DE69430384T2

DE69430384T2 - Nukleinsäurevermittelter elektronentransfer

Info

Publication number: DE69430384T2
Application number: DE69430384T
Authority: DE
Inventors: E. Fraser; F. Kayyem; J. Meade
Original assignee: California Institute of Technology
Current assignee: California Institute of Technology
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1994-12-05
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: EP0733058A1; JP2005013222A; EP0733058B1; AU703329B2; CA2178618A1; US5705348A; ATE215959T1; US6268149B1; DE69430384D1; US20010034033A1; US5780234A; AU1215295A; WO1995015971A3; EP1172446A2; DK0733058T3; JPH09506510A; US5591578A; EP1172446A3; ES2174917T3; US6087100A

Description

Gebiet der Technik

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Elektronentransfer über Nukleinsäuren. Im Speziellen bezieht sich die Erfindung auf die ortsselektive Modifikation von Nukleinsäuren mit Elektronentransfer-Einheiten, wie z. B. aktiven Übergangsmetall-Redoxkomplexen, zur Erzeugung einer neuen Reihe von Biomaterialien sowie auf Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben. Die neuen Biomaterialien der vorliegenden Erfindung können als Biokonduktoren (biologische Leiter) und diagnostische Sonden verwendet werden.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich zum Teil auf Verfahren zur ortsselektiven Modifikation von Nukleinsäuren mit aktiven Redox-Gruppen, wie z. B. Übergangsmetall- Komplexen, auf die modifizierten Nukleinsäuren selbst und auf ihre Verwendungen. Solche modifizierte Nukleinsäuren sind speziell als Biokonduktoren und photoaktive Nukleinsäuresonden nützlich.
Die Detektion spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist ein wichtiges Werkzeug der diagnostischen Medizin und molekularbiologischen Forschung. Gensondentests spielen gegenwärtig bei der Identifizierung infektiöser Organismen, wie z. B. Bakterien und Viren, eine große Rolle, weiters bei der Sondierung der Expression normaler Gene und bei der Identifizierung mutierter Gene, wie z. B. Onkogene, bei der Typisierung von Gewebe hinsichtlich Verträglichkeit vor einer Gewebetransplantation, bei der Abgleichung von Gewebe- oder Blutproben in der forensischen Medizin sowie bei der Erforschung der Homologie zwischen Genen verschiedener Spezies.
Idealerweise sollte ein Gensondentest sensitiv, spezifisch und leicht automatisierbar sein (um einen Überblick zu gewinnen, siehe Nickerson, Current Opinion in Biotechnology 4, 48-51 (1993)). Die Erfordernis der Sensitivität (d. h. niedrige Nachweisgrenzen) wurde durch die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anderer Amplifikationstechnologien, die es Forschern ermöglichen, eine spezifische Nukleinsäuresequenz vor der Analyse exponentiell zu amplifizieren, stark abgeschwächt (um einen Überblick zu gewinnen, siehe Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology 4, 41- 47 (1993)).
Im Gegensatz dazu bleibt die Spezifität in vielen gegenwärtig verfügbaren Gensondentests weiterhin ein Problem. Das Ausmaß der Molekülkomplementarität zwischen Sonde und Target definiert die Spezifität der Wechselwirkung. Variationen der Konzentrationen von Sonden, Targets und Salzen im Hybridisierungsmedium, Variationen in der Reaktionstemperatur und in der Sondenlänge können die Spezifität der Wechselwirkung zwischen Sonde und Target verändern oder beeinflussen.
Unter bestimmten, begrenzten Umständen kann es möglich sein, Targets mit perfekter Komplementarität von Targets mit Fehlpaarungen zu unterscheiden, obwohl dies im Allgemeinen unter Verwendung traditioneller Technologien sehr schwierig ist, da selbst geringe Variationen in den Reaktionsbedingungen die Hybridisierung ändern. Neue experimentelle Techniken zur Detektion von Fehlpaarungen mittels Standardsonden umfassen DNA-Ligations-Tests, in welchen Einzelpunkt-Fehlpaarungen eine Ligation verhindern, und Sonden-Verdautests, worin Fehlpaarungen Stellen für eine Sondenspaltung erzeugen.
