DE3855709T2

DE3855709T2 - Hybridisierungsverfahren und Reagenzsatz dafür

Info

Publication number: DE3855709T2
Application number: DE3855709T
Authority: DE
Inventors: Petri Uolevi Buchert; Anne Maritta Jaervinen; Stefan Henrik Karlsson; Kai Mikael Korpela; Matti Heikki Sakari Laaksonen; Gunnel Solveig Kris Loennqvist; Tuula Marjut Ranki; Hans Erik Soederlund; Ann-Christine Elizabe Syvaenen; Jukka Tapani Tenhunen; Arja Marjatta Weckman
Original assignee: Sangtec Medical AB
Current assignee: SANGTEC MEDICAL BROMMA SE AB
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1988-10-07
Publication date: 1997-04-17
Anticipated expiration: 2008-10-08
Also published as: JPH01222800A; DK174957B1; GR3022457T3; EP0317074A2; DE3855709D1; FI80476B; AU2178188A; EP0317074B1; FI80476C; JP2705811B2; AU618278B2; ES2095206T3; FI874466A0; DK551088D0; ATE146529T1; DK551088A; EP0317074A3; FI874466L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Hybridisierung mittels Filtration. Die Erfindung betrifft auch einen Reagenssatz (Kit) zur Verwendung in diesem Verfahren und eine Reagentienpackung.
Die in dem Verfahren verwendete Sandwich-Hybridisierungtechnik wird im Europäischen Patent EP 79139 beschrieben, und das Grundprinzip der Lösungshybridisierung wird z.B. im Britischen Patent GB 2169403 beschrieben. Die Lösungshybridisierung wird in einer Lösungsphase unter Verwendung von mindestens zwei gegenseitig nicht homologer Sonden durchgeführt, die dazu fähig sind, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, wobei mindestens eine der Sonden, die Detektorsonde, mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann, und mindestens eine, die Einfangsonde, über die Bildung eines Affinitätspaares an eine andere Komponente gebunden werden kann, die an einem festen Träger fixiert ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, die Lösungshybridisierung, bei der die Detektorsonde oder die Einfangsonde durch einen modifizierten Primer ersetzt ist, zu verwenden. Die Verwendung von modifizierten Primern in der Hybridisierung wird im GB-A-2202328 beschrieben. Das Verfahren verwendet zwei modifizierte Primer, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel- Nucleinsäure sind. Zusätzlich wird mindestens eine Nucleinsäuresonde benötigt, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und nicht mit den zwei vorstehend genannten Primern homolog ist. Wenn ein modifizierter Primer als Detektorsonde fungiert, d.h. mit einer bestimmbaren Markierung versehen ist oder mit ihr versehen werden kann, ist die in Frage stehende selektive Sonde ähnlich zu der in der Lösungshybridisierung verwendeten Einfangsonde, d.h. sie ist mit einer Affinitätspaar-Einheit oder einer Reaktionspaar-Einheit versehen oder kann mit einer solchen versehen werden. Wenn ein modifizierter Primer als Einfangsonde wirkt, wirkt die selektive Sonde als Detektorsonde, d.h. sie ist mit einem bestimmbaren Marker versehen oder kann mit einem solchen versehen werden.
In dem Verfahren werden die modifizierten Primer mit den komplementären Strängen der Ziel-Nucleinsäure, die einzelsträngig geblieben sind, hybridisieren gelassen. Danach wird die Mischung in Gegenwart einer Polymerase inkubiert, die das Templat, d.h. das Ziel- Nucleinsäuremolekül, erkennt; aufgrund der Polymerase können die Primer zu Ketten erweitert werden, die mehrere Tausend Basen umfassen. Die Polymerisationsreaktion wird, wenn erforderlich, wiederholt, bis die Zahl der Ziel-Nucleinsäuremolekülkopien, die erforderlich ist, um die gewünschte Sensitivität in dem bestimmen Fall zu erreichen, erhalten ist, wobei jede der Kopien mit einem modifizierten Primer versehen ist. Für den Fall, daß die Ziel-Nucleinsäure eine einzelsträngige RNA ist, wird in der Anfangsphase eine reverse Transkriptase verwendet, mit deren Hilfe zuerste ein cDNA-Strang hergestellt wird. Nach der Polymerisation wird die Hybridisierung zwischen den Kopien der Ziel-Nucleinsäuremoleküle, die mit modifizierten Primern versehen sind, und der selektiven Sonde durchgeführt.
Die Sandwich-Hybridisierung wird durchgeführt, indem man mindestens zwei gegenseitig nicht homologen Sonden verwendet, die dazu fähig sind, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, wobei mindestens eine der Sonden, die Einfangssonde, an einen festen Träger fixiert ist, und die andere, die Detektorsonde, mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann. Es ist auch möglich, eine Festträger- Hybridisierung zu verwenden, in der der modifizierte Primer als Detektorsonde wirkt (GB-A-2202328). In diesem Fall ist die in dem Verfahren verwendete Nucleinsäuresonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, an einem Mikroteilchen fixiert.
Sowohl im Sandwich-Hybridisierungsverfahren als auch im Lösungshybridisierungsverfahren wird ein Überschuß an Detektorsonde von dem zwischen der Ziel-Nucleinsäure, den Einfangsonden und den Detektorsonden gebildeten Hybrid abgetrennt, indem man die an den festen Träger (Filter, Eintauchstab, Mikrotiterplatte usw.) gebundenen Hybride sorgfältig wäscht. Für den Fall, daß Mikroteilchen als fester Träger verwendet werden, wird die Trennung durch Zentrifugieren und mehrmaliges Waschen der Teilchen, wie in der Veröffentlichung zur Lösungshybridisierung, Nucleic Acids. Res. 14 (1986) 5037-5048, und in der Europäischen Patentschrift EP 205532, die die Sandwichhybridisierung betrifft, beschrieben durchgeführt. Es ist auch möglich, eine Chromatographiesäule mit den Mikroteilchen zu beschicken und die überschüssige Detektorsonde aus der Säule zu eluieren (GB 2169403). Wenn modifizierte Primer verwendet werden, wird die Trennung durch die gleichen Verfahren wie bei der Sandwich-Lösungshybridisierung durchgeführt.
Die EP-A-139489 beschreibt ein Sandwich-Hybridisierungsverfahren zur Nucleinsäurebestimmung, in dem eine biotinylierte Nucleinsäuresonde zur Bestimmung von Genen oder interessierenden Basensequenzen in Nucleinsäuren verwendet wird. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet eine mit einem Enzym markierte Nucleinsäuresonde zur Hybridisierung mit der Nucleinsäure, eine biotinylierte Nucleinsäuresonde für eine spezifische Hybridisierung mit dem Gen oder der interessierenden Basensequenz, und ein mit Avidin beschichtetes Mikroteilchen für die Immobilisierung. Nach der Trennung wird die Markierung in den gebundenen Spezien bestimmt, um die Gegenwart von Nucleinsäure, die die gewünschte Gen- oder Basensequenz besitzt, zu bestimmen. Die Trennung von gebundenem und ungebundenem Material kann durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Waschstufen erfolgen. Es werden keine spezifischen Beispiele für das Verfahren angegeben.
