)的质粒的电转移进行修饰。
本公开内容的转座子以游离基因形式(episomally)维持或整合进重组体/修饰细胞的基因组中。转座子可以是利用转座子和转座酶以推动非-病毒性基因转移的两个组分piggyBac系统的部分。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座子是具有编码抗原受体的序列的质粒DNA转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac (PB)转座酶可包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
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481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 59)。
在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含具有在SEQ ID NO:59序列的位置30、165、282或538的两个或更多个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含或由具有在SEQ ID NO:59序列的位置30、165、282或538中3个或多于3个位置的氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶，其包含具有在以下SEQ ID NO: 59序列的位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggyBac™ (sPBo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可包含或由SEQ IDNO: 59序列的氨基酸序列组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，超级piggyBac™ (sPBo)转座酶可以包含或由与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列组成：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ IDNO: 60)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、 177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在以下一个或多个位置的氨基酸取代：46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置177的氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQID NO: 60的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置296的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ IDNO: 60的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置327的氨基酸取代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO:60的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 59或SEQ ID NO: 60的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的一个或多个的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶还可包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO: 60的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括那些其中piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 60序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，和在SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含SEQ ID NO: 59的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、SEQ ID NO: 59的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代、SEQ ID NO: 59的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和SEQ ID NO: 59的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
支架蛋白的产生与生成
本公开内容的至少一个支架蛋白可任选地通过本领域熟知的细胞系、混合的细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体生产。见例如，Ausubel, et al., ed., 分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons,Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., 分子克隆：实验室手册(MolecularCloning: A Laboratory Manual), 第二版、Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow和Lane、抗体，实验室手册(Antibodies, a Laboratory Manual), Cold Spring Harbor,N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., 免疫学的通用方案(Current Protocols inImmunology), John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al.,蛋白质科学的通用方案(CurrentProtocols in Protein Science), John Wiley & Sons, NY,N.Y., (1997-2001)。
支架蛋白中的氨基酸可以被改变、添加和/或缺失 以降低免疫原性或减少、增强或修改结合、亲和力、结合率(on-rate)、解离率(off-rate)、亲合力(avidity)、特异性、半衰期、稳定性、溶解性或本领域已知的任何其它合适的特性。
任选地，可对支架蛋白进行工程改造以保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性。为达到这个目标，支架蛋白可任选地通过利用亲本和工程序列的三维模型对亲代序列和各种概念工程产物的分析过程来制备。三维模型通常是可获得的且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序是可供利用的，其说明和显示选定候选序列的可能三维构象结构并可测量可能的免疫原性(如，Xencor, Inc. of Monrovia, Calif.的Immunofilter程序)。对这些展示的检查允许分析残基在候选序列功能中的可能作用，即分析影响候选支架蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，残基可以从亲代序列和参考序列中选择和组合，从而达到预期的特性，例如对目标抗原的亲和力。做为选择，或除上述程序外，其它合适的工程方法也可以使用。
支架蛋白的筛选
筛选与类似蛋白或片段特异结合的蛋白支架可以方便地使用核苷酸(DNA或RNA展示)或肽展示库，例如体外展示来实现。这种方法包括对具有所需功能或结构的单个成员收集的大量肽进行筛选。展示的核苷酸或肽序列的长度可以是3-5000或更多个合成核苷酸或氨基酸，常见为5-100个氨基酸长，且常常为约8-25氨基酸长。除了生成肽库的直接化学合成方法外，几种重组DNA方法已被描述。一种类型涉及肽序列在噬菌体或细胞表面上的展示。每个噬菌体或细胞含有编码特定展示的肽序列的核苷酸序列。这样的方法被描述于PCT专利公布号91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中。
生成肽库的其它系统具有体外化学合成和重组两种方法的特点。见，PCT专利公布号92/05258、92/14843，和96/19256。也见，美国专利号5,658,754；和5,643,768。肽展示库、载体，和筛选试剂盒可从这样的供应商经市售获得，如Invitrogen (Carlsbad、Calif.)，和Cambridge Antibody水平技术 (Cambridgeshire、UK)。见例如，授权于Enzon的美国专利号4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5856456；授权于Dyax的5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500，授权于Affymax的5,427,908、5,580,717；授权于Cambridge AntibodyTechnologies的5,885,793；授权于Genentech的5,750,373，授权于Xoma的5,618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417；Colligan, 同上；Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上。
本公开内容的蛋白支架可结合具有广泛范围的亲和力(KD)的人或其他哺乳动物蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的至少一个蛋白支架可任选地以高亲和力，例如，以等于或少于约10-7 M，例如但不限于0.1-9.9 (或其中的任何范围或值) X 10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值的KD结合于目标蛋白、如由本领域技术人员通过实施表面等离子体共振或Kinexa方法所测定的。
蛋白支架对抗原的亲和性(affinity)或亲合力(avidity)可以用任何合适的方法经实验确定(见，例如，Berzofsky、et al., “抗体-抗原相互作用(Antibody-AntigenInteractions)”, In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed.,Raven Press: NewYork, N.Y. (1984); Kuby、Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York,N.Y. (1992)；和在此描述的方法)。如果在不同的条件(如，盐浓度、pH)下测量，特定的蛋白支架-抗原相互作用的测量的亲和力可能会有所不同。因此，亲和力和其它抗原-结合参数(如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用蛋白支架和抗原的标准化溶液和标准化缓冲剂(如在此描述的缓冲剂)进行。
竞争性试验可以用本公开内容的蛋白支架执行，以确定哪些蛋白、抗体，和其他拮抗剂与本发明的蛋白支架竞争对目标蛋白的结合和/或共享表位区。这些随本领域普通技术人员来说是很容易知道的试验 评价拮抗剂或配体之间对有限数量的蛋白上的结合位点的竞争。蛋白和/或抗体在竞争前后是固定或不溶解的，且例如，通过倾斜(其中蛋白/抗体已预先溶解)或通过离心(其中蛋白/抗体在竞争反应后沉淀)，使与目标蛋白结合的样品与未结合的样品分离。同样，竞争性结合可能由蛋白支架与目标蛋白的结合或缺乏结合的功能是否改变而决定，例如，蛋白支架分子是否抑制或增强例如标记的酶促活性。ELISA和其他功能分析可被使用，这是本领域熟知的。
核酸分子
本公开内容编码蛋白支架的核酸分子可呈现为RNA的形式，如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或为DNA的形式，包括，但不限于CDNA和通过克隆获得的或合成产生的基因组DNA，或其任何组合。DNA可以是三链、双链或单链的，或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或它可以是非-编码链，也称为反义链。
本公开内容的分离的核酸分子可包含含有开放阅读框(ORF)的核酸分子，任选地具有一个或多个内含子，例如，但不限于至少一个蛋白支架的至少一个特定的部分；包含结合目标蛋白的蛋白支架或环区的编码序列的核酸分子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码如在此描述的和/或如本领域已知的蛋白支架的核酸分子。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，对于本领域技术人员来说，生产这样的简并核酸变体将是例行的事，所述核酸变体编码本发明的特定蛋白支架。见例如，Ausubel、et al., 同上，这样的核酸变体被包括在本发明内。
如在此指明的，本公开内容的包含核酸编码蛋白支架的核酸分子可包括，但不限于那些编码蛋白支架片段自身的氨基酸序列；完整蛋白支架或其部分的编码序列；蛋白支架、片段或部分的编码序列，以及附加序列，如至少一个信号先导或融合肽的编码序列，有或没有前面提到的附加编码序列，例如至少一个与附加的非-编码序列一起的内含子，包括但不限于非-编码5′和3′序列，如在转录、mRNA加工，包括剪接和多腺苷化信号(例如，mRNA的核糖体结合和稳定性)中起作用的转录的，非翻译的序列；编码额外的氨基酸的附加编码序列，例如提供额外功能的那些。因此，编码蛋白支架的序列可融合于标记序列，如编码促进包含蛋白支架片段或部分的融合蛋白支架的纯化的肽序列
选择性地与如在此描述的多核苷酸杂交的多核苷酸
本公开内容提供在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，这个实施方案的多核苷酸可被用于分离、检测，和/或定量包含这样的多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可被用来在保藏的库中鉴定、分离，或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是基因组的或分离的cDNA序列，或者相反，与来自人类或哺乳动物核酸库的cDNA互补。
优选地，cDNA库包含至少80%的全长序列，优选至少85%或90%的全长序列，且更优选至少95%的全长序列。cDNA库可以标准化以增加稀有序列的表示。低或中度严格性的杂交条件通常但不排除地用于相对于互补序列具有减少序列同一性的序列。中和高严格性条件可任选地用于具有更大同一性的序列。低严格性条件允许具有约70%序列同一性的序列的选择性杂交并可被用来鉴定正向同源或共生同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸将编码至少一部分由在此描述的多核苷酸编码的蛋白支架。本发明的多核苷酸包含可被用于与编码本发明的蛋白支架的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。见例如，Ausubel, 同上；Colligan, 同上，各自通过引用全文并入本文。
核酸的构建
本公开内容的分离的核酸采用以下方法制备：(a) 重组方法，(b) 合成技术；(c) 纯化技术，和/或(d) 其组合，如本领域熟知的。
除了本发明的多核苷酸外，所述核酸可方便地还包含其他序列。例如，包含一个或多个限制性内切酶位点的多克隆位点可插入核酸中以帮助分离多核苷酸。同样，可以插入可翻译的序列，以帮助分离本公开内容的翻译的多核苷酸。例如，六聚-组氨酸标记序列提供了一种纯化本公开内容的蛋白的便利方法。本公开内容的核酸(不包括编码序列)可任选地为用于本公开内容的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、适配体或接头。
附加序列可被加入到这样的克隆和/或表达序列中，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改善多核苷酸在细胞中的导入。克隆载体、表达载体、适配体和接头是本领域熟知的(见例如，Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上)。
构建核酸的重组方法
本公开内容的分离的核酸组合物，如RNA、CDNA、基因组DNA，或其任何组合，可以使用任意数量的本领域技术人员已知的克隆方法从生物来源获得。在一些实施方案中，在严格的条件下，与本发明的多核苷酸选择性地杂交的寡核苷酸探针被用来鉴定 cDNA或基因组DNA库中的期望的序列。RNA的分离，和cDNA和基因组库的构建是本领域普通技术人员熟知的(见例如，Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上)。
核酸筛选和分离方法
cDNA或基因组库可使用基于本公开内容多核苷酸的序列的探针进行筛选。探针可被用来与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离同一或不同生物中的同源基因。本领域技术人员将意识到，该方法可采用不同程度的杂交强度；和无论是杂交还是洗涤介质都可以是严格的。因为杂交的条件越来越严格，探针和靶标之间必须有更大程度的互补性，才能形成双链。严格程度可由温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一个或多个因素控制。例如，通过改变反应物溶液的极性，可以例如通过控制甲酰胺的浓度在0%-50%的范围内，方便地改变杂交的严格性。为可检测的结合所需的互补性(序列同一性)程度将根据杂交培养基和/或洗涤介质的严格性而有所不同。互补性程度将最好为100%，或70-100%，或其中的任何范围或值，然而，应该理解，探针和引物中的微小序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性来补偿。
