JPH02257898A - Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法 - Google Patents
Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本出願は臨床および食品環境中の微生物の検出に関し、
特にＲＮＡ依存依存ＲＮＡポリメラーゼ増幅ハイプリシ
ーシコン検定もに使用する新規ＲＮＡ鋳型プローブ構成
物に関する。 従来の技術 体液および食料品中の低レベルの病原性微生物の検出に
対する要請は病気の診断、処置および予防に第一に重要
な点である。そのような微生物を検出する現在の方法に
は、試験管内でのそれらの分離および培養または微生物
に特異的な分析物の直接検出が挙げられる。そのような
分析物としては、微生物の核酸ゲノム、繁殖の間にその
ゲノムの転写により産生されるリポ核酸、または感染微
生物により宿主中で特異的に産生または引き出されるタ
ンパク質または代謝産物があるであろう。 試料中の特異的核酸の存在を検出する方法は良く理解さ
れており、同じ一般原理を利用している：相補的配列を
持つ核酸の他の鎖に対しヌクレオチドの特異的配列を持
つ核酸の鎖の間の強い親和性相互作用によりハイブリッ
ドまたは二重鎖構造を形成する。配列が正確に相補的で
ないならばハイブリダイゼーションが起こらないように
このハイブリダイゼーションを起こす条件を調整するこ
とにより、そのようなハイプリ・Ｉドの形成を高度に特
異的（″ストリンジェント”）にできる。もし。 試料からの総核酸がニトロセルロース膜のごとき固体支
持体上に固定されるなら、試料中の特異的”標的”配列
の存在は検出可能部分を持り相補的核酸”プローブ”の
結合により決定できる。そのような部分は放射活性の核
種、螢光性化合物、または発色、発光または螢光生成物
を発生可能な触媒活性を持つタンパク質複合体により認
識されるリガンドであろう。保持体の洗浄によりハイブ
リダイズしなかったプローブを除去した後、存在する検
出可能部分の量により標的の量が決定される。 実際面では、そのような検定の感度は、プローブ核酸内
へ物理的に取シ込まれたであろう標識部分の数により制
限されている。放射活性−標識プローブの場合、実際的
限界は約１０４標的分子である。しかしながら、この感
度を達成するには数日を要する検出工程（即ち−オート
ラジオグラフィー）と相まって不都合に非常に制限され
た有用な半減期を持つ、非常に高比活性のプローブが必
要である。螢光、化学発光、または酵素的検出を利用す
る他の標識法はよシ迅速ではあるが、同位元素−標識プ
ローブの感度を１通常越えることはない。臨床的に興味
あるほとんどの微生物は、標的として使用するのに適し
た核酸をｓｏ、ｏｏｏ コピー以上は含んでいないの
で、そのような方法では多くの微生物の検出に制限をう
ける。しかしながら、臨床標本または食品中の感染性作
因はしばしば試料当り数個（１−１０）を越えない。そ
れ故、そのような低レベルを検出することが可能な方法
に対する要求が存在する。 核酸ハイブリダイゼーション検定の感度を改良するのが
本発明の一つの目的である。 低レベルのＤＮＡを検出するための一つの方法はＤＮＡ
−依存ＤＮＡポリメラーゼを利用し、直接ＤＮＡ標的を
複製して容易に検出可能な水準までその数を増加せしめ
ることである。この方法は“ポリメラーゼ連鎖反応”（
ＰＣＢ、）と称される。 ５ａｉｋｉ 、 Ｒ，Ｋ、 、 ５ｃｈａｒｆ 、 ８
． ＊Ｆａｌｏｏｎａ、Ｆ、 。 Ｍｕｌｌｉｓ 、 Ｋ、 Ｂ、 、Ｈｏｒｎ 、Ｇ、
Ｔ、、 Ｅｒ１ｉｃｈ、 Ｈ。 Ａｏ、およびＡｒｎｈｅｉｍ 、 Ｎ、 、″′ベータ
ーグロビンゲノム配列の酵素的増幅および鎌状赤血球貧
血の診断のための制限部位分析”５ｃｉｅｎｃｅ ２５
０ ：１３５０−１３５４（１９８５）；５ａｉｋｉ、
Ｒ，に、。 Ｇｅ１ｆａｎｄ 、Ｄ、 Ｈ，、５ｔｏｆｆｅｌ 、
Ｓ、 、 ５ｃｈａｒｆ 。 Ｓ、Ｊ、 、Ｈｉｇｕｃｈｉ 、Ｒ，、Ｈｏｒｎ 、Ｇ
、 Ｔ、、Ｍｕｌｌｉｓ 。 Ｋ、Ｂ、、およびＥｒ１ｉｃｈ、Ｈ，Ａ、、″熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのプライマー−支配酵
素的増幅”５ｃｉｅｎｃｅ ２３９ ： ４８７−４９
１（１９８８） ； Ｅｒ１ｉｃｈ 、Ｈ，Ａ、 、Ｇ
ｅ１ｆａｎｄ 、Ｄ。 Ｈｏ、および５ａｉｋｉ 、Ｒ，に、、″′特異的ＤＮ
Ａ増幅”、Ｎａｔｕｒｅ３３１：４６１− （１９８
８）：およびＭｕ １１ ｉ ｓ ら、欧州特許出願
第２００３６２および２０１１８４号（米国特許第４，
６８３．１９５および４，６８５，２０２号も参照され
たい〕が参考文献として含まれている。ＰＣＲ法におい
ては２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドが熱処理により分
離された標的ＤＮＡの相補鎖上の特異的な別々の部位に
ハイブリダイズされる。アニール化されたプローブはそ
の後ＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖の合
成を開始するのに使用し、標的の２つの二重鎖コピーを
得る。合成後、得られた二連体ＤＮＡ生成物中の鎖を熱
処理により再び分離し、オリゴヌクレオチドプローブ（
大過剰に存在する〕を標的および複製鎖の両方に再アニ
〜ルし、さらにポリメラーゼと伴にインキネベートする
。標的ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブの酵素
的伸長によ多発生されたＤＮＡ鎖の両方がプライマー−
支配複製の鋳型として働くので、多数の生成物鎖（例え
ば、百方コピー〕を生じるまで各々の回に特異的生成物
ＤＮＡの量が倍になる。 実際面では、増幅の標的がＤＮＡ（ＲＮＡに対して）で
ある必要性および、偶然に同様の複製産物を発生する非
−標的ＤＮＡ中の相同部位へのプローブのハイブリダイ
ゼーシ：ｌ／により生じる偽陽性物の存在などのためこ
の技術は制限を受ける。 さらに、標的ＤＮＡは非常に高い感度、で検出されるで
あろうが、検定の複雑さを著しく増加させなければ試料
中に存在する標的の数を決定することは困難である。病
気の処置グロトコールの評価するには感染性作因の数が
しばしば重要であり、この増幅法は定量的というより定
性的結果を与えるので不都合であり制限を受ける。 定量的検定により都合よく使用できるであろう方法およ
びプローブを提供するのが本発明の別の目的である。 核酸検出の感度を改良する別の方法は、 ＲＮＡ−依存
ＲＮＡポリメラーゼにより複製されるであろう（即ち鋳
型〒ある）ＲＮＡ分子に結合または取り込まれているハ
イブリダイゼーションプローブを用いることである。例
えば、ＭＤＶ−１゜ＲＮＡ、几ＮＡ−依存ＲＮＡポリメ
ラーゼ（Ｇ）βレプリカーゼ）のための２２１ヌクレオ
チドＲＮＡ鋳型、からの誘導により、ＲＮＡプローブを
発生する多くの手段がＣｈｕ 、 Ｂ、 Ｃ，Ｆ、 、
Ｋｒａｍｅｒ 、Ｆ。 Ｒｏ、およびＯｒｇｅｌ 、 Ｌ、 Ｅ、 、″′生物
検定のための増幅可能レポーターＲＮＡの合成”Ｎｕｃ
ｌ、Ａｃ１ｄｓ。 Ｒｅｓ、１４：５５９１−５６０３（１９８６）；Ｌｉ
ｚａｒｄｉ 、Ｐ、 Ｍ、、Ｇｕｅｒｒａ、Ｃ，Ｅ、
、Ｌｏｍｅｌｉ。 Ｈ，、Ｔｕｓｓｉｅ−Ｌｕｎａ 、 ＩおよびＫｒａｍ
ｅｒ 、 Ｆ、 Ｒｏ。 ６組換え体−ＲＮＡハイプリダイゼーシ−１ノブロ−プ
の指数的増幅”パイオノテクノロジー６：１１９７−１
２０３（１９Ｂ８年１０月〕；および欧州特許出願第２
６６．３９９号（ＥＰ出題第８７９０３１３１．８号）
（これらは完全に参考文献としてここに含まれている）
により提供されている。複製可能ＲＮＡプローブ構築物
はＲａｎｋｉら； Ｕ−８，４，５６３，４１９； ５
ｏｄｅｒｌｕｎｄ 、 Ｇ、 Ｂ、。 Ｕ、 Ｓ、 ２，１６９，４０３ ； ５ｔａｂｉｎｓ
ｋｙ、 Ｕ、 Ｓ。 ４．７５１，１７７；５ｙｖａｎｅｎｅｎ、Ｇ、 Ｂ、
、Ｕ、 Ｓ。 ２．１６９，４０５ ； ５ｔａｂｉｎｓｋｙ Ｕ、
Ｓ、 ４，７５１．１７７；および５ｙｖａｎｅｎｅｎ
ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ。 １４：５０３７−５０４８ （完全に参考文献として
ここに含まれている）により記載されているごとく、高
感度ハイブリダイゼーション検定に都合よく用いられて
いる。ハイブリダイゼーション後、標的と会合したＲＮ
Ａ−プローブキメラは１種々の方法（例えばエチジウム
プロミドまたはグロピジウムヨージドのごとき色素を使
用する螢光により〕により容易に検出されるようなＲＮ
Ａ量を生じるまで複製される。ＱβレプリカーゼのＭＤ
Ｖ−Ｉ ＲＮＡ量型は試験管内で２０秒毎に数が倍に
なるので、単一温度で数分以内にＲＮＡ分子の数の指数
的増加（ＰＩえは、１０億倍）が起こり、反応液中の鋳
型の数が活性酵素分子の数を越えるまでその速度で進行
する。その時点後は、鋳型ＲＮＡ０量は時間と伴に直線
的に増加する。その結果、この直線期に致達する充分な
期間が与えられた反応液においては（例えば１００分子
に対しては１５分つ、増幅産物ＲＮＡ量は最初に加えた
鋳型ＲＮＡの量の対数に直接比例する（Ｌｔｚａｒｄｉ
ら前記文献）。鋳型−プローブの最初の量は標的の量に
比例するので、いわゆるＰＣＢ増幅技術とは著しく異な
って非常に広い範囲にわたって、試験される試料中に存
在する標的の数を都合よく定量できるであろう。 そのようなＲＮＡ依存、ＲＮＡポリメラーゼ。 Ｑ−ベータレプリカーゼのためのＲＮＡ鋳型の性質を利
用するのが本発明の更に別の目的である。 これまで、複製可能ＲＮＡをプローブへ結合する手段が
ほとんどなかった。有用であるためには。 そのようなプローブ−ＲＮＡ構築物はレプリカーゼの鋳
型として直接働くかまたは複製に先立ってプローブ部分
の脱離をさせなければならない。 つの方法においてはプローブをＲＮＡにジスルフィド（
−Ｓ−Ｓ−）結合を含むシスタミン部分を通して結合す
るとそれは複製に先立って切断できるＣＣｈｕら、前記
文献〕。しかしながら、この方法はいくつかの合成工程
を必要とするのでそのようなプローブを産生ずる労力の
代価が増加する。それに加え、当業者は容易に認めるで
あろうが、そのようなジスルフィド結合は多くの生物試
料中に天然に存在する還元剤（例えばグルタチオン〕に
よる時期尚早の切断を受ける。 そのようなジスルフィド結合構築により負う制限を避け
るのが本発明のさらに別の目的である。 別の方法においてはプローブ配列は複製可能ＲＮＡの配
列内に取り込まれているＣ Ｌｉｚａｒｄｉら。 前記文献〕。しかしながら、多くのそのような構築物中
の異種ＲＮＡ配列は不都合なことに効率よく複製される
ＲＮＡの能力に影響するか、または複製の間に自発的に
欠落する。例えば８つのそのような構成物の収集物のう
ち、２つは忠実に複製するが、６つは複製されにくいか
または複製の間にプローブ配列が欠落する。そのような
欠落率は複製の速度に影響し、不規則な時間に起こるの
で。 増幅の直線期中に得られるＲＮＡ産生物のレベルを標的
レベルの算定に使用することができない。 さらに、多くの１的微生物に対し、標的および非感染物
の核酸の間の高い度合いの配列相同性のため非常に限ら
れた数の配列（例えば１つまたは２つ〕しかハイブリダ
イゼーション標的として使用されない。すなわち、プロ
ーブ配列が安定で効率よく複製されなければならないな
どの付加的な必要条件がこの方法の一般的応用を制限し
ている。 この制限を克服するブローブー鋳型ＲＮＡ構築物および
方法を提供するのが本発明のさらに別の目的である。 鋳型几ＮＡの６′かまたは５′末端にＲＮＡに通常観察
されるホスホジエステル結合を通してプローブ配列を結
合すると（謹々の手段により簡単に達成できるが）、複
製を強く阻着すると報告されてイル。例えば、ＭＤＶ−
１・ＲＮＡの５１ヌクレオチドへの短いオリゴリボヌク
レオチド（Ａｔｏ）の結合はＲＮＡの指数的複製を不可
能にする（Ｍｉｅｌｅ、 博士論文、コロ／ビア・ユ
ニバーシティ、１９８２）。他の鋳型ＲＮＡの６′末端
への付加的ヌクレオチドの結合も同様にＱβレプリカー
ゼによるそれらの複製を阻害する。例えば。 ＱβファージＲＮＡの６′末端への１０−２０の間のシ
チジル酸残基の付加はその鋳型活性を破壊する（Ｇｉｌ
ｌｉｓ 、 Ｅ、 、 Ｄｅｖｏｓ、Ｒ，およびＳｅｕ
ｒｉｎｃｋ−Ｏｐｓｏｍｅｒ 、Ｃ，、Ａｒｃｈ、 Ｉ
ｎｔ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ 。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、８４：３９２−３９３（１９７６））
；短いオリゴアデニル鎖の付加も同様の効果を持つ（Ｇ
ｉ ｌｖａｒｇ 、 Ｃ，Ｊｏｃｋｕｓｃｈ 、 Ｈ，
およびＷｅｉｓｓｍａｎｎ 、ＣｏＢｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ４１４．３１３−８（１９
７５）；Ｄｅｖｏｓ、ＰＬ、ｖａｎ−Ｅｍｍｅｌｏ 、
Ｊ、、Ｓｅｕｒｉｎｃｋ−Ｏｐｓｏｍｅｒ 、Ｃ，。 Ｇ１１ｌｉｓ、Ｅ、、およびＦｉｅｒａ 、Ｗ、 、
Ｂｉｏｃｈｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ４４７：３１９−２７（１９
７６）もまた参照されたい）。ＣｈｕらによるＷｏ・８
７１０６２７０はＲＮＡ鋳型への親和性分子の結合はそ
れがプリン結合を通してなされたものなら可能であろう
が、そのため複製に先立って酸脱プリン切断工程にかけ
られるであろうと公表している。 従ってこの技術はうまく働かず、それ故この方法は複製
可能ＲＮＡへのプローブ配列の結合の手段としては使用
されなかったことが示された。 自己触媒ＲＮＡポリメラーゼ鋳型と連結して核酸プロー
ブ配列の配置のよシ大きな融通性を許す新規プローブお
よびその使用方法を提供するのが本発明まださらに別な
る目的である。 複製可能ＲＮＡの５′末端へ結合した標的特異性核酸プ
ローブ配列を用いる複製可能ＲＮＡ鋳型を提供するのが
本発明のさらに別の目的である。 Ｑβ複製可能ＲＮＡの６′末端に結合している標的特異
的核酸プローブを含むプローブおよびその使用法を提供
するのも本発明の更なる目的である。 ＦｏｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ （Ｃｅｌｌ 、５０
： ９−１６（１９８７））およびＵｈｌｅｎｂｅｃ
ｋ（Ｎａｔｕｒｅ 。 ３２８：５９６−６００（１９８７）） は植物ウイル
ソイドおよびほかの場合で観察され、二価カチオ／の存
在下自己触媒的切断が進行するという独特の性質を持つ
ＲＮＡ配列について記載している。 一つのそのような構造は現在”ノ・ンマーヘッド構造と
称されておシ、定義された領域に二重鎖へリックスの結
合および絶対配列保存を含む。 Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋはこの構造の”領域”は別々のＲＮ
Ａ分子上で作られハイブリダイゼーシヨンにより互いに
組み合わさったことを示した。Ｗ。 Ｇｅｒｌａｃｈ （アゾレード、オーストラリア〕はそ
のような構造の一部を持つＲＮＡを残存要素を持つ別の
全く関係ないＲＮＡを切断するのに使用し。 試験管内で、適切なＲＮＡ配列を選択することによりク
ロラムフェニコール・アセチル−トランスフェラーゼの
ためのメツセージが切断の標的とされ、適切な構造が形
成することを示した。これらの”ハンマー−ヘッド様構
造は”リボザイム”の名前を得ておシ（ここでもその名
前を使用するが〕１反応中の２つのＲＮＡの内の１つは
本当の触媒のごとく反応の間に消費されないので無限の
数の基質ＲＮＡを切断するのに使用できる。 標的ポリヌクレオチドの検出のためにリポザイムに連結
して複製可能ＲＮＡ鋳型を用いるプローブおよびその使
用法もまたさらに本発明の目的である。 当業者には明らかになるであろうが、たった一つの鋳型
ＲＮＡ分子も検出可能な生成物を導くので、標的の存在
に関係なくハイブリダイゼーション過程の間にプローブ
分子の複製により生じるであろうバックグラウンドによ
りハイプリダイゼーションプロープが増幅される方法が
制限される。 例えば、標識核酸がニトロセルロース上に固定される複
製可能ＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション
検定においては一標的が存在するしないに関与せず１０
プローブ分子が結合しているのが観察されている（ Ｌ
ｉｚａｒｄｉら前記文献〕。 そのようなバックグラウンドでは、このレベルと等しい
かそれ以下の数で存在する標的は増幅産物の収量に有意
に寄与しないであろうから、そのような検定の感度を制
限し、それ故信頼性を持って決定できないであろう。 バックグラウンド限界と離れた感度のＲＮＡ鋳型プロー
ブ構築物およびその方法を提供するのも本発明のさらな
る目的である。 このバックグラウンドを減少させる１つの方法は標的−
プローブ複合体が保持体に可逆的に結合する方法を用い
ることである（″可逆的標的捕捉”）。 ハイブリダイゼーションおよび固定化後夜合体を保持体
から溶出し、保持体は非特異的に結合したプローブと伴
に放棄する。複合体は続いて新鮮な保持体上に再捕捉さ
れる。この過程を数回繰シ返するとハイブリダイズして
いないプローブの量を著しく（例えば１０倍）減少させ
る（この標的−循環技術の詳細な記載は、ここに参考文
献として含まれているＣｏ１１ｉｎｓ、欧州特許出願第
８７５０９５０８．２号を参照されたい〕。 そのような可逆的標的捕捉技術に使用されるであろう構
築物およびプローブを提供するのも本発明のさらなる目
的である。 発明の要約 本発明の原理および目的に従うと＋ ＲＮＡ鋳型の５′
および６′の末端の片方または両方に結合した標的特異
性プローブ配列と連結した複製可能ＲＮＡ鋳型を用いる
新規プローブが提供される。 １つの実施態様においては、標的プローブ配列は標的核
酸と分子間相補性によりリボザイムを形成し、それは二
価カチオンのごときものにより切断を受ける。特に、適
当なＲＮＡ標的核酸の存在下では複製可能ＲＮＡ鋳型の
６′末端の標的特異性プローブ配列（一連のＮ”ヌクレ
オチドにより表わされ、そこにおいてＮは任意のヌクレ
オチドおよびＮ′はその相補的ヌクレオチドである）お
よび５′末端上のプローブ配列が標的核酸の相補配列ヘ
ハイプリダイズされる。ＭＤＶ−１の５′末端上の配列
伸長により生じる阻害が都合よく使用され、それにより
５’プローブ伸長を持つ複製可能ＲＮＡ、第２のＲＮ
Ａプローブおよび標的ＲＮＡ間で三成分のハイブリッド
が形成されて自己触媒性ＲＮＡ構造〔リポザイム〕を産
生し、それは複製可能ＲＮＡプローブからの５′伸長物
を切断し。 同時にそれを効率的複製型に変換し、保持体からのその
放出に影響を与える。この方法は活性リボザイム構造を
発生するのに特異的配列要素５’−ＧＡＡＡ −３’を
含む標的ＲＮＡを必要とするのであまシ好適ではない。 特異的に標的に結合するまでプローブ分子が複製に対し
て特徴的に無力であるものは、ハイブリダイゼーション
検定においてバックグラウンドを減少させるための他の
方法を提供できるので１利口な”プローブと記述された
。リボザイム構造は図１Ａの１四角に囲んだ”部分に非
常に詳細に示したごとく６環状”構造である。矢印はマ
ンガン、マグネシウムまたはカルシウムのととき二価の
カチオンの存在下起こる切断の部位を示している。 本発明の他の好適な実施態様においては、プローブおよ
び複製可能ＲＮＡ配列の間に非特異的配列を配置する。 この”スペーサー”要素の配列は検出限界を最適に調整
するように都合よく変化されるであろう（即ち、最も少
ない分子の数でＱβレプリカーゼとインキュベーション
後に検出可能な産生物を生じるように）。複製可能ＲＮ
Ａおよびプローブ配列要素の間に無作為な配列の定義さ
れた領域を持つどちらかといえば同一のＲＮＡ構築物の
集団から出発する最適なスペーサー配列の発生および選
択の方法が提供される。 別の最も好適な実施態様においては、−組のプローブが
構築さ九標的核酸中の隣接する部位に結合される。プロ
ーブの組のうちの１つは複製可能ＲＮＡからスペーサー
配列により分離されたプローブ配列要素を持つ６′また
は５′伸長物を持ったＱβＲＮＡ鋳型を好適には含んで
いる。第２のプローブは理想的には第１のプローブのス
ペーサー配列内をエンドヌクレアーゼ的に切断するヌク
レアーゼ（または順番にヌクレアーゼに結合できる親和
性試薬〕から成る放出試薬を結合したオリゴヌクレオチ
ドから成っている。ヌクレアーゼは理想的にはその活性
に必須の補因子が添加されるまでは不活性であるような
種類のヌクレアーゼの一つである。標的核酸が結合プロ
ーブと一緒に固定されるようなハイブリダイゼーション
検定において両方のプローブは都合よく用いられる。非
結合プローブの大部分を洗い流した後、ヌクレアーゼの
活性に必要な補因子が添加され、切断が起き短い伸長鎖
を持つ複製可能ＲＮＡが溶液中へ放出される。このＲＮ
Ａは続いて都合よくＱβレプリカーゼにより増幅される
であろう。 そのような伸長Ｑβ鋳型を用いる利口なプローブ系の多
くの他の実施態様が提供される。 本発明の最も好適なプローブはＲＮＡ複製可能鋳型の６
′および５′末端の両方に標的特異性ＲＮＡ配列を用い
ているが１本発明はこれらの位置にＤＮＡプローブをつ
けてもまた働くが１本発明の混合ＤＮＡ−ＲＮＡプロー
ブの構築および産生は非常に困難であろうことが容易に
認められるであろう。しかしながらリボザイムを形成す
るのに必要な配列はリボザイム構造を満足するように形
成し、誘導可能切断を受けやすくするためにＲＮＡでな
