DE68923603T2

DE68923603T2 - Nukleotid Sonden.

Info

Publication number: DE68923603T2
Application number: DE68923603T
Authority: DE
Inventors: Chandler Dr Bahl; Leopoldo Mendoza
Original assignee: Ortho Diagnostic Systems Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1996-01-04
Anticipated expiration: 2009-12-16
Also published as: US5783685A; EP0373956A2; DE68923603D1; CA2005557A1; GR890100824A; EP0373956B1; US5324829A; ES2076219T3; JPH02245663A; ATE125545T1; EP0373956A3; US5521298A

Description

Spezifische Oligonucleotidsequenzen sind sehr brauchbare Werkzeuge beim Nachweis komplementärer Nucleotidsequenzen. Die zwei Bedingungen die eine Nucleinsäuresonde erfüllen muß, sind ein sequenzspezifisches Signal und die Bildung von Elementen, die einfache Hybridisierungsvorgänge in multiple. nachweisbare Vorgänge umwandeln. In derzeitigen enzymatischen Verfahren zur Herstellung markierter Sonden werden radioaktive oder biotinylierte Nucleotide in die Sonden eingeführt, wobei polymerisierende Enzyme, wie DNA-Polymerase oder Terminale Transferase, verwendet werden. Es sind auch Verfahren verfügbar, um einzelne Enzyme oder Haptenmoleküle chemisch in DNA einzuführen, jedoch erzeugen diese einzeln markierten Sonden kein ausreichendes Signal und weisen somit nicht die Empfindlichkeit auf, die zum Nachweis komplementärer Sequenzen in biologischen Proben notwendig ist.
Beispielsweise beschreiben Ward et al. im US-Patent Nr. 4.711,955 ein Verfahren zum Derivatisieren von Nucleotiden mit chemischen Determinanten. Die derivatisierten Nucleotide werden dann enzymatisch polymerisiert. Diese Analoge wirken daher als Substrate für Nucleinsäure-Polymerasen. Aus diesem Grund ist es entscheidend, daß die chemischen determinanten nicht auf Ringpositionen angeordnet werden, die sterisch oder auf andere Weise das normale Watson-Crick-Wasserstoffbindungspotential der Basen stören.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Alternative zu den aus dem Stand der Technik bekannten Synthesen von Nucleinsäuresonden bereit. Das hier beschriebene Verfahren ist eine chemische Synthese einer markierten "Nucleotidsonde", das die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen einer ersten Zielerkennungsgruppe, die eine Nucleotidsequenz von mindestens etwa 15 Nucleotidbasen umfaßt, wobei die Sequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende enthält;
b) Abändern der ersten Zielerkennungsgruppe mit einer Phosphatgruppe an dem 5'-Ende, dem 3'-Ende oder an beiden, um eine phosphorylierte Zielerkennungsgruppe zu bilden;
c) Aktivieren der Phosphatgruppe der phosphorylierten Zielerkennungsgruppe von Schritt b) mit Imidazol und Ethyl-dimethylamino-propylcarbodiimid;
d) Umsetzen der aktivierten Phosphatgruppe der phosphorylierten Zielerkennungsgruppe von Schritt c) mit epsilon-Aminocapronsäure, um eine Carboxylgruppe an dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende der Zielerkennungsgruppe bereitzustellen, wobei die Carboxylgruppe aus der Carboxylgruppe der epsilon-Aminocapronsäure gebildet wird;
e) Bereitstellen einer zweiten signalerzeugenden Gruppe, die eine Nucleinsäuresequenz umfaßt, die mindestens einen Terminus und eine Länge von etwa 50 bis etwa 200 Basen aufweist oder ein Polysaccharid, das mindestens einen erminus aufweist, und die aweite signalerzeugende Gruppe darüber hinaus einen daran gebundenen nachweisbaren Marker aufweist, und wobei der Terminus eine Hydroxylgruppe enthält, die in der Lage ist, mit der Carboxylgruppe zu reagieren, die sich auf der ersten Zielerkennungsgruppe befindet;
f) Chemisches Umsetzen der Carboxylgruppe auf der ersten Zielerkennungsgruppe mit der Hydroxylgruppe auf der zweiten signalerzeugenden Gruppe, um die erste Zielerkennungsgruppe und die zweite signalerzeugende Gruppe kovalent zu verbinden, wodurch die markierte Nucleotidsonde hergestellt wird.
In eingen Ausführungsformen sind einer oder beide Termini der signalerzeugenden Gruppe chemisch modifiziert, damit sie eine funktionelle Gruppe enthalten, die mit einer oder mit beiden der reaktiven funktionellen Gruppen der Zielerkennungsgruppe reagiert.
Die vorliegende Erfingung stellt auch markierte Nucleotidsonden bereit, die aus dieser chemischen Verbindung der beiden Komponenten gebildet sind sowie diagnostische und Untersuchungsreagenzien, die diese Sondon enthalten.
Der hier verwendete Begriff "Nucleotidsonde" bedeutet eine markierte Nuceotidsequenz, die als Teil jener Sequenz eine Gruppe aufweist, die zumindest teilweise, mit einer Nucleotidsequenz eines Analyten hybridisieren kann und zum Nachweisen, Überwachen, Lokalisieren, Isolieren der Analytsequenz und dergleichen hilfreich sein kann. Der Begriff sollte breit interpretiert werden, und Oligonucleotide, Homopolynucleotide, Polynucleotide und dergleichen umfassen.
Unter der Bezeichnung "Hybridisierung" ist hier eine komplementäre Basenpaabindung an die gesamte oder an einen Teil einer Zielsequenz einer Nucleinsäure zu verstehen, d. h. die Sonden müssen zumindest eine gewisse Komlementarität aufweisen. Man sollte sich daruuber im klaren sein, daß dieses Binden nicht perfekt passen muß. Tatsächlich können ungepaarte Bereiche vorliegen, die zu inneren Schleifen, bauchigen Schleifen, Haarnadelschleifen, Cruziformstrukturen und zu Bereichen mit anderen Basenfehlpaarungen führen. Hybridisierung raucht lediglich in dem Ausmaß einzutreten, das notwendig ist, um einen Nachweis des Zieles zu ermöglichen.
Der hier verwendete Begriff "Zielerkennungsgruppe" (TRM) bedeutet, daß ein Teil der Sonde mit der Analythprobe hybridisiert oder an diese bindet. Die Zielerkennungsgruppe umfaßt eine Nucleotidsequenz und kann eine beliebige geeignete Konfiguration annehmen, um an den Analyten zu binden, gleichgültig ob das nun eine spezifische Sequenz von Nucleotidbasen ist, eine Homopolynucleotidesequenz oder dergleichen.
Der hier verwendete Begriff "signalerzeugende Gruppe" (SGM) bedeutet, daß ein Teil der Sonde durch einen radioaktiven Marker, einen enzymatischen Marker, einen chemischen Marker, einen immunogenen Marker und dergleichen ein Signal erzeugen kann.
Der hier verwendete Begriff "Zielsquenz des Analyten" bezeichnet die gesamte oder einen Teil der Nucleinsäure, die in biologischem Material enthalten ist oder zu diesem gehört, das in einer biologischen, physiologischen, einer Umweltprobe oder gergleichen gefunden werden kann.
Die Begriffe "5'-Ende" und 3'-Ende" weisen die in der Fachwelt allgemein akzeptierte Bedeutung auf, nämlich daß das terminale Nucleotid an einem Ende einer Nucleotidsequenz eine freie 5'- oder 3'-Gruppe aufweist, wobei einer der an den Phosphor gebundenen Sauerstoffe sich frei mit entweder dem fünften bzw. dem dritten Kohlenstoffatom einer Pentose verbinden kann.
Die chemische Synthese der hier beschriebenen Sonden hat den Vorteil, daß eine kontrolliertere Menge an Markern in die signalerzeugende Gruppe aufgenommen wird. Daher kann eine Amplifikation des Signals auf einfache Weise erreicht werden. Der Marker kann an verschiedenen Stellungen auf der signalerzeugenden Gruppe angebracht werden, wenn diese Gruppe ein Polynucleotid ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die signalerzeugende Gruppe ein Polynucleotid und der arker ist an Stellungen auf dem Polynucleotid angebracht, die die Hybridisierungsfähigkeit dieses Nucleotids stören, wodurch sichergestellt wird, daß nur die Zielerkennungsgruppe mit dem Zielanalyten hybridisiert. Die signalerzeugende Gruppe darf nich nur nicht für Nucleinsäurehybridisierung verfügbar sein, in einigen Ausführungsformen kann die signalerzeugende Gruppe sogar andere Polymere als Polynucleotide unfassen und kann daher für eine Hybridisierung nicht verfügbar sein.