RNA或DNA的扩增方法是本领域熟知的并可依据本公开内容基于本文的讲述和指导采用，而无需不适当的实验。
DNA或RNA扩增的已知的方法包括，但不限于聚合酶链反应(PCR)和相关扩增过程(参见例如，授予Mullis, et al.的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor, et al的4,795,699和4,921,794；授予Innis的5,142,033；授予Wilson,et al.的5,122,464；授予Innis的5,091,310；授予Gyllensten, et al的5,066,584；授予Gelfand, et al的4,889,818；授予Silver, et al的4,994,370；授予Biswas的4,766,067；授予Ringold的4,656,134)和RNA介导的扩增(使用对作为双链DNA合成模板的目标序列的反义RNA) (授予Malek, et al的美国专利号5,130,238，商品名NASBA)，其参考文献的全部内容通过引用并入本文(见例如，Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上)。
例如，聚合酶链反应(PCR)技术可被用来扩增本公开内容的多核苷酸的序列和直接来自基因组DNA或cDNA库的相关基因。PCR和其它体外扩增方法也可用于例如克隆编码要表达的蛋白的核酸序列，制备用作检测期望的mRNA在样品中的存在，对核酸测序，或用于其它目的的探针的核酸。通过体外扩增方法足以指导技术人员的技术的实例见于Berger, 同上, Sambrook, 同上，和Ausubel, 同上，以及Mullis、et al., 美国专利号4,683,202(1987)；和Innis、et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)。用于基因组PCR扩增的市售可获得的试剂盒是本领域已知的。见例如，优等-GC基因组PCR试剂盒(Advantage-GC GenomicPCR Kit) (Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可被用来提高长PCR产物的收率。
构建核酸的合成方法
本公开内容的分离的核酸也可以用已知的方法，通过直接化学合成来制备(见例如，Ausubel, et al., 同上)。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板，用DNA聚合酶聚合而转化成双链DNA。本领域技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成可能限制在大约100个或更多碱基的序列，更长的序列可以通过连接较短的序列获得。
重组表达盒
本公开内容进一步提供包含本公开内容的核酸的重组表达盒。本公开内容的核酸序列，例如，编码本公开内容的蛋白支架的cDNA或基因组序列，可被用来构建可引入至少一个期望的宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常包含可操作地连接到转录起始调控序列的本公开内容的多核苷酸，所述调控序列将指导预期宿主细胞中多核苷酸的转录。异源的和非-异源的(即，内源的)启动子都可能被用来指导本公开内容的核酸的表达。
在一些实施方案中，用作启动子、增强子，或其它元素的分离的核酸可在本公开内容的多核苷酸的非-异源形式的适当位置(上游、下游或在内含子中)引入，以便上调或下调本公开内容的多核苷酸的表达。例如，内源性启动子可以在体内或体外通过突变、缺失和/或替代而改变。
载体和宿主细胞
本公开内容也涉及包含分离的本公开内容的核酸分子的载体、用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和用重组技术制备的至少一种蛋白支架，这是本领域熟知的。见例如，Sambrook, et al., 同上；Ausubel, et al.,同上，各自通过引用全文并入本文。
例如，可使用PB-EF1a载体。图4中提供了载体的图。载体包含以下核苷酸序列：
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多核苷酸可任选地连接到包含可选择标记的载体，以供在宿主中增殖。一般来说，在沉淀物中引入质粒载体，如磷酸钙沉淀，或在一个带电荷脂质的复合物中。如果载体是病毒，它可以用合适的包装细胞系在体外包装，然后导入宿主细胞。
DNA插入应该可操作地连接到适当的启动子上。表达构建体还将包含转录起始、终止的位点，并在转录区包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录子的编码部分将优选地包含从开头开始的翻译和适当定位在要翻译的mRNA末端的终止密码子(如，UAA、UGA或UAG)，UAA和UAG优先用于哺乳动物或真核细胞表达。
表达载体将优选地(但任选地)包括至少一个可选择的标记。这样的标记包括，例如，但不限于氨苄西林、博来霉素(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、麦考酚酸，或谷氨酰胺合成酶(GS、美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因)，对真核细胞培养以及氨苄西林、博来霉素(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、卡那霉素、大观霉素、链霉素、羧苄西林、博莱霉素、红霉素、多粘菌素B，或四环素 对在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的耐药基因(以上专利通过引用全部并入本文)。对于上述宿主细胞的适宜的培养基和条件是本领域已知的。对于技术人员而言，合适的载体将是显而易见的。将载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知的方法进行。这样的方法在本领域有描述，如Sambrook, 同上, 章节1-4和16-18; Ausubel, 同上, 章节1、9、13、15、16。
表达载体将优选地(但任选地)包含至少一个可选择的细胞表面标记，以供分离由本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的细胞表面标记包含表面蛋白、糖蛋白，或浆细胞的或细胞的子集与另一个定义的细胞子集区分开来的蛋白组。优选地，可选择的细胞表面标记将由本公开内容的组合物和方法修饰的那些细胞与未由本公开内容的组合物和方法修饰的那些细胞区分开来。这样的细胞表面标记包括，例如，但不限于“指定簇”或“分类决定子”蛋白(通常缩写为“CD”)，例如截短的或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52，或其任何组合。细胞表面标记还包括自杀基因标记RQR8(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)。
表达载体将优选地(但任选地)包括至少一个可选择的耐药标记，以供分离由本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的耐药标记可包含野生型或突变体Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2，或其任何组合。
至少一个本公开内容的蛋白支架可以以一种修饰的形式表达，例如融合蛋白，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括额外的异源功能区。例如，额外的氨基酸区，特别是荷电的氨基酸，可被加入到蛋白支架的N-末端，以提高在纯化过程中，或在随后的处理和储存过程中的稳定性和在宿主细胞中的持久性。同样，所述肽部分可加入到本公开内容的蛋白支架以促进纯化。在最后制备蛋白支架或其至少一个片段之前，可以移除这样的区。这样的方法被描述于许多标准实验室手册，如Sambrook, 同上, 章节17.29-17.42和18.1-18.74; Ausubel, 同上, 章节16、17和18。
本领域普通技术人员对大量可用于表达编码本公开内容的蛋白的核酸表达系统非常了解。做为选择，通过在含有编码本公开内容的蛋白支架的内源性DNA的宿主细胞中打开(通过操作)，本公开内容的核酸可在宿主细胞中表达。这样的方法是本领域熟知的，例如，如在美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述，通过引用全部并入本文。
可用于制备蛋白支架、其特定部分或变体的示例性细胞培养，是本领域已知的细菌、酵母，和表达细胞。表达细胞系统常常以单层细胞的形式存在，尽管哺乳动物细胞悬液或生物反应器也可以被使用。本领域已经开发出许多能够表达完整糖基化蛋白的合适的宿主细胞系，并包括COS-1 (如，ATCC CRL 1650)、COS-7 (如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(如，ATCC CRL-10)、CHO (如，ATCC CRL 1610)和BSC-1 (如，ATCC CRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) , Manassas, Va.(www.atcc.org)容易地获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1851)。在特别优选的实施方案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
用于这些细胞的表达载体可包含一个或多个以下的表达控制序列，例如，但不限于复制起点；启动子(如，延迟或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062; 5,385,839)、HSV tk启动子、pgk (磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一个人启动子；增强子，和/或处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag聚A加成位点)，和转录终止子序列。见例如，Ausubel etal., 同上；Sambrook、et al., 同上。可用于制备本发明的核酸或蛋白的其它细胞是已知的和/或可从例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(American Type CultureCollection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas) (www.atcc.org)或其它已知的或商业来源获得。
当利用真核宿主细胞时，多腺苷酸化或转录终止子序列通常被结合到载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。转录本的准确剪接序列也可以包括在内。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague、et al., J. Virol. 45:773-781 (1983))。另外，控制宿主细胞复制的基因序列可以结合到载体中，如本领域已知的。
蛋白支架的纯化
用众所周知的方法可以从重组细胞培养中回收和纯化蛋白支架，包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和层析、羟基磷灰石色谱和凝集素层析。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。见例如，Colligan, 免疫学的通用方案(Current Protocols in Immunology)，或蛋白质科学的通用方案(Current Protocols in Protein Science), John Wiley & Sons, NY,N.Y., (1997-2001), 如，章节1、4、6、8、9、10，各自通过引用全文并入本文。
本公开内容的蛋白支架包括天然纯化的产物、化学合成工艺的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主，包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和表达细胞生产的产物。取决于重组生产程序中所用的宿主，本公开内容的蛋白支架可以被糖基化或可以被非-糖基化。这样的方法被描述于许多标准实验室手册，如Sambrook, 同上、Sections 17.37-17.42; Ausubel, 同上, 章节10、12、13、16、18和20, Colligan, Protein Science, 同上, 章节12-14，所有通过引用全部并入本文。
氨基酸密码
组成本公开内容的蛋白支架的氨基酸通常都是缩写的。氨基酸命名可以通过用其单字母代码指定氨基酸、其三个字母代码，名称，或本领域普遍理解的三个核苷酸密码子来表示(见Alberts, B., et al., 细胞的分子生物学(Molecular Biology of The Cell), 第3版, Garland Publishing, Inc., New York, 1994)。本公开内容的蛋白支架可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，无论是从自然突变或人为操纵，如本文所指定的。本公开内容的蛋白支架中为功能所必需的氨基酸，可以通过本领域已知的方法来识别，如例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(如，Ausubel, 同上, 章节8, 15; Cunningham和Wells,Science 244:1081-1085 (1989))。后一种程序在分子中的每一个残基上都引入了单一的丙氨酸突变。然后对产生的突变分子进行生物活性测试，例如，但不限于至少一种中和活性。蛋白支架结合的关键位点也可通过结构分析来确定，如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith、et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)和de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992))。
如技术人员所意识到的，本发明包括至少一个生物活性的本公开内容的蛋白支架。生物活性的蛋白支架具有天然的(非-合成)、内源的或相关和已知的蛋白支架的特异性活性的至少20%、30%，或40%，和优选至少50%、60%，或70%，且最优选至少80%、90%，或95%-99%或更多的特异性活性。酶活性和底物特异性的测定和定量测量的方法是本领域技术人员熟知的。
在另一方面，本公开内容涉及如在此描述的蛋白支架和片段，其被有机分子的共价附着修饰。这样的修饰可产生一种具有改进的药代动力学特性的蛋白支架片段(如，增加的体内血清半衰期)。有机部分可以是线性或支化的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。在特定的实施方案中，亲水性聚合物基团可具有约800-约120,000道尔顿的分子量并可以是聚链烷二醇(如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，和脂肪酸或脂肪酸酯基可包含从约8至约40个碳原子。
本公开内容的修饰蛋白支架和片段可包含一个或多个与抗体直接或间接地共价结合的有机部分。结合于本公开内容的蛋白支架或片段的每个有机部分可独立地为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。如本文所用的，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。如本文所用的术语“亲水性聚合物基团”，指一种比在辛烷中更易溶于水的有机聚合物。例如，聚赖氨酸比在辛烷中更易溶于水。因此，本公开内容涵盖通过聚赖氨酸的共价附着修饰的蛋白支架。适合于修饰本公开内容的蛋白支架的亲水性聚合物可以是线性或支化的并包括，例如，聚链烷二醇(如，PEG，单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(如，葡聚糖、纤维素、低聚糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷烃氧化物(如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本公开内容的蛋白支架的亲水性聚合物作为一个单独的分子实体时，具有约800-约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG5000和PEG 20,000，其中下标是聚合物的平均分子量(道尔顿)。亲水性聚合物基团可用1-约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基取代。用脂肪酸或脂肪酸酯基取代的亲水性聚合物可采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可以偶联到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸盐上，和在脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸盐(如，用羰基二咪唑激活)可以偶联到聚合物上的羟基上。
适合于修饰本公开内容的蛋白支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，也可以包含一个或多个不饱和单位。适合于修饰本公开内容的蛋白支架的脂肪酸包括，例如，正-十二烷酸(C12，月桂酸)、正-十四烷酸(C14，豆蔻酸)、正-十八烷酸(C18、硬脂酸)、正-二十烷酸(C20、花生酸)、正-二十二烷酸(C22、山萮酸)、正-三十烷酸(C30)、正-四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18、油酸)、所有顺式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸，十四碳二酸，十八碳二酸，二十二碳二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含线性或支化的低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可包含1-约12，优选地，1-约6个碳原子。