ければならない（および図１Ａに示したリボザイム構造
で特定したごとく）。最も好適な実施態様において、そ
のような切断はマグネシウムの存在下起こり、それはま
たＱβレプリカーゼ支配のＲＮＡ鋳型（理想的にはミデ
ィ変異体）の複製のための補因子としても働く。マンガ
ンも有効であるが、鋳型特異性が変わり、それ数夜製が
所望の忠実度で起こらないので好適さはよシ低い。 最も好適なＲＮＡ鋳型はＭＤＶ−１まだはミディ変異体
（２２１のヌクレオチドＲＮＡ）であり。 Ｃｈｕら１によ、すＷＯ８７１０６２７０（参考文献と
して含まれている〕に記載されており、バクテリオフプ
ージＱβに感染した細胞中に見い出される。 ＭＤＶ−１はＱβレプリカーゼ調製試料に普通にある夾
雑物である。ＱβレプリカーゼはＭＤＶ−１および他の
構造のごとき特定の１次および２次構造を持つＲＮＡ鋳
型に作用する（例えば複製する）。ＱβＲＮＡ遺伝子に
沿って複製するがＭＤＶ−１はその機能が知られていな
いようである。５′および６′末端にある種の天然の変
異を示すことも知られておシ〔−量的に単にＧＣ対の付
加または欠失がみられる〕図１および２中の４つのＧＣ
対および図６および４中の６つのＧＣ対の説明として示
されている。 本発明のより好適なプローブ実施態様はＲＮＡ鋳型の６
′末端に比較的”短い”標的特異性プローブ配列を用い
るであろう。最も好適であるのはこの標的特異性配列が
約４から約１２塩基の長さを持っているであろうし、理
想的には約５塩基の長さである。リボザイムの切断に続
いて、典型的な切断温度である約５５℃では標的配列か
らの複製可能ＲＮＡ鋳型が会合しやすいのでそのような
比較的短い長さが良好である。 複製可能ＲＮＡ鋳型の５′末端上の標的特異性プローブ
配列の長さを増すほど一般的に標的特異性が増加するこ
とを当業者はもちろん容易に認識するであろう。まだ結
合しているこの５′末端標的特異性プローブにより試み
られた鋳型の複製が更なる複製を阻害するような鋳型の
崩壊を生じるのに十分な長さを持つようなプローブもま
た最も都合がよい。一方、５′および３′標的特異性プ
ローブの両方が短いプローブであるならば（例えばただ
の５つのヌクレオチドの長さ）、この実施態様において
はリボザイムの一定の形成および回転の可能性があり、
複製可能ＲＮＡ鋳型のより急速に切断する結果となる。 本質的により長い長さの５′末端標的特異性配列を用い
る最も好適な実施態様と比較するとこの実施態様の欠点
は標的特異性がいく分失われることが予測されることで
あろう。 本発明の最も好適なプローブは、３′末端および５′末
端を持つＲＮＡ鋳型としてミディ変異体を含み、 ５’
−ＵＣ−３’に続いて第１の標的核酸配列に相補的な標
的特異的第１の核酸プローブ配列から成る５′末末端先
導伸長動を持ち、およびさらに。 第２の標的核酸配列に相補的な第２の核酸プローブ配列
に続いて５’−ＣＵＧＡＮＧＡ−３’から成る６′末端
トレーラ−伸長配列を持ち、その中で最も好適なミディ
変異体は図１Ａに示したごとくＧＧＧＧＡＣＣ，、、、
、、で５′末端が始まり１１．。 ＧＵＵＣＣＣＣで３′末端が終了する配列を持っている
。もしくは他の好適な実施態様においては。 ミディ変異体は図１Ａに示した６′末端上の４つのＣの
１つが欠失しＵ（６′末端で図１Ａに示した四角の枠の
すぐ内側）とＧとの対合を許しそれにより基部を６まっ
すぐにし”そのような基部中の異性化の可能性を除去す
るが、それはさもなくば基部の残りに沿って誤対合を起
こすことになるであろう。そのような誤対合は最終的に
は誤形成を導くであろうし、それ故事件、リボザイムの
不活性化が避けられている。 他の好適な実施態様においては（図２に示した〕、ＲＮ
Ａ標的に特異的な第１の核酸プローブ配列が好適な実施
態様のごとく複製可能ＲＮＡ鋳型の５′先導配列に添え
られているプローブ構築物を利用する。しかしながら最
も好適な実施態様と異なり、複製可能ＲＮＡ鋳型の６′
末端は標的特異的核酸プローブ配列を取り込んでいない
。むしろ、第２のＲＮＡ標的配列に特異的な第２の核酸
プローブ配列から成る第２のプローブ（リボザイム構造
の半分）、および５’ＲＮ Ａ鋳型基部配列の一部に対
し特異的な第６の核酸プローブ配列が利用される。 最も好適な実施態様のとと＜、ＲＮＡ標的との両方のプ
ローブのハイブリダイゼーションにより。 ＲＮＡ標的が必要条件５’７ＧＡＡＡ−３’配列を提供
している切断可能リボザイムを生成する結果となる。 本発明の最も好適な方法は、第１および第２の核酸プロ
ーブ配列が第１および第２の標的配列（Ａ’ −ＧＡＡ
Ａ −３’の介在配列を持つ）の各々とハイブリダイゼ
ーションが可能な条件下、本発明の好適なプローブ構築
物を単鎖標的核酸と接触せしめてそれによりリボザイム
を生成する。例えばそれらをマンガン、マグネシウムお
よびカルシウムから成る群より選択された二価のカチオ
ンと接触せしめてそのリボザイムを続いて都合よく切断
する。ＲＮＡ鋳型（理想的にはＭＶＤ−１ミディ変異体
）は、ＲＮＡ鋳型の６′末端の”短い”第２の核酸プロ
ーブ配列がＲＮＡ１的に安定してハイブリダイズするに
は不十分な長さであろうから。 標的核酸から都合よく放出される。放出されたＲＮＡ鋳
型はそのあと都合よ〈Ｑβレプリカーゼにより複製され
、複製されたＲＮＡ鋳型は標的核酸の存在または不存の
指標として検出される。最も理想的な方法は、切断誘導
に先立って分離工程を含むだろうし、それによりハイブ
リダイズしていないプローブが除去され、それ故Ｑβレ
プリカーゼによる増幅サイクル中に利用できる鋳型とし
ては関与できなくなる。例えばプローブ−標的ハイブリ
ダイゼーション複合体を固定化するごとき（他の不溶化
標的特異性プローブを通して、それ自身直接的または間
接的に捕捉ピーズ、計深棒その他のごとき固体表面に固
定化して〕種々の手段により除去が達成される。いわゆ
る”サンドウィッチ”技術が当業者にはよく知られてお
り、ここで詳細に説明する必要はないであろう。 発明および最良の形態の詳細な説明 Ｍｉｅｌｅ （上記文献〕およびその他の結果の調査に
おいて１種々の長さの６′末末端伸長動を持つ１組の組
み換え体ＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡが−Ｌｉｚａｒｄｉら（
上記文献〕により記載されているごときＭＤＶｃＤＮＡ
の下流に切断部位を持つ制限酵素で種々に消化されてい
るｃＤＮＡクローンの転写により生成している。驚くべ
きことに文献の一般的な教えに反し１組換え体ＲＮＡ鋳
型の５′末端への１８３ヌクレオチドもの長さの６′付
加物でも十分な複製が起こることが観察され、Ｑβレプ
リカーゼ反応の開始にそのような６′伸長物を持つたっ
たの１０分子を用いても増幅ＲＮＡ生成物が検出できた
。 増幅産物ＲＮＡは６′伸長物を欠＜ＲＮＡと同じ大きさ
であり１分子の鋳型部分で６′伸長物は複製されないこ
とを示唆している。この驚くべき全く予想されなかった
結果は複製可能ＲＮＡ上のプローブ配列の配置に多大な
融通性を与えるので増幅ハイブリダイゼーション検定に
おいてプローブとしての複製可能ＲＮＡの応用に重要な
意味を持っている。 実施例 実施例１：リポザイムの産生：Ｑβ鋳型ＲＮＡプローブ
キメラ 図１に示した几ＮＡ構築物は下記の方法により産生され
る。２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーは当業者
にはなじみの方法により産生される。第１のものは続い
イの構築に使用される制限酵素の多くの認識部位の鎖を
含み（図４Ａ参照）、酵素Ｑβレプリカーゼの鋳型に近
い配列に相補的部分に結合されているがミディ変異体Ｒ
ＮＡのプラス鎖の最後の６′ヌクレオチド（Ａ）は含ん
でいない。当業者には理解されるであろうごとく。 ＲＮＡのこの領域に相補的配列の正確な長さは分子間ハ
イブリッドを形成し、ミディ変異体ＲＮＡのこの領域中
に存在する分子内塩基対合を置きかえるのに十分な長さ
でなければならない。第２のオリゴヌクレオチドはその
５′から６′末端の順に。 転写の方向と同じ向きで読んだ場合ＤＮＡ−依存ＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターの一つの鎖から成る配列を
含んでいる。この場合、前記プロモーターはバクテリオ
フフージＴ７によりコードされているＲＮＡポリメラー
ゼ（高度に効率のよい酵素）のためのものであるが、当
業者には理解されるであろうごとく、同様に他のＲＮＡ
ポリメラーゼのためのプロモーターも使用できる。この
配列要素に続いて３′の方向に二重鎖ＤＮＡにねじれた
開裂を生み、突き出た単鎖６′末端伸長物を残す制御ｌ
！エンドヌクレアーゼのための切断部位がある。 この実施例において、この酵素はＡｐａＩ であり。 その配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと部
分的に重複するように作られる。この部位に制［エンド
ヌクレアーゼのための認識配列が続くが、エンドヌクレ
アーゼは一部の酵素のうちのどれでもよく、配列を認識
し、配列要素の６′領域中でＤＮＡを切断し、ねじれた
切断および突き出した単鎖５′末端伸長物を残す。この
認識配列はミディ変異体ＦＬＮＡをコードする配列の直
ぐ先に。 鎖中の最終ＤＮＡベクター構築物の切断を支配するよう
な様式に配置する。本実施例では（図４Ａ参照）これは
制限エンドヌクレアーゼＥａｒＩのための部位であシ、
その酵素はＣＴＣＴＴＣＮ の配列を認識しく式中Ｎは
任意のヌクレオチドＮ以降じ鎖中のヌクレオチドＮ以降
のＤＮＡおよび相補鎖中のさらに６つのヌクレオチドを
切断する。最後に、この配列に基部に近い配列に相同の
他の配列が続き、それはアニール化しおよび以下に記載
するごとく第２の鎖生成物の合成を開始するのに十分な
長さを持つミディ変異体ＲＮＡ（ＭＤＶ−ＩＲＮＡ）の
５′末端を含んでいる（ただし、ＭＤＶ−１に観察され
るリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドに置き
換えられている〕。 ミディ変異体ＲＮＡのｃＤＮＡの合成のためにプライマ
ーとして使用される第１のオリゴヌクレオチドが図６に
示しである。ＭＶＤ−１は外因性鋳型ＲＮＡなしで開始
されたＱβレプリカーゼ反応から得られる。多くの方法
により調製されたＱβレプリカーゼホロ酵素のすべての
調製液は典型的には低水準のこのＲＮＡが夾雑している
ので豊富な量のＭＤＶ−ｌＲＮＡが生成するであろう。 前記の第１のオリゴヌクレオチドおよびＭＤＶ−ＩＲＮ
Ａの各々１ピコモルを混合し、加熱によりアニールし、
放置して混合物を徐々に冷却する。 このプライマー−鋳型の組合せをＭａｎｉａｔｉｓ ら
（クローニング マニュアル〕により記載されているご
とき方法での逆転写反応の開始に使用する。 第１の鎖合成が完了後、ミディ変異体ＲＮＡは温和なア
ルカル処理またはもしくはＲＮａａｅＨで破壊する。第
２の相補鎖をこの反応生成物と前記第２のオリゴヌクレ
オチドとアニールして発生せしめ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼで伸長させる。 この生成物はＭａｎｉａｔｉｓらにより記載されたごと
き方法により選択可能、複製可能ＤＮＡベクター内へク
ロ、−ン化できる。常法により潜在的クローンをオリゴ
ヌクレオチド中に含まれる各々の制限エンドヌクレアー
ゼ部位の存在でスクリーニングする。 細菌中で増殖させ精製した後、クローン化ｃＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＫｐｎ、Ｉ で
切断する。よシ小さい断片を電気泳動により精製し、制
限エンドヌクレアーゼＨｉｎｆ Ｉで切断する。この酵
素はＭＤＶ−１中の６５の位置に対応する部位でｃＤＮ
Ａ を切断する。しかしながら天然に存在するＭＤＶ−
Ｉ ＲＮＡの集団においてはこの部位は一部の分子に
しか存在しない。そのため適切な配列を持つもののため
、多くのクローンをスクリーニングせねばな・らない。 −度そのようにして得られたら、Ｈｉｎｆ副断片全断片
ゴヌクレオチド５’−ｐＣＴ、。−３’にアニール化し
たオリゴヌクレオチド５’−ｐＧＡ、、 −３’に結合
する。この結合混合物をＡｐａＪおよびＫｐｎｌで消化
する。得られた混合物を前記のごとくして生成されたベ
クターをＡｐａ ｌおよびＫｐｎｌで消化して得られた
大きな断片内へ結合する。これによりミディ変異体をコ
ードしているＤＮＡ配列がＡ残基域で中断されたクロー
ンが発生するであろう。 本実施例で利用されたＡｌ６域を任意の数の配列で置換
してもよい。しかしながら、Ｍｉｅｌｅら（Ｊ。 Ｍｏ１．８ｉｏ１．（１９８３）２８１−２９５）によ
り示されたごとく、ミディ変異体ＲＮＡの複製の間Ａ、
。は維持されることが知られている。 細菌中で増殖させ精製した後、上記構築物からのクロー
ン化ＤＮＡは２つの別々の反応で切断される（図４Ａ参
照）。最初に完全ミディ変異体ＲＮＡ ｃＤＮＡ を
持つゼクメントを酵素ＥａｒｌおよびＳｍａ （で切り
出す。この消化物をチミジン三すン酸存在下Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処理して−ＭＤＶ−１プラス鎖（例えば
図１に示した鎖。 その相補物はマイナス鎖であり、複製可能なＲＮＡ鋳型
でもある）と同じ向きの配列を持つ鎖の６′末端から６
つのヌクレオチドを除去する。得られる修飾断片をポリ
アクリルアミドゲルを通す電気泳動により精製する。第
２の制限消化は酵素ＡｐａｌおよびＫｐｎ ｌ にて行
なう。大きな方から２つの断片をアガロースゲル電気泳
動により精製する。 ２つのオリゴヌクレオチドを合成する。そのうちの第１
のものは５’−ＧＡＡＡ −３’要素の５′側の標的Ｒ
ＮＡ中の配列と相補的な少くとも４つのヌクレオチドに
続いて配列５’−ＣＣＣＣＴＧＡＮＧＡ−６′を都合よ
く含んでおり、配列５’−ＧＡＴＣ−３’で終止してい
る。第２のオリゴヌクレオチドは理想的には標的中の５
’−ＧＡＡＡ −３’の６′側の配列の少くとも４つの
ヌクレオチドに続いて配列５’−ＣＣＣＧＡ−３’ を
含み、ただし標的のりボヌクレオチドはデオキシリボヌ
クレオチドに置き換わっている。この要素は都合よく要
素５’−ＧＧＧＧ−６′に直ぐ続いている。オリゴヌク
レオチドの各々はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより
その５′末端がリン酸化される。 両方のオリゴヌクレオチドを、Ｍａｎｉａｔｉｓ ら
（上記文献〕により記載されているごとくして、Ｔ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼおよびＡＴＰを含む反応液中。 ベクターＤＮＡのＫｐｎｌおよびＡｐａ ｌ消化により
産生される大きな断片へ結合せしめる。結合生成物（図
４Ｂ参照〕をゲル濾過により非結合オリゴヌクレオチド
から精製する。結合生成物はそれから、修飾末端を持つ
小さなりａｒ、 Ｉ、Ｓｍａ Ｉ 断片と結合する。 得られる”ギャップのある”分子はＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼで処理して完全な二重鎖となす。この生成物
は都合よく細菌内へ導入され、増殖される。 当業者には明らかであるごとく、この一連の操作でＭ
Ｄ Ｖ ｃ ＤＮＡ部分がＴ０ｎ、ＮＡポリメラーゼの
転写の方向に関して、正常および逆の両方の方向に挿入
されているＤＮＡクローンが発生するであろう。ＭＤＶ
ｃＤＮＡをプラス鎖方向に含むクローン（転写によ
りＭＤＶ−１のプラス鎖を含むＲＮＡを産生ずる方向に
〕はＭＤＶ−１ｃＤＮＡ配列内を切断することが知られ
ている適当な大きさの制限エンドヌクレアーゼ断片でス
クリーニングして決定される。 ＭＤＶ−１をプラス鎖の向きで含むクローンから調製さ
れたＤＮＡはプロモーターに関して第２のプローブ要素
とより離れている制限部位で切断する。この実施稠では
、制限エンドヌクレアーゼＤｒａ（である。この消化さ
れたＤＮＡは都合よ＜、Ｍｉｌｌｉｇａｎ ら（Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。 （１９８７）１５：８７８３−８７９８ ）により記載
されているごとき条件下、試験管内でＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼにより転写され、ＲＮＡプローブを生成する。 実施例２：生体分子リポザイムプロープセットの組立て 実施例１で記載したごときｃＤＮＡクローンをＡｐａｌ
およびＥａｒ）酵素で切断し、前把手さな断片から大き
な断片が理想的に精製される。配列５’−ＣＣＣＧＡ−
３’ に続いて標的中の５’−ＧＡＡＡ＝６′要素の
直ぐ６′側の配列と等しい４−５０のヌクレオチド、順
に配列５’−ＧＧＣＣ−３’が続くオリゴヌクレオチド
は当業者になじみの任意の方法により合成される。この
オリゴヌクレオチドをアニール化し、大きな制限断片に
結合し、生じる単鎖の”ギャップ”領域はＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼの作用によりニ重鎖とする。このＤＮ
Ａは細菌内に導入し増殖させる。細菌から精製後、制限
エンドヌクレアーゼ５ｙｎａ ｌ で切断し、それか
らバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用す
る試験管内での転写反応の鋳型として使用する。 第２の配列プローブはＭｉ ｌ ｌ ｉ ｇａｎら（Ｎ
ｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、（１９８７）１５：８７８３−８
７９８）により記載されたごときＴ７ＲＮＡ ポリメ
ラーゼのための合成りＮＡ鋳型、この鋳型の一つの鎖は
。 標的中に見られるリボヌクレオチドがデオキシリボヌク
レオチドに置き換わっていることを除いて標的中の５’
−ＧＡＡＡ −３’要素の５′領域からの配列の少くと
も４つのヌクレオチドでその５′末端を出発し、配列５
’−ＴＣＮＴＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧ
ＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（式中Ｎは任意のヌクレオチド
を示す〕が続く。鋳型の他の鎖は配列５’−ＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’を持つオリゴヌクレ
オチドである。これらの２つのオリゴヌクレオチドは好
適には混合され、Ｍｉｌｌｉｇａｎら（同じ文献〕によ
り記載されているごとくして試験管内で転写される。生
成物は当業者にはなじみの任意の多くの方法により容易
に精製される。 実施例６：６′−末端伸長物を持つ修飾ＭＤＶ−Ｉ Ｒ
ＮＡの複製 実施例１に記載したものと同様のＭＤＶ−１のｃＤＮＡ
クローンが、公衆衛生研究所にューヨーク〕のＦ、 Ｒ
，Ｋｒａｍｅｒから得られ、それはＴ７ＦｔＮＡポリメ
ラーゼのためのプロモーターを含んでおり、天然に存在
するＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡ中のヌクレオチド６４−６６を
コードしている６−ヌクレオチドセグメントが配列要素
５’−ＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＡＣＡＴ
ＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＣＡＴＣＧＡＧ
ＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＧ−３’に置き換わシ、配列５’
−ＧＧＧＡＡＴ Ｔ Ｃ−３’が続いている修飾ＭＤＶ
−１ｃＤＮＡ 配列である。この全ての配列をｐｓＰ
６４のＨｉｎｄｌ［部位とＥｃｏＲ１部位の間にクロー
ン化する（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、、 １２巻７０３５−７０５６
）。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＳｍａ
Ｉ 。 ＥｃｏＲｌ 、 Ａｌｕ ＩおよびＰｖｕ １１ で
別々に切断し。 切断試料の各々を１Ｍｉｌｌｉｇａｎらにより記載され
ている条件下試験管内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによ
り転写する。これらの反応液中に生成されたＲＮＡは変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。こ
の過程により、天然のＭＤＶ−ＩＲＮＡに観察されるよ
うに３′末端に伸長銀がないもの、７−ヌクレオチド６
′−伸長物、２４−ヌクレオチド３′−伸長物または１
８３−ヌクレオチド６′−伸長物を持つ修飾ＭＤＶ−１
分子が発生する。 精製ＲＮＡは連続して希釈を行い、 Ｃｈｕら（Ｎｕｃ
ｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、 （１９８６）１４：５５
９１−６０３）により記載されているごとく、Ｑβレプ
リカーゼ反応の開始に１０４分子を使用する。 ただしＱβレプリカーゼはＢｉｅｂｒｉｃｈｅｒら（Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８６）３２１ ：８９−９１ ）
により記載されているごとくレプリカーゼの発現クロー