Kurze Beschreibung der Figur

FIGURE 1 ist eine schematische Darstellung einer erfingungsgemäßen Ausführungsform, wobei die Zielerkennungsgruppe so modifiziert ist, daß sie mindestens eine terminale funktionelle Carboxylgruppe enthält und dann mit einer signalerseugenden Gruppe mittels einer Esterverknüpfung umgesetzt wird, wobei eine Nucleotidsonde gebildet wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine markirte Nucleotidsonde bereit, die gemäß der chemischen Synthese einer markierten Nucleotidsonde durch eine chemische Verknüpfung oder Verbindung der beiden Komponenten der Sonde, nämlich der Sequenz der Zielerkennungsgruppe und der signalerzeugenden Gruppe, gebildet wird.
Die erste Komponente der erfindungsgemäßen markierten Nucleotidsonden ist die Sequenz der Zielerkennungsgruppe, die eine Nucleotidsequenz von mindestens etwa 10 Nucleotidbasen umfaßt. Diese Gruppe ist in der Lage, ganz oder teilweise mit dem Zielanalyten zu hybridisieren. Sie kann auf beliebie vielfältige Weisen bereitgestellt werden. Beispielsweise kann sie aus der genomischen DNA eines Organismusses, den man nachweisen möchte, isoliert werden, sie kann rekombinant hergestellt werden oder sie kann durch Standardverfahren der Oligonucleotidsynthese chemisch synthetisiert werden. Eine gute Beschreibung solcher geeigneter Verfahren für letzteres ist in Methods in Enzymology, Bank 154, Seiten 221-328, Academic Press N.J. 1987, Herausgeber Ray Wu und L. Grossman, zu finden. Es ist jede beliebige Konfiguration von Stickstoffbasen, einschließlich Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil oder Methylcytosin denkbar, um die Nucleotidsequenz dieser Gruppe zu bilden, solange die Gruppe zumindest in einem gewissen Ausmaß in der Lage ist, mit mindestens einem Teil der Nucleinsäure eines Analyten zu binden.
Ein Bindungsvorgang ist jege komplementäre Basenparrbindung, die in einem geeigneten Ausmaß stattfindet, um einen Nachweis des Zielanalyten zu erlauben. Im Hinblick darauf kann die Länge der Nucleotidsequenz der Zielerkennungsgruppe ebenfalls start variieren, und awar im Bereich von mehreren hundert Basen bis weniger als etwa 100 Basen, und vorzugsweise etwa 5 - 75, bevorzugt etwa 5 - 60, und am meisten bevorzugt 15 - 50 Basen. Derzeit sind diese zuletzt genante Sequenzlängen bevorzugt, da gefunden wurde, daß diese Länge einfach zu handhaben ist. Dies beruht allgemein auf dem Phänomen, daß Sequenzen im Bereich von 15 - 50 Nucleotidbasen auf einfache Weise bequem und kosteneffektiv zu synthetisieren sind und genügend Wasserstoffbindungskapazität aufweisen, um eine stabile, doppelsträngige Struktur zu ergeben, die verschiedene Manipulationen und Behandlungen übersteht. Sequenzen von mehr als etwa 100 Basen können sich während der Verwendung als schwierig herausstellen, da sie schwieriger zu synthetisieren sind, weniger kostengünstig sind und die Chancen, intramolekulare sekundäre Strukturen zu fördern, erhöhen. Es ist bekannt, daß unterhalb einer bestimmen Länge der Polynucleotidsequenz den Hybriden nur eine sehr geringe zusätzliche Stabilität verliehen wird. Der Fachmann ist sich darüber im klaren, daß eine stabile Sequenzlänge für diese bindende Gruppe in einem gewissen Ausmaß auch durch die Bindungseigenschaften der Analytsequenz selbst gesteuert wird.
Man sollte sich bewußt sein, daß es in manchen Fällen erwünscht sein kann, Derivate oder andere chemische Gruppen an verschiedenen Stellungen der Nucleotidsequenz der Zielerkennungsgruppe einzubauen, und zwar aus einer Reihe von Gründen, beispielsweise um direckt oder indirekt als Reportermoleküle zu dienen. Z. B, können Derivate wie 5-substituiertes Pyrimidin und 7-substituiertes Purin erwünscht sein. Sämtliche derartige Derivate gehören mit zu der Erfingung, solange die Addition solcher chemischer Derivate an verschiedenen Stellungen in er Sequenz die Bindung der Zielerkennungsgruppe an den Analyten nicht wesentlich beeinrächtigt.