修饰的蛋白支架和片段可使用合适的方法，例如通过与一个或多个修饰剂反应来制备。如本文所用的术语“修饰剂”，指包含活化基团的合适的有机基团(如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或功能团，其可在适当的条件下与第二个化学基团反应，从而在修饰剂和第二个化学基团之间形成共价键。例如，胺-反应性活化基团包括亲电基团，如甲苯磺酸、甲磺酸、卤代(氯代、溴代、氟代、碘代)、N-羟基琥珀酰基酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶二硫醚(pyridyl disulfides)、5-硫羟基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能团可偶联至含有胺或酰肼的分子，而叠氮基可与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯(phosphoramidate)或磷酰亚胺键(phosphorimide linkages)。将活化基团引入分子的合适的方法是本领域已知的(见 例如，Hermanson、G. T., Bioconjugate Techniques；Academic Press: San Diego, Calif. (1996))。活化基团可直接连接于有机基团(如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通过接头部分，例如，二价C1-C12基团，其中一个或多个碳原子可被杂原子，如氧、氮或硫替代。合适的接头部分包括，例如，四乙二醇(tetraethylene glycol)、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。例如，通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下，使单-Boc-烷基二胺(如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，形成在游离胺和脂肪酸羧酸盐之间的酰胺键，可制备包含接头部分的修饰剂。Boc保护基团可通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物除去,以暴露于可偶联至另一个所述的羧酸盐的伯胺，或可与马来酸酐反应，并使生成的产物环化生成一种活化的马来酰亚胺脂肪酸的衍生物(见，例如，Thompson, et al., WO 92/16221，其中的全部讲述都通过引用并入本文)。
本公开内容的修饰的蛋白支架可通过使蛋白支架或片段与修饰剂反应来制备。例如，通过使用胺-反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，可以非-位点特异性方式使有机部分结合于蛋白支架。包含结合于本公开内容的蛋白支架的特定位点的有机部分的修饰蛋白支架和片段可使用合适的方法，如反向蛋白水解(Fisch , et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaranet al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463(1997))，和在Hermanson、G. T., Bioconjugate Techniques；Academic Press: SanDiego, Calif. (1996)中描述的方法来制备。
包含另外的治疗活性成分的蛋白支架组合物
本发明的蛋白支架化合物、组合物或组合可以进一步包含任何合适的辅助剂，例如，但不限于稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等的至少一种。药学上可接受的辅助剂是优选的。制备这样的无菌溶液及制备方法的非限制性实例是本领域熟知的，例如，但不限于，Gennaro, Ed., Remington’s药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences), 第18版, Mack Publishing Co. (Easton、Pa.) 1990。可常规选择适合于本领域熟知的或如在此描述的蛋白支架、片段或变体组合物的给药方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。
可用于本发明的组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(如，糖，包括单糖、二-、三-、四-，和低聚糖；衍生的糖，如醛糖、醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其既可以单独存在，也可以组合存在，包含单独或组合量的1-99.99%重量或体积。示例性蛋白赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。代表性氨基酸/蛋白组分，其也可具有缓冲功能，包括丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，甜菜碱、组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适合用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，如果糖，麦芽糖，半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖，山梨糖等；二糖，如乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖等；多糖，如棉子糖、木密三糖(melezitose)、麦芽糊精、葡聚精、淀粉等；和醛醇，如甘露醇，木糖醇，麦芽酚，丙交醇，木糖醇、山梨醇(花楸糖醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋形剂是甘露醇，海藻糖，和棉子糖。
蛋白支架组合物也可包含缓冲剂或pH-调节剂；通常地，缓冲剂是由从有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris, 盐酸氨丁三醇，或磷酸盐缓冲液。用于本发明组合物的优选的缓冲剂是有机酸盐，例如柠檬酸盐。
此外，本发明的蛋白支架组合物可包括聚合物赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(ficolls) (聚合糖)、葡萄糖结合剂(如，环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂，抗菌剂，甜味剂，抗氧化剂，抗静电剂，表面活性剂(如，聚山梨醇酯，如“TWEEN20”和“TWEEN 80”)、脂质(如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(如，胆固醇)，和螯合剂(如，EDTA)。
适合用于依据本发明的蛋白支架、部分或不同成分的这些和另外的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如，如在“Remington：药物科学和实践(Remington: TheScience & Practice of Pharmacy)”, 第19版, Williams & Williams、(1995)，和在“临床药师案头参考书(Physician's Desk Reference)”, 第52版, Medical Economics,Montvale, N.J. (1998)中列出的，其公开内容通过引用全部并入本文。优选的载体或赋形剂原料是碳水化合物(如，糖和醛醇)和缓冲剂(如，柠檬酸盐)或聚合剂。示例性载体分子是粘多醣、透明质酸，其可用于关节内递送。
制剂
如上所述，本发明提供稳定的制剂，其优选地包含含盐或选择盐的磷酸盐缓冲剂，以及保存的溶液和含有防腐剂和多用途保藏制剂的制剂，其适用于医药或兽医用途，其包含在药学上可接受的制剂中的至少有一个蛋白支架。保存的制剂含有至少一个已知的防腐剂或任选地选自在水性稀释剂中的苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(如，六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物的至少一种。可如本领域已知的使用任何合适的浓度或混合物，如约0.0015%，或any 范围、值，或其中的部分。非-限制性实例包括，除防腐剂外，约0.1-2%间-甲酚(如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、约0.1-3%苄醇(如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、约0.001-0.5%硫柳汞(如，0.005、0.01)、约0.001-2.0%苯酚(如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005-1.0%对羟基苯甲酸烷基酯(如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)等。
如上所述，本发明提供一种制造物品，包括包装材料和至少一个小瓶，小瓶包含含有规定的缓冲液和/或防腐剂的至少一个蛋白支架的溶液，任选在水性稀释剂中，其中所述包装材料包含指示这样的溶液可保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长的时期的标签。本发明进一步包含一种制造物品，其包含包装材料、包含冻干的至少一个蛋白支架的第一个小瓶，和第二个小瓶包含规定的缓冲剂或防腐剂的水性稀释剂，其中所述包装材料包含一个标签，该标签指示患者在水性稀释剂中重新构成至少一个蛋白支架，以形成可在24小时或更长时间内保持的溶液。
根据本发明所用的至少一个蛋白支架可通过重组方法，包括从哺乳动物细胞或转基因制剂产生，或可从其他生物源中提纯，如本文所述或本领域所知的。
在本发明的产物中至少一个蛋白支架的范围包括在重新构成时产生的量，如果是在湿/干系统中，则浓度是从约1.0 μg/ml至约1000 mg/ml，尽管较低和更高的浓度是可操作的，并且取决于预定的递送介质，例如溶液制剂将不同于透皮贴片，肺，经粘膜，或渗透或微泵方法。
优选地，水性稀释剂任选地进一步包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括从苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯。丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物组成的一组选择的那些。用于制剂的防腐剂的浓度是足以产生抗-微生物效应的浓度。这样的浓度取决于所选择的防腐剂并很容易由熟练的技术人员决定
其它赋形剂，例如，等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂，和防腐增强剂可任选地和优选地添加到稀释剂中。等渗剂，如甘油，通常以已知的浓度使用。优选加入生理上耐受的缓冲液，以提供改进的pH控制。制剂可覆盖广泛范围的pHs，如从约pH 4-约pH 10，且优选从约pH 5至约pH9的范围，且最优选从约6.0-约8.0的范围。优选地，本发明的制剂具有在约6.8和约7.8之间的pH。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
其它添加剂，例如药学上可接受的增溶剂如Tween 20 (聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、Tween 40 (聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕酸酯)、Tween 80 (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、普朗尼克F68 (聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)，和PEG (聚乙二醇)或非-离子表面活性剂，如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188、普朗尼克®多元醇、其它嵌段共聚物，和螯合剂，如EDTA和EGTA，可任选地添加到制剂或组合物中以减少聚集。这些添加剂是特别有用的，如果使用泵或塑料容器给予制剂的话。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻蛋白聚集的倾向。
本发明的制剂可通过这样的方法制备，其包括将至少一个蛋白支架与选自苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯。丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物的防腐剂在水性稀释剂中混合。在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架和防腐剂使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的制剂，例如，在缓冲溶液中至少有一个蛋白支架的测量的量与缓冲溶液中足以提供所需浓度的蛋白和防腐剂的量合并在一起。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如，组分加入的次序，是否使用额外的添加剂，制备制剂的温度和pH，都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。
要求的制剂可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者，包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架，所述支架用第二瓶中含有的水、防腐剂和/或赋形剂(最好是磷酸盐缓冲液和/或盐水以及选定的盐)在水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者治疗，从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。
目前要求的制造物品可用于在当即到24小时或更长的时间范围内给药。因此，目前要求的制造物品给患者提供显著的优点。本发明的制剂可任选地在从约2℃至约40℃的温度下安全地储存并长时间保持蛋白的生物活性，因此，允许使用一个包装标签，该标签指示该溶液可以在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的一段时间内持有和/或使用。如果使用保存的稀释剂，这样的标记可使用至多1-12个月、半年、1年半，和/或两年。
本发明的至少一个蛋白支架的溶液可通过包括在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架的方法制备。混合使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的稀释剂，例如，至少一个蛋白支架在水或缓冲剂中测量的量与足以提供所需浓度蛋白和任选的防腐剂或缓冲剂的量合并。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如，组分加入的次序，是否使用额外的添加剂，制备制剂的温度和pH，都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。
要求的产物可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者，包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架，所述支架用第二瓶中含有的水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法，从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。
要求的产物可通过向药房、诊所或其他此类机构和设施提供澄清的溶液或双瓶而间接提供给患者，所述双瓶包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架，其用第二瓶中含有的水性稀释剂中重新构成。在这种情况下的澄清溶液可以达到一升或甚至更大的大小，提供一个大储藏室，从中至少一个蛋白支架溶液的较小部分可被回收一次或多次以供转移到较小的小瓶中并由药房或诊所提供给其顾客和/或患者。
包含单瓶系统的识别装置包括用于输送溶液的笔式喷射器装置，如BD Pens、BDAutojector®、Humaject®、NovoPen®、B-D®Pen、AutoPen®，和OptiPen®、GenotropinPen®、Genotronorm Pen®、Humatro Pen®、Reco-Pen®、Roferon Pen®、Biojector®、Iject®、J-tip Needle-Free Injector®、Intraject®、Medi-Ject®，例如，如由Becton Dickinson (Franklin Lakes、N.J.、www.bectondickenson.com)、Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland,Oreg. (www.bioject.com); National Medical l Products, Weston Medical(Peterborough, UK, www.weston-medical.com)、Medi-Ject Corp (Minneapolis,Minn., www.mediject.com)制造或开发的，及类似的合适装置。包含双瓶系统的识别装置包括那些用于在药盒中重新构成冻干药物以供递送已重构的溶液的笔式喷射器系统，如HumatroPen®。其它合适的装置的实例包括预填充注射器、自动注射器、无针注射器和无针静脉输液器。
目前要求的产物包括包装材料。包装材料除提供监管机构要求的信息外，还提供产品使用的条件。本发明的包装材料提供给患者操作的指示，在水性稀释剂中重新构成至少一个蛋白支架，以形成溶液并在2-24小时或更长的时间内使用该溶液，用于两瓶(湿/干)产品。对于单瓶溶液产品，标签指明这种溶液可以在2-24小时或更长的时间内使用。目前要求的产品对于人类药品的使用是有用的。