ンから精製されたかまたはＣ，Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ
（マックスプラント研究所〕から物質的に得た。各々の
反応物の２マイクロリツトルを１８マイクロリツトルの
９５係ホルムアミドと混合し、３０分後１００℃に５分
澗加熱し、ａ３Ｍ尿素を含む８係ポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動にて展開する。複製組換え体ＲＮＡはヌ
クレオチド６４−６６をより大きな配列に置き換えた結
果のその大きさから（その結果電気泳動的移動度が小さ
くなる〕、酵素調製試料中に夾雑しまた複製もされるＭ
ＤＶ−Ｉ ＲＮＡから区別される。６′伸長物がない物
、７−ヌクレオチド伸長物、２４−ヌクレオチド伸長物
または１８６ヌクレオチド伸長物を持つ修飾ＭＤＶ−Ｉ
ＲＮＡ で反応を始めた場合１組換え体ＲＮＡ生成
物は総ＲＮＡの各々約５０係、８６Ｌ ７２ｓおよび１
５％であった。各々の場合に生成される組換え体ＲＮＡ
は６′末端伸長物を欠く組換え体と同じ大きさであり、
６′伸長物自身は分子の残りの部分とともに複製されな
かったことを示している。多くの異った配列の６′末端
伸長物でこの実験を繰り返したが結果は同じであった。 実施例４：リポザイムブローブを利用する標的核酸の検
定 下記の配列の２つのデオキシリボーオリゴヌクレオチド
が合成された： ５’−ＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡ
ＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡ
ＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＣ−５’および５’−ＣＣＣＣＣ
ＴＴＧＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＡＴＣ−３’。これらは
実施例１に記載したｃＤＮＡベクター内へクローン化さ
れ、精製クローン化ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＤ
ｒａ Ｉ で切断した後Ｔ７ ＥｔＮＡポリメラーゼ
で転写された。正しい大きさのＲＮＡ生成物は変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製された。 このＲＮＡの１ピコモル（１０−１２モル〕をヒト免疫
不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）に感染した患者からの
ヒト全面、正常ヒト匍またはＲａｎｋｉ ら（上記文献
〕により記載されているごときサンドイッチハイブリダ
イゼーション検定でＨＩＶ−１の存在を検定するための
試料と−２，５Ｍグアニジンチオ７アナートおよび配列
５’−ＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣ
ＴＡＡＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡ −３
’ を持つ１ピコモルの合成デオキシリボ−オリゴヌク
レオチドの存在下ハイブリダイズさせる。図１Ａを一般
的に参照すると。 Ｃｏ１１ｉｎｓら（ＵＳＳＮ ９２２，１５５．ＥＰＡ
８７３０９３０８．２およびＣＩＰ ＵＳＳＮ１３６
．９２０．ＥＰＡ８８３１２１３５．２ 完全にここ
に参考文献として含まれている〕の方法に従ってｄＴ
で被覆したポリスチレンマイクロタイタープレー
トのウェル中（または図１Ａに示した捕捉ビーズ〕のご
ときものに固定化されたポリデオキシチミジンへのオリ
ゴヌクレオチド中のｄＡ、５ｏ域のハイブリダイゼーシ
ョンにより固体保持体へハイブリッドが固定される。プ
レートを６７℃で５０分間インキュベートした後非結合
プローブを含む内容物を吸引して捨て、“ウェルを０．
５Ｍグアニジンチオシアナートを含む緩衝液で繰シ返し
て洗浄する。その後ウェルを９０ｍＭトリスＨＣｌＣｐ
Ｈ７，５）を含む緩衝液で洗浄し。 １４ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃ１ｔ を含む同じ緩衝、液５０
３ｇをウェル内へ導入し、５０℃にて１５分間インキュ
ベートしてＩＪ ｆｆザイム切断を誘導する。切断およ
び放出されたプローブ（図１Ｂ参照）を含むウェルの内
容物を複製のため別のウェルに移す。各々４ｍＭのＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、１０μＣｉの Ｐ
−ＣＴＰおよび１μｇのＱβレプリカーゼを含む溶液５
マイクロリツトルを添加し。 プレートを６７℃にて２５分間インキュベートする。２
マイクロリツトルのウェル内容物を取り。 複製を停止するため１８μｌの９５％ホルムアミド、０
．０５係キシレ／シアツール、０．０５４ブロモフエノ
ールブルーを加える。この５マイクロリツトルを変性８
４ホリアクリルアミドゲルのウェルに応用し、複製され
ｆｃＲＮＡはキシレンシアツール色素がゲルの長さ移動
するまで電気泳動で展開する。Ｘ−線フィルムをゲルに
６時間曝露し。 その後検出の最終工程として現像する。よシ大きなＲＮ
Ａ生成物の長さが天然に存在するＭＤＶ−ＩＲＮＡ（７
）非付加５’末端お！びＭＤＶ−ＩＲＮＡ の非付加
６′末端に対応する配列の間のヌクレオチド数および実
施例１で記載したごとく（その場合１０ヌクレオチド）
Ｈｉｎｆ部位内へ挿入された配列要素の長さをつんだも
のに等しければ血液試料中のＨＩＶ−１ウイルスまたは
そのメツセンジャーＲＮＡの存在を示している。注意深
く複製相の時間的調節を行い、結果を適当な対照と比較
すると複製ＲＮＡ０量と本来の試料中の標的ＲＮＡ量の
間の関係が決定できそれにより定量的効果が提供される
ことが容易に認められるであろう。容易に理解されるよ
うに、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的な抗体（例
えば複製されたＲＮＡ配列に特異的なりＮＡオリゴヌク
レオチドの添加を必要とする）を利用する免疫学的方法
、もしくはエチジウムプロミドを使用する方法（その螢
光はＲＮＡポリマーの存在により促進される〕などの他
の複製ＲＮＡの検出法も用いることができるであろう。 ３１旦二二ヒト後天性免疫不全症候群の原因因子である
ＨＩＶ−１に対する１組の プローブが生み出された。２組の部 分的に相補的なオリゴヌクレオチド が生みだされ、下記の配列を持つ： （ＩＡ）５’−ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＴ
ＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＴ
ＡＡＴＴＴＴＣＧ−３’； （ＩＢ）５’−ＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡ
ＣＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣ
ＴＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ−３’； （２Ａ）５’−ＧＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＡ
ＧＡＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧ
ＴＣＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＧ−３’；および（２Ｂ）
５’−ＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＣＡＧＧ
ＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＴＴ
ＴＣＧＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣ−３’。 これらのオリゴヌクレオチド対（ＩＡおよびＩＢ：２Ａ
および２Ｂ）の各々をアニール化し。 別々に前記実験で使用したプラスミドのＥｃｏＲＩ部位
およびＳｍａ１部位間にクローン化する。クローニング
後、精製プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲｌで制限消化し、
Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼで転写してＨＩＶ−１中の同
じ配列に部分的に相補的な６′伸伸長列を持つ２つのＲ
ＮＡを発生させる。第１のオリゴヌクレオチド対から得
られるクローンにより産生されるＲＮＡ中、複製可能Ｒ
ＮＡの配列およびプローブ配列はスペーサー配列要素：
５’−ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ−３’により分離される。 第２のクローンにおいては配列５’−ＧＧＧＣＧＧＵＣ
ＧＣＧＣＧＡＡＡ−３’ のスペーサーが生じた。 各々のＲＮＡを連続的に希釈し、一部を１μｇのＱβレ
プリカーゼ（″Ｑ−ベータレプリカーゼの精製”と題し
た同時係争中のＵＳＳＮ３６４．３０６゜ＷＯに記載さ
れているＤｉＦｒａｎｃｅｓｃ。 の方法に従って精製した。完全にここに参考文献として
含まれている）、９０ｍＭ ）リスＨＣ１゜１４ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１ｔおよび各々４００μＭ のＡＴＰ
。 ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ を含むＱβレプリカー
ゼ反応の開始に使用する。６７℃にて３０分後ＥＤＴＡ
を２０ｍＭ、 およびエチジウム プロミドを１μｇ
７ｍｌまで添加して反応を停止する。エチジウム プ
ロミド−ＲＮＡ複合体の螢光が紫外光透照機により観察
された。第１のクローンで生じた少くとも１０ 分子お
よび第２のクローンにより生じた１０ 分子で反応を開
始すると増幅ＲＮＡ生成物が観察された。複製可能ＲＮ
Ａ配列の６′末端に直ぐ隣接する配列領域がプローブ検
出の感度に強く影響することをこれらの結果は示唆して
いる。続いての実験は反応時間を増加させても螢光によ
る検出可能生成物の最終的希釈収量に影響しないことを
示している。 これらの結果は核酸の高感度検出のためのプローブとし
て６′配列伸長物を持つ複製ＲＮＡの使用のための実際
的指標を提供する。スペーサー配列の適切な選択により
、標的核酸の検出に本質的により顕著な感度を持りＲＮ
Ａプローブが都合よく生じる。反対に、感染作因として
高濃度で存在するある種の標的核酸に対しては（即ち、
リボソームＲＮＡ、微生物当り５０，０００ コピー
まで存在する〕、検出の相対的に悪い限界を与えるスペ
ーサー領域を、非特異的結合プローブの低レベルの増幅
によりさもなくば生じるパックグラウンドを避けるのに
都合よく利用できるであろう。例えば。 Ｃｏ１１ｉｎｓ （上記文献）のごときバックグラウン
ド減少法を用いて検出限界以下中くとも１ケタの水準に
数を減ら′すと、非−特異的結合クローンは検出可能な
信号を与えることができないであろう。 それ故、適当なスペーサー配列を含む本発明のプローブ
はそのような検定において経費、複雑さ。 偽−陽性反応の頻度を減少させるのに都合よく使用でき
る。 現在認められるであろうごとく、前の実施例に記載した
ごときＴ４ＲＮＡＩＪガーゼの使用（Ａｔｅｆａｎｏ、
上記文献〕およびｃＤＮＡクローンの転写を含む多くの
手段がそのような構築物の発生に利用されるであろう。 Ｔ４ＲＮＡリガーゼの使用は都合よくプローブ伸長物が
ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかである構築物の生成を可
能にすることで評価されるであろう。 Ｑ９ し７” ＩＪ カー セハＭＤ Ｖ −Ｉ Ｒ，
ＮＩＲ型（７）３’末端で娘鎖の合成を開始し、−量的
に５′末端に致達するまで６′から５′の方向に（鋳型
（Ｂ）詩聖のコピーを続け、５′伸長物を持つ鋳型分子
は６′末端伸長物を持つ娘鎖生成物（例えば鋳型のマイ
ナス鎖〕を発生し、順に前に観察されたごとく複製され
る（例えばＱ−ベータレプリカーゼは末端に付加した６
′配列を無視する）。当業者には明らでなるであろうご
とく、そのようなプローブはまたハイブリダイゼーショ
ン検定にも使用できる。現在さらに明らかになるであろ
うごとく、スペーサー配列の効果は、そのようなプロー
ブの感度の調整に都合よく同様に用いられるであろう。 標的支配の５′または６′配列伸長物の切断を用いる利
口なプローブ系をさらに利用する本発見から
特にＲＮＡ依存依存ＲＮＡポリメラーゼ増幅ハイプリシ
ーシコン検定もに使用する新規ＲＮＡ鋳型プローブ構成
物に関する。 従来の技術 体液および食料品中の低レベルの病原性微生物の検出に
対する要請は病気の診断、処置および予防に第一に重要
な点である。そのような微生物を検出する現在の方法に
は、試験管内でのそれらの分離および培養または微生物
に特異的な分析物の直接検出が挙げられる。そのような
分析物としては、微生物の核酸ゲノム、繁殖の間にその
ゲノムの転写により産生されるリポ核酸、または感染微
生物により宿主中で特異的に産生または引き出されるタ
ンパク質または代謝産物があるであろう。 試料中の特異的核酸の存在を検出する方法は良く理解さ
れており、同じ一般原理を利用している：相補的配列を
持つ核酸の他の鎖に対しヌクレオチドの特異的配列を持
つ核酸の鎖の間の強い親和性相互作用によりハイブリッ
ドまたは二重鎖構造を形成する。配列が正確に相補的で
ないならばハイブリダイゼーションが起こらないように
このハイブリダイゼーションを起こす条件を調整するこ
とにより、そのようなハイプリ・Ｉドの形成を高度に特
異的（″ストリンジェント”）にできる。もし。 試料からの総核酸がニトロセルロース膜のごとき固体支
持体上に固定されるなら、試料中の特異的”標的”配列
の存在は検出可能部分を持り相補的核酸”プローブ”の
結合により決定できる。そのような部分は放射活性の核
種、螢光性化合物、または発色、発光または螢光生成物
を発生可能な触媒活性を持つタンパク質複合体により認
識されるリガンドであろう。保持体の洗浄によりハイブ
リダイズしなかったプローブを除去した後、存在する検
出可能部分の量により標的の量が決定される。 実際面では、そのような検定の感度は、プローブ核酸内
へ物理的に取シ込まれたであろう標識部分の数により制
限されている。放射活性−標識プローブの場合、実際的
限界は約１０４標的分子である。しかしながら、この感
度を達成するには数日を要する検出工程（即ち−オート
ラジオグラフィー）と相まって不都合に非常に制限され
た有用な半減期を持つ、非常に高比活性のプローブが必
要である。螢光、化学発光、または酵素的検出を利用す
る他の標識法はよシ迅速ではあるが、同位元素−標識プ
ローブの感度を１通常越えることはない。臨床的に興味
あるほとんどの微生物は、標的として使用するのに適し
た核酸をｓｏ、ｏｏｏ コピー以上は含んでいないの
で、そのような方法では多くの微生物の検出に制限をう
ける。しかしながら、臨床標本または食品中の感染性作
因はしばしば試料当り数個（１−１０）を越えない。そ
れ故、そのような低レベルを検出することが可能な方法
に対する要求が存在する。 核酸ハイブリダイゼーション検定の感度を改良するのが
本発明の一つの目的である。 低レベルのＤＮＡを検出するための一つの方法はＤＮＡ
−依存ＤＮＡポリメラーゼを利用し、直接ＤＮＡ標的を
複製して容易に検出可能な水準までその数を増加せしめ
ることである。この方法は“ポリメラーゼ連鎖反応”（
ＰＣＢ、）と称される。 ５ａｉｋｉ 、 Ｒ，Ｋ、 、 ５ｃｈａｒｆ 、 ８
． ＊Ｆａｌｏｏｎａ、Ｆ、 。 Ｍｕｌｌｉｓ 、 Ｋ、 Ｂ、 、Ｈｏｒｎ 、Ｇ、
Ｔ、、 Ｅｒ１ｉｃｈ、 Ｈ。 Ａｏ、およびＡｒｎｈｅｉｍ 、 Ｎ、 、″′ベータ
ーグロビンゲノム配列の酵素的増幅および鎌状赤血球貧
血の診断のための制限部位分析”５ｃｉｅｎｃｅ ２５
０ ：１３５０−１３５４（１９８５）；５ａｉｋｉ、
Ｒ，に、。 Ｇｅ１ｆａｎｄ 、Ｄ、 Ｈ，、５ｔｏｆｆｅｌ 、
Ｓ、 、 ５ｃｈａｒｆ 。 Ｓ、Ｊ、 、Ｈｉｇｕｃｈｉ 、Ｒ，、Ｈｏｒｎ 、Ｇ
、 Ｔ、、Ｍｕｌｌｉｓ 。 Ｋ、Ｂ、、およびＥｒ１ｉｃｈ、Ｈ，Ａ、、″熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのプライマー−支配酵
素的増幅”５ｃｉｅｎｃｅ ２３９ ： ４８７−４９
１（１９８８） ； Ｅｒ１ｉｃｈ 、Ｈ，Ａ、 、Ｇ
ｅ１ｆａｎｄ 、Ｄ。 Ｈｏ、および５ａｉｋｉ 、Ｒ，に、、″′特異的ＤＮ
Ａ増幅”、Ｎａｔｕｒｅ３３１：４６１− （１９８
８）：およびＭｕ １１ ｉ ｓ ら、欧州特許出願
第２００３６２および２０１１８４号（米国特許第４，
６８３．１９５および４，６８５，２０２号も参照され
たい〕が参考文献として含まれている。ＰＣＲ法におい
ては２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドが熱処理により分
離された標的ＤＮＡの相補鎖上の特異的な別々の部位に
ハイブリダイズされる。アニール化されたプローブはそ
の後ＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖の合
成を開始するのに使用し、標的の２つの二重鎖コピーを
得る。合成後、得られた二連体ＤＮＡ生成物中の鎖を熱
処理により再び分離し、オリゴヌクレオチドプローブ（
大過剰に存在する〕を標的および複製鎖の両方に再アニ
〜ルし、さらにポリメラーゼと伴にインキネベートする
。標的ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブの酵素
的伸長によ多発生されたＤＮＡ鎖の両方がプライマー−
支配複製の鋳型として働くので、多数の生成物鎖（例え
ば、百方コピー〕を生じるまで各々の回に特異的生成物
ＤＮＡの量が倍になる。 実際面では、増幅の標的がＤＮＡ（ＲＮＡに対して）で
ある必要性および、偶然に同様の複製産物を発生する非
−標的ＤＮＡ中の相同部位へのプローブのハイブリダイ
ゼーシ：ｌ／により生じる偽陽性物の存在などのためこ
の技術は制限を受ける。 さらに、標的ＤＮＡは非常に高い感度、で検出されるで
あろうが、検定の複雑さを著しく増加させなければ試料
中に存在する標的の数を決定することは困難である。病
気の処置グロトコールの評価するには感染性作因の数が
しばしば重要であり、この増幅法は定量的というより定
性的結果を与えるので不都合であり制限を受ける。 定量的検定により都合よく使用できるであろう方法およ
びプローブを提供するのが本発明の別の目的である。 核酸検出の感度を改良する別の方法は、 ＲＮＡ−依存
ＲＮＡポリメラーゼにより複製されるであろう（即ち鋳
型〒ある）ＲＮＡ分子に結合または取り込まれているハ
イブリダイゼーションプローブを用いることである。例
えば、ＭＤＶ−１゜ＲＮＡ、几ＮＡ−依存ＲＮＡポリメ
ラーゼ（Ｇ）βレプリカーゼ）のための２２１ヌクレオ
チドＲＮＡ鋳型、からの誘導により、ＲＮＡプローブを
発生する多くの手段がＣｈｕ 、 Ｂ、 Ｃ，Ｆ、 、
Ｋｒａｍｅｒ 、Ｆ。 Ｒｏ、およびＯｒｇｅｌ 、 Ｌ、 Ｅ、 、″′生物
検定のための増幅可能レポーターＲＮＡの合成”Ｎｕｃ
ｌ、Ａｃ１ｄｓ。 Ｒｅｓ、１４：５５９１−５６０３（１９８６）；Ｌｉ
ｚａｒｄｉ 、Ｐ、 Ｍ、、Ｇｕｅｒｒａ、Ｃ，Ｅ、
、Ｌｏｍｅｌｉ。 Ｈ，、Ｔｕｓｓｉｅ−Ｌｕｎａ 、 ＩおよびＫｒａｍ
ｅｒ 、 Ｆ、 Ｒｏ。 ６組換え体−ＲＮＡハイプリダイゼーシ−１ノブロ−プ
の指数的増幅”パイオノテクノロジー６：１１９７−１
２０３（１９Ｂ８年１０月〕；および欧州特許出願第２
６６．３９９号（ＥＰ出題第８７９０３１３１．８号）
（これらは完全に参考文献としてここに含まれている）
により提供されている。複製可能ＲＮＡプローブ構築物
はＲａｎｋｉら； Ｕ−８，４，５６３，４１９； ５
ｏｄｅｒｌｕｎｄ 、 Ｇ、 Ｂ、。 Ｕ、 Ｓ、 ２，１６９，４０３ ； ５ｔａｂｉｎｓ
ｋｙ、 Ｕ、 Ｓ。 ４．７５１，１７７；５ｙｖａｎｅｎｅｎ、Ｇ、 Ｂ、
、Ｕ、 Ｓ。 ２．１６９，４０５ ； ５ｔａｂｉｎｓｋｙ Ｕ、
Ｓ、 ４，７５１．１７７；および５ｙｖａｎｅｎｅｎ
ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ。 １４：５０３７−５０４８ （完全に参考文献として
ここに含まれている）により記載されているごとく、高
感度ハイブリダイゼーション検定に都合よく用いられて
いる。ハイブリダイゼーション後、標的と会合したＲＮ
Ａ−プローブキメラは１種々の方法（例えばエチジウム
プロミドまたはグロピジウムヨージドのごとき色素を使
用する螢光により〕により容易に検出されるようなＲＮ
Ａ量を生じるまで複製される。ＱβレプリカーゼのＭＤ
Ｖ−Ｉ ＲＮＡ量型は試験管内で２０秒毎に数が倍に
なるので、単一温度で数分以内にＲＮＡ分子の数の指数
的増加（ＰＩえは、１０億倍）が起こり、反応液中の鋳
型の数が活性酵素分子の数を越えるまでその速度で進行
する。その時点後は、鋳型ＲＮＡ０量は時間と伴に直線
的に増加する。その結果、この直線期に致達する充分な
期間が与えられた反応液においては（例えば１００分子
に対しては１５分つ、増幅産物ＲＮＡ量は最初に加えた
鋳型ＲＮＡの量の対数に直接比例する（Ｌｔｚａｒｄｉ
ら前記文献）。鋳型−プローブの最初の量は標的の量に
比例するので、いわゆるＰＣＢ増幅技術とは著しく異な