Die zweite Komponente der Sonden ist die signalerzeugende Gruppe. Diese umfaßt eine Nucleinsäuresequenz, die mindestens einen Terminus und eine Länge von etwa 50 bis etwa 200 Basen aufweist oder ein Polysaccharid, das mindestens einen Terminus aufweist und ist darüber hinaus in der Lage, eine chemische Verknüpfung mit der Zielerkennungsgruppe zu bilden, und zwar durch eine Hydroxylgruppe auf mindestens einem Terminus. Von diesen Polymeren sind zur Verwendung in der signalerzeugenden Gruppe Nucleotidsequenzen bevorzugt. Dies kann darauf zurückgeführt werden, daß sie einfach zu synthetisieren und zu markieren sind und daß ihre Amplifikation einfach zu konrollieren ist. Die spezifische Sequenz dieser Nucleotidsequenzen kann stark variieren, solange sie einen Marker enthalten, der in der Lage ist, die Bindung des Teils der Zielerkennungsgruppe der Sonde an den Analyten anzuzeigen. Die Nucleotidsequenzen können DNA oder RNA sein. Einer der Hauptvorteile, der durch die bevorzugte signalerzeugende Gruppe, die Polynucleotidsequenz, erreicht wird, ist, daß für den Anwender Mehrfachmarker an definerten Stellen in der Sequenz bereitgestellt werden können. Dies ermöglicht dem Anwender eine größere Kontrolle als dies bislang möglich war. Die Markierung des Polymers in der signalerzeugenden Gruppe kann viele Formen aufweisen, einschließlich herkömmlicher Radioisotopenmarkierung, chemischer Markierung, immunogener Markierung oder einer Markierung mit Lichtstreuungsefekt.
Der Marker der signalerzeugenden Gruppe kann daher einen Radiomarker (z. B. ¹&sup4;C, ³²P, ³H, und dergleichen), ein Enzym (z. B. Peroxidase, alkalische oder saure Phosphatase und dergleichen), einen bakteriellen Marker, einen fluoreszierenden Marker, einen Antikörper (der in einem Doppelantikörpersystem verwendet werden kann), ein Antigen, (das mit einem markierten Antikörper zu verwenden ist), ein kleines Molekül, beispielsweise ein Hapten wie Biotin (Mit einem Avidin-, Streptavidin- oder Antibiotinsystem zu verwenden), ein Hapten wie Fluorescein, das mit einem Antifluorescein-Antikörper zu verwenden ist, ein Latezteilchen (in einem Auftriebs- oder Latez-Agglutinationssystem zu verwenden), einer Verbindung mit hoher Elektronendichte wie Ferritin (bei Elektronenmikroskopie zu verwenden) oder ein lichstreuendes Teilchen, wie kolloidales Gold, oder beliebige Kombinationen oder Permutationen davon, umfassen.
Das Signal wird durch die signalerzeugende Gruppe durch die verschiedensten herkömmlichen Techniken erzeugt. Wenn der Markierungsteil der signalerzeugenden Gruppe beispielsweise ein Antigen ist, kann ein Signal duch Komplezieren des Antigens mit einem Antiköper/Enzym-Konjugat erzeugt werden und anschließend ein Enzymsubstrat zugegeben werden. Wenn der markierende Teil der signalerzeugenden Gruppe ein Antiköper ist, kann ein Signal durch Komplexieren eines anti-Antikörpers oder eines Fo-bindenden Proteins, wie Protein A, mit diesem gebildet werden, wobei der zweite Antikörper oder Protein a bereits mit einem Enzym konjugiert worden sind.
Aus Gründen der Einfachheit und der Sicherheit bei der Handhabung der Probe ist es bevorzug, daß die signalerzeugende Gruppe chemisch, insbesondere immunogen oder enzymatisch markiert ist. In bevorzugteren Ausführungsformen ist der chemische Marker der Wahl ein Hapten wie Biotin, Iminobiotin, Fluorescein und dergleichen. Diese sind derzeit bevorzugt, da sie auf einfache Weise zu synthetisieren sind und Sekundärreagenzien mit hoher spezifischer Aktivität zu ihrer Verwendung zur Verfügung stehen. Beispielsweise kann die signalerzeugende Gruppe durch herkömmliche Techniken, wie die Behandlung mit einem Alkyldiamin, mit einem Hapten markiert werden. Aktivierte Haptene, wie Biotin-NHS-Ester, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und dergleichen können durch die fungktionellen Aminogruppen chemisch gebunden werden. Auf diese Weise wird die Menge des vorliegenden aktivierten Haptens durch fie Verfügbarkeit der funktionellen Aminogruppen gesteuert, die durch den Anwender durch die Behandlung mit dem Alkyldiamin zu diesem Zweck bereitgestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, in der die signalerzeugende Gruppe eine Nucleotidsequenz umfaßt, erzeugt die signalerzeugende Gruppe ein Signal, daß auf dem Biotin/Streptavidin-System beruht. Dieses System kan auf die verschiedensten Weisen in die signalerzeugende Gruppe eingebaut werden. Beispielsweise kann der Nucleotidteil der signalerzeugenden Gruppe mittels einer Cytochrom C-Brücke kovalent an Biotin gebunden werden (Manning et al, Biochemistry, 16: 1364 - 1370 (1977), Manning et al, Chromosoma, 53: 107 - 117 (1975), Sodja, A., Nucleic Acids Research, 5: 385 - 401 (1978), oder das Biotin kann kovalent in die spezifischen Nucleotidreste eingebaut werden (Langer, P.R., Proceedings of one National Academy of Sciences, USA, 78: 6633 - 6637 (1981) oder wie zuvor angedeutet, das Biotin kann mittels einer Diaminbrücke (z. B. Pentandiamin) an ein Polynucleotid gebunden werden (Broker, T.R., et al, Nucleic Acids Research 5: 363 - 384 (1978)). Dann läßt man die Biotinmoleküle in der signalerzeugenden Gruppe mit avidin, Streptavidin oder Antibiotin-Antikörpern wechselwirken, wobei das Avidin, Streptavidin oder die Antikörper mit signalgebenden Komponenten konjugiert werden, wie Latexteilchen (Sodja, A., et al, supra, oder Manning, eta al Chromosoma, supra), Ferritin (Broker, supra), einem Fluorogen wie Fluorescein, einem Enzym, sekundären Antikörpern, Magnetteilchen oder dergleichen.