本发明的制剂可通过这样的方法制备，其包括混合至少一个蛋白支架和选择的缓冲剂，优选地，磷酸盐缓冲剂含有盐水或选择的盐。在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架和缓冲剂使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的制剂，例如，使至少一个蛋白支架在水或缓冲剂中测量的量与足以提供所需浓度的蛋白和缓冲剂的所需缓冲剂在水中的量合并。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如，组分加入的次序，是否使用额外的添加剂，制备制剂的温度和pH，都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。
要求的稳定或保存的制剂可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者，包括一小瓶冻干的蛋白支架，所述支架用第二瓶中含有的防腐剂和赋形剂在水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法，从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。
稳定蛋白支架的其它制剂或方法可导致包含蛋白支架的冻干粉末的澄清溶液以外的其他制剂。在非澄清的溶液中有含有微粒悬浮液的制剂，所述微粒是一种组合物，其含有可变尺寸的结构和各种被称为微球、微粒、纳米颗粒、纳米球或脂质体的蛋白支架。这样的相对均一的，基本上是球形的含有活性物质的微粒制剂可通过使含有活化剂和聚合物的水相和非水相接触，接着使非水相蒸发，导致水相中粒子的聚结而形成，如在美国专利号4,589,330中讲述的。多孔微粒可使用含有活化剂的第一相和分散在连续溶剂中的聚合物并用冷冻干燥或稀释萃取沉淀从悬浮液中除去所述溶剂来制备，如在美国专利号4,818,542中讲述的。用于此类制剂的优选的聚合物是选自以下的天然或合成共聚物或聚合物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚羟基乙酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-乳酸共聚物)、聚(ε-己内酯-乙醇酸共聚物)、聚(β-羟基丁酸)、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟基乙基DL-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-六亚甲基二异氰酸酯)和聚(甲基甲基丙烯酸酯)。特别优选的聚合物是聚酯，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-乳酸共聚物)，和聚(ε-己内酯-乙醇酸共聚物)。可用于溶解聚合物和/或活性剂的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、苯，或六氟丙酮倍半水合物。用第二相分散含活性剂相的过程可包括压力迫使所述的第一相通过喷嘴中的孔来影响液滴的形成。
干粉制剂可从冻干以外的过程产生，如通过喷雾干燥或溶剂萃取，通过蒸发或沉淀结晶成分，然后采取一个或多个步骤去除水性或非水性溶剂。喷雾干燥蛋白支架制剂的制备在美国专利号6,019,968中讲述。蛋白支架基干粉组合物可以在提供一种可吸入的干粉的条件下，通过喷雾干燥蛋白支架的溶液或浆液以及任选的在溶剂中的赋形剂来制备。溶剂可包括极性化合物，如水和乙醇，它们可容易被干燥。蛋白支架稳定性可在没有氧气的情况下(例如在氮气覆盖下)执行喷雾干燥程序或通过使用氮气作为干燥气体来增强。另一个相对干燥的制剂是分散在通常包含氢氟烷烃推进剂的悬浮介质中的多个穿孔微结构的分散体，如在WO 9916419中讲述的。使用计量吸入器，可将稳定的分散剂应用于患者的肺部。可用于喷雾干燥药物工业生产的设备由Buchi Ltd.或Niro Corp.制造。
至少一个蛋白支架在本文所述的稳定或保存的制剂或溶液中，可根据本发明，经由各种递送方法给予患者，包括SC或IM注射；透皮，肺，经粘膜，植入物，渗透泵，药盒，微型泵，或技术人员认可的其他方法，如本领域熟知的。
治疗应用
本发明也提供一种使用至少一个本发明的蛋白支架在细胞、组织、器官、动物，或患者中调节或治疗疾病的方法，如本领域已知的或如在此描述的，例如用治疗有效量的蛋白支架给予或接触细胞、组织、器官、动物，或患者。本发明也提供一种在细胞、组织、器官、动物，或患者中调节或治疗疾病(包括，但不限于恶性疾病)的方法。
本发明也提供一种在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗至少一种恶性疾病的方法，包括，但不限于至少一种以下的疾病：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性淋巴细胞白血病、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、急性骨髓性白血病，慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤，卡波济氏肉瘤，结肠直肠癌，胰腺癌、鼻咽癌，恶性组织细胞增生症，副肿瘤综合征/恶性肿瘤高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈部癌、遗传性非息肉病癌、何杰金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，睾丸癌、腺癌，肉瘤，恶性黑色素瘤，血管瘤，转移性疾病，癌症相关骨吸收，癌症相关骨痛等。
本发明的任何方法可包括将包含至少一个蛋白支架的有效量的组合物或药物组合物给予需要这样的调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这样一种方法可任选地进一步包括共同给药或组合疗法以供治疗这样的疾病或障碍，其中所述至少一个蛋白支架、特定的部分或其变体的给予，进一步包括之前、同时和/或之后给予至少一种选自烷化剂、有丝分裂抑制剂，和放射性药物中的至少一种。合适的剂量是本领域熟知的。见例如，Wells et al., eds.,药物治疗手册(Pharmacotherapy Handbook), 第二版, Appleton和Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon PocketPharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif.(2000); Nursing 2001 药物手册(Handbook of Drugs), 21st版, Springhouse Corp.,Springhouse, Pa.、2001; 卫生专业药物指南(Health Professional’s Drug Guide)2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River,N.J.，其中的各个参考文献通过引用全部并入本文。
优选的剂量可任选地包括约0.1-99和/或100-500 mg/kg/给予，或任何范围、值或其分数，或达到约0.1-5000 μg/ml血清浓度每单次或多次给予的血清浓度，或任何范围、值或其分数。对于本发明的蛋白支架的优选剂量范围是从约1 mg/kg，至多约3、约6或约12mg/kg患者体重。
做为选择，给予的剂量可能会有所不同，这取决于已知的因素，如特定药物的药效学特征及其给药方式和给药途径；的年龄、健康和体重；症状的性质和程度，合并治疗的种类，治疗的频率和期望的效果。通常活性成分的剂量可以是约0.1-100毫克每千克体重。普通地，0.1-50，和优选0.1-10毫克每千克每次给予或缓慢释放的形式对获得期望的结果是有效的。
作为一个非限制性实例，人或动物的治疗可作为至少一个本发明的蛋白支架的1次或定期剂量提供，每天约0.1-100 mg/kg或其任何范围、值或分数，在第1-40天中至少有一天，或者，做为选择或此外，在第1-52周中至少有一天，或者做为选择或此外，1-20年中至少有一天，或其任何组合，使用单次、输注或重复剂量。
适合于内部给予的剂型(组合物)通常每单位或容器含有从约0.001毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将普通地以基于组合物总重量约0.5-99.999%重量的量存在。
对于胃肠外给予，蛋白支架可配制为溶液、悬浮液、乳剂、颗粒、粉末或冻干粉，与药学上可接受的胃肠外媒介组合，或单独提供。这样的媒介的实例有水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液，和约1-10%人血清白蛋白。脂质体和非水媒介，如固定油，也可以使用。媒介或冻干粉末可含有保持等渗性(如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。制剂用已知的或合适的技术灭菌。
合适的药物载体被描述于最新版本的Remington’s药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences), A. Osol，一本本领域的标准参考书。
可供选择的给药
依据本发明可采用许多已知的和已开发的模式给予药物有效量的至少一个依据本发明的蛋白支架。虽然在下面的描述中使用了肺给药，根据本发明，可以使用其他给予方式，并取得适当的效果。本发明的蛋白支架可在载体中递送，作为溶液、乳液、胶体或悬浮液，使用在此描述的或本领域已知的各种适合吸入或其他方式给药的装置和方法的任何一种。
胃肠外制剂和给药
对于胃肠外给予的制剂可含有作为普通赋形剂无菌水或盐水、聚烷二醇，如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。用于注射的水性或油性悬浮液可根据已知的方法，使用适当的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备。用于注射的试剂可以是无毒的、非口服的稀释剂，如水溶液、无菌注射液或在溶剂中的悬浮液。作为合适的介质或溶剂，水、林格氏溶液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可使用无菌的非挥发油。为了这些目的，可以使用任何种类的非挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成单-或二-或三-甘油酯。胃肠外给予是本领域已知的并包括，但不限于传统的注射方式，一种如在美国专利号5,851,198中描述的气体加压无针注射装置，和如在美国专利号5,839,446中描述的激光射孔器装置，通过引用全部并入本文。
可供选择的递送
本发明进一步涉及通过胃肠外、皮下、肌肉、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔颈内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内，胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹腔内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内，肾内，视网膜内，椎管内，滑膜腔内，胸内，子宫内、膀胱内、病灶内、团状、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径给予至少一个蛋白支架。至少一个蛋白支架组合物可被制备用于胃肠外(皮下、肌肉或静脉)或任何其他给药方式，特别是以液体溶液或悬浮液的形式；用于阴道或直肠给予方式，特别是以半固体的形式，例如，但不限于乳膏和栓剂；用于口腔或舌下给药，例如，但不限于片剂或胶囊的形式；或鼻内，例如，但不限于粉末、滴鼻剂、喷雾剂或某些制剂的形式；或经皮，如不限于凝胶、软膏、洗剂、悬浮液或具有化学促进剂例如二甲亚砜以或者改变皮肤结构或者增加透皮贴剂的药物浓度的贴剂递送系统(Junginger, et al. In “药物渗透增强(Drug PermeationEnhancement);” Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York1994，通过引用全部并入本文)，或使用氧化剂，其能使含有蛋白和肽的制剂应用在皮肤上(WO 98/53847)，或应用电场以建立瞬态传输路径，如电穿孔，或增加带电药物通过皮肤的移动性，如离子导入，或超声波的应用，如声纳电泳(美国专利号4,309,989和4,767,402)(以上出版物和通过引用全部并入本文)。
肺/鼻给予
对于肺给药，优选地，至少一个蛋白支架组合物以颗粒大小递送到达肺或鼻窦的下气道是有效的。依据本发明，至少一个蛋白支架可由本领域已知的任何一种吸入或鼻腔装置递送，用于吸入治疗剂。能够在患者的窦腔或肺泡内沉积雾化的制剂的这些装置包括计量剂量吸入器，雾化器，干粉发生器，喷雾器等。其他适用于指引蛋白支架的肺或鼻给药的装置也是本领域已知的。所有这样的装置可使用适用于给予在气溶胶中分布蛋白支架的制剂。这样的气溶胶可包含或者溶液(水性和非水性两种溶液)或者固体颗粒。
计量剂量吸入器像Ventolin计量剂量吸入器，通常使用推进剂气体，在吸气时需要驱动(见例如，WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器像Turbuhaler™ (Astra)、Rotahaler® (Glaxo)、Diskus® (Glaxo)、Spiros™ 吸入器 (Dura)，由InhaleTherapeutics销售的装置，和Sp吸入器®粉末吸入器(Fisons)，使用混合粉末的呼吸驱动(美国专利号4,668,218 Astra、EP 237507 Astra、WO 97/25086 Glaxo、WO 94/08552Dura、美国专利号5,458,135 Inhale、WO 94/06498 Fisons，通过引用全部并入本文)。喷雾器像AERx™ Aradigm，Ultravent®喷雾器(Mallinckrodt)，和Acorn II®喷雾器(Marquest Medical Products) (美国专利号5,404,871 Aradigm、WO 97/22376)，以上参考文献通过引用并入本文，从溶液产生气溶胶，而计量剂量吸入器、干粉吸入器等生成小颗粒气溶胶。这些商业上可获得的吸入装置的具体例子旨在代表适合于本发明实践的特定装置，且并不是为了限制本发明的范围。
优选地，包含至少一个蛋白支架的组合物通过干粉吸入器或喷雾器递送。吸入装置有几个理想的特性，用于给予至少一个本发明的蛋白支架。例如，吸入装置的递药可靠，重复性好，准确性高。为了良好的呼吸适合性，吸入装置可任选地递送小干燥颗粒，例如少于约10 μm，优选约1-5 μm。
给予作为喷雾剂的蛋白支架组合物
包含蛋白支架组合物的喷雾剂可通过在压力下强制至少一种蛋白支架的悬浮液或溶液通过喷嘴而产生。可以选择喷嘴的尺寸和结构、施加的压力和液体进给率来达到预期的输出和粒度。例如，电喷雾可以通过与毛细管或喷嘴进料有关的电场产生。有利地，由喷雾器递送的至少一个蛋白支架组合物的颗粒具有少于约10 μm，优选在约1 μm至约5 μm，且最优选约2 μm至约3 μm的范围内的粒度。
适用于喷雾器的至少一个蛋白支架组合物的制剂通常包括蛋白支架组合物的水溶液，其浓度为约0.1 mg至约100 mg的至少一个蛋白支架组合物每mL溶液或mg/gm，或其中的任何范围、值，或分数。制剂可包括试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选锌。制剂也可包括赋形剂或用于稳定蛋白支架组合物的试剂，例如缓冲剂、还原剂、大体积蛋白，或是碳水化合物。可用于配制蛋白支架组合物的散装蛋白包括白蛋白、精蛋白等。可用于配制蛋白支架组合物的典型碳水化合物包括蔗糖，甘露醇，乳糖，海藻糖，葡萄糖等。蛋白支架组合物制剂也可包括表面活性剂，其可减少或防止在形成气溶胶中溶液雾化引起的蛋白支架组合物表面诱导的聚集。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。所述量通常介于制剂的0.001和14%重量之间的范围内。为了本发明目的，特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域已知的用于配制蛋白，如蛋白支架，或特定的部分或变体的另外的试剂也可包括在制剂中。
用喷雾器给予蛋白支架组合物
本发明的蛋白支架组合物可通过喷雾器给予，如喷射雾化器或超声波雾化器。通常地，在喷射雾化器中，压缩空气源被用来制造高速空气射流通过孔板。当气体在喷嘴外膨胀时，产生低压区，这迫使蛋白支架组合物的溶液通过连接到贮液器的毛细管被抽出。从毛细管流出的液体流被剪切成不稳定的细丝和液滴，当它离开管时，产生气溶胶。可以使用一系列的配置、流速和挡板类型来实现给定的喷射雾化器所需的性能特性在超声波雾化器中，高频电能被用来产生振动，机械能，典型使用压电换能器。这种能量被直接或通过耦合流体传递到蛋白支架组合物的制剂中，创建包含蛋白支架组合物的气溶胶。有利地，由雾化器递送的蛋白支架组合物的颗粒具有少于约10 μm，优选约1 μm至约5 μm，且最优选约2 μm至约3μm的范围内的粒度。
适用于雾化器，无论是喷射雾化器还是超声波雾化器的至少一个蛋白支架的制剂，通常包括浓度约0.1 mg至约100 mg的至少一个蛋白支架每mL溶液。制剂可包括试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选锌。制剂也可包含赋形剂或稳定至少一个蛋白支架组合物的试剂，例如缓冲剂、还原剂、散装蛋白，或碳水化合物。可用于配制至少一个蛋白支架组合物的散装蛋白包括白蛋白、精蛋白等。可用于配制至少一个蛋白支架的典型的碳水化合物包含蔗糖，甘露醇，乳糖，海藻糖，葡萄糖等。至少一个蛋白支架制剂也可包括表面活性剂，其可减少或防止在形成气溶胶中溶液雾化引起的至少一个蛋白支架表面诱导的聚集。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。所述量通常介于制剂的0.001和4%重量之间的范围内。为了本发明目的，特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域已知的用于配制蛋白，如蛋白支架的另外的试剂也可包括在制剂中。