Die EP-A-192168 beschreibt ein duales Hybridisierungsuntersuchungsverfahren zur Bestimmung der Gegenwart einer bestimmten Polynucleotidsequenz in einer Testprobe, worin die Hybridisierung in Lösungsphase durchgeführt wird. Es werden zwei lösliche Polynucleotidsonden verwendet, die mit gegenseitig sich ausschließenden Anteilen der zu bestimmenden Sequenz hybridisieren. Die erste oder Trennsonde umfaßt eine reaktive Stelle für einen Reaktionspartner, vorzugsweise eine Bindungsstelle (z.B. Biotin) für eine bindende Substanz (z.B. Avidin). Nach der Hybridisierung wird die resultierende Lösung mit einer immobilisierten Form des Reaktionspartners in Kontakt gebracht, wobei duale Hybride, die die zu bestimmende Sequenz umfassen, und die Bestimmungs- und Trennsonden immobilisiert werden. Die immobilisierte Fraktion wird dann abgetrennt und dann die Detektionssonde in einer der abgetrennten Fraktionen bestimmt. Die Abtrennung der immobilisierten Fraktion aus dem verbleibenden Material kann durch Zentrifugieren, Filtrieren, Chromatographie oder Abdekantieren erfolgen. In den spezifischen Beispielen wurde Filtrieren nicht verwendet.
Die EP-A-200113 beschreibt ein Verfahren einer Festphasen- Nucleinsäurehybridisierungsbestimmung, die ein erster Fragment einer Nucleinsäure, das an einen festen Träger, der wasserunlösliche Teilchen umfaßt, verwendet, und ein zweites Nucleinsäurefragment, das an einen lumineszierenden Marker gebunden ist. Die Hybridisierung tritt auf, während der feste Träger suspendiert ist, und die Lumineszenz wird gemessen, nachdem der feste Träger durch Mikrofiltration aufkonzentriert wurde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, mittels zwei oder mehrerer Filtrationen im gleichen Behälter die Durchführung von Hybridisierungsverfahren zu beschleunigen und zu erleichtern und zusätzlich ihre Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Wirtschaftlichkeit zu verbessern. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es auch möglich, ohne umständliche vorausgehende Behandlungsstufen Nucleinsäurebestimmungen an Proben durchzuführen, die große Mengen an biologischen Verunreinigungen enthalten, die schwierig zu entfernen sind.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden geeignet vorbehandelte Teilchen als fester Träger verwendet. Verschiedene Probleme haben sich bei der Trennung der Teilchen von der Hybridisierungsmischung ergegeben, wenn konventionelle Verfahren verwendet wurden, insbesondere wenn die Teilchen große Mengen an unlöslichen biologischen Verunreinigüngen enthielten. Bei den Zentrifugierverfahren können diese Verunreinigungen nicht von den zu bestimmenden Hybriden abgetrennt werden; sie trennen sich aus der Hybridisierungslösung zusammen mit den Teilchen ab. Zusätzlich tritt im Zusammenhang mit wiederholten Waschungen ein Verlust eines Teiles der Teilchen auf, wenn sie an den Wänden der Zentrifuge und der Waschbehälter anhaften. Die Verwendung von Chromatographiesäulen ist, insbesondere bei Routinebestimmungen, ebenfalls langsam und mühsam, und auch teuer.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäure durch Hybridisierung bereit, das umfaßt:
(a) Filtern einer Lösung, in der die Gegenwart einer Ziel- Nucleinsäure oder eine Kopie des Ziel-Nucleinsäuremoleküls bestimmt werden soll, in einen Behälter, um unlösliche Verunreinigungen aus der Lösung zu entfernen;
(b) Herstellen eines Konjugats eines unlöslichen Teilchens und einer hybridisierten Ziel-Nucleinsäure oder einer hybridisierten Kopie eines Ziel-Nucleinsäuremoleküls aus dem Filtrat im Behälter, wobei die hybridisierte Nucleinsäure oder die Kopie des Moleküls an das Teilchen über eine Nucleinsäuresonde oder gegebenenfalls, im Fall einer hybridisierten Kopie des Moleküls, über einen Primer, mit dessen Hilfe die Kopie hergestellt wurde, gebunden ist;
(c) Trennen des Konjugats in dem Behälter von überschüssiger Sonde und/oder Primer durch Filtration und Waschen; und
(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.
Ein Beispiel für einen geeigneten Behälter ist eine Injektionsspritze.
Erfindungsgemäß kann das Verfahren durchgeführt werden durch Filtrieren einer hybridisierten oder nicht-hybridisierten Nucleinsäureprobe in einen Behälter, in dem entweder die gegebenenfalls in der Probe vorhandene Ziel-Nucleinsäure, wenn erforderlich, hybridisiert wird und an die Teilchen im Behälter, oder an die dem Behälter zugegebenen Teilchen nach Hybridisierung über eine Nucleinsäuresonde fixiert wird, oder Kopien der Ziel-Nucleinsäuremoleküle in einen Behälter filtriert werden, in dem die Kopien der Ziel- Nucleinsäuremoleküle wenn erforderlich hybridisiert werden und an Teilchen im Behälter oder an Teilchen, die dem Behälter zugegeben werden, nach der Hybridisierung über die modifizierten Primer, mittels denen sie polymerisiert wurden, fixiert werden, und durch nachfolgendes Filtrieren der Teilchen und Durchführen von Waschungen in einer geeigneten Zahl im gleichen Behälter und durch Bestimmen der Ziel-Nucleinsäure durch eine für den gegebenen Fall geeignete Methode.
Das Fixieren der Ziel-Nucleinsäure an die Teilchen wird z.B. durchgeführt, indem man die Ziel-Nucleinsäure mit einer Nucleinsäuresonde, die an das Teilchen fixiert werden kann, hybridisieren läßt, oder indem man die Nucleinsäuresonde, die mit der Ziel-Nucleinsonde hybridisiert ist, an den Teilchen fixiert, oder indem man Kopien der Ziel-Nucleinsäuremoleküle an die Teilchen durch die modifizierten Primer, mit deren Hilfe sie polymerisiert wurden, fixiert.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die in der Probe vorhandenen unlöslichen biologischen Verunreinigungen auf zweckmäßige Weise eliminiert werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber den Verfahren der Zentrifugation und Chromatographie sind die leichte Durchführbarkeit und Schnelligkeit der Waschungen. Außerdem sind die Waschungen effektiv, da die Teilchen sofort und vollständig in der Waschlösung resuspendiert werden. Ein Verlust von Teilchen, der bei dem Zentrifugationsverfahren immer auftritt, wird vermieden, weil die Filtrationen im gleichen Behälter stattfinden. Dies verbessert die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens.
Die Erfindung betrifft auch einen Reagenssatz (Kit) und eine Reagentienpackung zur Verwendung in dem beschriebenen Verfahren. Der Kit umfaßt einen Behälter, vorteilhafterweise eine Injektionsspritze zum einmaligen Gebrauch, in den die auf geeignete Weise vorbehandelten Teilchen und mindestens ein Filter, das an dem Behälter befestigt oder an ihm befestigt werden kann, vorhanden sind. Der Filter wird so ausgewählt, daß die Ziel-Nucleinsäure, die Detektor- und Einfangsonden und die Hybride hindurchlaufen, aber unlösliche biologische Verunreinigungen und Teilchen dies nicht tun. Der Filter kann auch ein Filtersystem, z.B. eine Filterkassette sein, in dem die Teilchen vorher eingebracht wurden. Die Reagentienpackung umfaßt zusätzlich zu dem vorstehend genannten Kit auch die auf geeignete Weise vorbehandelten Sonden und Primer für den bestimmten Fall. Sie kann auch andere Reagentien, die in dem Verfahren benötigt werden, mit ihren Verpackungen umfassen, z.B. Reagentien, die zur Bestimmung der Detektorsonde verwendet werden.
Die wichtigsten Hybridisierungsverfahren, für die das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, werden nachfolgend genauer beschrieben. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist jedoch nicht auf die nachfolgend beschriebenen Verfahren beschränkt; für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es klar, daß er das Prinzip des Verfahrens auch auf andere Hybridisierungsverfahren anwenden kann.