Es sollte auch beachet werden, daß es die Funktion der signalerzeugenden Gruppe ist, das Vorliegen einer Bindung an einen Analyten anzuzeigen. Es ist daher unerwünscht, daß Nucleotide innerhalb dieser Gruppe mit dem Analyten oder irgendwelchen anderen Basen, die in einer zu untersuchenden Probe vorliegen können, zu hybridisieren, da dies jedes zu bildende Signal löschen kann. Es ist daher bevorzugt, die Cytosinbasen am vierten Kohlenstoffatom mit einem Hapten, wie Biotin, Iminobiotin, Fluroescein oder dergleichen zu substituieren, um die normale Hybridisierungsfunktion dieser Base zu verhindern.
Die signalerzeugende Gruppe ist kommersiell erhältlich oder sie kann aus jeder beliebigen geeigneten Quelle hergestellt werden, und zwar einschließlich denaturierter einzelsträngiger DNA aus natürlichen Quellen, RNA aus natürlichen Quellen, durch chemische Synthese von Oligonucleotiden, Polynucleotiden einschließlich Homopolynucleotiden und Homooligonucleotiden. Die Länge dieser Sequenz variiert auf eine Weise, die der erforderlichen Signalamplifikation und der Menge an Marker, der gebunden werden soll, entspricht. Es wurde jedoch gefunden, daß Längen von etwa 50- 200 besonders brauchbar sind, und zwar aufgrund der Amplifikation, die für den Nachweis biologischer Proben erforderlich ist der Grenzen, die der Synthese der langen Sequenz in der Praxis gesetzt sind. Man sollte sich auch darüber im klaren sein, daß sehr lange Schwänze dazu neigen, die Hybridisierungsgeschwindigkeiten zu beeinträchtigen. Bevorzugte Längen liegen im Bereich von etwa 50 bis etwa 200, am meisten bevorzugt sind etwa 100 bis etwa 150.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der 5'- oder 3'- Terminus der Nucleotidsequenz der Zielerkennungsgruppe oder beide chemisch verändert, um eine rektive funktionelle Gruppe aufzunehmen, die eine chemische Verküpfung dieser Zielerkennungsgruppe mit einem oder beiden Termini der zweiten Komonente der Sonde, der signalerzeugenden Gruppe, ermöglicht. Diese chemische Bindung der signalerzeugenden Gruppe and die Zielerkennungsgruppe, wobei die hier beschriebenen Sonden gebildet werden, ist gegenüber einer Dissoziation dieser beiden Gruppen bei der nachfolgeneden Verwendung der Sonden in Hybridisierungstests stabil. Mit anderen Worten, die beiden Komponenten der Sonde sollten sich bei Hybridisierung der Zielsequenz der Sonde mit dem Zielanalyten nicht voneinander trennen. Wenn die Sonde mit dem Zielanalyten hybridisiert ist, dann trägt sie somit die Signalgruppe mit sich, um diese Komplezierung zu markieren und die Markierung wird später nachgewiesen.
Bezugnehmend auf das in Figur 1 dargestellte Reaktionsschema ist die Zielerkennungssequenz so modifiziert, daß sie ein funktionelle Carboxylgruppe an einem oder beiden Termini enthält. Dies wird erreicht, indem entweder das 3'-Ende oder das 5'-Ende zunächst phosphoriliert wird. Die Phosphatgruppe der phosphorylierten DNA wird dann mit einem Imidazol/Ethyl-Diamethylamino-Proply-Carbodiimid (EDAC) aktiviert und dann mit einem Überschuß and &epsi;-Aminocapronsäure umgesetzt, um die Carboxylgruppe zu bilden. Die Zielerkennungsgruppe wird dann in Gegenwart von überschüssigem EDAC mit der signalerzeugenden Gruppe umgesetzt, die eine reaktive terminale Hydroxylgruppe enthält, wobei eine Esterverknüpfung gebildet wird, die die zwei Gruppen chemisch verknüpft. Wei bereits in dem gesamten Text angedeutet wurde, werden einer oder beide Termini der signalerzeugenden Gruppe oder der Zielerkennungsgruppe mit einer reaktiven funktionellen Gruppe versehen, wie hier beschrieben ist. Wenn beide Termini einer Zielerkennungsgruppe reaktiv sind, ist es vorstellbar, daß an beiden Enden mit der signalerzeugenden Gruppe eine chemische Verknüpfung gebildet werden kan. Die Sonde wäre dann mit einer Zielerkennungsgruppe aufgebaut, die auf jeder Seite mit einer signalerzeugenden Gruppe flankiert ist. Wenn beide Termini der signalerzeugenden Gruppe reaktiv sind, würde das entgegengesetzte Gebilde geformt. Wenn jede der Komponenten der Nucleotidsonde an jedem Ende reaktive Gruppen aufweist, dann kann ein repetitives Polymer oder eine zyklisch markierte Sonde gebildet werden.