Schlussendlich bleibt die Automatisierung von Gensondentests ein Bereich, der durch das Fehlen aktueller Technologien geprägt ist. Solche Test beruhen im Allgemeinen auf der Hybridisierung einer markierten Sonde an eine Target- oder Zielsequenz, gefolgt von der Trennung der nicht-hybridisierten, freien Sonde. Diese Trennung erfolgt im Allgemeinen mittels Gel-Elektrophorese oder Einfangen der Ziel-DNA an einer festen Phase und Waschen derselben, und im Allgemeinen ist eine Automatisierung ziemlich schwierig zu erreichen.
Diese Trennschritte sind zeitintensiv, was zu zwei unterschiedlichen Entwicklungswegen geführt hat. Der eine Weg umfasst die Entwicklung von sehr schnellen, automatisierbaren Elektrophorese-Techniken mit hohem Durchsatz sowie anderer Trennungsverfahren. Der andere Weg schließt die Entwicklung von homogenen Gensondentests, bei denen keine Trennung erfolgt, ein.
So hat beispielsweise Gen-Probe Inc. (San Diego, CA, USA) einen homogenen Schutztest entwickelt, in dem hybridisierte Sonden vor Basenhydrolyse geschützt werden und somit anschließend zur Chemolumineszenz fähig sind (Okwumabua et al., Res. Microbiol. 143, 183 (1992)). Leider lässt bei diesem Ansatz das Vertrauen in ein chemolumineszentes Substrat, das für seine starke Hintergrundphotonenemission bekannt ist, vermuten, dass dieser Test keine hohe Spezifität aufweist. Die EP-A mit der Anmeldenr. 86116652.8 beschreibt einen Versuch, nicht über Strahlung erfolgenden Energietransfer von einer Donorsonde zu einer Akzeptorsonde als homogenes Detektionsschema zu verwenden. Die Übertragung von Fluoreszenzenergie wird jedoch durch die Sondentopologie und -topographie stark beeinflusst, und das DNA-Target selbst ist zu signifikantem Energiequenching fähig, was in beträchtlichen Schwankungen resultiert. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an DNA-Sonden, die spezifisch sind, zur Detektion von Target-Fehlpaarungen und zur Aufnahme in ein automatisiertes System zur Identifizierung von Sequenzen fähig sind.
Wie bereits oben ausgeführt beruht die Molekularbiologie für traditionelle Gensondentests sehr stark auf modifizierten oder markierten Oligonukleotiden ("Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", Gait et al. (Hrsg.), IRL Press, Oxford, UK (1984); "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", F. Eckstein (Hrsg.), Oxford University Press (1991)). Als Resultat davon gibt es gegenwärtig einige Techniken zur Synthese von maßgeschneiderten Nukleinsäuremolekülen. Da Nukleinsäuren natürlicherweise keine funktionellen Gruppen enthalten, an welche sich Moleküle von Interesse leicht kovalent binden können, wurden Verfahren entwickelt, die chemische Modifikation an einem der beiden terminalen Phosphaten oder an den heterozyklischen Basen erlauben (Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 968 (1985)).
So können beispielsweise Analoge der gängigen Desoxyribo- und Ribonukleoside, die an der 2'- oder 3'-Position des Zuckers Aminogruppen enthalten, unter Verwendung etablierter chemischer Techniken hergestellt werden (siehe Imazawa et al., J. Org. Chem. 44, 2039 (1979); Imazawa et al., J. Org. Chem. 43 (15), 3044 (1978); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36 (2), 250 (1971); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4), 714 (1977)). Zusätzlich dazu können Oligonukleotide mit 2-5'- oder 3'-5'-Phosphoamid-Bindungen synthetisiert werden (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10), 1925 (1992); Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sawai, Chem. Lett. 805 (1984); "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", F. Eckstein (Hrsg.), Oxford University Press (1991)).
Die Modifikation von Nukleinsäuren wurde aus zwei allgemeinen Gründen durchgeführt: zum einen, um nichtradioaktive DNA-Marker zu erzeugen, die als Sonden dienen, und zum anderen, um chemisch modifizierte DNA zur Erzielung ortsspezifischer Spaltung zu verwenden.
Dazu kann DNA markiert werden, um als Sonde zu dienen, indem ein Nukleotid geändert wird, welches daraufhin als Ersatzanalog bei der Nick-Translations-Resynthese von doppelstrangiger DNA dient. Die chemisch veränderten Nukleotide können daraufhin reaktive Stellen zur Anbindung immunologischer oder anderer Markierungen, wie z. B. Biotin, bereitstellen (Gilliam et al., Anal. Biochem. 157, 199 (1986)). Ein weiteres Beispiel verwendet Ruthenium-Derivate, die sich in die DNA einlagern, um unter definierten Bedingungen Photolumineszenz zu erzeugen (Friedman et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 4960 (1990)).