1. Durch Filtration verbesserte Lösungshybridisierung
Die Hybridisierung kann in Lösung unter bereits beschriebenen Bedingungen (GB 2169403) durchgeführt werden. Nach Hybridisierung wird die Reaktionslösung filtriert, wobei die Hybride und der Überschuß an Detektorsonde und Einfangsonde durch den Filter hindurchtreten, aber irgenwelche unlöslichen biologischen Verunreinigungen, die möglicherweise in der Hybridisierungslösung vorhanden sind, zurückgehalten werden. Die im Filter verbleibenden Hybride können, wenn erforderlich, durch Spülen des Filters mit einer Hybridisierungslösung, die keine Nucleinsäuren enthält, gewonnen werden. Danach werden die Hybride auf Teilchen unter Bedingungen fixieren gelassen, die ausgewählt sind auf der Basis des im Verfahren verwendeten Affinitätspaares.
Alternativ kann die Hybridisierung nach der Filtration durchgeführt werden. In diesem Fall ist es besonders vorteilhaft, die Teilchen erst nach der Hybridisierung zuzugeben, da die Zugabe der Teilchen vor der Hybridisierung einen schädlichen Effekt auf die Kinetik der Hybridisierung haben kann.
Nach dem Fixieren werden die Teilchen von der Hybridisierungslösung durch Filtration abgetrennt, und ein Überschuß an Detektorsonde von den Teilchen abgewaschen, indem man die Waschflüssigkeit in Filtrationsschritten in der gewünschten Anzahl durch ein Filter filtriert.
Die weiteren mit der Bestimmung von Hybriden zusammenhängenden Stufen hängen von der in einem bestimmten Fall ausgewählten Bestimmungsmethode ab. Wenn eine radioaktive Detektorsonde verwendet wird, kann die Messung direkt an den Teilchen oder den Filtern durchgeführt werden, oder die Detektorsonde kann von den Teilchen unter Verwendung von z.B. Natriumhydroxid abgelöst werden.
Eine Elution mit Natriumhydroxid dient als zusätzliche Waschung, die die Empfindlichkeit der Untersuchung erhöht und leicht durch Filtration durchführbar ist. Wenn eine enzymatische Bestimmung verwendet wird, wird die Farbstofflösung von den Teilchen nach Reaktion abgetrennt und gemessen.
Ein Weg zur Durchführung des Verfahrens wird in den Figuren a bis g (Figur 1) dargestellt, worin die Hybridisierungslösung mittels einer Injektionsspritze filtriert wird.
Die Stufen des Verfahrens sind:
Stufe (a) Hybridisierung der Detektorsonden (1), Einfangsonden (2) und der Ziel-Nucleinsäure (3) wird in einem getrennten Behälter durchgeführt;
Stufe (b) Wenn erforderlich, werden Teilchen (4) zugefügt und ein Filter (5) mit der Spritze (6) verbunden.
Stufe (c) Die Hybridisierungslösung wird in die Spritze gesaugt.
Stufe (d) Wenn erforderlich, wird das Filter gespült, indem man ein Hybridisierungslösung (7), die keine Nucleinsäuren enthält, hindurchzieht.
Stufe (e) Die Hybride werden an die Teilchen unter Bedingungen fixiert, die zur Bildung eines Affinitätspaares vorteilhaft sind.
Stufe (f) Die Hybridisierungslösung wird von den Teilchen abgetrennt, indem man die Spritze leert, und die Teilchen in der Spritze werden von unhybridisierten Detektorsonden unter Verwendung einer Waschflüssigkeit (8) freigewaschen.
Stufe (g) Die Detektorsonden werden von den Teilchen in ein Eluens (9) eluiert, und die Detektorsonden werden aus dem Überstand bestimmt. Alternativ kann Stufe (g) ersetzt werden durch direkte Bestimmung der Detektorsonden an den Teilchen oder den Filtern.
Die Reagentienpackung enthält mindestens zwei gegenseitig nichthomologe Sonden, die dazu fähig sind, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, wobei mindestens eine der Sonden, die Detektorsonde, mit einer Stelle oder einer Komponente versehen ist oder mit einer Komponente versehen werden kann, die eine Affinität zu einer anderen Komponente besitzt. Zusätzlich enthält die Packung mindestens ein Filter und einen Behälter, vorzugsweise eine Injektionsspritze, der/die einen Filter besitzt, oder mit dem Filter verbunden werden kann, und Teilchen, an die die vorstehend erwähnte ander Komponente fixiert ist.
2. Lösungshybridisierungsverfahren, das durch Filtration verbessert ist und in dem ein modifizierter Primer als Detektorsonde verwendet wird.
Die Ziel-Nucleinsäuremoleküle werden, wie bereits beschrieben (Patentanmeldung GB-A-2202328) unter Verwendung von zwei Primern kopiert, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel- Nucleinsäure sind und mit einem bestimmbaren Marker versehen oder mit einem solchen versehen werden können. Danach wird die Hybridisierung zwischen den Ziel-Nucleinsäuremolekülkopien, die mit den modifizierten Primern versehen sind, und der Einfangsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit ihnen zu hybridisieren, und mit einer Stelle oder einer Komponente versehen ist, oder dazu fähig ist, mit einer Komponente versehen zu werden, die eine Affinität für eine andere Komponente besitzt, durchgeführt. Die Einfangsonde darf nicht homolog zu den im Verfahren verwendeten modifizierten Primern sein. Die Hybridisierungslösung wird in einen Behälter, vorzugsweise eine Injektionsspritze, filtriert, in der das Fixieren an Teilchen stattfinden soll. Der Filter wird, wenn erforderlich, gewaschen, und danach werden die Hybride unter geeigneten Bedingungen an die Teilchen fixieren gelassen. Wenn die Hybridisierung nicht erst nach der Filtration durchgeführt wird, werden die Teilchen vorzugsweise erst nach der Hybridisierung zugegeben.
Nach der Fixierung werden die Teilchen von der Hybridisierungslösung und von einem Überschuß an modifiziertem Primer abgetrennt, indem man eine Filtration und eine gewünschte Anzahl an Waschstufen durchführt. Die Bestimmung kann entweder direkt mit den Teilchen oder dem Filter durchgeführt werden, oder durch Elution der Kopien der Ziel-Nucleinsäuremoleküle, die mit modifizierten Primern versehen sind, von den Teilchen und Bestimmen des Markers aus dem Überstand.
Die Reagentienpackung umfaßt zwei Primer, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und die mit einem bestimmbaren Marker versehen sind oder dazu geeignet sind, mit einem solchen versehen zu werden, und eine Nucleinsäuresonde, d.h. eine Einfangsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und die mit einer Stelle oder einer Komponente versehen ist, oder dazu fähig ist, mit einer Komponente versehen zu werden, die eine Affinität für eine andere Komponente besitzt und nicht homolog ist mit dem vorstehend erwähnten modifizierten Primer. Zusätzlich enthält die Packung mindestens ein Filter und einen Behälter, vorzugsweise eine Injektionsspritze, der/die ein Filter aufweist oder mit einem solchen verbunden werden kann, und Teilchen, an die die vorstehend erwähnte andere Komponente fixiert ist.
3. Durch Filtration verbessertes Lösungshybridisierungsverfahren, das einen modifizierten Primer als Einfangsonde verwendet.