In den bevorzugten Ausführungsformen, in denen die signalerzeugende Gruppe Nucleotidbasen unfaßt, gehören sämtliche Terminus-Terminus-Kombinationen zu der Erfindung. Beispielsweise kann die chemische Verknüpfung eine Verknüpfung von 5' xu 5', eine Verknüpfung von 3' zu 3' oder eine Verknüpfung von 5' zu 3' oder von 3' zu 5' sein. Jeder denkbare Terminus wird in einer geeigneten Weise mit der funktionellen Gruppe ausgestattet, die in der Lage ist, mit dem Terminus der anderen Komonente zu reagieren.
Die wie zuvor konstruierte Nucleotidsonde kann als eine Reagenzlösung bereitgestellt werden, die eine oder mehrere der hier beschriebenen Nucleotidsonden und einen Puffer umfaßt. Geeignete Puffer sind im allgemeinen wäßrig und können Dextronsulfat, EDTA und ähnliche Additive enthalten, die alleine oder in beliebiger Kombination vorliegen können, vorausgesetzt, daß die Additive mit der nachfolgenden Hybridisierung des Reagenzes mit dem Zielanalyten kompatibel sind. Die Reagenzlösung kann auch Agentien umfassen, die fie Fähigkeit der Sonde, an ein Ziel zu binden, erhöhen, wie z. B. geeignete Hybridisierungsenhancer, Träger-DNA und Verbindungen zum Erhöhen der Spezifität, wie Formamid. In dieser Lösungsform liegt die Haltbarkeit des Sondenreagenzes im allgemeinen im Bereich von mehr als einem Jahr. Alternativ kann die Sonde lyophilisiert werden und daher in Form eines trockenen Reagenzes bereitgestellt werden, das mit Puffern wie den zuvor beschriebenen rekonstituiert wird, bevor der Anwender Hybridisierungstests mit Analytproben durchführt.
Das Verfahren und die Verwendung der Hybridisierungssonde und der Reagenzien, die in dieser Erfindung beschrieben sind, setzt die vorherige Auswahl einer Zielpolynucleotidsequenz eines Analyten voraus. In vielen Ausführungsformen ist der Nachweis eines speziellen Analyten erwünscht, da die spezielle Sequenz von Purin- und Pyrimidinbasen in dem Zielpolynucleotid bekannt ist oder für ein mutiertes oder normales Gen eines Organismusses als charakteristisch angesehen wird und da das vorliegen oder Nichtvorliegen dieses speziellen mutierten oder normalen Gens mit dem Vorliegen oder Nichtborliegen eines infektiösen Agens, Karzinogens, Erkrankungszustands oder bestimmter anderer genetischer Eigenschaften korreliert werden kann.
Die Verwendung der wie hier beschrieben hergestellten Sonden ist nicht auf spezielle Verfahren oder Techniken zum Durchführen der Hybridisierung mit der Nucleinsäure in einer biologischen Probe, um die Zielsequenz nachzuweisen, beschränkt. Aus dem Stand der Technik sind bereits verschiedene Hybridisierungstesttechniken bekannt und umfassen beispielsweise Dot-Blot-Hybridisierung, Southern Blotting; Sandwich-Hybridisierungstests, wie die von Ranki et at. in den U.S. Patenten Nrn. 4,563,415 und 4,486,539 beschriebenen; Sandwich-Hybridisierung auf Beads wie von Hansen, et al. in der Europäischen Patenanmeldung 84306513.7 beschrieben; Verdrängungshybridisierungstechniken, wie die in der WO 87/03911 beschriebenen; Einfangtechniken, bei denen die hier beschriebenen Nucleinsäuresonden zunächst auf einem festen Träger immobilisiert werden und dann mit der Probe in Kontakt gebracht werden; in situ Hybridisierung, wie die angegebenen oder von Ploeg, Folia Histochemia et Cytobiologica, Bd. 24 (1986) Nr. 3, S. 189 - 194; beschriebenen und dergleichen.
Die Zielnucleotidsequenz des Analyten kann in verschiedenen Medien vorliegen, am häufigsten in biologischen, physiologischen oder in Umweltproblen. In manchen Fällen ist es bevorzugt, die Probe, die die Analytzielsequenz enthält, einer Reihe von Extraktions-, Reinigungs- und Isolierungsprotokollen zu unterziehen, bovor eine Analyse gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird. Maßnahmen wie diese sind erwünscht, um die Probe von Substanze zu befreien, die die Bindung des Analyten an die Hybridisierungssonde stören könnten. Beispiele solcher Protokolle sind im zweiten kapitel von Nucleic Acid Hybridization, Hrsg. B. Hames & S. Higgins, IRL Press, Washington, D.C. (1985) und in Standarlehrbüchern zu finden.
Es gehört auch zur vorliegenden Erfindung, daß synthetische Homooder Heteropolynucleotide im Laboratorium hergestellt werden können, um trotz ihres nichtbiologischen Ursprungs als Analytzielsequenz zu dienen, da solche synthetischen Polynucleotide häufig für Forschungszwecke und dergleichen erwünscht sind.