って非常に広い範囲にわたって、試験される試料中に存
在する標的の数を都合よく定量できるであろう。 そのようなＲＮＡ依存、ＲＮＡポリメラーゼ。 Ｑ−ベータレプリカーゼのためのＲＮＡ鋳型の性質を利
用するのが本発明の更に別の目的である。 これまで、複製可能ＲＮＡをプローブへ結合する手段が
ほとんどなかった。有用であるためには。 そのようなプローブ−ＲＮＡ構築物はレプリカーゼの鋳
型として直接働くかまたは複製に先立ってプローブ部分
の脱離をさせなければならない。 つの方法においてはプローブをＲＮＡにジスルフィド（
−Ｓ−Ｓ−）結合を含むシスタミン部分を通して結合す
るとそれは複製に先立って切断できるＣＣｈｕら、前記
文献〕。しかしながら、この方法はいくつかの合成工程
を必要とするのでそのようなプローブを産生ずる労力の
代価が増加する。それに加え、当業者は容易に認めるで
あろうが、そのようなジスルフィド結合は多くの生物試
料中に天然に存在する還元剤（例えばグルタチオン〕に
よる時期尚早の切断を受ける。 そのようなジスルフィド結合構築により負う制限を避け
るのが本発明のさらに別の目的である。 別の方法においてはプローブ配列は複製可能ＲＮＡの配
列内に取り込まれているＣ Ｌｉｚａｒｄｉら。 前記文献〕。しかしながら、多くのそのような構築物中
の異種ＲＮＡ配列は不都合なことに効率よく複製される
ＲＮＡの能力に影響するか、または複製の間に自発的に
欠落する。例えば８つのそのような構成物の収集物のう
ち、２つは忠実に複製するが、６つは複製されにくいか
または複製の間にプローブ配列が欠落する。そのような
欠落率は複製の速度に影響し、不規則な時間に起こるの
で。 増幅の直線期中に得られるＲＮＡ産生物のレベルを標的
レベルの算定に使用することができない。 さらに、多くの１的微生物に対し、標的および非感染物
の核酸の間の高い度合いの配列相同性のため非常に限ら
れた数の配列（例えば１つまたは２つ〕しかハイブリダ
イゼーション標的として使用されない。すなわち、プロ
ーブ配列が安定で効率よく複製されなければならないな
どの付加的な必要条件がこの方法の一般的応用を制限し
ている。 この制限を克服するブローブー鋳型ＲＮＡ構築物および
方法を提供するのが本発明のさらに別の目的である。 鋳型几ＮＡの６′かまたは５′末端にＲＮＡに通常観察
されるホスホジエステル結合を通してプローブ配列を結
合すると（謹々の手段により簡単に達成できるが）、複
製を強く阻着すると報告されてイル。例えば、ＭＤＶ−
１・ＲＮＡの５１ヌクレオチドへの短いオリゴリボヌク
レオチド（Ａｔｏ）の結合はＲＮＡの指数的複製を不可
能にする（Ｍｉｅｌｅ、 博士論文、コロ／ビア・ユ
ニバーシティ、１９８２）。他の鋳型ＲＮＡの６′末端
への付加的ヌクレオチドの結合も同様にＱβレプリカー
ゼによるそれらの複製を阻害する。例えば。 ＱβファージＲＮＡの６′末端への１０−２０の間のシ
チジル酸残基の付加はその鋳型活性を破壊する（Ｇｉｌ
ｌｉｓ 、 Ｅ、 、 Ｄｅｖｏｓ、Ｒ，およびＳｅｕ
ｒｉｎｃｋ−Ｏｐｓｏｍｅｒ 、Ｃ，、Ａｒｃｈ、 Ｉ
ｎｔ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ 。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、８４：３９２−３９３（１９７６））
；短いオリゴアデニル鎖の付加も同様の効果を持つ（Ｇ
ｉ ｌｖａｒｇ 、 Ｃ，Ｊｏｃｋｕｓｃｈ 、 Ｈ，
およびＷｅｉｓｓｍａｎｎ 、ＣｏＢｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ４１４．３１３−８（１９
７５）；Ｄｅｖｏｓ、ＰＬ、ｖａｎ−Ｅｍｍｅｌｏ 、
Ｊ、、Ｓｅｕｒｉｎｃｋ−Ｏｐｓｏｍｅｒ 、Ｃ，。 Ｇ１１ｌｉｓ、Ｅ、、およびＦｉｅｒａ 、Ｗ、 、
Ｂｉｏｃｈｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ４４７：３１９−２７（１９
７６）もまた参照されたい）。ＣｈｕらによるＷｏ・８
７１０６２７０はＲＮＡ鋳型への親和性分子の結合はそ
れがプリン結合を通してなされたものなら可能であろう
が、そのため複製に先立って酸脱プリン切断工程にかけ
られるであろうと公表している。 従ってこの技術はうまく働かず、それ故この方法は複製
可能ＲＮＡへのプローブ配列の結合の手段としては使用
されなかったことが示された。 自己触媒ＲＮＡポリメラーゼ鋳型と連結して核酸プロー
ブ配列の配置のよシ大きな融通性を許す新規プローブお
よびその使用方法を提供するのが本発明まださらに別な
る目的である。 複製可能ＲＮＡの５′末端へ結合した標的特異性核酸プ
ローブ配列を用いる複製可能ＲＮＡ鋳型を提供するのが
本発明のさらに別の目的である。 Ｑβ複製可能ＲＮＡの６′末端に結合している標的特異
的核酸プローブを含むプローブおよびその使用法を提供
するのも本発明の更なる目的である。 ＦｏｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ （Ｃｅｌｌ 、５０
： ９−１６（１９８７））およびＵｈｌｅｎｂｅｃ
ｋ（Ｎａｔｕｒｅ 。 ３２８：５９６−６００（１９８７）） は植物ウイル
ソイドおよびほかの場合で観察され、二価カチオ／の存
在下自己触媒的切断が進行するという独特の性質を持つ
ＲＮＡ配列について記載している。 一つのそのような構造は現在”ノ・ンマーヘッド構造と
称されておシ、定義された領域に二重鎖へリックスの結
合および絶対配列保存を含む。 Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋはこの構造の”領域”は別々のＲＮ
Ａ分子上で作られハイブリダイゼーシヨンにより互いに
組み合わさったことを示した。Ｗ。 Ｇｅｒｌａｃｈ （アゾレード、オーストラリア〕はそ
のような構造の一部を持つＲＮＡを残存要素を持つ別の
全く関係ないＲＮＡを切断するのに使用し。 試験管内で、適切なＲＮＡ配列を選択することによりク
ロラムフェニコール・アセチル−トランスフェラーゼの
ためのメツセージが切断の標的とされ、適切な構造が形
成することを示した。これらの”ハンマー−ヘッド様構
造は”リボザイム”の名前を得ておシ（ここでもその名
前を使用するが〕１反応中の２つのＲＮＡの内の１つは
本当の触媒のごとく反応の間に消費されないので無限の
数の基質ＲＮＡを切断するのに使用できる。 標的ポリヌクレオチドの検出のためにリポザイムに連結
して複製可能ＲＮＡ鋳型を用いるプローブおよびその使
用法もまたさらに本発明の目的である。 当業者には明らかになるであろうが、たった一つの鋳型
ＲＮＡ分子も検出可能な生成物を導くので、標的の存在
に関係なくハイブリダイゼーション過程の間にプローブ
分子の複製により生じるであろうバックグラウンドによ
りハイプリダイゼーションプロープが増幅される方法が
制限される。 例えば、標識核酸がニトロセルロース上に固定される複
製可能ＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション
検定においては一標的が存在するしないに関与せず１０
プローブ分子が結合しているのが観察されている（ Ｌ
ｉｚａｒｄｉら前記文献〕。 そのようなバックグラウンドでは、このレベルと等しい
かそれ以下の数で存在する標的は増幅産物の収量に有意
に寄与しないであろうから、そのような検定の感度を制
限し、それ故信頼性を持って決定できないであろう。 バックグラウンド限界と離れた感度のＲＮＡ鋳型プロー
ブ構築物およびその方法を提供するのも本発明のさらな
る目的である。 このバックグラウンドを減少させる１つの方法は標的−
プローブ複合体が保持体に可逆的に結合する方法を用い
ることである（″可逆的標的捕捉”）。 ハイブリダイゼーションおよび固定化後夜合体を保持体
から溶出し、保持体は非特異的に結合したプローブと伴
に放棄する。複合体は続いて新鮮な保持体上に再捕捉さ
れる。この過程を数回繰シ返するとハイブリダイズして
いないプローブの量を著しく（例えば１０倍）減少させ
る（この標的−循環技術の詳細な記載は、ここに参考文
献として含まれているＣｏ１１ｉｎｓ、欧州特許出願第
８７５０９５０８．２号を参照されたい〕。 そのような可逆的標的捕捉技術に使用されるであろう構
築物およびプローブを提供するのも本発明のさらなる目
的である。 発明の要約 本発明の原理および目的に従うと＋ ＲＮＡ鋳型の５′
および６′の末端の片方または両方に結合した標的特異
性プローブ配列と連結した複製可能ＲＮＡ鋳型を用いる
新規プローブが提供される。 １つの実施態様においては、標的プローブ配列は標的核
酸と分子間相補性によりリボザイムを形成し、それは二
価カチオンのごときものにより切断を受ける。特に、適
当なＲＮＡ標的核酸の存在下では複製可能ＲＮＡ鋳型の
６′末端の標的特異性プローブ配列（一連のＮ”ヌクレ
オチドにより表わされ、そこにおいてＮは任意のヌクレ
オチドおよびＮ′はその相補的ヌクレオチドである）お
よび５′末端上のプローブ配列が標的核酸の相補配列ヘ
ハイプリダイズされる。ＭＤＶ−１の５′末端上の配列
伸長により生じる阻害が都合よく使用され、それにより
５’プローブ伸長を持つ複製可能ＲＮＡ、第２のＲＮ
Ａプローブおよび標的ＲＮＡ間で三成分のハイブリッド
が形成されて自己触媒性ＲＮＡ構造〔リポザイム〕を産
生し、それは複製可能ＲＮＡプローブからの５′伸長物
を切断し。 同時にそれを効率的複製型に変換し、保持体からのその
放出に影響を与える。この方法は活性リボザイム構造を
発生するのに特異的配列要素５’−ＧＡＡＡ −３’を
含む標的ＲＮＡを必要とするのであまシ好適ではない。 特異的に標的に結合するまでプローブ分子が複製に対し
て特徴的に無力であるものは、ハイブリダイゼーション
検定においてバックグラウンドを減少させるための他の
方法を提供できるので１利口な”プローブと記述された
。リボザイム構造は図１Ａの１四角に囲んだ”部分に非
常に詳細に示したごとく６環状”構造である。矢印はマ
ンガン、マグネシウムまたはカルシウムのととき二価の
カチオンの存在下起こる切断の部位を示している。 本発明の他の好適な実施態様においては、プローブおよ
び複製可能ＲＮＡ配列の間に非特異的配列を配置する。 この”スペーサー”要素の配列は検出限界を最適に調整
するように都合よく変化されるであろう（即ち、最も少
ない分子の数でＱβレプリカーゼとインキュベーション
後に検出可能な産生物を生じるように）。複製可能ＲＮ
Ａおよびプローブ配列要素の間に無作為な配列の定義さ
れた領域を持つどちらかといえば同一のＲＮＡ構築物の
集団から出発する最適なスペーサー配列の発生および選
択の方法が提供される。 別の最も好適な実施態様においては、−組のプローブが
構築さ九標的核酸中の隣接する部位に結合される。プロ
ーブの組のうちの１つは複製可能ＲＮＡからスペーサー
配列により分離されたプローブ配列要素を持つ６′また
は５′伸長物を持ったＱβＲＮＡ鋳型を好適には含んで
いる。第２のプローブは理想的には第１のプローブのス
ペーサー配列内をエンドヌクレアーゼ的に切断するヌク
レアーゼ（または順番にヌクレアーゼに結合できる親和
性試薬〕から成る放出試薬を結合したオリゴヌクレオチ
ドから成っている。ヌクレアーゼは理想的にはその活性
に必須の補因子が添加されるまでは不活性であるような
種類のヌクレアーゼの一つである。標的核酸が結合プロ
ーブと一緒に固定されるようなハイブリダイゼーション
検定において両方のプローブは都合よく用いられる。非
結合プローブの大部分を洗い流した後、ヌクレアーゼの
活性に必要な補因子が添加され、切断が起き短い伸長鎖
を持つ複製可能ＲＮＡが溶液中へ放出される。このＲＮ
Ａは続いて都合よくＱβレプリカーゼにより増幅される
であろう。 そのような伸長Ｑβ鋳型を用いる利口なプローブ系の多
くの他の実施態様が提供される。 本発明の最も好適なプローブはＲＮＡ複製可能鋳型の６
′および５′末端の両方に標的特異性ＲＮＡ配列を用い
ているが１本発明はこれらの位置にＤＮＡプローブをつ
けてもまた働くが１本発明の混合ＤＮＡ−ＲＮＡプロー
ブの構築および産生は非常に困難であろうことが容易に
認められるであろう。しかしながらリボザイムを形成す
るのに必要な配列はリボザイム構造を満足するように形
成し、誘導可能切断を受けやすくするためにＲＮＡでな
ければならない（および図１Ａに示したリボザイム構造
で特定したごとく）。最も好適な実施態様において、そ
のような切断はマグネシウムの存在下起こり、それはま
たＱβレプリカーゼ支配のＲＮＡ鋳型（理想的にはミデ
ィ変異体）の複製のための補因子としても働く。マンガ
ンも有効であるが、鋳型特異性が変わり、それ数夜製が
所望の忠実度で起こらないので好適さはよシ低い。 最も好適なＲＮＡ鋳型はＭＤＶ−１まだはミディ変異体
（２２１のヌクレオチドＲＮＡ）であり。 Ｃｈｕら１によ、すＷＯ８７１０６２７０（参考文献と
して含まれている〕に記載されており、バクテリオフプ
ージＱβに感染した細胞中に見い出される。 ＭＤＶ−１はＱβレプリカーゼ調製試料に普通にある夾
雑物である。ＱβレプリカーゼはＭＤＶ−１および他の
構造のごとき特定の１次および２次構造を持つＲＮＡ鋳
型に作用する（例えば複製する）。ＱβＲＮＡ遺伝子に
沿って複製するがＭＤＶ−１はその機能が知られていな
いようである。５′および６′末端にある種の天然の変
異を示すことも知られておシ〔−量的に単にＧＣ対の付
加または欠失がみられる〕図１および２中の４つのＧＣ
対および図６および４中の６つのＧＣ対の説明として示
されている。 本発明のより好適なプローブ実施態様はＲＮＡ鋳型の６
′末端に比較的”短い”標的特異性プローブ配列を用い
るであろう。最も好適であるのはこの標的特異性配列が
約４から約１２塩基の長さを持っているであろうし、理
想的には約５塩基の長さである。リボザイムの切断に続
いて、典型的な切断温度である約５５℃では標的配列か
らの複製可能ＲＮＡ鋳型が会合しやすいのでそのような
比較的短い長さが良好である。 複製可能ＲＮＡ鋳型の５′末端上の標的特異性プローブ
配列の長さを増すほど一般的に標的特異性が増加するこ
とを当業者はもちろん容易に認識するであろう。まだ結
合しているこの５′末端標的特異性プローブにより試み
られた鋳型の複製が更なる複製を阻害するような鋳型の
崩壊を生じるのに十分な長さを持つようなプローブもま
た最も都合がよい。一方、５′および３′標的特異性プ
ローブの両方が短いプローブであるならば（例えばただ
の５つのヌクレオチドの長さ）、この実施態様において
はリボザイムの一定の形成および回転の可能性があり、
複製可能ＲＮＡ鋳型のより急速に切断する結果となる。 本質的により長い長さの５′末端標的特異性配列を用い
る最も好適な実施態様と比較するとこの実施態様の欠点
は標的特異性がいく分失われることが予測されることで
あろう。 本発明の最も好適なプローブは、３′末端および５′末
端を持つＲＮＡ鋳型としてミディ変異体を含み、 ５’
−ＵＣ−３’に続いて第１の標的核酸配列に相補的な標
的特異的第１の核酸プローブ配列から成る５′末末端先
導伸長動を持ち、およびさらに。 第２の標的核酸配列に相補的な第２の核酸プローブ配列
に続いて５’−ＣＵＧＡＮＧＡ−３’から成る６′末端
トレーラ−伸長配列を持ち、その中で最も好適なミディ
変異体は図１Ａに示したごとくＧＧＧＧＡＣＣ，、、、
、、で５′末端が始まり１１．。 ＧＵＵＣＣＣＣで３′末端が終了する配列を持っている
。もしくは他の好適な実施態様においては。 ミディ変異体は図１Ａに示した６′末端上の４つのＣの
１つが欠失しＵ（６′末端で図１Ａに示した四角の枠の
すぐ内側）とＧとの対合を許しそれにより基部を６まっ
すぐにし”そのような基部中の異性化の可能性を除去す
るが、それはさもなくば基部の残りに沿って誤対合を起
こすことになるであろう。そのような誤対合は最終的に
は誤形成を導くであろうし、それ故事件、リボザイムの
不活性化が避けられている。 他の好適な実施態様においては（図２に示した〕、ＲＮ
Ａ標的に特異的な第１の核酸プローブ配列が好適な実施
態様のごとく複製可能ＲＮＡ鋳型の５′先導配列に添え
られているプローブ構築物を利用する。しかしながら最
も好適な実施態様と異なり、複製可能ＲＮＡ鋳型の６′
末端は標的特異的核酸プローブ配列を取り込んでいない
。むしろ、第２のＲＮＡ標的配列に特異的な第２の核酸
プローブ配列から成る第２のプローブ（リボザイム構造
の半分）、および５’ＲＮ Ａ鋳型基部配列の一部に対
し特異的な第６の核酸プローブ配列が利用される。 最も好適な実施態様のとと＜、ＲＮＡ標的との両方のプ
ローブのハイブリダイゼーションにより。 ＲＮＡ標的が必要条件５’７ＧＡＡＡ−３’配列を提供
している切断可能リボザイムを生成する結果となる。 本発明の最も好適な方法は、第１および第２の核酸プロ
ーブ配列が第１および第２の標的配列（Ａ’ −ＧＡＡ
Ａ −３’の介在配列を持つ）の各々とハイブリダイゼ
ーションが可能な条件下、本発明の好適なプローブ構築
物を単鎖標的核酸と接触せしめてそれによりリボザイム
を生成する。例えばそれらをマンガン、マグネシウムお
よびカルシウムから成る群より選択された二価のカチオ
ンと接触せしめてそのリボザイムを続いて都合よく切断
する。ＲＮＡ鋳型（理想的にはＭＶＤ−１ミディ変異体
）は、ＲＮＡ鋳型の６′末端の”短い”第２の核酸プロ
ーブ配列がＲＮＡ１的に安定してハイブリダイズするに
は不十分な長さであろうから。 標的核酸から都合よく放出される。放出されたＲＮＡ鋳
型はそのあと都合よ〈Ｑβレプリカーゼにより複製され
、複製されたＲＮＡ鋳型は標的核酸の存在または不存の
指標として検出される。最も理想的な方法は、切断誘導
に先立って分離工程を含むだろうし、それによりハイブ
リダイズしていないプローブが除去され、それ故Ｑβレ
プリカーゼによる増幅サイクル中に利用できる鋳型とし
ては関与できなくなる。例えばプローブ−標的ハイブリ
ダイゼーション複合体を固定化するごとき（他の不溶化
標的特異性プローブを通して、それ自身直接的または間
接的に捕捉ピーズ、計深棒その他のごとき固体表面に固
定化して〕種々の手段により除去が達成される。いわゆ
る”サンドウィッチ”技術が当業者にはよく知られてお
り、ここで詳細に説明する必要はないであろう。 発明および最良の形態の詳細な説明 Ｍｉｅｌｅ （上記文献〕およびその他の結果の調査に
おいて１種々の長さの６′末末端伸長動を持つ１組の組
み換え体ＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡが−Ｌｉｚａｒｄｉら（
上記文献〕により記載されているごときＭＤＶｃＤＮＡ
の下流に切断部位を持つ制限酵素で種々に消化されてい
るｃＤＮＡクローンの転写により生成している。驚くべ
きことに文献の一般的な教えに反し１組換え体ＲＮＡ鋳
型の５′末端への１８３ヌクレオチドもの長さの６′付
加物でも十分な複製が起こることが観察され、Ｑβレプ
リカーゼ反応の開始にそのような６′伸長物を持つたっ
たの１０分子を用いても増幅ＲＮＡ生成物が検出できた
。 増幅産物ＲＮＡは６′伸長物を欠＜ＲＮＡと同じ大きさ
であり１分子の鋳型部分で６′伸長物は複製されないこ
とを示唆している。この驚くべき全く予想されなかった
結果は複製可能ＲＮＡ上のプローブ配列の配置に多大な
融通性を与えるので増幅ハイブリダイゼーション検定に
おいてプローブとしての複製可能ＲＮＡの応用に重要な
意味を持っている。 実施例 実施例１：リポザイムの産生：Ｑβ鋳型ＲＮＡプローブ
キメラ 図１に示した几ＮＡ構築物は下記の方法により産生され
る。２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーは当業者
にはなじみの方法により産生される。第１のものは続い
イの構築に使用される制限酵素の多くの認識部位の鎖を
含み（図４Ａ参照）、酵素Ｑβレプリカーゼの鋳型に近
い配列に相補的部分に結合されているがミディ変異体Ｒ
ＮＡのプラス鎖の最後の６′ヌクレオチド（Ａ）は含ん
でいない。当業者には理解されるであろうごとく。 ＲＮＡのこの領域に相補的配列の正確な長さは分子間ハ
イブリッドを形成し、ミディ変異体ＲＮＡのこの領域中
に存在する分子内塩基対合を置きかえるのに十分な長さ
でなければならない。第２のオリゴヌクレオチドはその
５′から６′末端の順に。 転写の方向と同じ向きで読んだ場合ＤＮＡ−依存ＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターの一つの鎖から成る配列を
含んでいる。この場合、前記プロモーターはバクテリオ
フフージＴ７によりコードされているＲＮＡポリメラー
ゼ（高度に効率のよい酵素）のためのものであるが、当
業者には理解されるであろうごとく、同様に他のＲＮＡ
ポリメラーゼのためのプロモーターも使用できる。この
配列要素に続いて３′の方向に二重鎖ＤＮＡにねじれた
開裂を生み、突き出た単鎖６′末端伸長物を残す制御ｌ
！エンドヌクレアーゼのための切断部位がある。 この実施例において、この酵素はＡｐａＩ であり。 その配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと部
分的に重複するように作られる。この部位に制［エンド
ヌクレアーゼのための認識配列が続くが、エンドヌクレ
アーゼは一部の酵素のうちのどれでもよく、配列を認識
し、配列要素の６′領域中でＤＮＡを切断し、ねじれた
切断および突き出した単鎖５′末端伸長物を残す。この
認識配列はミディ変異体ＦＬＮＡをコードする配列の直
ぐ先に。 鎖中の最終ＤＮＡベクター構築物の切断を支配するよう