In der zweiten Kategorie gibt es eine Reihe von Beispielen für kovalent an die DNA gebundenen Verbindungen, welche eine nachfolgende Spaltung der DNA-Kette verursachen. So wurde beispielsweise 1,10-Phenanthrolin über einen Linker an ein einstrangiges Oligothymidylat gebunden, was in Gegenwart von Cu²&spplus; und 3-Mercaptopropionsäure zur Abspaltung von Poly-dA-Oligonukleotiden führt (Francois et al., Biochemistry 27, 2272 (1988)). Ähnliche Experimente wurden für EDTA¹-Fe(II), sowohl für doppelstrangige DNA (Boutorin et al., FEBS Lett. 172, 43-46 (1986)) als auch für Triplex-DNA (Strobel et al., Science 249, 73 (1990)), Porphyrin-Fe(III) (Le Doan et al., Biochemistry 25, 6736-6739 (1986)) und 1,10-Phenanthronin-Cu(I) (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 7147 (1985)) durchgeführt, welche alle in Gegenwart eines Reduktionsmittels in lufthaltigen Lösungen in der Spaltung der DNA-Kette resultieren. Ein ähnliches Experiment mit Porphyrinen führte zur Spaltung des DNA-Strangs und unter sehr spezifischen Bedingungen zu Basenoxidation oder Vernetzung der DNA (Le Doan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8643 (1987)).
Eine andere Arbeit konzentriert sich auf die chemische Modifikation heterozyklischer Basen. So ergab beispielsweise die Anbindung eines anorganischen Koordinationskomplexes, nämlich von Fe-EDTA, an eine modifizierte innere Base die Spaltung der DNA nach Hybridisierung in Gegenwart von molekularem Sauerstoff (Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 968 (1985)). Eine Ruthenium-Verbindung wurde erfolgreich an eine innere Base in einem DNA-Octomer gekoppelt - unter Beibehaltung sowohl der Fähigkeit der DNA zur Hybridisierung als auch der spektroskopischen Eigenschaften der Ruthenium-Markierung (Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 7221 (1989)). Andere Experimente haben erfolgreich zwei getrennte spektroskopische Markierungen an ein einzelnes doppelstrangiges DNA-Molekül angefügt (Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 7226 (1989)).
Die Studie von Elektronentransferreaktionen in Proteinen und DNA wurde auch im Hinblick auf Systeme verfolgt, welche zum Elektronentransfer über weite Strecken fähig sind.
Zu diesem Zweck wurde gezeigt, dass intramolekularer Elektronentransfer in Protein- Protein-Komplexen, wie z. B. jenen, die in photosynthetischen Proteinen und Proteinen in den Atemwegen gefunden wurden, über bemerkenswerte Distanzen im Proteininneren mit biologisch signifikanter Geschwindigkeit stattfindet (siehe Bowler et al., "Progress in Inorganic Chemistry: Bioinorganic Chemistry", Bd. 38, Stephen J. Lippard (Hrsg.) (1990)). Zusätzlich wurde die selektive Modifikation von Metalloenzymen mit Übergangsmetallen durchgeführt, und Techniken zur Überwachung von Elektronentransfer in diesen Systemen wurden entwickelt. So wurden beispielsweise Elektronentransfer-Proteine, wie z. B. Cytochrom C, mit Ruthenium durch die Anbindung an mehrere Histidine modifiziert, und die Geschwindigkeit des Elektronentransfers vom Häm-Fe²&spplus; zum gebundenen Ru³&spplus; wurde gemessen. Die Resultate lassen vermuten, dass "Tunnel"-Wege für den Elektronentransfer existieren können (Baum, "Chemical & Engineering News", 2023, 22. Februar 1993; siehe auch Chang et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 7056 (1991)). In verwandten Arbeiten wurde die normale Proteinisolierung, die die Redox-Zentren eines Enzyms oder Proteins vor nicht-diskriminativen Reaktionen mit dem äußeren Lösungsmittel schützen, "verdrahtet", um diese Systeme aus elektrischen Isolatoren in elektrische Leiter umzuwandeln (Heller, Acc. Chem. Res. 23, 128 (1990)).