用计量剂量吸入器给予蛋白支架组合物
在计量剂量吸入器(MDI)中，推进剂、至少一个蛋白支架，和任何赋形剂或其它添加剂作为一种混合物包含在罐内，其中包含液化压缩气体。计量阀的驱动作用将混合物释放为气溶胶，优选地含有在少于约10 μm，优选约1 μm至约5 μm，且最优选约2 μm至约3 μm的大小范围内的颗粒。所需的气溶胶粒度可通过使用蛋白支架组合物的制剂而获得，由本领域技术人员已知的各种方法，包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点凝结等产生。优选的计量剂量吸入器包括由3M或Glaxo制造的那些并使用氢氟碳化合物推进剂。用于计量剂量装置吸入器的至少一种蛋白支架的制剂将一般包含细分散粉末，其含有至少一个蛋白支架作为在非-水性培养基中的悬浮液，例如，在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，如氯氟烃、氢氯氟烃、氟烃，或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a (氢氟烷烃-134a)、HFA-227 (氢氟烷烃-227)等。优选地，推进剂是氟烃。可选择表面活性剂以稳定至少一个蛋白支架作为在推进剂中的悬浮液，保护活性剂免受化学降解等。合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况下，溶液气溶胶优先使用溶剂，如乙醇。用于蛋白制剂的本领域已知的另外的试剂也可包括在制剂内。本领域普通技术人员将认识到，本发明的方法可经由此处未描述的装置，将至少一个蛋白支架组合物经肺给予实现。
口服制剂和给药
用于口服给予的制剂依赖于共同给予辅助剂(如，间苯二酚和非离子表面活性剂，如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)，以人为地增加肠壁的通透性，以及酶抑制剂的共同给予(如，胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和抑肽酶)以抑制每降解。用于递送亲水剂的制剂，包括蛋白和蛋白支架以及至少两种表面活性剂的组合，打算用于口腔、粘膜、鼻腔、肺、阴道、跨膜，或直肠给予，讲述于美国专利号6,309,663中。口服用固体剂型的活性成分化合物可与至少一种添加剂混合，包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物，和甘油。这些剂型也可含有其它类型的添加剂，例如，非活性稀释剂、润滑剂、如硬脂酸镁、对羟基本甲酸酯、保水剂，如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚，抗氧化剂，如半胱氨酸，崩解剂，粘合剂，增稠剂，缓冲剂，甜味剂，调味剂，香料。
片剂和丸剂可被进一步加工成包肠衣的制剂。用于口服给予的液体制剂包括乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液和考虑到医学应用的溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于上述领域的不活跃稀释剂，例如水。脂质体也被描述为胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物微球已被用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，在美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753中描述的并用来口服递送生物活性剂的载体化合物是本领域已知的。
粘膜制剂和给药
用于口服包封在一种或多种生物相容性聚合物或共聚物赋形剂(优选可生物降解的聚合物或共聚物)中的生物活性剂，由于所合成的微胶囊的适当尺寸而提供的微胶囊，导致药物到达并被毛囊淋巴聚集物吸收，也称为动物的“集合淋巴小结(Peyer's patch)”或“GALT”，而不回因药物通过胃肠道而失效。类似的毛囊淋巴聚集物可在支气管(BALT)和大肠中被发现。上述组织一般称为粘膜相关淋巴网组织(MALT)。为了通过粘膜表面吸收，给予至少一个蛋白支架的组合物和方法包括由多个亚微米粒子、粘液粘附大分子、生物活性肽和水连续相组成的乳液，其通过实现乳化液颗粒的粘结作用，促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适用于本发明的乳剂应用的粘液表面可包括角膜、结膜、口、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道或直肠给予的制剂，例如，栓剂，可含有赋形剂，例如聚烷二醇、凡士林、可可脂等。鼻内给予的制剂可以是固体并含有赋形剂，例如，乳糖或可以是水或含油的滴鼻液。对于粘膜给药，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸、预凝胶化淀粉等(美国专利号5,849,695)。
透皮制剂和给药
对于透皮给药，至少一个蛋白支架被封装在递送装置中，如脂质体或聚合物纳米粒子、微粒、微胶囊或微球(统称为微粒，除非另有说明)。许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物组成的微粒，如聚羟基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚原酸酯、多元酸酐、聚磷腈(polyphosphazenes)和天然聚合物，如胶原蛋白、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白、藻酸盐和其它聚糖，及其组合(美国专利号5,814,599)。
长期给药和制剂
将本发明的化合物在延长的时间段递送至受试者可能是可取的，例如，为期一周至一年的单次给药。可使用各种缓释剂、贮库或植入物剂型。例如，剂型可含有药学上可接受的化合物的非-毒性盐，其在体液中的溶解度低，例如(a) 与多元酸，如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、扑酸、藻酸，聚谷氨酸，萘单或二磺酸，聚半乳糖醛酸等所成的酸加成盐；(b)与多价金属阳离子，如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或与从如，N,N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子所成的盐；或(c) (a)和(b)的组合，例如，单宁酸锌盐。此外，本发明的化合物，或者最好是一种相对不溶的盐，如刚才所述的盐，可在凝胶中配制，例如单硬脂酸铝凝胶，配以芝麻油，适合注射用。特别优选的盐是锌盐、单宁酸锌盐、扑酸盐等。另一类用于注射的缓慢释放贮库制剂 将含有分散在缓慢降解、无毒、无抗原聚合物中以供包封的化合物或盐，例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物例如，如在美国专利号3,773,919中所述。化合物或优选相对不溶的盐，例如上述的那些，也可以在胆固醇基质硅橡胶颗粒中配制，特别是在动物中使用。另外的缓慢释放，贮库或植入制剂，例如气体或液体脂质体，是在文献这已知的(美国专利号5,770,222和“缓释和控释给药系统(Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems)”, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc.,N.Y., 1978)。
MUC1
MUC1ns是广泛的O-糖基化蛋白，主要由上皮细胞表达。分泌和膜结合的MUC1ns构成一个物理屏障，其保护上皮细胞的顶端边界免受毒素、微生物和发生在与外部环境的界面上的其他形式压力的损伤。跨膜MUC1n 1 (MUC1)也可以通过细胞质结构域向细胞内部发出信号。MUC1与其它膜-结合的MUC1ns没有序列的相似性，除了海胆精子蛋白-肠激酶-agrin(SEA)结构域外。在这方面，MUC 1被翻译成一个单一的多肽，然后在SEA结构域进行自裂解。
MUC1在癌症中起作用。人MUC1是杂二聚糖蛋白，被翻译为单一多肽并在内质网被裂解成N-和C-末端亚基(MUC1-N和MUC1-C)。MUCl的异常过表达，如在大多数人癌中所发现的，会导致不依赖于锚定蛋白(anchorage)的生长和致瘤性。MUC1的过表达赋予可对由氧化应激诱导的细胞凋亡及抗肿瘤药物的遗传毒性的抗性。
栓系(tethered)和分泌的MUC1ns家族在提供上皮细胞表面的保护屏障方面起着重要的作用。随着上皮层的破坏，相邻细胞间的紧密连接被破坏，而当细胞启动一个由调蛋白(heregulin)诱导的修复程序时，极性就会消失。MUC1-N从细胞表面脱落，使得MUC1-C用作环境应力信号的传感器而传递到细胞内部。在这方面，MUC1-C与ErbB受体家族的成员一起形成细胞表面复合物，和MUC1-C是针对细胞核对调蛋白刺激的反应。通过MUCl胞质结构域(CD)和连环蛋白(catenin)家族成员之间的直接相互作用，MUC1-C在整合ErbB受体和Wnt信号传导通路中也起着重要作用。通过糖原合酶激酶3β、c-Src、蛋白激酶Cδ，和c-Abl使MUC1-CD磷酸化。
MUC1结构
MUC1是一种在正常分泌上皮细胞的顶端边缘表达的MUC1n-类型糖蛋白。MUC1在合成后形成作为单一多肽，并将前体切割成内质网中的两个亚基的异二聚体。裂解可通过自催化过程介导。>250 kDa的MUC1 N-末端(MUC1 N-ter或MUC1-N)亚基含有20个可变数量的氨基酸串联重复序列，这些重复序列不完美，高度保守，并由O-连接的聚糖修饰。MUC1-N通过与大约23kDa C-末端亚基(MUC1 C-ter或MUC1-C)的二聚而被栓系到细胞表面，其包含58个氨基酸的胞外区、28个氨基酸的跨膜结构域和72-氨基酸的胞质结构域(CD) (图1)。它是本公开内容的蛋白支架结合的MUC1-C/ECD (SEQ ID NO: 2的斜体部分)的58个氨基酸部分。人MUC1-C序列如下所示：
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG
WGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHT
HGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL (SEQ ID NO: 2)。
黑体序列指示CD，且加下划线的部分是低聚物抑制肽。随着正常上皮细胞向癌细胞的转化，MUC 1在胞浆和整个细胞膜上异常地过度表达。细胞膜-相关的MUC1通过clathrin-介导的内吞作用靶向于内小体。此外，MUC1-C，但不是MUC1-N，是靶向细胞核和线粒体的。
MUC1功能
MDC1-C与ErbB受体家族的成员和与Wnt效应器、β-连环蛋白相互作用。表皮生长因子受体和c-Src使Y-46上的MUC1胞质结构域(MUC1-CD)磷酸化，从而增加MUC1和β-连环蛋白的结合。MUC1和β-连环蛋白的结合也受糖原合酶激酶3β和蛋白激酶Cδ的调节。MUC1与核内的β-连环蛋白共定位，共同激活Wnt目标基因的转录。MUC1还直接与p53结合并调节p53靶基因的转录。MUC1-C的过度表达足以诱导不依赖于锚定的生长和致瘤性。
MUC1“表位”
本公开内容的蛋白支架可选择性地结合“表位” MUCl-C/胞外域(MUCl-C/ECD)的一个或多个氨基酸。本公开内容的表位可以是线性的，也可以是构象的。如本文所用的，术语“表位”意指本公开内容的蛋白支架特异性地结合的一个或多个氨基酸。本公开内容的表位的一个或多个氨基酸可以线性、非线性、连续或不连续的方式排列。本公开内容的表位可以是“构象”的，意指当氨基酸以适当折叠的肽、蛋白，或蛋白复合物的构象存在时，蛋白支架以更大的亲和力或更大的选择性结合表位的一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，结合构象表位的蛋白支架可能不结合线性表位。
本公开内容的蛋白支架可选择性地结合由下面氨基酸序列SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (SEQ ID NO: 3)限定的MUCl-C/胞外域(MUCl-C/ECD)的一个或多个氨基酸(见图1)。可供选择地，或者另外地，本公开内容的蛋白支架可选择性地结合变体MUC1-C/胞外域(MUC1-C/ECD)的一个或多个氨基酸。本公开内容的变体MUC1-C/ECD肽可包括，但不限于MUC1-C/ECD-L6A、MUC1-C/ECD-L8A、MUC1-C/ECD-L6,8A、MUC1-C/ECD-Q23V、MUC1-C/ECD-Q26V、MUC1-C/ECD-N36A，如根据SEQ ID NO: 3编号的。
本公开内容的蛋白支架可选择性地结合以下源自MUCl-C/胞外域(MUCl-C/ECD)的肽的一个或多个氨基酸：SVVVQLTLAFREGTINVHDVET (“肽1”，SEQ ID NO: 61)、VETQFNQYKTEAASRYNLTISD (“肽2”，SEQ ID NO: 71)，或TISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (“肽3”，SEQ ID NO: 72)。
作为过继性细胞疗法的修饰细胞的输注
本公开内容提供表达一个或多个本公开内容的CAR和/或CARTyrin的修饰细胞，其已经选择和/或扩增以供给予有需要的受试者。本公开内容的修饰细胞可被配制以供在任何温度(包括室温和体温)下储存。本公开内容的修饰细胞可被配制以供冷冻保存和随后的解冻。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中配制，以指导从无菌包装给予受试者。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中与细胞成活力和/或CAR/CARTyrin表达水平的指示剂一起配制，以确保最小水平的细胞功能和CAR/CARTyrin表达。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中以规定的密度与一个或多个试剂配制，以抑制剂进一步扩增和/或防止细胞死亡。
诱导型前凋亡多肽
本公开内容的诱导型前凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，因为本公开内容的诱导型前凋亡多肽是免疫原性极其低的。虽然本公开内容的诱导型前凋亡多肽是重组体多肽，因此，经重组产生本公开内容的诱导型前凋亡多肽的非-天然存在的序列不包含宿主人免疫系统可识别为“非-自身”的非-人序列，从而在接受本公开内容的诱导型前凋亡多肽，包含诱导型前凋亡多肽的细胞或包含诱导型前凋亡多肽的组合物或包含诱导型前凋亡多肽的细胞的受试者中诱导免疫反应。
本公开内容提供包含配体结合区、接头，和前凋亡肽的诱导型前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，前凋亡肽是半胱天冬酶多肽。在某些实施方案中，半胱天冬酶多肽是半胱天冬酶9多肽。在某些实施方案中，半胱天冬酶9多肽是截短的半胱天冬酶9多肽。本公开内容的诱导型前凋亡多肽可以是非-天然存在的。
本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12，和半胱天冬酶14。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于那些与细胞凋亡相关的半胱天冬酶多肽，包括半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9，和半胱天冬酶10。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于那些与初始细胞凋亡相关的半胱天冬酶多肽，包括半胱天冬酶2、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9，和半胱天冬酶10。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于那些执行凋亡的半胱天冬酶多肽，包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶6，和半胱天冬酶7。
本公开内容的半胱天冬酶多肽与野生型氨基酸或核酸序列相比，可由具有一个或多个修饰的氨基酸或核酸序列编码。本公开内容的编码半胱天冬酶多肽的核酸序列可以是优化的密码子。对本公开内容的半胱天冬酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一个或多个修饰可增加相互作用、交联、交叉激活，或本公开内容的半胱天冬酶多肽的激活(与野生型氨基酸或核酸序列比较)。做为选择，或者另外地，对本公开内容的半胱天冬酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一个或多个修饰可降低本公开内容的半胱天冬酶多肽于野生型氨基酸或核酸序列相比的免疫原性。
与野生型半胱天冬酶多肽比较，本公开内容的半胱天冬酶多肽可以是截短的。例如，半胱天冬酶多肽可被截短以消除编码半胱天冬酶激活和招募结构域(CARD)的序列，以除了在包含本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽的细胞中引发细胞凋亡外，还消除或尽量减少激活局部炎症反应的可能性。本公开内容的编码半胱天冬酶多肽的核酸序列可剪接，以形成本公开内容的半胱天冬酶多肽的变异氨基酸序列(与野生型半胱天冬酶多肽比较)。本公开内容的半胱天冬酶多肽可由重组体和/或嵌合序列编码。本公开内容的重组和/或嵌合半胱天冬酶多肽可包括来自一个或多个不同的半胱天冬酶多肽的序列。可供选择地，或者另外，本公开内容的重组和/或嵌合半胱天冬酶多肽可包括来自一个或多个物种的序列(如人序列和非-人序列)。本公开内容的半胱天冬酶多肽可以是非-天然存在的。
本公开内容的诱导型前凋亡多肽的配体结合区可包括任何多肽序列，其利于或促进第一个本公开内容的诱导型前凋亡多肽与第二个本公开内容的诱导型前凋亡多肽的二聚，二聚作用激活或诱导前凋亡多肽的交联和诱导细胞凋亡。