な様式に配置する。本実施例では（図４Ａ参照）これは
制限エンドヌクレアーゼＥａｒＩのための部位であシ、
その酵素はＣＴＣＴＴＣＮ の配列を認識しく式中Ｎは
任意のヌクレオチドＮ以降じ鎖中のヌクレオチドＮ以降
のＤＮＡおよび相補鎖中のさらに６つのヌクレオチドを
切断する。最後に、この配列に基部に近い配列に相同の
他の配列が続き、それはアニール化しおよび以下に記載
するごとく第２の鎖生成物の合成を開始するのに十分な
長さを持つミディ変異体ＲＮＡ（ＭＤＶ−ＩＲＮＡ）の
５′末端を含んでいる（ただし、ＭＤＶ−１に観察され
るリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドに置き
換えられている〕。 ミディ変異体ＲＮＡのｃＤＮＡの合成のためにプライマ
ーとして使用される第１のオリゴヌクレオチドが図６に
示しである。ＭＶＤ−１は外因性鋳型ＲＮＡなしで開始
されたＱβレプリカーゼ反応から得られる。多くの方法
により調製されたＱβレプリカーゼホロ酵素のすべての
調製液は典型的には低水準のこのＲＮＡが夾雑している
ので豊富な量のＭＤＶ−ｌＲＮＡが生成するであろう。 前記の第１のオリゴヌクレオチドおよびＭＤＶ−ＩＲＮ
Ａの各々１ピコモルを混合し、加熱によりアニールし、
放置して混合物を徐々に冷却する。 このプライマー−鋳型の組合せをＭａｎｉａｔｉｓ ら
（クローニング マニュアル〕により記載されているご
とき方法での逆転写反応の開始に使用する。 第１の鎖合成が完了後、ミディ変異体ＲＮＡは温和なア
ルカル処理またはもしくはＲＮａａｅＨで破壊する。第
２の相補鎖をこの反応生成物と前記第２のオリゴヌクレ
オチドとアニールして発生せしめ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼで伸長させる。 この生成物はＭａｎｉａｔｉｓらにより記載されたごと
き方法により選択可能、複製可能ＤＮＡベクター内へク
ロ、−ン化できる。常法により潜在的クローンをオリゴ
ヌクレオチド中に含まれる各々の制限エンドヌクレアー
ゼ部位の存在でスクリーニングする。 細菌中で増殖させ精製した後、クローン化ｃＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＫｐｎ、Ｉ で
切断する。よシ小さい断片を電気泳動により精製し、制
限エンドヌクレアーゼＨｉｎｆ Ｉで切断する。この酵
素はＭＤＶ−１中の６５の位置に対応する部位でｃＤＮ
Ａ を切断する。しかしながら天然に存在するＭＤＶ−
Ｉ ＲＮＡの集団においてはこの部位は一部の分子に
しか存在しない。そのため適切な配列を持つもののため
、多くのクローンをスクリーニングせねばな・らない。 −度そのようにして得られたら、Ｈｉｎｆ副断片全断片
ゴヌクレオチド５’−ｐＣＴ、。−３’にアニール化し
たオリゴヌクレオチド５’−ｐＧＡ、、 −３’に結合
する。この結合混合物をＡｐａＪおよびＫｐｎｌで消化
する。得られた混合物を前記のごとくして生成されたベ
クターをＡｐａ ｌおよびＫｐｎｌで消化して得られた
大きな断片内へ結合する。これによりミディ変異体をコ
ードしているＤＮＡ配列がＡ残基域で中断されたクロー
ンが発生するであろう。 本実施例で利用されたＡｌ６域を任意の数の配列で置換
してもよい。しかしながら、Ｍｉｅｌｅら（Ｊ。 Ｍｏ１．８ｉｏ１．（１９８３）２８１−２９５）によ
り示されたごとく、ミディ変異体ＲＮＡの複製の間Ａ、
。は維持されることが知られている。 細菌中で増殖させ精製した後、上記構築物からのクロー
ン化ＤＮＡは２つの別々の反応で切断される（図４Ａ参
照）。最初に完全ミディ変異体ＲＮＡ ｃＤＮＡ を
持つゼクメントを酵素ＥａｒｌおよびＳｍａ （で切り
出す。この消化物をチミジン三すン酸存在下Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処理して−ＭＤＶ−１プラス鎖（例えば
図１に示した鎖。 その相補物はマイナス鎖であり、複製可能なＲＮＡ鋳型
でもある）と同じ向きの配列を持つ鎖の６′末端から６
つのヌクレオチドを除去する。得られる修飾断片をポリ
アクリルアミドゲルを通す電気泳動により精製する。第
２の制限消化は酵素ＡｐａｌおよびＫｐｎ ｌ にて行
なう。大きな方から２つの断片をアガロースゲル電気泳
動により精製する。 ２つのオリゴヌクレオチドを合成する。そのうちの第１
のものは５’−ＧＡＡＡ −３’要素の５′側の標的Ｒ
ＮＡ中の配列と相補的な少くとも４つのヌクレオチドに
続いて配列５’−ＣＣＣＣＴＧＡＮＧＡ−６′を都合よ
く含んでおり、配列５’−ＧＡＴＣ−３’で終止してい
る。第２のオリゴヌクレオチドは理想的には標的中の５
’−ＧＡＡＡ −３’の６′側の配列の少くとも４つの
ヌクレオチドに続いて配列５’−ＣＣＣＧＡ−３’ を
含み、ただし標的のりボヌクレオチドはデオキシリボヌ
クレオチドに置き換わっている。この要素は都合よく要
素５’−ＧＧＧＧ−６′に直ぐ続いている。オリゴヌク
レオチドの各々はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより
その５′末端がリン酸化される。 両方のオリゴヌクレオチドを、Ｍａｎｉａｔｉｓ ら
（上記文献〕により記載されているごとくして、Ｔ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼおよびＡＴＰを含む反応液中。 ベクターＤＮＡのＫｐｎｌおよびＡｐａ ｌ消化により
産生される大きな断片へ結合せしめる。結合生成物（図
４Ｂ参照〕をゲル濾過により非結合オリゴヌクレオチド
から精製する。結合生成物はそれから、修飾末端を持つ
小さなりａｒ、 Ｉ、Ｓｍａ Ｉ 断片と結合する。 得られる”ギャップのある”分子はＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼで処理して完全な二重鎖となす。この生成物
は都合よく細菌内へ導入され、増殖される。 当業者には明らかであるごとく、この一連の操作でＭ
Ｄ Ｖ ｃ ＤＮＡ部分がＴ０ｎ、ＮＡポリメラーゼの
転写の方向に関して、正常および逆の両方の方向に挿入
されているＤＮＡクローンが発生するであろう。ＭＤＶ
ｃＤＮＡをプラス鎖方向に含むクローン（転写によ
りＭＤＶ−１のプラス鎖を含むＲＮＡを産生ずる方向に
〕はＭＤＶ−１ｃＤＮＡ配列内を切断することが知られ
ている適当な大きさの制限エンドヌクレアーゼ断片でス
クリーニングして決定される。 ＭＤＶ−１をプラス鎖の向きで含むクローンから調製さ
れたＤＮＡはプロモーターに関して第２のプローブ要素
とより離れている制限部位で切断する。この実施稠では
、制限エンドヌクレアーゼＤｒａ（である。この消化さ
れたＤＮＡは都合よ＜、Ｍｉｌｌｉｇａｎ ら（Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。 （１９８７）１５：８７８３−８７９８ ）により記載
されているごとき条件下、試験管内でＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼにより転写され、ＲＮＡプローブを生成する。 実施例２：生体分子リポザイムプロープセットの組立て 実施例１で記載したごときｃＤＮＡクローンをＡｐａｌ
およびＥａｒ）酵素で切断し、前把手さな断片から大き
な断片が理想的に精製される。配列５’−ＣＣＣＧＡ−
３’ に続いて標的中の５’−ＧＡＡＡ＝６′要素の
直ぐ６′側の配列と等しい４−５０のヌクレオチド、順
に配列５’−ＧＧＣＣ−３’が続くオリゴヌクレオチド
は当業者になじみの任意の方法により合成される。この
オリゴヌクレオチドをアニール化し、大きな制限断片に
結合し、生じる単鎖の”ギャップ”領域はＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼの作用によりニ重鎖とする。このＤＮ
Ａは細菌内に導入し増殖させる。細菌から精製後、制限
エンドヌクレアーゼ５ｙｎａ ｌ で切断し、それか
らバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用す
る試験管内での転写反応の鋳型として使用する。 第２の配列プローブはＭｉ ｌ ｌ ｉ ｇａｎら（Ｎ
ｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、（１９８７）１５：８７８３−８
７９８）により記載されたごときＴ７ＲＮＡ ポリメ
ラーゼのための合成りＮＡ鋳型、この鋳型の一つの鎖は
。 標的中に見られるリボヌクレオチドがデオキシリボヌク
レオチドに置き換わっていることを除いて標的中の５’
−ＧＡＡＡ −３’要素の５′領域からの配列の少くと
も４つのヌクレオチドでその５′末端を出発し、配列５
’−ＴＣＮＴＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧ
ＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（式中Ｎは任意のヌクレオチド
を示す〕が続く。鋳型の他の鎖は配列５’−ＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’を持つオリゴヌクレ
オチドである。これらの２つのオリゴヌクレオチドは好
適には混合され、Ｍｉｌｌｉｇａｎら（同じ文献〕によ
り記載されているごとくして試験管内で転写される。生
成物は当業者にはなじみの任意の多くの方法により容易
に精製される。 実施例６：６′−末端伸長物を持つ修飾ＭＤＶ−Ｉ Ｒ
ＮＡの複製 実施例１に記載したものと同様のＭＤＶ−１のｃＤＮＡ
クローンが、公衆衛生研究所にューヨーク〕のＦ、 Ｒ
，Ｋｒａｍｅｒから得られ、それはＴ７ＦｔＮＡポリメ
ラーゼのためのプロモーターを含んでおり、天然に存在
するＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡ中のヌクレオチド６４−６６を
コードしている６−ヌクレオチドセグメントが配列要素
５’−ＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＡＣＡＴ
ＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＣＡＴＣＧＡＧ
ＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＧ−３’に置き換わシ、配列５’
−ＧＧＧＡＡＴ Ｔ Ｃ−３’が続いている修飾ＭＤＶ
−１ｃＤＮＡ 配列である。この全ての配列をｐｓＰ
６４のＨｉｎｄｌ［部位とＥｃｏＲ１部位の間にクロー
ン化する（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、、 １２巻７０３５−７０５６
）。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＳｍａ
Ｉ 。 ＥｃｏＲｌ 、 Ａｌｕ ＩおよびＰｖｕ １１ で
別々に切断し。 切断試料の各々を１Ｍｉｌｌｉｇａｎらにより記載され
ている条件下試験管内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによ
り転写する。これらの反応液中に生成されたＲＮＡは変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。こ
の過程により、天然のＭＤＶ−ＩＲＮＡに観察されるよ
うに３′末端に伸長銀がないもの、７−ヌクレオチド６
′−伸長物、２４−ヌクレオチド３′−伸長物または１
８３−ヌクレオチド６′−伸長物を持つ修飾ＭＤＶ−１
分子が発生する。 精製ＲＮＡは連続して希釈を行い、 Ｃｈｕら（Ｎｕｃ
ｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、 （１９８６）１４：５５
９１−６０３）により記載されているごとく、Ｑβレプ
リカーゼ反応の開始に１０４分子を使用する。 ただしＱβレプリカーゼはＢｉｅｂｒｉｃｈｅｒら（Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８６）３２１ ：８９−９１ ）
により記載されているごとくレプリカーゼの発現クロー
ンから精製されたかまたはＣ，Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ
（マックスプラント研究所〕から物質的に得た。各々の
反応物の２マイクロリツトルを１８マイクロリツトルの
９５係ホルムアミドと混合し、３０分後１００℃に５分
澗加熱し、ａ３Ｍ尿素を含む８係ポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動にて展開する。複製組換え体ＲＮＡはヌ
クレオチド６４−６６をより大きな配列に置き換えた結
果のその大きさから（その結果電気泳動的移動度が小さ
くなる〕、酵素調製試料中に夾雑しまた複製もされるＭ
ＤＶ−Ｉ ＲＮＡから区別される。６′伸長物がない物
、７−ヌクレオチド伸長物、２４−ヌクレオチド伸長物
または１８６ヌクレオチド伸長物を持つ修飾ＭＤＶ−Ｉ
ＲＮＡ で反応を始めた場合１組換え体ＲＮＡ生成
物は総ＲＮＡの各々約５０係、８６Ｌ ７２ｓおよび１
５％であった。各々の場合に生成される組換え体ＲＮＡ
は６′末端伸長物を欠く組換え体と同じ大きさであり、
６′伸長物自身は分子の残りの部分とともに複製されな
かったことを示している。多くの異った配列の６′末端
伸長物でこの実験を繰り返したが結果は同じであった。 実施例４：リポザイムブローブを利用する標的核酸の検
定 下記の配列の２つのデオキシリボーオリゴヌクレオチド
が合成された： ５’−ＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡ
ＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡ
ＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＣ−５’および５’−ＣＣＣＣＣ
ＴＴＧＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＡＴＣ−３’。これらは
実施例１に記載したｃＤＮＡベクター内へクローン化さ
れ、精製クローン化ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＤ
ｒａ Ｉ で切断した後Ｔ７ ＥｔＮＡポリメラーゼ
で転写された。正しい大きさのＲＮＡ生成物は変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製された。 このＲＮＡの１ピコモル（１０−１２モル〕をヒト免疫
不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）に感染した患者からの
ヒト全面、正常ヒト匍またはＲａｎｋｉ ら（上記文献
〕により記載されているごときサンドイッチハイブリダ
イゼーション検定でＨＩＶ−１の存在を検定するための
試料と−２，５Ｍグアニジンチオ７アナートおよび配列
５’−ＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣ
ＴＡＡＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡ −３
’ を持つ１ピコモルの合成デオキシリボ−オリゴヌク
レオチドの存在下ハイブリダイズさせる。図１Ａを一般
的に参照すると。 Ｃｏ１１ｉｎｓら（ＵＳＳＮ ９２２，１５５．ＥＰＡ
８７３０９３０８．２およびＣＩＰ ＵＳＳＮ１３６
．９２０．ＥＰＡ８８３１２１３５．２ 完全にここ
に参考文献として含まれている〕の方法に従ってｄＴ
で被覆したポリスチレンマイクロタイタープレー
トのウェル中（または図１Ａに示した捕捉ビーズ〕のご
ときものに固定化されたポリデオキシチミジンへのオリ
ゴヌクレオチド中のｄＡ、５ｏ域のハイブリダイゼーシ
ョンにより固体保持体へハイブリッドが固定される。プ
レートを６７℃で５０分間インキュベートした後非結合
プローブを含む内容物を吸引して捨て、“ウェルを０．
５Ｍグアニジンチオシアナートを含む緩衝液で繰シ返し
て洗浄する。その後ウェルを９０ｍＭトリスＨＣｌＣｐ
Ｈ７，５）を含む緩衝液で洗浄し。 １４ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃ１ｔ を含む同じ緩衝、液５０
３ｇをウェル内へ導入し、５０℃にて１５分間インキュ
ベートしてＩＪ ｆｆザイム切断を誘導する。切断およ
び放出されたプローブ（図１Ｂ参照）を含むウェルの内
容物を複製のため別のウェルに移す。各々４ｍＭのＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、１０μＣｉの Ｐ
−ＣＴＰおよび１μｇのＱβレプリカーゼを含む溶液５
マイクロリツトルを添加し。 プレートを６７℃にて２５分間インキュベートする。２
マイクロリツトルのウェル内容物を取り。 複製を停止するため１８μｌの９５％ホルムアミド、０
．０５係キシレ／シアツール、０．０５４ブロモフエノ
ールブルーを加える。この５マイクロリツトルを変性８
４ホリアクリルアミドゲルのウェルに応用し、複製され
ｆｃＲＮＡはキシレンシアツール色素がゲルの長さ移動
するまで電気泳動で展開する。Ｘ−線フィルムをゲルに
６時間曝露し。 その後検出の最終工程として現像する。よシ大きなＲＮ
Ａ生成物の長さが天然に存在するＭＤＶ−ＩＲＮＡ（７
）非付加５’末端お！びＭＤＶ−ＩＲＮＡ の非付加
６′末端に対応する配列の間のヌクレオチド数および実
施例１で記載したごとく（その場合１０ヌクレオチド）
Ｈｉｎｆ部位内へ挿入された配列要素の長さをつんだも
のに等しければ血液試料中のＨＩＶ−１ウイルスまたは
そのメツセンジャーＲＮＡの存在を示している。注意深
く複製相の時間的調節を行い、結果を適当な対照と比較
すると複製ＲＮＡ０量と本来の試料中の標的ＲＮＡ量の
間の関係が決定できそれにより定量的効果が提供される
ことが容易に認められるであろう。容易に理解されるよ
うに、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的な抗体（例
えば複製されたＲＮＡ配列に特異的なりＮＡオリゴヌク
レオチドの添加を必要とする）を利用する免疫学的方法
、もしくはエチジウムプロミドを使用する方法（その螢
光はＲＮＡポリマーの存在により促進される〕などの他
の複製ＲＮＡの検出法も用いることができるであろう。 ３１旦二二ヒト後天性免疫不全症候群の原因因子である
ＨＩＶ−１に対する１組の プローブが生み出された。２組の部 分的に相補的なオリゴヌクレオチド が生みだされ、下記の配列を持つ： （ＩＡ）５’−ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＴ
ＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＴ
ＡＡＴＴＴＴＣＧ−３’； （ＩＢ）５’−ＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡ
ＣＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣ
ＴＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ−３’； （２Ａ）５’−ＧＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＡ
ＧＡＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧ
ＴＣＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＧ−３’；および（２Ｂ）
５’−ＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＣＡＧＧ
ＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＴＴ
ＴＣＧＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣ−３’。 これらのオリゴヌクレオチド対（ＩＡおよびＩＢ：２Ａ
および２Ｂ）の各々をアニール化し。 別々に前記実験で使用したプラスミドのＥｃｏＲＩ部位
およびＳｍａ１部位間にクローン化する。クローニング
後、精製プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲｌで制限消化し、
Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼで転写してＨＩＶ−１中の同
じ配列に部分的に相補的な６′伸伸長列を持つ２つのＲ
ＮＡを発生させる。第１のオリゴヌクレオチド対から得
られるクローンにより産生されるＲＮＡ中、複製可能Ｒ
ＮＡの配列およびプローブ配列はスペーサー配列要素：
５’−ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ−３’により分離される。 第２のクローンにおいては配列５’−ＧＧＧＣＧＧＵＣ
ＧＣＧＣＧＡＡＡ−３’ のスペーサーが生じた。 各々のＲＮＡを連続的に希釈し、一部を１μｇのＱβレ
プリカーゼ（″Ｑ−ベータレプリカーゼの精製”と題し
た同時係争中のＵＳＳＮ３６４．３０６゜ＷＯに記載さ