Die Ziel-Nucleinsäuremoleküle werden nach dem bereits beschriebenen Verfahren (Patentanmeldung GB-A-2202328) kopiert unter Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind und mit einer Stelle oder Komponente versehen sind, oder mit einer Komponente versehen werden können, die eine Affinität für eine andere Komponente besitzt. Die Hybridisierung wird durch die Ziel-Nucleinsäuremolekülkopien, die mit modifizierten Primern versehen sind, und eine Detektorsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit ihnen zu hybridisieren und mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder versehen werden kann, durchgeführt. Die Detektorsonde darf nicht homolog mit den im Verfahren verwendeten modifizierten Primern sein. Die Hybridisierungslösung wird in einen Behälter, vorteilhafterweise eine Injektionsspritze, filtriert, der Filter, wenn erforderlich, gewaschen und die mit modifizierten Primern versehenen Ziel- Nucleinsäuremolekülkopien werden an die Teilchen fixiert. Wenn Hybridisierung erst nach der Filtration durchgeführt wird, werden die Teilchen vorzugsweise erst nach der Hybridisierung dem Behälter zugegeben.
Nach dem Fixieren werden die Teilchen von der Hybridisierungslösung und einem Überschuß von Detektorsonden mittels Filtrieren und Durchführung einer gewünschten Zahl von Waschstufen getrennt, und die Bestimmung wie vorstehend unter Punkt (1) angegeben, durchgeführt.
Die Reagentienpackung enthält zwei Primer, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und died mit einer Stelle oder einer Komponente versehen sind oder mit einer Komponente versehen werden können, die eine Afffinität für eine andere Komponente besitzt, und eine Nucleinsäuresonde, d.h. eine Detektorsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und die mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann, und die nicht homolog zum modifizierten Primer ist. Zusätzlich enthält die Packung mindestens einen Filter und einen Behälter, vorteilhafterweise eine Injektionsspritze, der/die den Filter enthält oder mit ihm verbunden werden kann, und Teilchen, an die die vorstehend erwähnte andere Komponente fixiert ist.
4. Durch Filtration verbessertes Sandwich-Hybridisierungsverfahren
Eine Hybridisierungslösung, die gegenseitig prehybridisierte oder vorzugsweise unhybridisierte Ziel-Nucleinsäuremoleküle und Detektorsonden enthält, wird filtriert, um unlösliche biologische Verunreinigungen zu entfernen. Die im Filter verbleibenden Ziel-Nucleinsäuremoleküle können, wenn erforderlich, durch Spülen des Filters mit der Hybridisierungslösung, die keine Nucleinsäuren enthält, gewonnen werden. Danach wird die Hybridisierung zwischen der Ziel-Nucleinsäure und den auf Teilchen fixierten Einfangsonden durchgeführt, und gleichzeitig die Hybridisierung zwischen der Ziel-Nucleinsäure und den Detektorsonden, wenn keine Pre-Hybridisierung durchgeführt wurde. Schließlich werden die Teilchen von der Hybridisierungslösung mittels Filtration abgetrennt, und die Bestimmung entweder direkt mit den Teilchen oder mit der Waschlösung durchgeführt, wie dies vorstehend im Hinblick auf die Lösungshybridisierung beschrieben wurde.
Die Figuren a-f (Figur 2) stellt ein Verfahren unter Verwendung einer Injektionsspritze dar.
Stufe (a) Wenn erforderlich, werden die Teilchen (2), an die die Einfangsonde (3) fixiert wurde, in die Injektionsspritze eingebracht. Der Filter (4) wird ebenfalls installiert.
Stufe (b) Die die Ziel-Nucleinsäure (5) und die Detektorsonde (6) enthaltende Hybridisierungslösung wird in die Spritze gesaugt.
Stufe (c) Wenn erforderlich wird das Filter gespült, indem man eine Hybridisierungslösung (7), die keine Nucleinsäure enthält, hindurchsaugt.
Stufe (d) Die Hybridisierung wird durchgeführt.
Stufe (e) Die Hybridisierungslösung wird von den Teilchen abgetrennt, indem man die Spritze leert und die Teilchen in der Spritze werden von unhybridisierten Sonden unter Verwendung einer Waschflüssigkeit (8) freigewaschen.
Stufe (f) Die Detektorsonden werden von den Teilchen in ein Eluens (9) eluiert, und die Detektorsonden aus dem Überstand bestimmt.
Die vorstehend beschriebene Ausführungsform ist nur eine beispielhafte, und mit ihrer Hilfe sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet auch andere Ausführungsformen vorstellbar. Die Stufe (a) kann ganz weggelassen werden, wenn die Teilchen und der Filter bereits vorher fixiert wurden. Vor Stufe (c) ist es möglich, eine Pre-Hybridisierung durchzuführen, in der die Ziel-Nucleinsäure und die Detektorsonde miteinander hybridisiert werden. Wie bei der Lösungshybridisierung kann Stufe (f) ersetzt werden durch eine direkte Bestimmung der Detektorsonde an den Teilchen.
Die im Verfahren zu verwendende Reagentienpackung enthält mindestens zwei gegenseitig nicht-homologe Sonden, die dazu fähig sind, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und mindestens eine von ihnen, die Detektorsonde, ist mit einem bestimmbaren Marker versehen oder kann mit einem solchen versehen werden, und mindestens eine, die Einfangsonde, ist an die Teilchen fixiert. Zusätzlich enthält die Packung mindestens einen Filter und einen Behälter, vorzugsweise eine Injektionsspritze, der/die den Filter umfaßt oder mit ihm verbunden werden kann.
5. Durch Filtration verbesserte Festträger-Hybridisierung unter Verwendung eines modifizierten Primers als Detektorsonde
Die Ziel-Nucleinsäuremoleküle werden unter Verwendung von zwei mit den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure modifierten Primern, die mit einem bestimmbaren Marker versehen sind oder mit einem solchen versehen werden können, kopiert. Die Nucleinsäurelösung wird in einen Behälter, vorzugsweise in eine Injektionsspritze, filtriert, und der Filter, wenn erforderlich, mit einer Hybridisierungslösung, die keine Nucleinsäuren enthält, gewaschen. Die Hybridisierung wird durchgeführt zwischen den Ziel-Nucleinsäuremolekülkopien, die mit modifizierten Primern versehen sind, und der Nucleinsäuresonde, die an ein Teilchen fixiert ist und dazu fähig sind, selektiv mit den Kopien zu hybridisieren. Die Nucleinsäuresonde darf nicht homolog zu den modifizierten Primern sein. Als nächstes werden die Teilchen von der Hybridisierungslösung und einem Überschuß an modifiziertem Primer durch Futrieren und Durchführung von Waschstufen in einer gewünschten Anzahl abgetrennt. Die Bestimmung wird entweder direkt an den Teilchen vorgenommen, oder durch Elution der Ziel-Nucleinsäuremolekülkopien, die mit modifizierten Primern versehen sind, und Bestimmen des Markers im Überstand.
Die Reagentienpackung enthält zwei Primer, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und mit einem bestimmbaren Marker versehen sind oder damit versehen werden können, und eine Nucleinsäuresonde, d.h. eine Einfangsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und die an Teilchen fixiert ist und nicht mit den vorstehend genannten modifizierten Primern hornolog ist. Zusätzlich enthält die Packung mindestens einen Filter und einen Behälter, vorzugsweise eine Injektionsspritze, der/die den Filter umfaßt oder mit dem/der der Filter verbunden werden kann, und Teilchen, an die die vorstehend erwähnte andere Komponente fixiert wurde.
Die praktische Durchführung des Lösungshybridisierungsverfahrens wird nachstehend mit Hilfe des Beispiels 1 beschrieben.