配体-结合(“二聚”)区可包含任何多肽或其功能结构域，其将允许使用天然或非天然配体(即和诱导剂)引入，例如，非天然合成配体。配体-结合区可能是细胞膜的内部或外部，取决于诱导型前凋亡多肽的性质和配体(即诱导剂)的选择。广泛种类的配体-结合多肽及其功能结构域，包括受体，是已知的。本公开内容的配体-结合区可包括来自受体的一个或多个序列。特别令人感兴趣的是配体结合区，其中配体(例如，小的有机配体)是已知的或可能容易产生。这些配体-结合区或受体可包括，但不限于，FKBPs和亲环蛋白受体，甾体受体，四环素受体等，以及“非天然”受体，其可从抗体，特别是其重链或轻链亚单位、突变序列、经随机过程得到的随机氨基酸序列、组合合成等而获得。在某些实施方案中，配体-结合区选自FKBP配体-结合区、亲环蛋白受体配体-结合区、甾体受体配体-结合区、亲环蛋白受体配体-结合区，和四环素受体配体-结合区。
包含一个或多个受体结构域的配体-结合区可以有至少约50个氨基酸，和少于约350个氨基酸，通常少于200个氨基酸，或者作为天然结构域或其截短的活性部分。结合区可以例如是小的(< 25 kDa，允许在病毒载体中有效转染)、单体的、非免疫的、具有易于合成的、细胞可渗透的、无毒的配体，其可配置用于二聚。
包含一个或多个受体结构域的配体-结合区可以在细胞内或细胞外，取决于诱导型前凋亡多肽的设计和适宜的配体(即诱导剂)的可利用性。对于疏水性配体，结合区可以是在膜的任一面上，但对于亲水性配体，特别是蛋白配体，结合区将通常是在细胞膜的外面，除非有一种转运系统将配体以一种可供结合的形式内化。对于细胞内受体，包含诱导型前凋亡多肽的诱导型前凋亡多肽或转座子或载体可编码信号肽和受体结构域序列的跨膜结构域5′或3′或可具有受体结构域序列的脂质附着信号序列5′。当受体结构域是在信号肽和跨膜结构域之间，受体结构域将是在细胞外。
抗体和抗体亚单位，例如重链或轻链，特别是片段，更特别是所有或部分的可变区，或重链和轻链的融合以建立高-亲和性结合，可用作本公开内容的配体结合区。设想中的抗体包括为外生表达的人类产物的抗体，如胞外结构域，它不会引起免疫反应，通常不会在周围(即，CNS/脑区外)表达。这样的实例包括，但不限于低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)，和胚胎表面蛋白(即癌胚抗原)。此外，还可以制备抗触觉分子的抗体，其在生理上可以接受的，以及筛选出的个体抗体亚基的结合亲和力。cDNA编码亚单位可可通过缺失恒定区、可变区的部分、可变区的突变等分离和修饰，以获得对配体具有适当亲和力的结合蛋白结构域。这样，几乎任何生理上可以接受的触觉化合物都可以用作配体或为配体提供一个表位。可以用天然受体代替抗体单位，其中结合区或结构域是已知的，并且有一个有用的或已知的配体来结合。
为使受体多聚化，对于诱导型前凋亡多肽的配体-结合区/受体结构域的配体可能是多聚体，因为在这个意义上，配体可有至少两个结合位点，每个结合位点都能够结合于配体受体区(即配体具有能够结合第一个诱导型前凋亡多肽的配体-结合区的第一个结合位点和能够结合诱导型前凋亡多肽的配体-结合区的第二个结合位点，其中第一个和第二个诱导型前凋亡多肽的配体-结合区是相同或不同的)。因此，如本文所用的，术语“多聚体配体结合区”指结合于多聚体配体的本公开内容的诱导型前凋亡多肽的配体-结合区。本公开内容的多聚体配体包括二聚配体。本公开内容的二聚配体可具有两个能够结合配体受体结构域的结合位点。在某些实施方案中，本公开内容的多聚体配体是二聚体或高阶低聚物，通常由小的合成有机分子组成的不大于约四聚的配体，单个分子通常是至少约150 Da和少于约5 kDa，通常少于约3 kDa。可以使用多种合成配体和受体对。例如，在涉及天然受体的实施方案中，二聚FK506可与FKBP12受体一起使用，二聚环孢菌素A可与亲环蛋白受体一起使用，二聚雌激素与雌激素受体、二聚糖皮质激素与糖皮质激素受体、二聚四环素与四环素受体、二聚维生素D与维生素D受体等。另外，也可以使用高阶配体，例如，三聚体。对于涉及非天然受体的实施方案，例如抗体亚单位、修饰的抗体亚单位、由重链和轻链可变区串联而成的单链抗体，由柔性接头分开，或修饰受体，及其突变列等，可用于多种化合物中的任何一种。包含本公开内容的多聚体配体的单元的一个显著特征是，各个结合位点能够以高亲和力结合受体，且优选地，它们能够在化学上二聚化。同样，所述方法可用来平衡配体的疏水性/亲水性，以便它们能够以功能水平溶解在血清中，而在大多数应用中则能扩散越过质膜。
本公开内容的诱导型前凋亡多肽的激活可通过例如，由诱导剂介导的化学诱导的二聚(CID)完成，以产生一种条件控制的蛋白或多肽。由于不稳定的二聚化剂的降解或单聚竞争抑制剂的使用，本公开内容的前凋亡多肽不仅是诱导型的，而且这些多肽的诱导也是可逆的。
在某些实施方案中，配体结合区包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，配体结合区包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)的FKBP12多肽。在某些实施方案中，其中配体结合区包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F)(F36V)的FKBP12多肽，诱导剂可包含AP1903、合成 药物(CAS索引名：2-哌啶羧酸，1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)butyl]-, 1,2-乙烷二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙烷二基)氧基-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS登记号：195514-63-7; 分子式：C78H98N4O20; 分子量:1411.65))。在某些实施方案中，其中配体结合区包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)的FKBP12多肽，诱导剂可包含AP20187 (CAS登记号：195514-80-8和分子式：C82H107N5O20)。在某些实施方案中，诱导剂是AP20187同系物，例如，AP1510。如本文所用的，诱导剂AP20187、AP1903和AP1510可互换使用。
AP1903 API由Alphora Research Inc.产生，而用于注射的AP1903药品由Formatech Inc制造。它被配制为AP1903在非-离子增溶剂Solutol HS 15 (250 mg/mL,BASF)的25%溶液中的5 mg/mL溶液。在室温，这个制剂是稍显黄色的澄清溶液。在制冷时，这个制剂经历了可逆的相变，形成了乳白色的溶液。这种相变在再加热到室温时被逆转。在3mL玻璃小瓶中装入2.33 mL (每小瓶注射总共大约10 mg AP1903)。在确定给予AP1903的需要量时，患者可以例如，在2小时内，使用一种非-DEHP、非-环氧乙烷消毒输液器，经由IV输注注射(0.4 mg/kg)给予单次固定剂量的AP1903。对所有患者的AP1903的剂量分别计算，且不再重新计算，除非体重波动≧10%。经计算的剂量在100 mL的0.9%正常盐水中稀释，然后输注。在AP1903的先前的I期研究中，24名健康志愿者用注射单剂量的AP1903治疗，以0.01、0.05、0.1、0.5和1.0 mg/kg的剂量水平经IV输注2小时。AP1903血浆水平与剂量成正比，平均Cmax值在大约10-1275 ng/mL剂量范围内，约为0.01-1.0 mg/kg。初始输注期后，血液浓度显示出快速的分布期，血浆水平在给药后0.5、2和10小时分别减少至大约18、7和1%最大浓度。对于注射而言，AP1903显示在所有剂量水平都是安全和耐受性好的，并显示出良好的药动学特征。Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001。
供注射用的AP1903的固定剂量，例如，可以是0.4 mg/kg，静脉内输注2小时。细胞有效信号转导所需的体外AP1903的量是10-100 nM (1600 Da MW)。这等于16-160 μg/L或˜0.016-1.6 μg/kg (1.6-160 μg/kg)。高达1 mg/kg的剂量在上述AP1903的I期研究中是良好耐受的。因此，0.4 mg/kg可以是AP1903用于与治疗细胞组合的这个I期研究的安全有效的剂量。
与野生型氨基酸或核酸序列相比，本公开内容的编码配体结合的氨基酸和/或核酸序列可含有序列一个或多个修饰。例如，本公开内容的氨基酸和/或核酸序列编码配体结合区可以是密码子-优化的序列。与野生型多肽比较，一个或多个修饰可增加配体(如诱导剂)对本公开内容的配体结合区的结合亲和力。做为选择，或者另外地，与野生型多肽比较，一个或多个修饰可降低本公开内容的配体结合区的免疫原性。本公开内容的配体结合区和/或本公开内容的诱导剂可以是非-天然存在的。
本公开内容的诱导型前凋亡多肽包含配体结合区，接头和前凋亡肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。接头可包含允许配体结合区二聚、相互作用、交联、交叉激活，或激活前凋亡多肽的任何有机或无机材料，以致前凋亡多肽的相互作用或激活启动细胞凋亡。在某些实施方案中，接头是多肽。在某些实施方案中，接头是包含G/S富含氨基酸序列(“GS”接头)的多肽。在某些实施方案中，接头是包含氨基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 41)的多肽。在优选的实施方案中，接头是多肽，编码多肽的核酸不含限制性内切酶的限切酶位点。本公开内容的接头可以是非-天然存在的。
本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在任何启动子能够引发和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在细胞中的表达的转录调节下，在细胞中表达。如本文所用的术语“启动子”指用作启动对RNA聚合酶的结合位点以转录基因的启动子。例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在能够启动和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在哺乳动物细胞中的表达的任何启动子的转录调节下，在哺乳动物细胞中表达，包括，但不限于天然的、内源的、外源的，和异源的启动子。优选的哺乳动物细胞包括人细胞。因此，本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在任何启动子能够启动和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在人细胞中的表达的任何启动子的转录调节下，在人细胞中表达，包括，但不限于人启动子或病毒性启动子。人细胞中表达的示例性启动子包括，但不限于、人巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因启动子、SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒长端重复、β-肌动蛋白启动子、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶启动子，其中的每一个可被用来获得高水平表达的本公开内容的诱导型前凋亡多肽。也考虑了使用本领域熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子，以达到本公开内容的诱导型前凋亡多肽的表达，只要表达水平足以引发细胞凋亡。通过使用具有熟知的特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣蛋白的表达水平和表达模式。
选择响应特定生理或合成信号而调节的启动子可允许本公开内容的诱导型前凋亡多肽的诱导型表达。蜕皮激素系统(ecdysone system) (Invitrogen, Carlsbad,Calif.)就是一个这样的系统。这种系统被设计以允许相关基因在哺乳动物细胞中的调节表达。它由一种严格调控的表达机制组成，几乎不允许转基因的基础水平表达，但是超过200倍的可诱导性。系统是建立在果蝇(Drosophila)异二聚体蜕皮激素受体的基础上的，且当蜕皮激素或类似物例如muristerone A结合受体时，受体激活启动子，以启动mRNA转录子的下游转基因高水平的表达。在该系统中，异二聚体受体的两个单体由一个载体构成表达，而蜕皮激素-反应性启动子，其驱动感兴趣基因的表达，位于另一个质粒上。因此，将这种类型的系统设计成感兴趣的载体可能是有用的。另一个可能有用的诱导型系统是Tet-Off™或Tet-On™系统(Clontech, Palo Alto, Calif.)，最早由Gossen and Bujard (Gosseand Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al.,Science, 268:1766-1769, 1995)开发。这种系统还允许对四环素或四环素衍生物如多西环素的反应来调节高水平的基因表达。在Tet-On™系统中，基因表达在多西环素的存在下开启，而在Tet-Off™系统中，基因表达在多西环素的不存在下开启。这些系统是基于从大肠杆菌的四环素抗药性操纵子衍生出的两个调节元件：四环素算符序列(四环素抑制剂结合的序列)和四环素抑制剂蛋白。感兴趣的基因被克隆到启动子后面的质粒中，启动子中含有四环素反应元件。第二个质粒含有称为四环素-受控反式激活剂的调节元件，其在Tet-Off™系统中由源自单纯疱疹病毒和野生型四环素抑制剂的VP16结构域组成。因此在多西环素的存在下，转录是构成性的。在Tet-On™系统中，四环素抑制剂不是野生型的，且在多西环素的存在下激活转录。对于基因疗法载体生产，可使用Tet-Off™系统，以使细胞可以在四环素或多西环素存在下培养产生，并防止潜在毒性转基因的表达，但当载体引入患者时，基因表达将是构成性的。
在某些情况下，需要调节转基因在基因治疗载体中的表达。例如，采用具有不同活性强度的不同病毒性启动子，这取决于期望水平的表达。在哺乳动物细胞中，CMV即刻早期启动子常常被用来提供强的转录激活。CMV启动子在Donnelly, J. J., et al., 1997.Annu. Rev. Immunol. 15:617-48中有评述。当期望转基因的表达水平减少时，效力较差的CMV启动子的修饰版本也被使用。当转基因在造血细胞中的表达是期望的情况下，通常采用逆病毒性启动子例如来自MLV或MMTV的LTRs。取决于所需效果而使用的其它病毒性启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2 LTR，例如来自E1A、E2A，或MLP区的腺病毒启动子，AAVLTR、HSV-TK，和禽肉瘤病毒。
在其它实例中，启动子的选择可能受到发育调控，并且在特定的分化细胞中是活跃的。因此，例如，启动子在多能干细胞中可能不活跃，但是，例如，多能干细胞分化成更成熟的细胞，然后启动子可能被激活。
类似地，组织特定启动子被用来在特定组织或细胞中进行转录，以减少对非-靶标组织的潜在的毒性或不需要的效应。这些启动子可导致与较强启动子例如CMV启动子比较的表达减少，但也可导致更有限的表达，和免疫原性(Bojak, A., et al., 2002.Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux, N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31)。例如，组织特定启动子例如PSA相关启动子或前列腺特异性腺激肽释放酶，或肌肉肌酸激酶基因，可酌情使用。
组织特异性或分化特异性启动子的例子包括，但不限于以下：B29 (B细胞)；CD14(单核细胞)；CD43 (白细胞和血小板)；CD45 (造血细胞)；CD68 (巨噬细胞)；肌间线蛋白(肌肉)；弹性蛋白酶-1 (胰腺腺泡细胞)；内皮蛋白(内皮细胞)；纤连蛋白(分化细胞、愈合组织)；和Flt-1 (内皮细胞)；GFAP (星形胶质细胞)。
在某些适应症中，在给予基因治疗载体后的特定时间激活转录是可取的。这是用那些激素或细胞因子可以调节的此类启动子来完成的。可使用的细胞因子和炎症蛋白应答启动子包括K和T激肽原(Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351),c-fos、TNF-α、C-反应性蛋白(Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8),3195-3207), 触珠蛋白(Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912)，血清淀粉状蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6 (Poli和Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA,86, 8202-8206)，补体C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Cell。Biol., 6181-6191)、IL-8,α-1酸糖蛋白(Prowse和Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂肪酶(Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988)，血管紧张素原(Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895)，纤维蛋白原、c-jun (被佛波醇酯诱导、TNF-α、UV辐射、维甲酸和过氧化氢)、胶原酶(佛波醇酯和维甲酸诱导的)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导型)、基质溶素(佛波醇酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗-糜蛋白酶。其它启动子包括，例如，SV40、MMTV、人免疫缺陷病毒(MV)、莫罗尼病毒、ALV、爱泼斯坦·巴尔病毒、劳氏肉瘤病毒、人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白和肌酸。
已设想上述任何一种启动子单独或与另一种启动子结合使用可能是有用的，这取决于所期望的作用。选择启动子和其它调节元件以使它们在期望的细胞或组织中发挥功能。此外，启动子的这个列表不应视为是穷举的或限制性的；其它启动子与本文公开的启动子和方法一起使用。
实施例
实施例1：MUC1-结合Centyrin的生成
可生成本公开内容的MUC1结合蛋白支架(也称为Centyrin)，以特异性地结合优选的靶标，MUC1，包括MUCl-C/胞外域(MUCl-C/ECD)。