Es gibt einige Berichte über photoinduzierten Elektronentransfer in einer DNA-Matrix. In diesen Systemen sind die Elektronendonoren und -akzeptoren nicht kovalent an die DNA gebunden, sondern nur statistisch mit der DNA verbunden, wodurch die explizite Erforschung und Kontrolle des Donor-Akzeptor-Systems erschwert wird. So wird beispielsweise die intensive Fluoreszenz gewisser quaternärer diazoaromatischer Salze nach Einlagerung in DNA oder nach dem Aussetzen gegenüber einzelnen Mononukleotiden gequencht, wodurch die Elektronendonorprozesse innerhalb der DNA selbst auftreten (Brun et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 8153 (1991)).
Ein weiteres Beispiel für die Schwierigkeit der Bestimmung des Elektronentransfer- Mechanismus findet sich in einer Arbeit mit einigen durch Licht anregbaren Ruthenium- Verbindungen. Frühere Arbeiten legten nahe, dass sich gewisse Ruthenium-Verbindungen entweder statistisch in die Nukleotidbasen einlagern oder sich an die Helix-Oberfläche binden (Purugganan et al., Science 241, 1645 (1988)). Ein kürzlich erfolgter Verweis zeigt, dass gewisse Ruthenium-Verbindungen sich nicht in die DNA einlagern (Satyanarayana et al., Biochemistry 31 (39), 9319 (1992)), sondern sich vielmehr nichtkovalent an die Oberfläche der DNA-Helix binden.
In diesen frühen Experimenten wurden verschiedene Elektronenakzeptor-Verbindungen, wie z. B. Kobalt-, Chrom- oder Rhodiumverbindungen, gewissen DNA-assoziierten Ruthenium-Elektronendonor-Verbindungen hinzugefügt (Puragganan et al., Science 241, 1645 (1988); Orellana et al., Photochem. Photobiol. 499, 54 (1991); Brun et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 8153 (1991); Davis, Chem.-Biol. Interactions 62, 45 (1987); Tomalia et al., Acc. Chem. Res. 24, 332 (1991)). Nach Zusatz dieser verschiedenen Akzeptorverbindungen, die sich statistisch nicht-kovalent an die Helix binden, wurde ein Quenchen des lichtangeregten Zustands durch Elektronentransfer entdeckt. Die Quenchingrate hing sowohl vom jeweiligen Elektronendonor und -akzeptor ab als auch von deren Konzentrationen, wodurch sich der Prozess als biomolekular erwies.
In einer Versuchsgruppe postulieren die Autoren, dass der mobilere, oberflächengebundene Donor Elektronentransfer mit höherer Effizienz fördert als die eingelagerte Spezies, und sie schlagen vor, dass die Zucker-Phosphat-Hauptkette der DNA - und möglicherweise das Lösungsmittelmedium, das die DNA umgibt - eine nicht unwesentliche Rolle im Elektronentransport spielen (Purugganan et al., Science 241, 1645 (1988)). In einer anderen Arbeit streichen die Autoren die Abhängigkeit der Rate von der Mobilität des Donors und des Akzeptors sowie ihrer lokalen Konzentrationen hervor und sprechen der DNA primär die Funktion zu, einen Anstieg in der lokalen Konzentration der Donor- und Akzeptorspezies auf der Helix zu erleichtern (Orellana et al., s.o.).
In einem weiteren Experiment wurde ein Elektronendonor wie verlautet statistisch in den Basenstapel der DNA eingelagert, während der Akzeptor statistisch an die Oberfläche der DNA gebunden wurde. Die Geschwindigkeit des Elektronentransferquenchs zeigte einen engen Kontakt des Donors und des Akzeptors, und das System zeigte auch eine Verbesserung in der Geschwindigkeit des Elektronentransfers, wenn dem Medium Salz zugesetzt wurde (Fromherz et al., J. Am. Chem. Soc. 108, 5361 (1986)).
In all diesen Experimenten ist die Geschwindigkeit des Elektronentransfers für nicht- kovalent gebundene Donoren und Akzeptoren um ein Vielfaches geringer als dies in freier Lösung der Fall ist.