れているＤｉＦｒａｎｃｅｓｃ。 の方法に従って精製した。完全にここに参考文献として
含まれている）、９０ｍＭ ）リスＨＣ１゜１４ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１ｔおよび各々４００μＭ のＡＴＰ
。 ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ を含むＱβレプリカー
ゼ反応の開始に使用する。６７℃にて３０分後ＥＤＴＡ
を２０ｍＭ、 およびエチジウム プロミドを１μｇ
７ｍｌまで添加して反応を停止する。エチジウム プ
ロミド−ＲＮＡ複合体の螢光が紫外光透照機により観察
された。第１のクローンで生じた少くとも１０ 分子お
よび第２のクローンにより生じた１０ 分子で反応を開
始すると増幅ＲＮＡ生成物が観察された。複製可能ＲＮ
Ａ配列の６′末端に直ぐ隣接する配列領域がプローブ検
出の感度に強く影響することをこれらの結果は示唆して
いる。続いての実験は反応時間を増加させても螢光によ
る検出可能生成物の最終的希釈収量に影響しないことを
示している。 これらの結果は核酸の高感度検出のためのプローブとし
て６′配列伸長物を持つ複製ＲＮＡの使用のための実際
的指標を提供する。スペーサー配列の適切な選択により
、標的核酸の検出に本質的により顕著な感度を持りＲＮ
Ａプローブが都合よく生じる。反対に、感染作因として
高濃度で存在するある種の標的核酸に対しては（即ち、
リボソームＲＮＡ、微生物当り５０，０００ コピー
まで存在する〕、検出の相対的に悪い限界を与えるスペ
ーサー領域を、非特異的結合プローブの低レベルの増幅
によりさもなくば生じるパックグラウンドを避けるのに
都合よく利用できるであろう。例えば。 Ｃｏ１１ｉｎｓ （上記文献）のごときバックグラウン
ド減少法を用いて検出限界以下中くとも１ケタの水準に
数を減ら′すと、非−特異的結合クローンは検出可能な
信号を与えることができないであろう。 それ故、適当なスペーサー配列を含む本発明のプローブ
はそのような検定において経費、複雑さ。 偽−陽性反応の頻度を減少させるのに都合よく使用でき
る。 現在認められるであろうごとく、前の実施例に記載した
ごときＴ４ＲＮＡＩＪガーゼの使用（Ａｔｅｆａｎｏ、
上記文献〕およびｃＤＮＡクローンの転写を含む多くの
手段がそのような構築物の発生に利用されるであろう。 Ｔ４ＲＮＡリガーゼの使用は都合よくプローブ伸長物が
ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかである構築物の生成を可
能にすることで評価されるであろう。 Ｑ９ し７” ＩＪ カー セハＭＤ Ｖ −Ｉ Ｒ，
ＮＩＲ型（７）３’末端で娘鎖の合成を開始し、−量的
に５′末端に致達するまで６′から５′の方向に（鋳型
（Ｂ）詩聖のコピーを続け、５′伸長物を持つ鋳型分子
は６′末端伸長物を持つ娘鎖生成物（例えば鋳型のマイ
ナス鎖〕を発生し、順に前に観察されたごとく複製され
る（例えばＱ−ベータレプリカーゼは末端に付加した６
′配列を無視する）。当業者には明らでなるであろうご
とく、そのようなプローブはまたハイブリダイゼーショ
ン検定にも使用できる。現在さらに明らかになるであろ
うごとく、スペーサー配列の効果は、そのようなプロー
ブの感度の調整に都合よく同様に用いられるであろう。 標的支配の５′または６′配列伸長物の切断を用いる利
口なプローブ系をさらに利用する本発見から
【そのよう
な方法はこれらの配列の正確および完全な除去を提供す
る必要がないので】重要な長所が由来する。例えば前に
示したごとく、プローブは６′および５′の両方の伸長
物を持って生成されてもよく、その標的へのハイブリダ
イゼーションによりリポザイム構造を提供し、それがＦ
ＬＮＡからの５′伸長物の切断を支配する。短い６′伸
長物は分子上に残る。 本発明の最も好適な実施態様が図５Ａおよび５Ｂに図解
されており、そこでは伸長物を持つプローブ分子は溶液
中で標的にハイブリダイズしている。少し前、後または
同時に、第２のオリゴヌクレオチドプローブが第１のプ
ローブに隣接する標的にハイブリダイズする。第２のオ
リゴヌクレオチドプローブは理想的にはその活性に補因
子（例えば、二価カチオン）を必要とするヌクレアーゼ
と結合している。ハイブリダイゼーションに続いて、複
合体はＲａｎｋｉ ら（上記文献）。 ８ｏｄｅｒｌｕｎｄ （上記文献〕、５ｔａｂｉｎｓｋ
ｙ （上記文献〕および／または８ｙｖａｎｅｎｅｎ
（上記文献）により記載されたごとき方法により固体
保持体上に捕捉される。洗浄などにより非特異的結合プ
ローブの大部分を分離した後、ヌクレアーゼ活性のため
の補因子を添加する。第１のプローブに近い方のプロー
ブの末端に結合しているヌクレアーゼはその標的とハイ
ブリダイズした場合第１のプローブ上のスペーサーを切
断し、それにより複製可能部分を溶液内へ放出する。前
に示したごとく、切断が起こるまでは複製を最大に阻害
するようにスペーサー配列は都合よく選択できる。この
方法の他の変更も明らかになるであろう。例えば、その
ようなプローブ対は５′伸長物の代ゎシに複製可能ＲＮ
Ａおよびプローブ配列要素の５′側にリボザイム配列が
存在するヌクレアーゼ−結合プローブを含んでいてもよ
い。 多くの任意のヌクレアーゼが切断剤として都合よく用い
られる。例えば、ミクロコツカルヌクレアーゼはＭＤＶ
〜Ｉ ＲＮＡを切断しないので（Ｈｉ ｌ １およびＢ
ｌｕｍｅｎｔｈａｌ （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ３０
１．３５０−３５２）使用される。Ｃｏｒｅｙ およ
び５ｃｈｕｌｔｚ （１９８７） ５ｃｉｅｎｃｅ ２
３８ ； １４０１−１４０３はそのようなオリゴヌク
レオチド−ミクロコツカル ヌクレアーゼ共役物の構築
について教えている。最も好適な実施態様において。 ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ （Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６４ ：５８５−５９１ （１９８８） 〕−
Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ （Ｎａｔｕｒｅ３２８：５９６−
６００（１９８７））、Ｃｅｃｈ（欧州特許出願ＷＯ８
８１０４３００，１９８８年６月１６日）、 Ｓｈａｒ
ｍｅｅｎら（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６Ｚ ：１４２
８−１４３０（１９８９）またはＨａｍｐ ｅ ｌおよ
びＴｒｉｔｚ（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐ
ｐ１．１２Ｄ、Ａｂｓｔ。 ＋Ｎ２１２．ｐ３’１ （１９８８））にょシ記載され
ているごとくエンドヌクレアーゼ様切断活性を持つ多数
のリボザイムの任意の１つが使用される。リボザイムは
著しい利点を持っており、 Ｍｕｌｌｉｇａｎ（上記文
献）により記載されているごとく適当な配列のＤＮＡオ
リゴヌクレオチドの転写により単一工程でリボザイムを
持つ第２のプローブが有効に産生され、それ故そのよう
な試薬を生成するのに必要とされる費用と労力を減じる
ことができる。 さらに、これらの好適な試薬は都合のよいことに特異的
切断を行うので、定められた複製性質の几ＮＡ生成物を
導く。 標的がＲＮＡであるような特別の場合、切断試薬は第１
のプローブ上のスペーサー配列の一部ト相補的な小さな
りＮＡオリゴヌクレオチド（例工ば６ケのヌクレオチド
〕であろう。この場合、複合体を持つ保持体に接触して
いる溶液へＲＮａｓｅＨ（ＲＮＨ：ＤＮＡ異種二連体中
のＲＮＡを切断するように作用する〕を添加することに
より切断が理想的に達成される。もちろん＋ ＲＮＡ標
的捕捉のための手段は、切断を特異的にするためそのよ
うな異種二連体の発生を理想的には避けるべきである。 例えば、標的ＲＮＡの別の部分と相補的なヒオチニル化
ＲＮ Ａは固定化ストレプタビジン保持体上に都合よく
捕捉される。 標的がＤＮＡである特別の場合、標的とのハイブリッド
の配列伸長物の消化は、そのようなオリゴヌクレオチド
を持つ第２のプローブを必要とせず、 ＲＮａｓｅ Ｈ
の添加により直接的に達成されるであろう。 以下のさらに詳細な実施例の研究からさらなる理解が得
られるであろう。 実施例６：クラミジア トラコマチス 几ＮＡの検出 配列： ｉｌｌ ５’−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＧＡＴＡＴＣＡ
ＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴ−３
’；および （２１５’−ＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＣ
ＣＡＡＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＡＧ−３’ を持つ２つのオリゴヌクレオチドをアニール化しＥｃｏ
Ｒｌで消化済みのＬｉｚａｒｄｉ （上記文献）により
記載されているものと類似のＭＤＶ ｃＤＮＡ構築物内
へ結合する。このｃＤＮＡクローンはＬｉｚａｒｄｉ
らにより記載されているものと内部挿入物がフフージ
Ｒ１７の被覆タンパク質のための結合部位をコードして
いるという点で異なる。このｃＤＮＡは公衆衛生研究所
、 Ｎ、 ＹのＦ、Ｒ。 Ｋｒａｍｅｒから得たものである。続いてのＥｃｏＲＩ
による消化でＴ７ＲＮＡポリメラーゼのブロモ−ターに
関してオリゴヌクレオチドの下流で切断が起こるような
方向でオリゴヌクレオチドを連結する。消化されたプラ
スミドは試験管内でＭｕｌｌｉｇａｎら（上記文献〕に
より記載された条件下、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにて転
写し、正しい長さの転写生成物を、ａ３Ｍ尿素を含むポ
リアクリルアミドゲルを通す電気泳動により分離する。 クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ）の１６Ｓリボソー
ＡＲＩＮＡ （Ｐａｌｍｅｒら、クラミジア感染（Ｏ
ｒｉｅｌ ら編〕ケンブリッジ大学出版局。 １９８６、ｐｐ８６−９２） 中の領域に相補的な配
列： ５’−ＴＡＣＡＣＣＧＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴ
ＡＧＧＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＴＴＣ−３’ を持つ
捕捉、ｊ−ＩＪ コヌクレオチドが合成され、Ｃｏ１１
ｉｎｅ （上記文献〕により記載されたごとく末端デオ
キシヌクレオチジル トランスフェラーゼ（スーパーチ
フス〕を用いて約１５０のｄＡ残基の尾をつけた。 種々の番号のホルマリン−固定のクラミジアトラコマチ
ス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の
基本菌体１．Ｏｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ（べ−リ
ンガーマンハイム〕および１．６％サルコシン（シグマ
）の溶液中、最終容量を６５μｌとし。 ６５℃にで１５分間溶菌する。３４０ ｎｆ／ｍｌの尾
を付けた捕捉オリゴヌクレオチドおよび１０１００ｎｒ
７の転写生成物プローブを含む３５μｌの緩衝液を添加
し、３７℃にて６０分間溶液相ハイブリダイゼーシ日ン
を起こさせる。４％ＢＳＡ、１０ｍＭＥＤＴＡ、α２％
ｙル：ｚシｙ、０．１Ｍ）リス−ＨｅｌｐＨ８，０およ
び０．０５壬プロノポール中Ｃｏ１１ｉｎｅ （上記
文献）に従って調製したオリゴ−ｄＴ修飾磁気ビーズの
１５μｌの０．０６係（ｗ／ｖ） 懸濁液を添加し、更
に６７℃で５分間インキュベートして標的−プローブ
ハイブリッドをビーズ上に捕捉する。 捕捉に続いて、ＩＭグアニジ／ チオシアナー） （Ｇ
ｕＳＣＮ、７ｈ力）、１０ｍＭＢＤＴＡ。 ０．０４Ｍ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，８，０，５係サルコ
シン。 ０６２％ＢＳＡおよび０．１％抗泡剤（トーマス〕を含
む０．２ ｍｌの”洗浄溶液”′を６Ｚ℃にて添加する
。 チューブを激しく振とうし磁場（好適には゛°磁気分離
装置および使用法”と題してＵＳＳＮＩ２１ 。 １９１ ；ＥＰＣ８８３１０８１０，２に記載されてい
るごとく、全部ここに参考文献として含まれている〕に
置く。ビーズをチューブの側面に引っ張り液体相をチュ
ーブから吸引により除去する。別の０、２ ｒｎｌの洗
浄溶液を加え、振とうさせてビーズを再懸濁し、磁場中
ビーズを再収集する。ビーズはさらに別の洗浄溶液で洗
浄する。上澄みを含まない収集ビーズをそれから３．２
５Ｍ ＧｕＳＣＮ。 ６５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４Ｍ ）リス−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ１Ｏ１０，５％ サルコシンおよび０．５％ＢＳＡを
含む５０μｌの緩衝液に再懸濁し、６７℃にて５分間イ
ンキュベートして標的−ＭＤＶプローブ−捕捉プローブ
ハイブリッドを放出する。磁気ビーズを前のごとくして
集め、上澄みを取り前に記載したごとくハイブリッドを
再捕捉するため各々５０μｌの新しいビーズ懸濁液を含
む新しいセットのチューブへ移す。これらのビーズは第
１のセットと同様の方法で３回洗浄し、ビーズの第３の
セットでもハイブリッドは放出され再捕捉される。この
ビーズのセットは同様の方法で６回洗浄し、更に０．１
Ｍ Ｋ（Ｊ−１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ ）リス。 ｐＨ８，００，５４ＮＰ −４０を含む溶液０．２ ｍ
ｌで６回洗浄する。 集められた洗浄済ビーズを１０ｍＭ）リス、−ＨＣｌ、
ｐＨ８，０，１ｍＭＢＤＴＡおよび０．５％ＮＰ−４０
からなる緩衝液５０μＥに再懸濁し、６７℃にて５分間
インキュベートして複合体を溶出する。ビーズを磁場で
集め、溶出複合体を含む上澄み液は新しいセットのチュ
ーブに移す。 ビーズ溶出液各々１０μｌを１７３ｍＭ）リス−ＨＣＩ
、ｐＨ７，５，２７ｍＭ ＭｇＣ１１ｔおよび各々０．
７７ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ（ファ
ルマシア）の溶液１６μｌを含むチューブのセットに添
加する。ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ （上記文献〕に従
って精製した２μｌのＱβレプリカーゼ（１，２μｇ）
を加え、チューブを６７℃にて１２分間インキュベート
する。５μｌの２０ｍＭＢＤＴＡ。 ６２μｇ７ｍｌのプロピジウム ヨーシト（シグマ）を
加えて複製を停止させる。５μｌの各々の停止反応液を
Ｕ底マイクロタイタープレート（ヌンク）の別々のウェ
ルに移す。発光極大が３６５ ｎｍである紫外光透照器
上ウララテン＋２９フイルターを用いてポラロイド６６
７型フイルムでプレートを写真に撮る。反応緩衝液およ
びプロピジウムヨージドのみを含む対照ウェル中の明ら
かな螢光を最小にするように露光を調節する。上記検定
を各基本菌体希釈液の６つにわけた試料についてそれぞ
れ実施する。 結果を下記の表に要約した。記号”＋”の数は観察され
た相対的螢光を反映している。 −”は螢光が対照ウェ
ルの螢光を越えなかったことを示している。 螢 光 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋ 上記実験で観察されたごとく、本検定は約１０基本菌体
の感度を持っていた。 実施例７：ＨＩＶ−１ｍＲＮＡの検出 捕捉プローブをＨＩＶ−１ＲＮＡ 中の保存領域と相
補的な６つのプローブに換えて実施例乙の検定を繰シ返
す。検出ＭＤＶプローブは実施例５に記載したごときも
のであシスペーテー配列５’−ＧＧＧＣＧＧＵＣＧＣＧ
ＣＧＡＡＡ−３’を含んでいる。こ（Ｄ検定１−１１０
００ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ 分子（７）ｇ度を示した。 実施例８：最適−複製スペーサー配列を含むプローブの
選択 ５′から６′の順に＝（１）標的と同一の短い（例えば
４０ヌクレオチド〕配列、（２）無作為な配列の短い伸
長物（１５ヌ／ｖ；ｔｆ）’）、（３）ＭＤＶ−Ｉ Ｒ
ＮＡの最も６′の６０ヌクレオチドに相補的な配列を持
つオリゴヌクレオチドの合成により鋳型ＤＮＡのライブ
ラリーを発生できる。無作為配列要素はオリゴヌクレオ
チドの合成の間に４つすべての保護ヌクレオチドを添加
することにより簡単に発生し。 この過程は現在入手可能な自動合成機により容易に達成
される。第１のオリゴヌクレオチドの最も５′の１９の
ヌクレオチドと相補的な第２のオリゴヌクレオチドが次
に合成された。これを＠１のオリゴヌクレオチドとアニ
ール化し、ＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼで伸長し二
重鎖ＤＮＡ断片を産生ずる。この断片は続いて制限酵素
Ｂａｔ Ｅｌで切断し、切断生成物はＬｉｚａｒｄｉ
（上記文献）により記載されているごとく前もってＢｓ
ｔＥＩＩで切断しであるＭＤＶｃＤＮＡクローンの断片
へ結合する。結合生成物の２ピコモルをＴ７ ＲＮＡポ
リメラーゼで転写し１０ の異ったスペーサー配列を含
むＲＮＡの集団を発生させる。 ＲＮＡの集団内の最も効率よく複製を開始する分子を２
つの方法のうちの１つにより都合よく選択し：その未完
成潜在性娘鎖ヘハイプリダイズされたＱβ鋳型ＲＮＡの
電気泳動的遅延ＣＭｉｌｌ ら（１９８０）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ １９：２２８−２り６） ；またはＱβレプリカ
ーゼおよび娘鎖の管理された潜在性を持つ鋳型ＲＮＡの
間で形成された安定な複合体の単離。後者の方法の例を
以下に記載する。 ２５ｔｉｌ の１００ｍＭ）リスＨＣＬ ＰＨ７，５゜
１４ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１！中熱作為配列スペーサー
を持つ２ピコモルのＲＮＡを５ピコモル（１，２μｇ）
のＱβレプリカーゼと３７℃にて５分間インキュベート
する。各々２．４ｍＭのＧＴＰおよびＡＴＰを含む同じ
緩衝液５μｌを加え、さらに５分間インキュヘ−’／ヨ
ンヲ続ケル。４０ピコモルのＭＤＶ−ＩＲＮＡを含む５
μｌの緩衝液をそれから加え、２分間インキュページジ
ンを続ける。反応液を０℃に冷却し、前もって０℃に冷
やしである１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍ
ＭＭｇＣＩＲ中の１０−６０係グリセロール勾配液２．
２ ｍｌの上面に注ぐ。 勾配液はＴＬＳ−５５ローター（ベックマ／インスツル
メント、バロアルトＣＡ）中５５Ｋ ＲＰＭで４℃にて
６時間回転する。遊離のＲＮＡよシ４０壬速く沈降する
酵素： ＲＮＡ複合体を集め。 フェノールで抽出し、エタノール沈澱を行う。この集団
はＱβレプリカーゼにより効率よく複製できるＲＮＡが
濃縮されている。この集団をさらに濃縮するためこの集
団のｃＤＮＡライブラリーが最初に構築される。プロー
ブ領域と相補的なオリゴヌクレオチドが逆転写酵素（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、上記文献）を用いる単鎖ｃＤＮＡ集
団の合成を開始するのに使用される。第２のオリゴヌク
レオチドは５′から６′の順に（１）二連体ｃＤＮＡの
クローニングさせるだめの制限酵素配列１２）Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼのためのプロモーターの配列、および＋
３１ＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡ ノ最初Ｏ２２ヌクレオｆ−
）”（Ｄ配列を含むように合成された。このオリゴヌク
レオチドおよび第１の鎖ｃＤＮＡ生成物の合成の開始に
使用されたものは第１の鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いる
ＰＣＢ反応に使用して１ピコモルの二連体ＤＮＡを生じ
る。この生成物は未変性のポリアクリルアミドゲル電気
泳動により精製され。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写されＲＮＡの集団を
発生させ、それは再び複合体−沈降グロトコールにかけ
る。この過程は所望する回数だけ多く繰返してもよいが
、ある濃縮の限界値で収束するであろう。各選択サイク
ル後の濃縮の程度が二連体ｃ Ｄ Ｎ Ａをプラスミド
ベクター内へクローニングすること、および各選択サイ
クルの生成物から無作為に選んだいくつかの（例えば、
１２〕そのようなりローンの転写により産生されるＲＮ
Ａの検出感度を試験して決定された。 クローン化ＲＮＡの検出の感度は以下のごとくして決定
される。各クローンからのプラスミドＤＮＡが常法によ
り精製される。各々をｃＤＮＡの直ぐ下流で制限酵素に
よる制限消化を行い。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写してベクター配列を欠＜
ＲＮＡ生成物を製する。このＲＮＡはゲル電気泳動かま
たは実施例６に記載した方法におけるごとく、同じ配列