本公开内容的MUC1-结合Centyrin可使用Cis展示方案鉴定和/或分离。基于RepA蛋白的DNA-结合特性，CIS展示通过在每个展示的库成员和编码该成员的双链DNA (dsDNA)模板之间的操作链接，为多肽库的筛选提供了便利。典型的库可具有约1013个成员。Cis展示往往是无细胞的系统。因为使用dsDNA模板，产物回收和库结构可通过基于PCR的策略来实现。候选的MUC1-结合Centyrin通过亲和力选择来筛选。洗脱的复合物通过简单的PCR再生。
对于这个过程的概述，参见图3 (及isogenica.com)。也见Diem et al, 2014PEDS 27, 419-429 (其内容通过引用以其整体并入)。
目标验证和淘选
目标验证：Poseida提供的靶标材料(Muc1-C融合蛋白)将在下拉实验(pull-downexperiment)中测试，以验证它们在淘选程序中的用途。
对于体外生物素化Muc1-C-Avitag融合蛋白，将样品与链霉抗生物素或中性亲和素(neutravidin)包覆的磁珠一起孵育。然后用磁石从反应物中取出珠子并清洗。3个类型的样品经由SDS-PAGE分析比较：孵育之前的样品，在珠孵育之后的上清液和固定在珠上的材料。对应于预测的试剂分子量(MW)的带应在所有样品中被检测到。上清液样品的蛋白含量(带强度)的减少应与在SDS-PAGE样品加载缓冲液中通过煮沸从磁珠中提取的正确MW的蛋白增加相一致。
对于MUC1-C-Fc融合蛋白，蛋白通过用生物素化试剂与底物的不同比例的胺反应化学(非位点特异性)进行生物素化。在过量的生物素化试剂的猝灭和去除后，反应的生物素化效率使用类似于上述实验的磁珠下拉实验来确认。
表1：
MUC1-C融合蛋白：
人Muc1-C-G4S接头(加下划线的)-Avitag (粗体和斜体)-6His (粗体)
MSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGGGGGS LNDIFEAQKIEWHE HHHHHH (SEQ ID NO: 62)。
人Muc1-C-G4S3接头(加下划线的)-人IgG1铰链(粗体和斜体)-CH2-CH3 (粗体)
MSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGGGGGS EPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 63)。
两个阳性scFv对照包括具有蛋白纯化和检测标记的可溶性重组蛋白。scFv被用来确定细胞结合实验中对照ECD-标记融合蛋白和参考的资格。
MUC1-C转染的细胞系，与匹配的MUC1-C阴性宿主细胞对照一起，被用于进一步定性控制(QC)上述的scFv，以及确定重组蛋白结合Centyrin与显示Muc1-C的细胞膜反应性的方法。MUC1-C转染的细胞系和匹配的MUC1-C阴性宿主细胞对照系被扩增和建库(储存)以供使用，如下所述。
重组蛋白上的scFv验证：MUC1-C融合蛋白和scFv通过测试scFv与两种抗原形式的结合彼此对比来控制质量：直接固定或通过链霉抗生物素捕获在平板或珠子上。使用分别用于板或珠的ELISA (抗-3xFLAG-HRP抗体轭合物，显色底物检测)或基于FACS的方法(抗-3xFLAG-FITC抗体直接检测)检测结合。
重组细胞系上的scFv验证：MUC1-C阳性和阴性细胞与scFv一起培养。洗涤步骤后，使细胞与抗-3xFLAG-FITC抗体一起培养，以供直接检测和使用流式细胞仪分析。根据结果，无论是其中一个还是两个scFv，都将在下面的Centyrin细胞结合筛选中用作阳性对照。
基准scFv：大肠杆菌宿主，胞质生产，无修饰，以可溶性形式产生。
淘选：Centyrin库DNA在多达24种选择的活动中，在适当的条件下经历5轮CIS展示淘选。选择将构成使用MUC1-C目标格式，无论是否使用肝素作为封闭剂。
初步筛选
单浓度结合ELISA击中率的鉴定
克隆出来：通过PCR扩增CIS展示选择的产物，克隆到表达载体中，并转化为大肠杆菌。产生的克隆被挑选到96-孔板(根据活动规模的不同，每个选择的输出至少有一个板)。
初步筛选：单浓度结合ELISA被用来鉴定阳性击中率。克隆被培养，表达，和被细菌溶解。溶解物被整体稀释并通过ELISA筛选其与目标抗原的结合。选择在背景上显示显著信号的克隆作为候选物。
测序：对主要候选物进行测序，并对数据进行多样性分析，以识别序列家族和/或重复克隆。
二次筛选：二次ELISA筛选可能是合适的，以测试特异性/对可供选择的目标格式的结合(MUC1-C-Avitag选择的克隆对比MUC1-C-Fc或反之亦然)。
由单浓度细胞结合(FACS)鉴定相关Ag结合克隆
三次筛选：作为CARTyrin功能筛选的第一个代替物，使用FACS证实了重组蛋白结合剂对膜展示形式的MUC1-C的可达性。MUC1-C转染的或对照的宿主细胞与ELISA中的单次稀释的Centyrin结合重组蛋白一起培养。scFv与细胞的结合用二次抗-3xFLAG-FITC缀合物孵育，接着在流式细胞仪上分析来检测。在早期程序测定的选择性地结合转染细胞的一个或两个scFv可用作阳性对照。
结合率/解离率(off-rate)淘选和筛选
淘选：取决于前几轮筛选的结果和所需的亲缘关系，可进行更多轮的淘选。这样的更多轮的淘选可能包括加入非固定化抗原的洗涤步骤，以使亲和力降低到较慢的解离率。
筛选：筛选、测序、二次筛选，和相当于初次筛选的三次筛选(在适当情况下)可以重复，例如，至少进行9轮淘选和筛选。
生物物理分析
生物物理分析：每种抗原选择至多96次的独特击中率可被重新排列和重新生长，以允许基于小规模板的Centyrin材料的His-标记亲和力纯化。纯化的材料将进行尺寸排阻色谱法，以确定哪些候选蛋白表现为单聚(非聚集)蛋白。
亲和力排序：采用ForteBio八位位组红色系统(ForteBio Octet Red system)，用BLI (生物层干涉法(Bio-Layer Interferometry))分析候选克隆的解离率(off-rate)。这些结果允许候选克隆用解离率排序。
细胞结合亲和力测定：FACS中的全剂量滴定细胞结合被用来根据细胞结合对候选细胞进行排序。这将证实对细胞表面表达的天然抗原的剂量-依赖性结合并产生表观Kd值。为实现这一点，生产50 mL规模的10-20个候选克隆的蛋白，并通过His-标记亲和层析进行纯化。利用已知蛋白浓度的稀释序列，用FACS生成剂量响应曲线，对候选物与靶细胞的结合进行排序。
重组目标亲和力测定
利用BLI对固定化重组蛋白靶标产生确定的结合亲和常数，以供选择候选 Centyrin。数据提供解离率(kd)和Kd值来衡量候选Centyrin与它们所选择的重组靶标之间的结合强度。
实施例2：piggyBac整合的iC9安全开关在人pan T-细胞中的表达和功能
使用具有4种piggyBac转座子之一的Amaxa 4D细胞核转染液对人pan T-细胞进行核转染。接受“模拟”条件的修饰T细胞用空piggyBac转座子进行核转染。修饰的T细胞接受或者含有单独治疗剂的piggyBac转座子(一种编码CARTyrin的序列)或者含有整合的iC9序列和治疗剂(一种编码CARTyrin的序列)的piggyBac转座子。
图6提供iC9安全开关的示意图，其含有配体结合区、接头，和截短的半胱天冬酶9多肽。特别地，iC9多肽含有包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的配体结合区，所述多肽包含取代位置36的苯丙氨酸(F)的缬氨酸(V) (F36V)。iC9多肽的FKBP12多肽由包含GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 39)的氨基酸序列编码。iC9多肽的FKBP12多肽由包含GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 40)的核酸序列编码。iC9多肽的接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO: 41)的氨基酸和包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 42)的核酸序列编码。编码iC9多肽的截短的半胱天冬酶9的核酸序列由包含GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 43)的氨基酸编码。编码iC9多肽的截短半胱天冬酶9的核酸序列由包含TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 44)的核酸序列编码。
为测试iC9安全开关，4种修饰T细胞的每一种用0、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM或1000 nM AP1903 (一种AP1903的诱导剂)培养24小时。使用7-原放线菌素D (7-AAD)，一种荧光嵌入剂，作为细胞凋亡的细胞的标记物，通过流式细胞术评价活力。
在第12天评价细胞成活力(见图7)。数据显示出细胞群从右下象限迁移到左上象限，诱导剂在含有iC9构建体的细胞中的浓度逐渐增加；然而，这个效应在缺乏iC9构建体的细胞(仅接受CARTyrin的那些)中未观察到，其中细胞在这两个区域均匀地分布，而与诱导剂的浓度无关。而且，细胞成活力在第19天评价(见图7)。数据显示如在图8 (核转染12天后)所示的相同趋势；然而，在这个较晚的时间点(核转染后第19天)，细胞群向左上象限的迁移更为明显。
对聚合结果进行了量化，如图9所示，显示在第12天(图7和左图)或第19天(图8和右图)，iC9安全开关对细胞成活力百分比的显著影响，所述细胞成活力百分比作为每个修饰细胞类型的iC9开关诱导剂(AP1903)浓度的函数。iC9安全开关的存在到第12天在绝大多数细胞中诱导细胞凋亡，到第19天效果甚至更显著。
这个研究结果显示，iC9安全开关在与诱导剂(如AP1903)接触时，极其有效地消除活性细胞，因为AP1903即使在研究的最低浓度(0.1 nM)下也诱导细胞凋亡。此外，iC9安全开关可以在功能上作为三顺反子载体的一部分表达。
实施例3：MUC1-svFv CAR的生成和功能
生成具有含单链抗体的抗原识别区的嵌合抗原受体(CAR)，其特异性地结合MUC1的表位。示例性MUC1-scFv CAR的图描述于图11中。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1B” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 4)的重链可变区和包含氨基酸序列DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 5)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1B-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含重链可变区的序列和包含轻链可变区的序列之间的接头EVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 6)。
生成具有含有单链抗体的抗原识别区的“F1B-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列的接头
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“K2B” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列
QVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 8)的重链可变区和包含氨基酸序列DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 9)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“K2B-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含重链可变区的序列和包含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 10)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“K2B-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:11)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“K2A” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列QIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTP (SEQ ID NO: 12)的重链可变区和包含氨基酸序列DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTV (SEQ ID NO: 13)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“K2A-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含重链可变区的序列和包含轻链可变区的序列之间的接头
QIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTPGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTV (SEQ ID NO: 14)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“K2A-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列的接头
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTP (SEQ ID NO: 15)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1A” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSS (SEQID NO: 16)的重链可变区和包含氨基酸序列NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIK (SEQ IDNO: 17)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1A-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1A-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 19)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1C” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSA (SEQID NO: 20)的重链可变区和包含氨基酸序列
SIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 21)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1C-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 22)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“F1C-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
SIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSA (SEQ ID NO: 23)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“M1B” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSS (SEQID NO: 24)的重链可变区和包含氨基酸序列
DIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 25)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“M1B-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“M1B-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
DIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 27)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“M1A” CAR，所述单链具有包含氨基酸序列(CDR序列是粗体和加下划线的) QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARYYRSAWFAYWGQGTLVSVSA (SEQID NO: 28)的重链可变区和包含氨基酸序列
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO: 29)的轻链可变区。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“M1A-HL” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在含重链可变区的序列和含轻链可变区的序列之间的接头
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARYYRSAWFAYWGQGTLVSVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 30)。
生成具有含单链抗体的抗原识别区的“M1A-LH” CAR，所述单链具有氨基酸序列(其中加下划线的氨基酸包含在包含轻链可变区的序列和包含重链可变区的序列之间的接头