Ungeachtet des zuvor Gesagten ist es in manchen Fällen bevorzugt, daß die Zielsequenz des Analyten in einer einzelsträngigen Form vorliegt, um die Hybridisierung mit der Zielerkennungsgruppe der durch die erfingungsgemäßen Verfahren gebildeten Hybridisierungssonde zu erleichtern. Proben, die Zielnucleotidsequenzen des Analyten enthalten, müssen häufig behandelt werden, um jeden Zielanalyten in die einzelsträngige Form umzuwandeln. Diese Konversion in die einzelsträngige Form kann durch die verschiedensten aus dem Stad der Technik bekannten Weisen errreicht werden. Beispielsweise kann die Denaturierung von Nucleinsäureduplexen thermisch, chemisch oder auf andere herkömmliche Weisen erreicht werden. Der Denaturierungsprozeß hängt ab von pH, der Ionenstärke, der Temperatur und anderen Eigneschaften des umgebenden Mediums (z. B. das Vorliegen von Harnstoff, Formamid, Glyoxal, Methylquecksilberhydroxid oder anderen Angentien) sowie von der Basenzusammensetzung (d. h. daß Verhaltnis von GC/AT), der Sequenz und der Länge des Nucleinsäureduplezes. Cherischtsartikel über verschiedene Verfahren der Denaturierung sind in Standardlehrbüchern zu finden und bei J. Marmur, C. Schildkraut und P. Doty in Molecular Basis of Neoplasia, Univ. of Texas Press, Austin, Texas, 1962.
Beispielhaft für eine Hybridisierungsreaktion sind Situationen, in denen die Zielsequenz des Analyten in einem flüssigen Medium vorliegt. Dieses Medium kann viele Formen aufweisen, wobei unbehandeltes boilogisches Fluid am anschaulichsten ist. Das unbehandelte boilogische Fluid kann in manchen Ausfuuhrungsformen mit einer "zweiten Lösung" gemischt werden, um ein Medium herzustellen, von dem bekannt ist, daß es die Rehybridisierung von komplementären einzelstrüngigen Nucleinsäuren unterstützt. Die zweite Lösung kann wäßrig oder nichwäßrig oder ein Gemisch von beidem sein. Bestimmte anorganische oder organische Additive, von denen bekannt ist, daß sie die Rehybridisierung komplementärer einzelsträgiger Nucleinsäuren beeinträchtigen, können zugegeben werden, um die Hybridisierungsgeschwindigkeit zu steigern und/oder das Ausmaß des Gleichgewichts der Hybridisierung (d. h. die Stabilität der rehybridisierten Form) zu erhöhen. Von den anorganischen Additiven sind Natriumcitrat und Natriumchlorid zu erwähnen; von den organischen Verbindungen sind Verbindungen wei Formamid zu nennen. Angere brauchbare Additive sind Polyethylenglycol, Dextransulfat, Natriumdocecylsulfat und Casein.
Die Sonde kann unter Bedingungen, bei denen die Zielsequenz des Analyten, falls vorhanden, als ganzes oder teilweise mit einer komplementären Region hybridisieren kann, die in der Zielerkennungsgruppe der Nucleotidsonde enthalten ist, mit einer flüssigen Probe in kontakt gebracht werden. Dieser Kontaktierungsschritt kann auf vielfältige Weise und unter variierenden "Stringenz" - Bedingungen bewirkt werden. Ein überblick über Faktoren, die Rehybridisierungs-Prozesse (Reassoziation) beeinträchtigen, ist in Nucleic Acid Hybridization, Hrsg. B. Hames und S. Higgins, IRL Press, Washington, D.C. (1985) erhältlich. Die Faktoren umfassen Temperaturbedingungen, pH, Salzkonzentration und Solvensmedium, zusätzlich zu Faktoren, die die Länge, die Komplezität und den Grad der Komplementarität der Sonde und der Zielpolynucleotide des Analyten widerspiegeln. Die Kontaktdauer kann je nach der Zeitdauer variieren, die notwenig ist, um eine Hybridisierung im gewünschten Ausmaß zu bewirken, die wiederum teilweise von der Länge des bindenden Bereichs in der Zielerkennungsgruppe sowie von den Reaktionsbedingungen abhängig ist.
Die Nucleotidsonde wird mit jeder gebundenen komplementären Analytzielsequenz von der boilogischen Probe abgetrennt, nachdem die gewünschte Hybridisierung stattgefunden hat. Diese Abrennung kann durch jedes beliebige geeignete Verfahren erreicht werden, einschließlich Chromatographie (Säule. Gel, usw.). Filtration, Elektrophorese (einschließ Elektroelution) und dergleichen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Es kann darüber hinaus erwünscht sein, einen Spülschritt aufzunehmen, um zu gewährleisten, daß ungebundenes Material vollständig von rehybridisiertem Material, das an die Probe gebunden ist, abgetrennt wird.
Wenn der Hybridisierungsvorgang stattgefunden hat und das gebundene Material von dem ungebundenen getrennt ist, wird der Nachweis des Markers auf der signalerzeugenden Gruppe durch Testen des gebundenen Materials, des ungebundenen Materials oder von beiden vorgenommen.
Wenn der Marker ein radioaktiver Marker ist, kann durch herkömmliche Techniken zur quantitativen Radioisotopenbestimmung ein direkter Nachweis erfolgen.
Wenn der Marker ein chemischer Marker ist, wie beispielsweise Biotin, wird er indirekt nachgewiesen. Beispiele dafür umfassen Kontaktieren mit einem chromogenen Substrat oder dergleichen, die dem Fachmann bekannt sind.
Die folgenden Beispiele stellen noch speziellere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hereit, sollen diese jedoch nich einschränken.