のＤＮＡオリゴヌクレオチドを標的としてｄＡ、、。の
尾を付け（ただし第２次の捕捉プローブは除かれている
〕オリゴｄＴ−磁気ビーズ上へ捕捉することにより精製
される。各々の精製された転写体は連続的に水に希釈し
、−部（１０μｌ）を実施例６に記載したごとくＱβ反
応液に添加する。反応液は６７℃で３０分反応を進行さ
せて停止し、最も薄い螢光発生希釈液から生成物を観察
するのに必要な最小数のプローブが決定される。この過
程を選択過程の各々の回から得られるクローンに対し繰
り返す。 上記の過程は標的にハイブリダイズした時効率よく複製
されるＲＮＡの単離にもまた応用されるであろう事が容
易に評価されるであろう。このことは開始複合体の形成
に先立って最初にＲＮＡの集団を合成標的にハイブリダ
イズさせることにより簡単に実施される。そのような集
団のあるものは遊離であるよシ標的にハイブリダイズし
た場合より効率よく複製される分子を含んでいるにちが
いないことがまた認識されるであろう。ハイブリダイゼ
ーション過程を非特異的になし遂げる分子は本質的に効
率悪く複製されるであろうから、前文のような分子はハ
イブリダイゼーション検定で使用する好適なプローブと
なるであろう。 呈１旦ヱ：ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ 検出のための利口な
プローブ系 配列： ５’−ＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴ
ＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡ
ＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＴＧＴＣ
ＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ−３’
のオリゴヌクレオチドが合成された。配列： ５’−Ｇ
ＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧ
ＴＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴ
ＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧ−６′ の第２のオリ
ゴヌクレオチドが合成された。 ２つのオリゴヌクレオチドはアニール化され前もってＢ
ｓｔＢ■およびＥｃｏＲＩ で消化した組換え体ＭＤ
Ｖ ＲＮＡのｃＤＮＡ クローン内へＬｉｚａｒｄｉ（
１言Ｃ文献）により記載されているごとくして結合され
た。生じるクローンをＤｒａ ｌ で消化し。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写する。生成物ＲＮＡは８
．６Ｍ尿素を含む６憾ポリアクリルアミドゲル上で精製
し、オートラジオグラフィーまたはＵＶシャドーイング
により目に見えるようにした後ゲルから溶出する。配列
５’−ＴＡＣＣＡＧＧＴＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＣＧ
ＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧ
ＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡ
ＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣ
ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴ−３’を持
つリポザイムープローブのための鋳型オリゴヌクレオチ
ドが合成された。この生成物の２ピコモルを当モル量の
″Ｔ７プロモータープライマー”オリゴヌクレオチド〔
プロメガ〕ヘアニーリングし。 Ｍｕｌｌｉｇａｎ （上記文献〕により記載されてい
るとと＜Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写する。ただしオ
ートラジオグラフィーによる可視化のため生成物を標識
するために反応液にはａ−ＰＣＴＰ（Ｉ Ｃｉ ／ｍｍ
ｏｌ ） が含まれている。転写生成物は８．３Ｍ尿
素を含む１０憾ポリアクリルアミドゲル上で精製し溶出
する。上記ＲＮＡの各々１ナノグラムを実施例７に記載
しであるとと＜ＨＩＶ−１検定に添加する。実施例６に
＝ｅ載したごとく最後のビーズの洗浄後、ビーズを２０
０ｍＭ ＫＣＬｌ ０ ｍＭ Ｍｇ Ｃ１１ｚ およ
び０．５％ＮＰ−４０を含む溶出緩衝液５０μｌ に再
懸濁する。ビーズをこの緩衝液中３７℃にて１０分間イ
ンキュベートし、その後磁場中に置くことにより再収集
する。液体相を集め新しいチューブに移す。この溶出液
１０μ！ 中に存在するＲＮＡは実施例乙に記載したご
とくＱβ反応で増幅する。 例えばプローブ長変更、別のリボザイム様構造に配位し
た別のミディ変異体または別の配列の選択を含む前記の
説明およびプローブ−鋳型構築物および検定法の実施例
の多くの変更が本発明の精神または範囲から離れること
なくなされるであろうことは当業者には容易に明らかに
なるであろう。
な方法はこれらの配列の正確および完全な除去を提供す
る必要がないので】重要な長所が由来する。例えば前に
示したごとく、プローブは６′および５′の両方の伸長
物を持って生成されてもよく、その標的へのハイブリダ
イゼーションによりリポザイム構造を提供し、それがＦ
ＬＮＡからの５′伸長物の切断を支配する。短い６′伸
長物は分子上に残る。 本発明の最も好適な実施態様が図５Ａおよび５Ｂに図解
されており、そこでは伸長物を持つプローブ分子は溶液
中で標的にハイブリダイズしている。少し前、後または
同時に、第２のオリゴヌクレオチドプローブが第１のプ
ローブに隣接する標的にハイブリダイズする。第２のオ
リゴヌクレオチドプローブは理想的にはその活性に補因
子（例えば、二価カチオン）を必要とするヌクレアーゼ
と結合している。ハイブリダイゼーションに続いて、複
合体はＲａｎｋｉ ら（上記文献）。 ８ｏｄｅｒｌｕｎｄ （上記文献〕、５ｔａｂｉｎｓｋ
ｙ （上記文献〕および／または８ｙｖａｎｅｎｅｎ
（上記文献）により記載されたごとき方法により固体
保持体上に捕捉される。洗浄などにより非特異的結合プ
ローブの大部分を分離した後、ヌクレアーゼ活性のため
の補因子を添加する。第１のプローブに近い方のプロー
ブの末端に結合しているヌクレアーゼはその標的とハイ
ブリダイズした場合第１のプローブ上のスペーサーを切
断し、それにより複製可能部分を溶液内へ放出する。前
に示したごとく、切断が起こるまでは複製を最大に阻害
するようにスペーサー配列は都合よく選択できる。この
方法の他の変更も明らかになるであろう。例えば、その
ようなプローブ対は５′伸長物の代ゎシに複製可能ＲＮ
Ａおよびプローブ配列要素の５′側にリボザイム配列が
存在するヌクレアーゼ−結合プローブを含んでいてもよ
い。 多くの任意のヌクレアーゼが切断剤として都合よく用い
られる。例えば、ミクロコツカルヌクレアーゼはＭＤＶ
〜Ｉ ＲＮＡを切断しないので（Ｈｉ ｌ １およびＢ
ｌｕｍｅｎｔｈａｌ （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ３０
１．３５０−３５２）使用される。Ｃｏｒｅｙ およ
び５ｃｈｕｌｔｚ （１９８７） ５ｃｉｅｎｃｅ ２
３８ ； １４０１−１４０３はそのようなオリゴヌク
レオチド−ミクロコツカル ヌクレアーゼ共役物の構築
について教えている。最も好適な実施態様において。 ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ （Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６４ ：５８５−５９１ （１９８８） 〕−
Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ （Ｎａｔｕｒｅ３２８：５９６−
６００（１９８７））、Ｃｅｃｈ（欧州特許出願ＷＯ８
８１０４３００，１９８８年６月１６日）、 Ｓｈａｒ
ｍｅｅｎら（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６Ｚ ：１４２
８−１４３０（１９８９）またはＨａｍｐ ｅ ｌおよ
びＴｒｉｔｚ（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐ
ｐ１．１２Ｄ、Ａｂｓｔ。 ＋Ｎ２１２．ｐ３’１ （１９８８））にょシ記載され
ているごとくエンドヌクレアーゼ様切断活性を持つ多数
のリボザイムの任意の１つが使用される。リボザイムは
著しい利点を持っており、 Ｍｕｌｌｉｇａｎ（上記文
献）により記載されているごとく適当な配列のＤＮＡオ
リゴヌクレオチドの転写により単一工程でリボザイムを
持つ第２のプローブが有効に産生され、それ故そのよう
な試薬を生成するのに必要とされる費用と労力を減じる
ことができる。 さらに、これらの好適な試薬は都合のよいことに特異的
切断を行うので、定められた複製性質の几ＮＡ生成物を
導く。 標的がＲＮＡであるような特別の場合、切断試薬は第１
のプローブ上のスペーサー配列の一部ト相補的な小さな
りＮＡオリゴヌクレオチド（例工ば６ケのヌクレオチド
〕であろう。この場合、複合体を持つ保持体に接触して
いる溶液へＲＮａｓｅＨ（ＲＮＨ：ＤＮＡ異種二連体中
のＲＮＡを切断するように作用する〕を添加することに
より切断が理想的に達成される。もちろん＋ ＲＮＡ標
的捕捉のための手段は、切断を特異的にするためそのよ
うな異種二連体の発生を理想的には避けるべきである。 例えば、標的ＲＮＡの別の部分と相補的なヒオチニル化
ＲＮ Ａは固定化ストレプタビジン保持体上に都合よく
捕捉される。 標的がＤＮＡである特別の場合、標的とのハイブリッド
の配列伸長物の消化は、そのようなオリゴヌクレオチド
を持つ第２のプローブを必要とせず、 ＲＮａｓｅ Ｈ
の添加により直接的に達成されるであろう。 以下のさらに詳細な実施例の研究からさらなる理解が得
られるであろう。 実施例６：クラミジア トラコマチス 几ＮＡの検出 配列： ｉｌｌ ５’−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＧＡＴＡＴＣＡ
ＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴ−３
’；および （２１５’−ＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＣ
ＣＡＡＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＡＧ−３’ を持つ２つのオリゴヌクレオチドをアニール化しＥｃｏ
Ｒｌで消化済みのＬｉｚａｒｄｉ （上記文献）により
記載されているものと類似のＭＤＶ ｃＤＮＡ構築物内
へ結合する。このｃＤＮＡクローンはＬｉｚａｒｄｉ
らにより記載されているものと内部挿入物がフフージ
Ｒ１７の被覆タンパク質のための結合部位をコードして
いるという点で異なる。このｃＤＮＡは公衆衛生研究所
、 Ｎ、 ＹのＦ、Ｒ。 Ｋｒａｍｅｒから得たものである。続いてのＥｃｏＲＩ
による消化でＴ７ＲＮＡポリメラーゼのブロモ−ターに
関してオリゴヌクレオチドの下流で切断が起こるような
方向でオリゴヌクレオチドを連結する。消化されたプラ
スミドは試験管内でＭｕｌｌｉｇａｎら（上記文献〕に
より記載された条件下、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにて転
写し、正しい長さの転写生成物を、ａ３Ｍ尿素を含むポ
リアクリルアミドゲルを通す電気泳動により分離する。 クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ）の１６Ｓリボソー
ＡＲＩＮＡ （Ｐａｌｍｅｒら、クラミジア感染（Ｏ
ｒｉｅｌ ら編〕ケンブリッジ大学出版局。 １９８６、ｐｐ８６−９２） 中の領域に相補的な配
列： ５’−ＴＡＣＡＣＣＧＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴ
ＡＧＧＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＴＴＣ−３’ を持つ
捕捉、ｊ−ＩＪ コヌクレオチドが合成され、Ｃｏ１１
ｉｎｅ （上記文献〕により記載されたごとく末端デオ
キシヌクレオチジル トランスフェラーゼ（スーパーチ
フス〕を用いて約１５０のｄＡ残基の尾をつけた。 種々の番号のホルマリン−固定のクラミジアトラコマチ
ス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の
基本菌体１．Ｏｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ（べ−リ
ンガーマンハイム〕および１．６％サルコシン（シグマ
）の溶液中、最終容量を６５μｌとし。 ６５℃にで１５分間溶菌する。３４０ ｎｆ／ｍｌの尾
を付けた捕捉オリゴヌクレオチドおよび１０１００ｎｒ
７の転写生成物プローブを含む３５μｌの緩衝液を添加
し、３７℃にて６０分間溶液相ハイブリダイゼーシ日ン
を起こさせる。４％ＢＳＡ、１０ｍＭＥＤＴＡ、α２％
ｙル：ｚシｙ、０．１Ｍ）リス−ＨｅｌｐＨ８，０およ
び０．０５壬プロノポール中Ｃｏ１１ｉｎｅ （上記
文献）に従って調製したオリゴ−ｄＴ修飾磁気ビーズの
１５μｌの０．０６係（ｗ／ｖ） 懸濁液を添加し、更
に６７℃で５分間インキュベートして標的−プローブ
ハイブリッドをビーズ上に捕捉する。 捕捉に続いて、ＩＭグアニジ／ チオシアナー） （Ｇ
ｕＳＣＮ、７ｈ力）、１０ｍＭＢＤＴＡ。 ０．０４Ｍ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，８，０，５係サルコ
シン。 ０６２％ＢＳＡおよび０．１％抗泡剤（トーマス〕を含
む０．２ ｍｌの”洗浄溶液”′を６Ｚ℃にて添加する
。 チューブを激しく振とうし磁場（好適には゛°磁気分離
装置および使用法”と題してＵＳＳＮＩ２１ 。 １９１ ；ＥＰＣ８８３１０８１０，２に記載されてい
るごとく、全部ここに参考文献として含まれている〕に
置く。ビーズをチューブの側面に引っ張り液体相をチュ
ーブから吸引により除去する。別の０、２ ｒｎｌの洗
浄溶液を加え、振とうさせてビーズを再懸濁し、磁場中
ビーズを再収集する。ビーズはさらに別の洗浄溶液で洗
浄する。上澄みを含まない収集ビーズをそれから３．２
５Ｍ ＧｕＳＣＮ。 ６５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４Ｍ ）リス−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ１Ｏ１０，５％ サルコシンおよび０．５％ＢＳＡを
含む５０μｌの緩衝液に再懸濁し、６７℃にて５分間イ
ンキュベートして標的−ＭＤＶプローブ−捕捉プローブ
ハイブリッドを放出する。磁気ビーズを前のごとくして
集め、上澄みを取り前に記載したごとくハイブリッドを
再捕捉するため各々５０μｌの新しいビーズ懸濁液を含
む新しいセットのチューブへ移す。これらのビーズは第
１のセットと同様の方法で３回洗浄し、ビーズの第３の
セットでもハイブリッドは放出され再捕捉される。この
ビーズのセットは同様の方法で６回洗浄し、更に０．１
Ｍ Ｋ（Ｊ−１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ ）リス。 ｐＨ８，００，５４ＮＰ −４０を含む溶液０．２ ｍ
ｌで６回洗浄する。 集められた洗浄済ビーズを１０ｍＭ）リス、−ＨＣｌ、
ｐＨ８，０，１ｍＭＢＤＴＡおよび０．５％ＮＰ−４０
からなる緩衝液５０μＥに再懸濁し、６７℃にて５分間
インキュベートして複合体を溶出する。ビーズを磁場で
集め、溶出複合体を含む上澄み液は新しいセットのチュ
ーブに移す。 ビーズ溶出液各々１０μｌを１７３ｍＭ）リス−ＨＣＩ
、ｐＨ７，５，２７ｍＭ ＭｇＣ１１ｔおよび各々０．
７７ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ（ファ
ルマシア）の溶液１６μｌを含むチューブのセットに添
加する。ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ （上記文献〕に従
って精製した２μｌのＱβレプリカーゼ（１，２μｇ）
を加え、チューブを６７℃にて１２分間インキュベート
する。５μｌの２０ｍＭＢＤＴＡ。 ６２μｇ７ｍｌのプロピジウム ヨーシト（シグマ）を
加えて複製を停止させる。５μｌの各々の停止反応液を
Ｕ底マイクロタイタープレート（ヌンク）の別々のウェ
ルに移す。発光極大が３６５ ｎｍである紫外光透照器
上ウララテン＋２９フイルターを用いてポラロイド６６
７型フイルムでプレートを写真に撮る。反応緩衝液およ
びプロピジウムヨージドのみを含む対照ウェル中の明ら
かな螢光を最小にするように露光を調節する。上記検定
を各基本菌体希釈液の６つにわけた試料についてそれぞ
れ実施する。 結果を下記の表に要約した。記号”＋”の数は観察され
た相対的螢光を反映している。 −”は螢光が対照ウェ
ルの螢光を越えなかったことを示している。 螢 光 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋ 上記実験で観察されたごとく、本検定は約１０基本菌体
の感度を持っていた。 実施例７：ＨＩＶ−１ｍＲＮＡの検出 捕捉プローブをＨＩＶ−１ＲＮＡ 中の保存領域と相
補的な６つのプローブに換えて実施例乙の検定を繰シ返
す。検出ＭＤＶプローブは実施例５に記載したごときも
のであシスペーテー配列５’−ＧＧＧＣＧＧＵＣＧＣＧ
ＣＧＡＡＡ−３’を含んでいる。こ（Ｄ検定１−１１０
００ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ 分子（７）ｇ度を示した。 実施例８：最適−複製スペーサー配列を含むプローブの
選択 ５′から６′の順に＝（１）標的と同一の短い（例えば
４０ヌクレオチド〕配列、（２）無作為な配列の短い伸
長物（１５ヌ／ｖ；ｔｆ）’）、（３）ＭＤＶ−Ｉ Ｒ
ＮＡの最も６′の６０ヌクレオチドに相補的な配列を持
つオリゴヌクレオチドの合成により鋳型ＤＮＡのライブ
ラリーを発生できる。無作為配列要素はオリゴヌクレオ
チドの合成の間に４つすべての保護ヌクレオチドを添加
することにより簡単に発生し。 この過程は現在入手可能な自動合成機により容易に達成
される。第１のオリゴヌクレオチドの最も５′の１９の
ヌクレオチドと相補的な第２のオリゴヌクレオチドが次
に合成された。これを＠１のオリゴヌクレオチドとアニ
ール化し、ＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼで伸長し二
重鎖ＤＮＡ断片を産生ずる。この断片は続いて制限酵素
Ｂａｔ Ｅｌで切断し、切断生成物はＬｉｚａｒｄｉ
（上記文献）により記載されているごとく前もってＢｓ
ｔＥＩＩで切断しであるＭＤＶｃＤＮＡクローンの断片
へ結合する。結合生成物の２ピコモルをＴ７ ＲＮＡポ
リメラーゼで転写し１０ の異ったスペーサー配列を含
むＲＮＡの集団を発生させる。 ＲＮＡの集団内の最も効率よく複製を開始する分子を２
つの方法のうちの１つにより都合よく選択し：その未完
成潜在性娘鎖ヘハイプリダイズされたＱβ鋳型ＲＮＡの
電気泳動的遅延ＣＭｉｌｌ ら（１９８０）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ １９：２２８−２り６） ；またはＱβレプリカ
ーゼおよび娘鎖の管理された潜在性を持つ鋳型ＲＮＡの
間で形成された安定な複合体の単離。後者の方法の例を
以下に記載する。 ２５ｔｉｌ の１００ｍＭ）リスＨＣＬ ＰＨ７，５゜
１４ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１！中熱作為配列スペーサー
を持つ２ピコモルのＲＮＡを５ピコモル（１，２μｇ）
のＱβレプリカーゼと３７℃にて５分間インキュベート
する。各々２．４ｍＭのＧＴＰおよびＡＴＰを含む同じ
緩衝液５μｌを加え、さらに５分間インキュヘ−’／ヨ
ンヲ続ケル。４０ピコモルのＭＤＶ−ＩＲＮＡを含む５
μｌの緩衝液をそれから加え、２分間インキュページジ
ンを続ける。反応液を０℃に冷却し、前もって０℃に冷
やしである１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍ
ＭＭｇＣＩＲ中の１０−６０係グリセロール勾配液２．
２ ｍｌの上面に注ぐ。 勾配液はＴＬＳ−５５ローター（ベックマ／インスツル
メント、バロアルトＣＡ）中５５Ｋ ＲＰＭで４℃にて
６時間回転する。遊離のＲＮＡよシ４０壬速く沈降する
酵素： ＲＮＡ複合体を集め。 フェノールで抽出し、エタノール沈澱を行う。この集団
はＱβレプリカーゼにより効率よく複製できるＲＮＡが
濃縮されている。この集団をさらに濃縮するためこの集
団のｃＤＮＡライブラリーが最初に構築される。プロー
ブ領域と相補的なオリゴヌクレオチドが逆転写酵素（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、上記文献）を用いる単鎖ｃＤＮＡ集
団の合成を開始するのに使用される。第２のオリゴヌク
レオチドは５′から６′の順に（１）二連体ｃＤＮＡの