Beispiel 1

Gewinnung von Hybriden in der Lösungsmittelhybridisierung mittels der Pandex-Avidin-Filtrationsmethode.

Materialien

Die verwendeten festen Träger sind Polystyrolteilchen, die Avidinbeschichtet sind (Epicon Avidinpolystyrene Assay Particles, Pandex Laboratories, Inc., USA). Der Durchmesser der Teilchen beträgt im Durchschnitt 0,8 µm, und aufgrund ihrer geringen Größe bleiben sie in der Lösung gleichmäßig verteilt. Die Teilchen sind als 5 % (w/v) Suspension erhältlich. Um freies Avidin zu entfernen, werden die Teilchen vor der Verwendung einer Ultraschallbehandlung unterworfen und einmal gewaschen.
Zur Filtration der Hybridisierungslösung und der Abtrennung der festen Trägerteilchen aus der Lösung werden Polyvinyldifluoridfilter mit einer Porengröße von 0,45 um (Millex-HV&sub1;&sub3;, Millipore) verwendet.
Die Hybride werden an die Teilchen in 1 µl Einmal-Spritzen fixiert, in denen die Waschungen auf zweckmäßige Weise durchgeführt werden können.

Hybridisierung

Die Ziel-DNA war das Plasmid pBR-322, unter Verwendung von EcoRI- Enzym lineariziert. Die verwendeten Detektorsonden waren ³²P-markiertes Plasmid pKTH 1300. Die verwendeten Einfangsonden waren photobiotinylierte Phagen mKTH 1301 und 1302. Die Herstellung der Detektorsonden und der Einfangsonden wurde im Journal of Biotechnology, Band 5 (1987) 267-277 beschrieben. Die Hybridisierung findet in 120 µl einer Lösung statt, die in dieser Menge die folgenden Mengen an Reagentien enthält: Ziel-DNA 10&sup8;, 10&sup9; oder 10¹&sup0; Moleküle, radioaktive Sonde 4,6 x 10&sup5; cpm, d.h. 7 x 10&sup8; Moleküle, und biotinyliertes mKTH 1301 und 1302 jeweils 1 x 10¹&sup0; Moleküle. Zusätzlich enthält die Hybridisierungslösung Natriumchlorid, 0,6 M, Natriumphosphat 20 mM, EDTA 1 mM, und Natriumdodecylsulfat (SDS) 0,1 %. Die Hybridisierungsdauer betrug 3 Stunden und die Temperatur 65 ºC.

Gewinnung der Hybride

20 µl einer Ultraschall-behandelten, einmal gewaschenen 5 %-igenr Suspension von Pandex-Avidin-Teilchen wurden in 1 ml Einmal-Spritzen gegeben. Danach wurden Millex HV&sub1;&sub3;-Filtereinheiten in den Spritzen angebracht und 120 µl der Reaktionslösung in die Spritzen gesaugt. Um die Hybride von den Filtern zu waschen wurden zusätzlich 120 µl einer DNA- freien Hybridisierungslösung in die Spritze gesaugt, wonach das Gesamtvolumen in den Spritzen 260 µl betrug. Das Fixieren der Hybride an die Teilchen erfolgt bei 37 ºC während 15 Minunten in einer "End-over- End"-Mischvorrichtung. Nach dem Fixieren wurden die Teilchen mit einer Waschlösung gewaschen, die Natriumchlorid, 15 mM, Natriumcitrat, 1,5 mM und SDS, 0,2 % enthielt, und deren Temperatur 50 ºC betrug. Die Teilchen wurden anfänglich fünfmal gewaschen, indem man die Spritze voll mit Waschlösung saugte (1 ml), und die Lösung sofort wieder ausdrückte. Zusätzlich wurden sie zweimal gewaschen, indem man die Waschlösung jeweils zwei Minuten lang einwirken ließ. Nach den Waschungen wurde die Detektorsonde aus den Hybriden eluiert, indem man in die Spritze 125 µl einer Lösung, die Natriumhydroxid, 0,2 M und EDTA, 1 mM, enthielt, saugte. Die Lösung wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur einwirken gelassen, und dann die Behandlung einmal wiederholt. Zu den Natriumhydroxid- Überständen wurden 2 ml AquasolR-Scintillationsflüssigkeit zugegeben, und ihre Radioaktivität unter Verwendung eines ß-Zählers gemessen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
¹) Zahl der Moleküle
²) cpm ist ein Mittel aus drei parallelen Bestimmungen; das durch die 0- Probe erhaltene Signal (573 cpm) wurde von der spezifischen cpm abgezogen.

Beispiel 2

Gewinnung von Hybriden in einer Sandwich-Hybridisierung an Mikroteilchen durch Filtration

Reagentien

Die Sandwich-Hybridisierungreagentien waren von dem 4,2 kb kryptischen Plasmid (pJD1) von Neisseria gonorrhoeae abgeleitet (C. Korch, P. Hagblom & S. Normark (1983); Sequence-specific DNA modification in Neisseria gonorrhoeae, Journal of Bacteriology 155, 1324-32). Das rekombinante Plasmid F101/pUM1, das das N. gonorrhoeae kryptische Plasmid in pBR322 enthielt, wurde als Ziel-DNA verwendet. Das rekombinante Plasmid pKTH1368, das ein 1,3 kb HinfI-TaqI-Fragment des N. gonorrhoeaekryptischen Plasmid in Plasmid pAT153 enthielt, wurde als Einfangsonde verwendet. Die rekombinanten Phagen mKTH 1369 und mKTH 1370 (beide Polaritäten), die ein ein 1,7 kb HinfI-HinfI-Fragment im M13 mp10-Phagen enthielten, wurden als Detektorsonde verwendet. Die Ziel-DNA (F101/pUM1) wurde mit EcoRI linearisiert.

Markierung

Die als Detektorsonden verwendeten Phagen mKTH1369 und mKTH1370 wurden mit [α-³²P]dCTP (Amersham, U.K.) durch Primerextension mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I auf eine spezifische Aktivität von ca. 108 cpm/µg markiert. Das Plasmid pKTH 1368, das als Tracer zur Quantifizierung der Menge der an die Mikroteilchen gebundenen Plasmid-DNA verwendet wurde, wurde durch Nick-Translation (12) mit [α-³²P]dCTP bis zu einer spezifischen Aktivität von ca. 10&sup8; cpm/µg markiert.