BEISPIELE

Herstellung von Oligomeren zur Verwendung als signalerzeugende und Zielerkennungsgruppen:

Sämtliche Oligonucleotide wurden durch typische Phosphoramiditchemie auf einer DNA-Synthesevorrichtung synthetisiert, wobei 5-Phosphate-on- Cyanoethyl-phosphoramidit verwendet wurde, worauf das Oligomer entblockt wurde, um die Schutzgruppen zu entfernen. Alternative wurde die Phosphatgruppe durch Reaktion mit Polynucleotidkinase (nach dem Entblocken) zugefügt. Das Oligomer wurde nach der Synthese über einer Sephadez G-25 Säule gereinigt.
Das Oligomer der signalerzeugenden Gruppe wurde auf einer DA-Synthesevorrichtung synthetisiert und in einigen Fällen wurde der Cappingschritt nach jeder Verknuupfung weggelassen. Dieses Oligomer wies eine Länge von 50 - 200 Basen auf, wobie 20 - 100% der Basen Cytosine waren. Nach dem Entblocken und danach Entasalzen über Sephadex G-25 wurde das Oligomer lyophilisiert und die ezocyclischen Aminogruppen der C's wurden transaminiert, indem 2 ml des Transaminierungsgemischs dem trockenen Oligomer zugegeben wurden und bei Raumtemperatur 24 - 72 Stunden lang geschüttelt wurde. Das Transaminierungsgemisch wurde wie folgt hergestellt: 5,67 g Hexandiamindihydrochlorid wurden mit 0,231 g Morpholinoethansulfonsäure in 500 Microliter konzentriertem Natriumhydrozid in einem 50 ml Röhrchen mit Schraubverschluß gemischt. Das Volumen wurde mit warmen Wasser auf 9,5 ml aufgefüllt und das Gemisch wurde geschüttelt, bis es nahezu aufgelöst war. Es wurde 1 g Natriummetabisulfit zugegeben und aufgelöst und der pH wurde auf 6,0 - 6,2 eingestellt. Nachdem die Reaktion 24 - 72 Stunden land fortgeschritten war, wurde der pH für 2 Stunden auf 8,5 gebracht und dann für 30 Minuten auf 7 gesenkt. Das Produkt wurde dann über einer 1 x 40 cm Sephadez G-50 Säule gereinigt.