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARYYRSAWFAYWGQGTLVSVSA (SEQ ID NO: 31)。
作为初步研究，MUC1表达在不同的细胞类型中评价(见图13)。包括在这个研究中的细胞有：K562细胞(永生化人慢性骨髓性白血病细胞)、Raji细胞(人造血细胞系用作癌症模型)、经修饰以表达MUC1-C的Raji细胞、激活的T细胞和RPMI8226细胞(人外周血B细胞浆细胞瘤/骨髓瘤细胞系)。在这些细胞的每一个中的MUC1表达通过用抗-MUC1-N抗体染色来评价。
在这个实施例中描述的每个MUC1-scFv CAR的功能，在或者未修饰的条件下，或者在用MUC1构建体(或者全长或MUC1-C)转染而生成修饰的K562细胞、修饰的Raji细胞和修饰的8226细胞中，在K562细胞、Raji细胞和RPMI8226细胞(“8226”)的细胞中分析。每个MUC1-scFv CAR的功能用CAR使每种细胞类型脱粒的能力来衡量。脱粒用总细胞表达CD117a的百分比(CD117a+细胞的百分率)测量。
对F1C-HL、M1A-LH和K2B-HL MUC1-scFv CAR进行进一步的测试，以测定表位结合。如在图15中所示，F1C-HL结合未修饰的细胞，接受全长MUC1的细胞和接受胞外MUC1-C构建体的细胞。M1A-LH特异性地结合全长MUC1。K2B-HL特异性地结合胞外MUC1-C构建体。
通过引用并入
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其它实施方案
虽然本公开内容的特定实施方案已作了说明和描述，各种其它改变和修饰可在不背离本公开内容的精神和范围的情况下进行。所附权利要求书的范围包括所有这样的落入本公开内容范围内的改变和修饰。

Claims (120)

1.一种蛋白支架，其包含
至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列，
其中支架能够结合人MUC1的序列。
2.权利要求1的蛋白支架，其中支架能够结合人MUC1的C-末端结构域(MUC1-C)的序列。
3.权利要求1或2的蛋白支架，其中支架能够结合人MUC1-C的胞外域(ECD)的序列。
4.权利要求1-3的任一项的蛋白支架，其中至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域源自人蛋白。
5.权利要求4的蛋白支架，其中人蛋白是生腱蛋白-C。
6. 前述权利要求的任一项的蛋白支架，其中共有序列包含LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ IDNO: 1)。
7.前述权利要求的任一项的蛋白支架，其中共有序列在以下环内的一个或多个位置被修饰：
(a) 包含在共有序列的位置13-16的氨基酸残基TEDS (SEQ ID NO: 64)或由它们组成的A-B环；
(b) 包含在共有序列的位置22-28的氨基酸残基TAPDAAF (SEQ ID NO: 65)或由它们组成的B-C环；
(c) 包含在共有序列的位置38-43的氨基酸残基SEKVGE (SEQ ID NO: 66)或由它们组成的C-D环；
(d) 包含在共有序列的位置51-54的氨基酸残基GSER (SEQ ID NO: 67)或由它们组成的D-E环；
(e) 包含在共有序列的位置60-64的氨基酸残基GLKPG (SEQ ID NO: 68)或由它们组成的E-F环；
(f) 包含在共有序列的位置75-81的氨基酸残基KGGHRSN (SEQ ID NO: 69)或由它们组成的F-G环；或
(g) (a)-(f)的任何组合。
8.前述权利要求的任一项的蛋白支架，其包含
至少5个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
9.前述权利要求的任一项的蛋白支架，其包含
至少10个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
10.前述权利要求的任一项的蛋白支架，其包含
至少15个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
11.前述权利要求的任一项的蛋白支架，其中支架以至少一个选自以下KD的亲和力结合人MUC1的序列，所述KD小于或等于10-9M，小于或等于10-10M，小于或等于10-11M，小于或等于10-12M，小于或等于10-13M，小于或等于10-14M，和小于或等于10-15M。
12.权利要求11的蛋白支架，其中KD由表面等离子体共振测定。
13.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a) 包含抗原识别区的胞外结构域，其中抗原识别区包含至少一个依据前述权利要求的任一项的蛋白支架；
(b) 跨膜结构域，和
(c) 包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。
14.权利要求13的CAR，其中胞外结构域进一步包含信号肽。
15.权利要求13或14的CAR，其中(a)的胞外结构域还包含抗原识别区和(b)的跨膜结构域之间的铰链。
16.权利要求13-15的任一项的CAR，其中跨膜结构域包含编码CD8跨膜结构域的序列。
17.权利要求13-16的任一项的CAR，其中至少一个共刺激结构域包含CD28和/或4-1BB共刺激结构域。
18.权利要求17的CAR，其中4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。
19.一种组合物，其包含权利要求1-12的任一项的蛋白支架和至少一种药学上可接受的载体。
20.一种组合物，其包含权利要求13-18的任一项的嵌合抗原受体和至少一种药学上可接受的载体。
21.一种转座子，其包含权利要求1-12的任一项的蛋白支架。
22. 一种转座子，其包含权利要求13-18的任一项的CAR。
23.权利要求22的转座子，其中转座子包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含
(a) 配体结合区，
(b) 接头，和
(c) 截短的半胱天冬酶9多肽，
其中诱导型半胱天冬酶多肽不包含非-人序列。
24.一种组合物，其包含权利要求21-23的任一项的转座子。
25.权利要求24的组合物，其进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。
26.权利要求25的组合物，其中编码转座酶的序列是mRNA序列。
27.权利要求21-26的任一项的转座子或组合物，其中转座子是piggyBac转座子。
28.权利要求25-27的任一项的组合物，其中转座酶是piggyBac转座酶。
29. 权利要求28的组合物，其中piggyBac转座酶包含含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
30. 权利要求28或29的组合物，其中piggyBac转座酶是超活性变异体和其中超活性变异体包含在SEQ ID NO: 59的位置30、165、282和538的一个或多个处的氨基酸取代。
31. 权利要求30的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I) (I30V)。
32. 权利要求30的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G) (G165S)。
33. 权利要求30的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M) (M282V)。
34. 权利要求30的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N) (N538K)。
35. 权利要求28-34的任一项的组合物，其中转座酶是超级piggyBac (sPBo)转座酶。
36. 权利要求35的组合物，其中超级piggyBac (sPBo)转座酶包含含有SEQ ID NO: 60的氨基酸序列。
37.一种载体，其包含权利要求1-18的任一项的CAR。
38.权利要求37的载体，其中载体是病毒性载体。
39.权利要求38的载体，其中病毒性载体包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。
40.权利要求38或39的载体，其中病毒性载体包含从腺病毒相关病毒分离或衍生的序列。
41.权利要求38-40的任一项的载体，其中病毒性载体是重组载体。
42.权利要求37的载体，其中载体是纳米粒子载体。
43. 权利要求42的载体，其中纳米粒子载体包含核酸、氨基酸、聚合物、胶束、脂质、有机分子、无机分子或其任何组合。
44.权利要求37-43的任一项的载体，其中载体包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含
(a) 配体结合区，
(b) 接头，和
(c) 截短的半胱天冬酶9多肽，
其中诱导型半胱天冬酶多肽不包含非-人序列。
45.一种组合物，其包含权利要求37-44的任一项的载体。
46.一种细胞，其包含权利要求1-12的任一项的蛋白支架。
47.一种细胞，其包含权利要求13-18的任一项的CAR。
48.一种细胞，其包含权利要求21-36的任一项的转座子或转座酶。
49.一种细胞，其包含权利要求37-44的任一项的载体。
50.权利要求46-49的任一项的细胞，其中所述细胞在细胞表面上表达CAR。
51.权利要求46-50的任一项的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
52.权利要求51的细胞，其中免疫细胞是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。
53.权利要求51的细胞，其中免疫细胞是T-细胞。
54.权利要求46-50的任一项的细胞，其中所述细胞是人工抗原呈递细胞。
55.权利要求46-50的任一项的细胞，其中所述细胞是肿瘤细胞。
56.权利要求46-55的任一项的细胞，其中细胞是自体的。
57.权利要求46-55的任一项的细胞，其中细胞是同种异体的。
58. 一种组合物，其包含权利要求46-57的任一项的细胞。
59. 一种制备依据权利要求1-12的任一项的蛋白支架的方法，其包括
(a) 修饰共有序列的一个或多个氨基酸，和
(b) 选择蛋白支架，其选择性地结合人MUC1的序列。
60.权利要求59的方法，其中修饰步骤包括定点诱变或随机诱变。
61.权利要求60的方法，其中随机诱变包含易错聚合酶链反应(PCR)、DNA改组或其组合。
62.依据权利要求59-61的任一项的方法，其中步骤(a)和(b)重复至少一次。
63.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括给予所述受试者权利要求19、20、24、25、26、45或58的任一项的组合物。
64.权利要求63的方法，其包括给予所述受试者权利要求48的组合物，其中细胞或细胞群是自体的。
65.权利要求63的方法，其包括给予所述受试者权利要求48的组合物，其中细胞或细胞群是同种异体的。
66.一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法，其包括给予所述受试者一种包含细胞的组合物，所述细胞包含权利要求21-36的任一项的转座子，其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。
67.一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法，其包括给予所述受试者一种包含细胞的组合物，所述细胞包含权利要求37-44的任一项的载体，其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。
68.权利要求66或67的方法，其中细胞是自体的。
69.权利要求66或67的方法，其中细胞是同种异体的。
70.权利要求66-69的任一项的方法，其中细胞疗法是过继性细胞疗法。
71.权利要求66或67的方法，其中改变是终止细胞疗法。
72.权利要求66或67的方法，其中改变是细胞疗法中提供的一部分细胞的耗竭。
73.权利要求66或67的方法，其还包括给予诱导剂的抑制剂的步骤，以抑制细胞疗法的改变，从而恢复细胞疗法的功能和/或疗效。
74.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a) 包含抗原识别区的胞外结构域，其中抗原识别区包含Centyrin、VHH和scFv的至少一个，其特异性地结合人MUC1的序列；
(b) 跨膜结构域，和
(c) 包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。
75.权利要求74的CAR，其中抗原识别区包含至少一个Centryin。
76.权利要求74的CAR，其中抗原识别区包含至少一个VHH。
77.权利要求74的CAR，其中抗原识别区包含至少一个scFv。
78.权利要求74-77的任一项的CAR，其中胞外结构域进一步包含信号肽。
79.权利要求74-78的任一项的CAR，其中(a)的胞外结构域还包含抗原识别区和(b)的跨膜结构域之间的铰链。
80.权利要求74-79的任一项的CAR，其中跨膜结构域包含编码CD8跨膜结构域的序列。
81.权利要求74-80的任一项的CAR，其中至少一个共刺激结构域包含CD28和/或4-1BB共刺激结构域。
82.权利要求81的CAR，其中4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。
83.一种组合物，其包含权利要求74-82的任一项的嵌合抗原受体和至少一种药学上可接受的载体。
84. 一种转座子，其包含权利要求64-72的任一项的CAR。
85.权利要求84的转座子，其中转座子包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含
(a) 配体结合区，
(b) 接头，和
(c) 截短的半胱天冬酶9多肽，
其中诱导型半胱天冬酶多肽不包含非-人序列。
86.一种组合物，其包含权利要求84或85的转座子。
87.权利要求86的组合物，其进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。
88.权利要求87的组合物，其中编码转座酶的序列是mRNA序列。
89.权利要求84-88的任一项的转座子或组合物，其中转座子是piggyBac转座子。
90.权利要求87-89的任一项的组合物，其中转座酶是piggyBac转座酶。
91. 权利要求90的组合物，其中piggyBac转座酶包含含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
92. 权利要求90或91的组合物，其中piggyBac转座酶是超活性变异体和其中超活性变异体包含在SEQ ID NO: 59的位置30、165、282和538的一个或多个处的氨基酸取代。
93. 权利要求92的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I) (I30V)。
94. 权利要求92的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G) (G165S)。
95. 权利要求92的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M) (M282V)。
96. 权利要求92的组合物，其中SEQ ID NO: 59的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N) (N538K)。
97. 权利要求87-96的任一项的组合物，其中转座酶是超级piggyBac (sPBo)转座酶。
98. 权利要求97的组合物，其中超级piggyBac (sPBo)转座酶包含含有SEQ ID NO: 60的氨基酸序列。
99.一种载体，其包含权利要求74-82的任一项的CAR。
100.权利要求99的载体，其中载体是病毒性载体。
101.权利要求100的载体，其中病毒性载体包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。
102.权利要求100或101的载体，其中病毒性载体包含从腺病毒相关病毒分离或衍生的序列。
103.权利要求100-102的任一项的载体，其中病毒性载体是重组载体。
104.权利要求99的载体，其中载体是纳米粒子载体。
105. 权利要求104的载体，其中纳米粒子载体包含核酸、氨基酸、聚合物、胶束、脂质、有机分子、无机分子或其任何组合。
106.权利要求99-105的任一项的载体，其中载体包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含
(a) 配体结合区，
(b) 接头，和
(c) 截短的半胱天冬酶9多肽，
其中诱导型半胱天冬酶多肽不包含非-人序列。
107.一种组合物，其包含权利要求99-106的任一项的载体。
108.一种细胞，其包含权利要求74-82的任一项的CAR。
109.一种细胞，其包含权利要求84-92的任一项的转座子或转座酶。
110.一种细胞，其包含权利要求99-106的任一项的载体。
111.权利要求108-110的任一项的细胞，其中所述细胞在细胞表面上表达CAR。
112.权利要求108-111的任一项的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
113.权利要求112的细胞，其中免疫细胞是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。
114.权利要求112的细胞，其中免疫细胞是T-细胞。
115.权利要求108-111的任一项的细胞，其中所述细胞是人工抗原呈递细胞。
116.权利要求108-111的任一项的细胞，其中所述细胞是肿瘤细胞。
117.权利要求108-116的任一项的细胞，其中细胞是自体的。
118.权利要求108-116的任一项的细胞，其中细胞是同种异体的。
119.一种组合物，其包含权利要求108-118的任一项的细胞。
120.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括给予所述受试者权利要求83、86-98、107或119的任一项的组合物。
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