Kupplung der Einfangsonden an Mikroteilchen

Die Einfangsonde wurde an gleichmäßige Polystyrol-Mikroteilchen (0 bis 4,5 µm), die an ihrer Oberfläche sekundäre Hydroxygruppen enthielten, gebunden. Die Hydroxygruppen auf der Oberfläche der Teilchen wurden durch Zugabe von 0,29 g (1,5 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid un 60 µl (0,75 mmol) Pyridin zu 30 mg Teilchen in 1 mi Aceton durch End-over-End-Inkubierung bei Raumtemperatur 20 Stunden aktiviert. Die Teilchen wurden durch Waschen in Aceton mit steigenden H&sub2;O-Konzentrationen in eine wässerige Lösung überführt. Schließlich wurden die Teilchen einmal mit 0,2 M Boratpuffer, pH = 9,5, gewaschen und dann in einer Konzentration von 30 mg/ml suspendiert. Das Plasmid pKTH 1368 wurde durch Kochen in 0,2 M NaOH während 5 Minuten denaturiert und fragmentiert. 10 µg pKTH1368 wurden mit 1 mg aktivierten Perlen in 75 µl 0,2 M Boratpuffer, pH = 9,5, bei Raumtemperatur während 18 Stunden durch End-over-End-Rotation inkubiert. Die Teilchen wurden von der Lösung durch Zentrifugation abgetrennt. Die Menge an gekuppelter DNA wurde unter Verwendung von radioaktiv markiertem pKTH 1368 als Tracer bestimmt. Die unumgesetzten p- Toluolsulfonylgruppen wurden mit 1 M Tris-HCl-Puffer, pH = 9,0, bei Raumtemperatur während 4 Stunden blockiert. Die Perlen wurden in 0,05 M Tris-HCl, pH = 7,5, 0,1 M NaCl und 0,01 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 30 mg/ml suspendiert und bei + 4 ºC gelagert.

Hybridisierung und Gewinnung der Hybride

Die Hybridisierungsreaktion wurde in 1 ml Einweg-Spritzen, die Millex HV&sub1;&sub3;-Filtereinheiten (Filter wie im Beispiel 1) enthielten, durchgeführt, indem man in die Spritzen 1 mg der Teilchen pro Bestimmung gab, was 3,7 x 10¹&sup8; Moleküle an Einfangsonde (61 fmol) entspricht. Als Detektorsonden wurden 2 x 10&sup8; Moleküle, 300 000 cpm (0,3 fmol) von ³²P- markiertem mKTH1369 und mKTH1370 pro Umsetzung verwendet. 70 µl der Reaktionslösung, die 0,6 M NaCl, 60 mM Natriumcitrat, pH = 7,6 (4 x SSC), 20 mM Natriumphosphat und 0,25 % SDS, Detektorsonden und die in der nachfolgenden Tabelle angegebene Menge an Ziel-DNA enthielt, wurden in die Spritzen gesaugt. Zur Spülung der Ziel-DNA von den Filtern wurden 30 µl DNA-freier Hybridisierungslösung zusätzlich in die Spritze gesaugt, wonach das Gesamtvolumen in den Spritzen 100 µl betrug. Die Hybridisierungszeit betrug 5 Stunden und die Temperatur betrug 65 ºC. Nach der Hybridisierung der Teilchen wurden die Teilchen fünfmal bei 55 ºC mit 0,1 SSC, 0,2 % SDS durch Saugen der Lösung durch die Filter gewaschen. Nach der Waschung wurde die Elution der Hybride und die Bestimmung wie vorstehend beschrieben (vgl. Beispiel 1) durchgeführt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
*) Zahl der Moleküle
**) cpm ist ein Mittelwert aus vier parallelen Bestimmungen; das von der 0-Probe erhaltende Signal (90 cpm) wurde von der spezifischen cpm abgezogen.

Beispiel 3

Gewinnung von Hybriden in der Hybridisierungslösung durch die Pandex-Avidin-Filtrationsmethode unter Verwendung eines modifizierten Primers als Detektorsonde

Materialien und Reagentien

Die verwendeten festen Träger, Filter und Behälter waren die gleichen wie im Beispiel 1. In diesem Modellexperiment war das Ziel ein rekombinantes Plasmid (pBR322/CMV HindIII L), das ein 12,3 kb-Fragment des Cytomegalovirus (CMV, AD 169, ATCC VR-538) Genom beherbergt. Die zwei verwendeten Detektorprimer (Pa, Pb, Fig.3) waren 20 Nucleotide lang und wurden nach Standardverfahren in einem automatischen Synthesizer synthetisiert. Sie entsprachen zwei Regionen auf dem CMV-spezifischen Insert, die 111 Nucleotide entfernt waren. Zwei selektive Einfangsonden (S&sub1;, S&sub2;, Fig.3) erkannten Regionen an jedem der zwei Stränge zwischen den zwei Detektorprimern. Die Detektorprimer Pa und Pb wurden mit ³²P an ihren 5'-Enden bis zu einer spezifischen Aktivität von 4 x 10&sup9; CPM/µg unter Verwendung der allgemein bekannten Reaktion mit Polynucleotidkinase und γ-³²P-ATP markiert (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
An die 3'-Enden der Einfangsonden wurden unter Verwendung von bio 11-duTP (BRL) und terminaler Transferase (Promega Biotech.) wie von Riley et al., DNA 5 (4) (1986), Seiten 333-337 beschrieben biotinylierte Nucleotide addiert. Das Ziel-Plasmid wurde unter Verwendung des Enzyms EcoRI linearisiert. DNA-Polymerase, Klenow-Fragment wurde von Boehringer- Mannheim bezogen.

Kopieren der Ziel-DNA

Es wurden vier verschiedene Reaktionsansätze gemacht, die 0, 10&sup4;, 10&sup6; und 10&sup8; Moleküle (entsprechend 2 x 10&supmin;²&sup0;, 2 x 10&supmin;¹&sup8; und 2 x 10&supmin;¹&sup6; Mol) der Ziel-DNA enthielten. Zusätzlich enthielten alle vier Reaktionsansätze in einem Gesamtvolumen von 50 µl: 2 pmol von jedem der zwei Primer, 0,5 mM jedes der vier Deoxynucleosidtriphosphate (das sind dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 10 mM Tris-CL pH = 7,5, 10 mM MgCl&sub3;, 50 mM NaCl und 10 mM Dithiotreitol. Die Mischung wird zwei Minuten lang auf 100 ºC erhitzt, dann 5 Minuten bei 37 ºC inkubiert, danach 1 µl (entspricht 1 Einheit) DNA-Polymerase zugegeben. Die Mischung wurde dann wieder 10 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Kochen und nachfolgende Annelierung der Detektorprimer und Inkubation mit zugegebener DNA-Polymerase bei 37 ºC bilden den DNA-Synthesezyklus. Der Zyklus wurde 16-mal wiederholt.

Hybridisierung

Nach dem letzten Zyklus wurde die Probe wieder auf 100 ºC erhitzt und danach 10 pmol der selektiven Einfangsonde zusammen mit NaCl (0,9 M), EDTA (2mM), Natriumphosphat, pH = 7,5 (20 mM) und Natriumdodecylsulfat (0,1 %) zugegeben.
Das Volumen stieg auf 100 µl and und die angegebenen Konzentrationen sind Endkonzentrationen. Die Hybridisierungsdauer betrug 1 Stunde und die Temperatur 50 ºC.