クローニングさせるだめの制限酵素配列１２）Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼのためのプロモーターの配列、および＋
３１ＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡ ノ最初Ｏ２２ヌクレオｆ−
）”（Ｄ配列を含むように合成された。このオリゴヌク
レオチドおよび第１の鎖ｃＤＮＡ生成物の合成の開始に
使用されたものは第１の鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いる
ＰＣＢ反応に使用して１ピコモルの二連体ＤＮＡを生じ
る。この生成物は未変性のポリアクリルアミドゲル電気
泳動により精製され。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写されＲＮＡの集団を
発生させ、それは再び複合体−沈降グロトコールにかけ
る。この過程は所望する回数だけ多く繰返してもよいが
、ある濃縮の限界値で収束するであろう。各選択サイク
ル後の濃縮の程度が二連体ｃ Ｄ Ｎ Ａをプラスミド
ベクター内へクローニングすること、および各選択サイ
クルの生成物から無作為に選んだいくつかの（例えば、
１２〕そのようなりローンの転写により産生されるＲＮ
Ａの検出感度を試験して決定された。 クローン化ＲＮＡの検出の感度は以下のごとくして決定
される。各クローンからのプラスミドＤＮＡが常法によ
り精製される。各々をｃＤＮＡの直ぐ下流で制限酵素に
よる制限消化を行い。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写してベクター配列を欠＜
ＲＮＡ生成物を製する。このＲＮＡはゲル電気泳動かま
たは実施例６に記載した方法におけるごとく、同じ配列
のＤＮＡオリゴヌクレオチドを標的としてｄＡ、、。の
尾を付け（ただし第２次の捕捉プローブは除かれている
〕オリゴｄＴ−磁気ビーズ上へ捕捉することにより精製
される。各々の精製された転写体は連続的に水に希釈し
、−部（１０μｌ）を実施例６に記載したごとくＱβ反
応液に添加する。反応液は６７℃で３０分反応を進行さ
せて停止し、最も薄い螢光発生希釈液から生成物を観察
するのに必要な最小数のプローブが決定される。この過
程を選択過程の各々の回から得られるクローンに対し繰
り返す。 上記の過程は標的にハイブリダイズした時効率よく複製
されるＲＮＡの単離にもまた応用されるであろう事が容
易に評価されるであろう。このことは開始複合体の形成
に先立って最初にＲＮＡの集団を合成標的にハイブリダ
イズさせることにより簡単に実施される。そのような集
団のあるものは遊離であるよシ標的にハイブリダイズし
た場合より効率よく複製される分子を含んでいるにちが
いないことがまた認識されるであろう。ハイブリダイゼ
ーション過程を非特異的になし遂げる分子は本質的に効
率悪く複製されるであろうから、前文のような分子はハ
イブリダイゼーション検定で使用する好適なプローブと
なるであろう。 呈１旦ヱ：ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡ 検出のための利口な
プローブ系 配列： ５’−ＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴ
ＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡ
ＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＴＧＴＣ
ＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ−３’
のオリゴヌクレオチドが合成された。配列： ５’−Ｇ
ＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧ
ＴＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴ
ＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧ−６′ の第２のオリ
ゴヌクレオチドが合成された。 ２つのオリゴヌクレオチドはアニール化され前もってＢ
ｓｔＢ■およびＥｃｏＲＩ で消化した組換え体ＭＤ
Ｖ ＲＮＡのｃＤＮＡ クローン内へＬｉｚａｒｄｉ（
１言Ｃ文献）により記載されているごとくして結合され
た。生じるクローンをＤｒａ ｌ で消化し。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写する。生成物ＲＮＡは８
．６Ｍ尿素を含む６憾ポリアクリルアミドゲル上で精製
し、オートラジオグラフィーまたはＵＶシャドーイング
により目に見えるようにした後ゲルから溶出する。配列
５’−ＴＡＣＣＡＧＧＴＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＣＧ
ＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧ
ＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡ
ＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣ
ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴ−３’を持
つリポザイムープローブのための鋳型オリゴヌクレオチ
ドが合成された。この生成物の２ピコモルを当モル量の
″Ｔ７プロモータープライマー”オリゴヌクレオチド〔
プロメガ〕ヘアニーリングし。 Ｍｕｌｌｉｇａｎ （上記文献〕により記載されてい
るとと＜Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写する。ただしオ
ートラジオグラフィーによる可視化のため生成物を標識
するために反応液にはａ−ＰＣＴＰ（Ｉ Ｃｉ ／ｍｍ
ｏｌ ） が含まれている。転写生成物は８．３Ｍ尿
素を含む１０憾ポリアクリルアミドゲル上で精製し溶出
する。上記ＲＮＡの各々１ナノグラムを実施例７に記載
しであるとと＜ＨＩＶ−１検定に添加する。実施例６に
＝ｅ載したごとく最後のビーズの洗浄後、ビーズを２０
０ｍＭ ＫＣＬｌ ０ ｍＭ Ｍｇ Ｃ１１ｚ およ
び０．５％ＮＰ−４０を含む溶出緩衝液５０μｌ に再
懸濁する。ビーズをこの緩衝液中３７℃にて１０分間イ
ンキュベートし、その後磁場中に置くことにより再収集
する。液体相を集め新しいチューブに移す。この溶出液
１０μ！ 中に存在するＲＮＡは実施例乙に記載したご
とくＱβ反応で増幅する。 例えばプローブ長変更、別のリボザイム様構造に配位し
た別のミディ変異体または別の配列の選択を含む前記の
説明およびプローブ−鋳型構築物および検定法の実施例
の多くの変更が本発明の精神または範囲から離れること
なくなされるであろうことは当業者には容易に明らかに
なるであろう。
図１Ａは最も好適な実施態様を図示しており、ミディバ
リアントとＲＮＡ標的のノ・イブリダイゼーションによ
り生成されるリポザイム（箱形の枠内に含まれている”
環状”構造）及びその切断部位を示す図である。 図Ｉ ＢＦｉ、Ｆ’ Ｉ Ａのプローブ−標的複合体に
二価カチオンを添加することにより得られた切断生成物
を示す図である。 図２は他の実施態様の図示であシ１図中ＲＮＡ鋳型およ
びＲＮＡ標的にハイブリダイズした５′末端標的特異的
配列から成る第１のプローブおよび第２のプローブ配列
がＲＮＡ標的および第１のプローブのＲＮＡ鋳型の５′
基部配列にハイブリダイズしており、それによりリボザ
イムが生成されることを示す図である。 図３は本発明のプローブの発生に使用するためのｃＤＮ
Ａクローンの一般的な構築スキームを例示する図である
。 図４Ａおよび４Ｂは本発明の最も好適なプローブを産生
ずるためのベクターの１つの構築において図６で産生さ
れるｃＤＮＡクローンの使用を例示する図である。 図５Ａおよび５Ｂは一組のプローブを用いる最も好適な
実施態様を示す図であって、そのうちの１つは切断可能
なスペーサー要素を通して標的特異性プローブに結合し
ているミディ変異体−１含んでいることを示す図である
。 （外４名〕 第１Ｂ回 第 図 予 回 第４Ａ園 第４Ｂ回 第４ＡＴＢから ■ 第５Ａ凹 手 続 補 正 書（方式） ％式％ その使用方法 ３゜ 補正をする者 り１件との関係 特許出願人 住所 名 称 シーン−トラック・システムスタイプ印書に
より浄書した明細書
リアントとＲＮＡ標的のノ・イブリダイゼーションによ
り生成されるリポザイム（箱形の枠内に含まれている”
環状”構造）及びその切断部位を示す図である。 図Ｉ ＢＦｉ、Ｆ’ Ｉ Ａのプローブ−標的複合体に
二価カチオンを添加することにより得られた切断生成物
を示す図である。 図２は他の実施態様の図示であシ１図中ＲＮＡ鋳型およ
びＲＮＡ標的にハイブリダイズした５′末端標的特異的
配列から成る第１のプローブおよび第２のプローブ配列
がＲＮＡ標的および第１のプローブのＲＮＡ鋳型の５′
基部配列にハイブリダイズしており、それによりリボザ
イムが生成されることを示す図である。 図３は本発明のプローブの発生に使用するためのｃＤＮ
Ａクローンの一般的な構築スキームを例示する図である
。 図４Ａおよび４Ｂは本発明の最も好適なプローブを産生
ずるためのベクターの１つの構築において図６で産生さ
れるｃＤＮＡクローンの使用を例示する図である。 図５Ａおよび５Ｂは一組のプローブを用いる最も好適な
実施態様を示す図であって、そのうちの１つは切断可能
なスペーサー要素を通して標的特異性プローブに結合し
ているミディ変異体−１含んでいることを示す図である
。 （外４名〕 第１Ｂ回 第 図 予 回 第４Ａ園 第４Ｂ回 第４ＡＴＢから ■ 第５Ａ凹 手 続 補 正 書（方式） ％式％ その使用方法 ３゜ 補正をする者 り１件との関係 特許出願人 住所 名 称 シーン−トラック・システムスタイプ印書に
より浄書した明細書
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、第１および第２の核酸配列を持つ標的核酸を検出す
る方法で次の各工程からなることを特徴とする方法。 （Ａ）前記標的核酸を単鎖の形で提供する第一工程 （Ｂ）３′末端および５′末端を持ち、Ｑβレプリカー
ゼで複製可能であるＲＮＡ鋳型。 前記ＲＮＡ鋳型の前記５′末端上にあり、 前記標的核酸（第１の標的配列）の前記第１の核酸配列
と相補的である第１の核酸プローブ配列、および 前記ＲＮＡ鋳型の前記３′末端にあり、前 記標的核酸（第２の標的配列）の前記第２の核酸配列に
相補的な第２の核酸プローブ配列 から成るプローブをさらに提供する第二工程（Ｃ）前記
第１および第２のプローブ配列と前記それぞれの第１お
よび第２の標的配列（もし存在すれば）間でハイブリダ
イゼーションを起こさせるような条件下前記単鎖標的核
酸および前記プローブを接触させ、それによって前記第
１の核酸プローブ配列と前記第１の標的配列および前記
第２の核酸プローブ配列と前記第２の標的配列がハイブ
リダイゼーションを行い前記標的核酸および前記プロー
ブ由来の配列を含むリボザイムが生成される第三工程 （Ｄ）前記形成したリボザイムの切断を誘導し、それに
より前記ＲＮＡ鋳型が前記標的核酸から放出される第四
工程 （Ｅ）前もって定めた時間前記放出されたＲＮＡ鋳型が
Ｑβレプリカーゼにより複製されるようにする第五工程 （Ｆ）前記標的核酸の存在または不在の指標として複製
されたＲＮＡ鋳型を検出する第六工程２、前記誘導切断
工程が前記生成したリボザイムをＭｎ＾＋＾＋、Ｍｇ＾
＋＾＋およびＣａ＾＋＾＋から成る群より選択される二
価カチオンと接触せしめることからなる特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３、前記第１および第２の核酸プローブ配列がそれぞれ
、５′−ＧＡＡＡ−３′を含む配列により分離されてい
る第１および第２の標的配列とハイブリダイズし、前記
第２の核酸プローブ配列が少くとも約４つの塩基の長さ
を持ち、および前記ＲＮＡ鋳型がミディ変異体である特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記第１および第２の核酸プローブ配列がそれぞれ
５′−ＧＡＡＡ−３′を含む配列により分離されている
第１のおよび第２の標的配列とハイブリダイズし、前記
第２の核酸プローブ配列が少くとも約４つの塩基の長さ
を持ち、および前記ＲＮＡ鋳型がミディ変異体である特
許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、前記誘導切断工程が前記生成されたリボザイムとＭ
ｎ＾＋＾＋、Ｍｇ＾＋＾＋およびＣａ＾＋＾＋から成る
群より選択される二価カチオンを接触せしめることから
なる特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、前記接触工程に続いてかつ前記誘導工程の前にハイ
ブリダイズしたプローブからハイブリダイズしていない
プローブを分離する工程をさらに含むことを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、前記検出工程中、前記の検出された複製ＲＮＡ鋳型
を標的核酸の量に相関させる工程をさらに含むことを特
徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記誘導切断工程の間、前記第１の核酸プローブ配
列が前記第１の標的配列にハイブリダイズして残ってい
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、前記誘導切断工程の間、前記第１の核酸プローブ配
列が前記第１の標的配列にハイブリダイズして残ってい
る特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０、前記標的核酸をＲＮＡ鋳型および前記標的核酸の
一部と相補的な配列を持つプローブと接触せしめ、それ
によって前記プローブと前記標的核酸配列のハイブリダ
イゼーションにより前記標的核酸および前記プローブ由
来の配列を含むリボザイムが生成され；前記ＲＮＡ鋳型
の放出のため前記リボザイムの切断を誘導し；前記ＲＮ
Ａ鋳型をＱβレプリカーゼにより複製し；前記複製ＲＮ
Ａ鋳型を検出することから成る標的核酸配列を検出する
方法。 １１、第１および第２の核酸配列を持つ標的核酸を検出
する方法で次の各工程からなることを特徴とする方法。 （Ａ）前記標的核酸を単鎖の形で提供する第一工程 （Ｂ）３′末端および５′末端を持ち、Ｑβレプリカー
ゼで複製可能であるＲＮＡ鋳型、および前記ＲＮＡ鋳型
の前記５′末端上の前記標 的核酸（第１の標的配列）の前記第１の核酸配列と相補
的である第１の核酸プローブ配列 から成る第１のプローブをさらに提供する第二工程 （Ｃ）前記標的核酸（第２の標的配列）の前記第２の核
酸配列と相補的で、前記５′プローブ末端上に前記第１
のプローブに対し相補的な第３の配列を持つ第２の核酸
プローブ配列 から成る第２のプローブをさらに提供する第三工程 （Ｄ）前記第１および第２のプローブ配列と前記それぞ
れの第１および第２の標的配列（もし存在すれば）間で
ハイブリダイゼーションを起こさせるような条件下、前
記単鎖標的核酸と前記第１および第２のプローブを接触
させ、それにより前記第１の核酸プローブ配列と前記第
１の標的配列および前記第２の核酸プローブ配列と前記
第２の標的配列がハイブリダイゼーションを行い、前記
標的核酸、前記第１の核酸プローブおよび前記第２の核
酸プローブ由来の配列を含むリボザイムが生成される第
四工程 （Ｅ）前記形成したリボザイムの切断を誘導し、それに
より前記ＲＮＡ鋳型が前記標的核酸から放出される第五
工程 （Ｆ）前もって定めた時間前記放出されたＲＮＡ鋳型が
Ｑβレプリカーゼにより複製されるようにする第六工程 （Ｇ）前記標的核酸の存在または不在の指標として複製
されたＲＮＡ鋳型を検出する第七工程１２、前記誘導工
程が前記生成したリボザイムをＭｎ＾＋＾＋、Ｍｇ＾＋
＾＋およびＣａ＾＋＾＋から成る群より選択される二価
カチオンと接触せしめることからなる特許請求の範囲第
１１項記載の方法。 １３、前記第１および第２の核酸プローブ配列がそれぞ
れ５′−ＧＡＡＡ−３′から成る配列により分離されて
いる第１および第２の標的配列とハイブリダイズし、前
記第２の核酸プローブ配列が少くとも約４つの塩基の長
さを持ち、および前記ＲＮＡ鋳型がミディ変異体である
特許請求の範囲第１１または１２項記載の方法。 １４、前記接触工程に続いてかつ前記誘導工程の前に、
ハイブリダイズしたプローブからハイブリダイズしてい
ないプローブを分離する工程をさらに含むことを特徴と
する特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、前記検出工程中、前記の検出された複製ＲＮＡ鋳
型を標的核酸の量に相関させる工程をさらに含むことを
特徴とする特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、前記誘導切断工程の間、前記第１の核酸プローブ
配列が前記第１の標的配列にハイブリダイズして残って
いる特許請求の範囲第１１または１２項記載の方法。 １７、３′末端および５′末端を持ちおよびＲＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼによる複製を受けやすいＲＮＡ鋳型
および前記３′および５′末端の片方または両方に結合
している核酸から成るプローブ構造物。 １８、前記核酸が標的微生制核酸に特異的で適当な条件
下ハイブリダイズ可能である特許請求の範囲第１７項記
載のプローブ構造物。 １９、前記鋳型がＭＤＶ−１であり、および前記ＲＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼがＱ−ベータレプリカーゼであ
る特許請求の範囲第１８項記載のプローブ構造物。 ２０、前記標的微生物に対し非特異的で、前記ＲＮＡ鋳
型の前記３′末端および前記核酸に結合している核酸ス
ペーサー配列をさらに含むことを特徴とする特許請求の
範囲第１８項記載のプローブ構造物。 ２１、前記標的核酸に対し特異的な第２の核酸でそれに
結合する放出作因手段を持ち、それにより前記第２の核
酸および前記第１の核酸が前記標的微生物核酸とハイブ
リダイゼーションして複合体を形成し、それにより前記
放出作因手段が前記スペーサー配列を切断するように働
きそれにより前記標的微生物核酸から前記鋳型を放出す
るような第２の核酸をさらに含むことを特徴とする特許
請求の範囲第２０項記載のプローブ構造物。 ２２、前記放出作因手段が前記放出作因手段活性化のた
めの補因子を含む特許請求の範囲第２１項記載のプロー
ブ構造物。 ２３、第１および第２の核酸配列を持つ標的核酸配列の
存在または不在を検出するためのプローブ構造物であっ
て、次のプローブ配列から成る特許請求の範囲第１７項
記載のプローブ構造物。 （Ａ）前記ＲＮＡ鋳型の前記５′末端上の、前記標的核
酸の前記第１の核酸配列に相補的な第１の核酸プローブ
配列 （Ｂ）前記ＲＮＡ鋳型の前記３′末端上の、前記標的核
酸の前記第２の核酸配列に相補的な第２の核酸プローブ
配列 ２４、前記第１および第２の核酸プローブ配列が５′−
ＧＡＡＡ−３′から成る配列により分離されている第１
および第２の核酸配列とハイブリダイズし、および前記
第２の核酸プローブ配列が少くとも約４つの塩基の長さ
を持つ特許請求の範囲第２６項記載のプローブ構造物。 ２５、標的核酸の存在を検出するためのプローブ構成物
であって、前記ＲＮＡ鋳型の前記３′末端に結合した第
１の標的に特異的な核酸配列および前記ＲＮＡ鋳型の前
記５′末端に結合した第２の核酸配列を持ち、それによ
り前記プローブの前記標的核酸へのハイブリダイゼーシ
ョンでリボザイム構造を生じる特許請求の範囲第１７項
記載のプローブ構造物。 ２６、前記リボザイム構造が前記ＲＮＡ鋳型から前記第
２の核酸を切断する特許請求の範囲第２５項記載のプロ
ーブ構造物。 ２７、前記核酸がリボ核酸であり、および標的微生物デ
オキシリボ核酸に対し特異的であり、さらに前記リボ核
酸が前記標的微生物デオキシリボ核酸にハイブリダイズ
された場合前記標的微生物デオキシリボ核酸から前記リ
ボ核酸を放出させるためのＲＮアーゼＨを特徴とする、
特許請求の範囲第１７項記載のプローブ構造物。 ２８、次のものからなる標的核酸配列の存在または不存
を検出するためのキット。 （Ａ）３′末端および５′末端を持ちＱβレプリカーゼ
により複製可能なＲＮＡ鋳型から成る第１のプローブで
、前記ＲＮＡ鋳型の前記５′末端に結合され、前記標的
核酸の前記第１の核酸配列に相補的な第１の核酸プロー
ブ配列を持っている第１のプローブ （Ｂ）前記の第２の３′プローブ末端にあり、前記標的
核酸の前記第２の核酸配列と相補的な第２の核酸プロー
ブ配列を含む３′および５′末端を持つ第２のプローブ
で前記５′プローブ末端に、前記第１のプローブと相補
的な第３の配列を持っている第２のプローブ （Ｃ）前記標的核酸検出のための前記第１および第２の
プローブを使用するための説明書 ２９、前記第１および第２の核酸プローブ配列が５′−
ＧＡＡＡ−３′から成る配列により分離されている第１
および第２の核酸配列にハイブリダイズし、および前記
第２の核酸プローブ配列が少くとも約４ケの塩基の長さ
を持っている特許請求の範囲第２８項記載のキット。
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