Haptenylierung des signalerzeugenden Oligomers:

Das transaminierte Oligomer der signalerzeugenden Gruppe wurde entweder mit Biotin oder Fluoresceinisothiocyanat (FITC) hapenyliert, und zwar entweder vor oder nach der Verknüpfung mit dem Oligomer der Zielerkennungsgruppe. In gedem Fall wurde das Biotin (NHS-LC-Biotin) oder FITC in Dimethylformamid aufgelöst und mit einem gleichen Volumen des transaminierten Oligomers vermischt, das in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9,0 aufgelöst war, so daß das Verhältnis von Hapten zu Aminogruppen mindestens 2 betrug. Man ließ das Gemisch 16 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Nicht umgesetztes Hapten wurde mittels Sephadez G-25 Chromatographie entfernt. Alternativ wurde überschüssiges FITC durch eine oder zwei Butanolextraktionen und anschließende Chromatographie über Sephadez G-25 entfernt. In beiden Fällen wurde das gereinigt Oligomer lyophilisiert und in Wasser wieder aufgelöst.

Herstellung von 5'-Carboxly-Oligonucleotide:

5 Nanomole phosphoryliertes Oligonucleotid wurden in einer wäßrigen Lösung aufgelöst, die 1/10 molares Imidazol und 1/10 molares EDAC (100 Mikroliter, pH 6,0) enthielt und wurden 1 bis 16 Stunden lang bei 20 bis 50 ºC stehengelassen. Die Inhalte wurden durch eine Gelfiltrationssäule geleitet und zu den Fraktionen, die das Oligonucleotid enthielten, wurde ein gleiches Volumen einer 4/10 molaren Aminocapronsäure zugegeben. Nach 1 bis 16 Stunden wurde das carbozylierte Oligonucleotid durch Gelfiltration isoliert.

Herstellung von esterverknüpften Sonden:

Zu einem ml wäßriger Lösung, die je 5 Nanomole con 5'Hydrozyloligonucleotid und 5'-Carboxyloligonucleotid enthält, wurden 10 mg EDAC zugegeben. Die Lösungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, nachdem der pH auf 6 eingestellt worden war. Die markierte Sonde wurde mittels Chromatographie auf CL6B Sephacryl S-200 isoliert.

Charakterisierung des Produktes:

Die markierte Sonde wurde auf zwei Arten charakterisiert. Erstens mittels Polyacrylamidgelelectrophorese, wobei eine Zunahme des Molekulargewichts des procukts als Beweis dafür angenommen wurde, daß die Verknüpfung der Sonde mit dem Marker erfolgreich war. Zweitens wurde gezeigt, daß das Produkt in dem Test zum Nachweis von DNA aus Neisseria gonorrhea wirkte. In diesem Test wurde das Biotin oder FITC nachgewiesen, wo die Probe mit Neisseria gonorrhea hybridisiert hatte, wordurch angezeig wurde, daß das Zielerkennungsoligomer an da siganlerzeugende Oligomer kovalent gebunden war.

Claims

1.0 Markierte Nucleotidsonde, die gemäß der chemischen Synthese gebildet wird, die die folgenden Schritte aufweist:

a) Bereitstellen einer ersten Zielerkennungsgruppe, die eine Nucleotidsequenz von mindestens 15 Nucleotidbasen unfaßt, wobie die Sequenz ein 5'-Ende und ein 3'-Ende enthält;

b) Verändern der ersten Zielerkennungsgruppe mit einer Phosphatgruppe an dem 5'-Ende, dem 3'-Ende oder an beiden, wobei eine phosphorylierte Zielerkennungsgruppe gebildet wird:

c) Aktivieren der Phosphatgruppe der phosphorylierten Zielerkennungsgruppe von Schritt b) mit Imidazol und Ethyl-Dimethylamino-Propyl- Carbodiimid;

d) Umsetzen der aktivierten Phosphatgruppe der phosphorylierten Zielerkennungsgruppe von Schritt c) mit Epsilon-Aminocapronsäure, wobei eine Carboxylgruppe an dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende der Zielerkennungsgruppe bereitgestellt wird, und die Carboxylgruppe aus der Carboxylgruppe der Epsilon-Aminocapronsäure gebildet wird;

e) Bereitstellen einer zweiten signalerzwugenden Gruppe, die eine Nucleinsäuresequenz umfaßt, die mindestens einen Terminus und eine Länge von etwa 50 bis etwa 200 Basen aufweist, oder ein Polysaccharid, das mindestens einen Terminus aufweist, und wobei die zweite signalerzeugende Gruppe darüber hinaus mindestens einen nachweisbaren Marker aufweist, der daran gebunden ist und wobei der erminus eine Hydroxylgruppe enthält, die in der Lage ist, mit der Carboxylgruppe zu reagieren, die sich and der ersten Zielerkennungsgruppe befinet;

f) Chemisches Umsetzen der Carbocylgruppe der ersten Zielerkennungsgruppe mit der Hydroxylgruppe der zweiten signalerzeugenden Gruppe, un dei erste Zielerkennungsgruppe und die zweite signalerzeugende Gruppe kovalent miteinander zu verbinden, wobei die markierte Nucleotidsonde Hergestekkt wird.

2.) Markierte Nucleotidsonde nach Anspruch 1, wobei die signalerzeugende Gruppe mit einem Hapten wie Biotin oder Fluroescein markiert ist.