Gewinnung der Hybride

Pandex-Avidin-Teilchen wurden in 1 ml Einweg-Spritzen gegeben und wie im Beispiel 1 beschrieben Millex MV&sub1;&sub3;-Filtereinheiten in den Spritzen angeordnet. 100 µl der Reaktionslösung wurde in die Spritzen eingesaugt. Um die Hybride vorn Filter zu spülen wurden 120 µl DNA-freie Hybridisierungslösung zusätzlich in die Spritze gesaugt, wonach das Gesamtvolumen in den Spritzen 240 µl betrug. Die Fixierung der Hybride an die Teilchen und das Waschen der Teilchen wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt. Nach den Waschungen wurden die mit modifizierten Primern versehenen Kopien der Ziel-Nucleinsäuremoleküle wie im Beispiel 1 bestimmt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
a) Mittel aus zwei Bestimmungen
b) ND - nicht bestimmbar (geringere Radioaktivität als zweimal mittlere Hintergrundaktivität)

Beispiel 4

Gewinnung von Hybriden in der Lösungsmittelhybridisierung durch das Pandex-Avidin-Filtrationsverfahren unter Verwendung eines modifizierten Primers als Einfangsonde.
Die verwendete Ziel-DNA und die Materialien und Reagentien waren die gleichen wie im Beispiel 3, mit den folgenden Ausnahmen: Die Einfangprimer (Pa, Pb, Figur 3) waren nicht mit ³²P markiert, sondern ihre 5'-Enden waren so modifiziert, daß sie einen Biotin-Rest enthielten.
Diese chemische Modifizierung wurde unter Verwendung bekannter, von Chollet und Kawashima, Nucleic Acids Research, 13 (1985) 1529-1541, beschriebenen Methoden durchgeführt. Die zwei selektiven Sonden (S&sub1; und S&sub2;, Figur 3) waren in diesem Fall an ihren 5'-Enden markiert, um als Detektorsonden zu wirken. Ihre spezifischen Aktivitäten betrugen ca.
2 x 10&sup9; bzw. 2,5 x 10&sup9; cpm/µg.
Das Kopieren der Ziel-DNA und die Hybridisierung wurden wie im Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die biotinylierten Einfangprimer waren jedoch in der 10-fachen Mengen zugefügt, d.h. 20 pmol pro Reaktion. Wie im Beispiel 3 beschrieben wurden 16 Zyklen durchgeführt, wonach die Probe auf 100 ºC erhitzt wurde und je 0,5 pmol der ³²P-markierten Sonden S&sub1; und S&sub2; zugegeben wurden. Die Hybridisierung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie sie im Beispiel 3 beschrieben wurden, durchgeführt.
Die Hybride wurden dann wie im Beispiel 3 an Pandex-Avidin-Teilchen gesammelt, gewaschen und ihre ³²P-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
a) Mittel aus zwei Bestimmungen
b) ND - nicht bestimmbar

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Nucleinsäure durch Hybridisierung umfassend:

(a) Filtern einer Lösung, in der die Gegenwart einer Ziel-Nucleinsäure oder einer Kopie des Ziel-Nucleinsäuremoleküls bestimmt werden soll, in einen Behälter, um unlösliche Verunreinigungen aus der Lösung zu entfernen;

(b) Herstellen eines Konjugats eines unlöslichen Teilchens und einer hybridisierten Ziel-Nucleinsäure oder einer hybridisierten Kopie eines Ziel-Nucleinsäuremoleküls aus dem Filtrat im Behälter, wobei die hybridisierte Nudeinsure oder die Kopie des Moleküls an das Teilchen über eine Nucleinsäuresonde oder gegebenenfalls, im Fall einer hybridisierten Kopie des Moleküls, über einen Primer, mit dessen Hilfe die Kopie hergestellt wurde, gebunden ist;

(c) Trennen des Konjugats in dem Behälter von überschüssiger Sonde und/oder Primer durch Filtration und Waschen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter eine Injektionsspritze ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtration durch ein an der Düse der Injektionsspritze angebrachtes Filter erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend:

(a) Hybridisieren einer in der Lösung gegebenenfalls vorhandenen Ziel- Nucleinsäure mit einer Einfangsonde und einer Detektorsonde, und Filtrieren der hybridisierten Lösung, und gegebenenfalls Gewinnen des im Filter verbleibenden Hybrids durch Spülen des Filters;

(b) Fixieren des Hybrids im Filtrat auf ein unlösliches Teilchen, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung mittels Filtration und Waschen des Konjugats, um unhybridisierte Detektorsonde zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend:

(a) Filtrieren der Lösung, in der die Gegenwart der Ziel-Nucleinsäure bestimmt werden soll, gegebenenfalls Gewinnen der im Filter verbleibenden Ziel-Nucleinsäure durch Spülen des Filters, und dann Hybridisieren der gegebenenfalls im Filtrat vorhandenen Ziel-Nucleinsäure mit einer Einfangsonde und einer Detektorsonde;

(b) Fixieren des Hybrids im Filtrat auf einem unlöslichen Teilchen, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung mittels Filtration und Waschen des Konjugats, um nicht hybridisierte Detektorsonde zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend:

(a1) Kopieren einer vorhandenen Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und die mit einem bestimmbaren Marker versehen oder mit einem solchen versehen werden können;

(a2) Hybridisieren der Ziel-Nucleinsäurekopien mit einer Einfangsonde, die mit irgendeinem der Primer nicht homolog ist;

(a3) Filtrieren der hybridisierten Lösung, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und gegebenenfalls Gewinnen des im Filter verbleibenden Hybrids durch Spülen des Filters;

(b) Fixieren des Hybrids im Filtrat auf einem unlöslichen Teilchen mittels der Einfangsonde, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung durch Filtration und Waschen des Konjugats, um irgendwelchen nicht- hybridisierten Primer zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend:

(a1) Kopieren irgendeiner vorhandenen Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und die mit einem bestimmbaren Marker versehen sind oder damit versehen werden können;

(a2) Filtrieren der Lösung der Ziel-Nucleinsäurekopien, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und gegebenenfalls Gewinnen der auf dem Filter verbleibenden Ziel-Nucleinsäurekopien durch Spülen des Filters;

(a3) Hybridisieren der Ziel-Nucleinsäurekopien im Filtrat mit einer Einfangsonde, die mit irgendeinem der Primer nicht homolog ist;

(b) Fixieren des Hybrids auf einem unlöslichen Teilchen mittels der Einfangsonde, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung durch Filtration und Waschen des Konjugats, um irgendwelchen nichthybridisierten Primer zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend:

(a1) Kopieren irgendeiner vorhandenen Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung von zwei Primern, die zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel- Nucleinsäure komplementär sind;

(a2) Hybridisieren der Ziel-Nucleinsäurekopien mit einer Detektorsonde, die mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder mit einem solchen versehen werden kann, und die mit irgendeinem der Primer nicht homolog ist;

(a3) Filtrieren der hybridisierten Lösung, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und gegebenenfalls Gewinnen des in Filter verbleibenden Hybrids durch Spülen des Filters;

(b) Fixieren des Hybrids an einem unlöslichen Teilchen mittels eines Primers, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung durch Filtration und Waschen des Konjugats, um irgendeine nicht-hybridisierte Detektorsonde zu entfernen; und

(d) Bestimmung der Menge des vorhandenen Konjugats.

9. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend:

(a1) Kopieren irgendeiner vorhandenen Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind;

(a2) Filtrieren der Lösung der Ziel-Nucleinsäurekopien, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und gegebenenfalls Gewinnen der im Filter verbleibenden Ziel-Nucleinsäurekopien durch Spülen des Filters;

(a3) Hybridisieren der Ziel-Nucleinsäurekopien im Filtrat mit einer Detektorsonde, die mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann, und die mit irgendeinem der Primer nicht homolog ist;

(b) Fixieren des Hybrids auf einem unlöslichen Teilchen mittels eines Primers, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend:

(a) Filtrieren einer Lösung, die eine Detektorsonde umfaßt, und in der die Gegenwart einer Ziel-Nucleinsäure bestimmt werden soll, und gegebenfalls Gewinnen der auf dem Filter verbleibenden Ziel-Nucleinsäure durch Spülen des Filters;

(b) Hybridisieren der gegebenenfalls im Filtrat vorhandenen Ziel- Nucleinsäure mit einer Detektorsonde und einer Einfangsonde, wobei die Einfangsonde an einem unlöslichen Teilchen fixiert ist, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung durch Filtration und Waschen des Konjugats, um unhybridisierte Detektorsonde zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend:

(a) Pre-Hybridisieren einer gegebenfalls in der Lösung vorhandenen Ziel- Nucleinsäure mit einer Detektorsonde und Filtrieren der hybridisierten Lösung, und gegebenenfalls Gewinnen des im Filter verbleibenden Pre- Hybrids durch Spülen des Filters;

(b) Hybridisieren des Pre-Hybrids mit einer Einfangsonde, wobei die Einfangsonde auf einem unlöslichen Teilchen fixiert ist, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung durch Filtration und Waschen des Konjugats, um nicht hybridisierte Detektorsonde zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend:

(a1) Kopieren irgendeiner vorhandenen Ziel-Nucleinsäure unter Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind und die mit einem bestimmbaren Marker versehen sind oder damit versehen werden können;

(a2) Filtrieren der Lösung der Ziel-Nucleinsäurekopien, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und gegebenfalls Gewinnen der im Filter verbleibenden Ziel-Nucleinsäurekopien durch Spülen des Filters;

(b) Hybridisieren der gegebenfalls im Filtrat vorhandenen Ziel- Nucleinsäurekopien mit einer Nucleinsäuresonde, die mit irgendeinem Primer nicht homolog ist, und die an ein unlöslichen Teilchen fixiert ist, um ein Hybrid/Teilchen-Konjugat auszubilden;

(c) Abtrennen des Hybrid/Teilchen-Konjugats aus der Lösung durch Filtration und Waschen des Konjugats, um irgendeinen nicht-hybridisierten Primer zu entfernen; und

(d) Bestimmen der Menge des vorhandenen Konjugats.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5, 8, 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) die Detektorsonde vom Hybrid/Teilchen-Konjugat eluiert wird und die Menge der Sonde bestimmt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) die Ziel-Nucleinsäurekopien, die mit einem mit einem Marker versehenen Primer versehen sind, vom Hybrid/Teilchen-Konjugat eluiert werden und die Menge des Markers im Überstand bestimmt wird.

15. Verwendung eines Behälters, der Teilchen, die dazu fähig sind, einen Hybrid/Teilchen-Komplex mit einem Hybrid der Ziel-Nucleinsäure auszubilden, und mindestens ein Filter, das mit dem Behälter verbunden ist oder mit ihm verbunden werden kann, enthält, als Kit (Reagenzsatz) in einem in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten Bestimmungsverfahren.

16. Verwendung von mindestens zwei gegenseitig nicht-homologer Sonden, die dazu fähig sind, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, wobei mindestens eine der Sonden, die Detektorsonden, mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann, und mindestens eine, die Einfangsonde, mit einer Stelle oder einer ersten Komponente versehen ist, oder mit einer ersten Komponente versehen werden kann, die Affinität für eine zweite Komponente besitzt, und von mindestens einem Filter, einem Behälter, mit dem der Filter verbunden ist, oder mit dem der Filter verbunden werden kann, und Teilchen, an die die zweite Komponente fixiert worden ist, als Kit (Reagenzsatz) zur Bestimmung von Nucleinsäure in einem in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten Verfahren.

17. Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und mit einem Marker versehen sind oder versehen werden können; einer Nucleinsäure- Sonde, d.h. einer Einfangsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und die mit einer Stelle oder einer ersten Komponente versehen ist, oder mit einer ersten Komponente versehen werden kann, die eine Affinität für eine zweite Komponente besitzt, und die zu irgendeinem modifizierten Primer nicht homolog ist; und von mindestens einem Filter, einem Behälter, mit dem der Filter verbunden ist oder mit dem der Filter verbunden werden kann, und Teilchen, an die die zweite Komponente fixiert worden ist, als Kit (Reagenzsatz) zur Bestimmung von Nucleinsäure in einem in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten Verfahren.

18. Verwendung von mindestens zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäure sind, und die mit einer Stelle oder einer ersten Komponente versehen sind oder versehen werden können, die Affinität für eine zweite Komponente zeigt; einer Nucleinsäuresonde, d.h. einer Detektorsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und die mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann, und die mit irgendeinem Primer nicht homolog ist; und mindestens einem Filter, einem Behälter, mit dem der Filter verbunden ist oder mit dem der Filter verbunden werden kann; und Teilchen, an die die zweite Komponente fixiert worden ist, als Kit (Reagenzsatz) zur Bestimmung von Nucleinsäure in einem in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten Verfahren.

19. Verwendung von mindestens zwei gegenseitig nicht homologer Sonden, die dazu fähig sind, mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, wobei mindestens eine von ihnen, die Detektorsonde, mit einem bestimmbaren Marker versehen ist oder damit versehen werden kann, und die andere, die Einfangsonde, an Teilchen fixiert ist, und mindestens einem Filter und einem Behälter, mit dem der Filter verbunden ist oder mit dem der Filter verbunden werden kann, als Kit (Reagenzsatz) zur Bestimmung von Nucleinsäure in einem in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten Verfahren.

20. Verwendung von zwei Primern, die komplementär zu den gegenüberliegenden Polaritäten der Ziel-Nucleinsäuren sind, und die mit einem bestimmbaren Marker versehen sind oder damit versehen werden können; einer Nucleinsäuresonde, d.h. einer Einfangsonde, die dazu fähig ist, selektiv mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren, und die an Teilchen fixiert ist, und mit irgendeinem Primer nicht homolog ist; und von mindestens einem Filter und einem Behälter, mit dem der Filter verbunden ist oder mit dem der Filter verbunden werden kann; und von Teilchen, an die die Einfangsonde fixiert worden ist, als Kit (Reagenzsatz) zur Bestimmung von Nucleinsäure in einem in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten Verfahren.

21. Zur Verwendung zur Bestimmung von Nucleinsäure in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 geeigneter Kit (Reagenzsatz), umfassend eine Injektionsspritze, die Teilchen enthält, die dazu fähig sind, einen Hybrid/Teilchen-Komplex mit einem Hybrid der Ziel- Nucleinsäure auszubilden, und mindestens ein Filter, das mit dem Behälter verbunden ist oder mit ihm verbunden werden kann.