Ein wichtiger Stimulus für die Entwicklung von Langstrecken-Elektronentransfersystemen ist die Erzeugung von synthetischen Lichtemissionssystemen. Gegenwärtige Arbeiten legen nahe, dass ein künstliches Lichtemissionssystem einen Energietransferkomplex, einen Energiemigrationskomplex, einen Elektronentransferkomplex sowie einen Elektronenmigrationskomplex enthält (für einen themenbezogenen Überblick über dieses Gebiet siehe "Chemical & Engineering News", 38-48, 15. März 1993). Zwei Molekülarten wurden untersucht: a) lange organische Moleküle, wie z. B. Kohlenwasserstoffe, mit kovalent gebundenen Elektronentransferspezies, oder DNA mit eingelagerten, teilweise eingelagerten oder mit der Helix verbundenen Elektronentransferspezies, und b) synthetische Polymere.
Die langen organischen Moleküle werden, obwohl sie ziemlich starr sind, durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst, welche eine Entwicklung schwierig machen. Diese Faktoren umfassen die Polarität und Zusammensetzung des Lösungsmittels, Orientierung der Donor- und Akzeptorengruppen sowie den chemischen Charakter entweder der kovalenten Bindung oder der Bindung der Elektronentransferspezies an das Molekül.
Die Erzeugung von akzeptablen Polymer-Elektronentransfersystemen war schwierig, weil die verfügbaren Polymere zu flexibel sind, so dass mehrere Transfermodi auftreten. Polymere, die ausreichend starr sind, stören oftmals in beträchtlicher Weise den Elektronentransfer-Mechanismus, oder sie sind in der Synthese ziemlich schwierig.
Somit wäre die Entwicklung eines Elektronentransfersystems, das ausreichend starr ist, kovalent gebundene Elektronentransferspezies in definierten Abständen aufweist, leicht zu synthetisieren ist und in nicht nennenswertem Ausmaß den Elektronentransfer- Mechanismus stört, bei der Entwicklung künstlicher Lichtemissionssysteme zweckdienlich.
Durch eine DNA-Helix induzierter Langstrecken-Elektronentransfer ist in Science 262, 1025 (1993), beschrieben. Es folgt der Schluss daraus, dass die statistische Verteilung und Mobilität der Elektronendonor- und -akzeptor-Paare, in Verbindung mit potenziellen kurzen Entfernungen zwischen dem Donor und dem Akzeptor, die lose und vermutlich reversible Assoziation zwischen den Donoren und Akzeptoren, die berichtete Abhängigkeit von Lösungsmittel und breiten angenommenen Elektronenwegen sowie die Zerstörung der DNA-Struktur von eingelagerten Verbindungen, die eine normale Basenpaarung unmöglich machen, allesamt deutliche Einschränkungen für den Langstrecken- Elektronentransfer in einer DNA-Matrix darstellen. Aus diesem Grund ist ein Verfahren zur Herstellung einer starren, kovalenten Bindung von Elektronendonoren und -akzeptoren erwünscht, um für minimale Störungen der Nukleinsäurestruktur sowie Beibehaltung ihrer Fähigkeit, normale Basenpaare auszubilden, zu sorgen. Die vorliegende Erfindung dient dazu, ein System bereitzustellen, welches die Entwicklung von neuen Biokonduktoren und diagnostischen Sonden erlaubt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sieht die selektive Modifikation von Nukleinsäuren an spezifischen Stellen mit aktiven Redox-Gruppen, wie z. B. Übergangsmetall-Komplexen, vor. Eine Elektronendonor- und/oder Elektronenakzeptorgruppe ist kovalent vorzugsweise entlang der Ribose-Phosphat-Hauptkette der Nukleinsäure an vorbestimmten Positionen gebunden. Die sich daraus ergebenden Komplexe stellen eine Reihe neuer Derivate dar, die biomolekulare Template und dazu fähig sind, Elektronen über sehr große Entfernungen mit enorm schneller Geschwindigkeit zu übertragen. Diese Komplexe weisen einzigartige Struktureigenschaften auf, welche die Verwendung einer gänzlich neuen Klasse von Biokonduktoren und diagnostischen Sonden ermöglicht. In allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist eine Elektronendonorgruppe oder eine Elektronenakzeptorgruppe eine Elektrode.
Demgemäß ist es ein Ziel der Erfindung, eine einstrangige Nukleinsäure bereitzustellen, die sowohl eine Elektronendonorgruppe als auch eine Elektronenakzeptorgruppe kovalent daran gebunden aufweist. Diese Gruppen sind durch die Ribose-Phosphat- oder analoge Hauptkette der Nukleinsäure gebunden. Die einstrangige Nukleinsäure ist zur Hybridisierung an eine komplementäre Zielsequenz in einer einstrangigen Nukleinsäure und zum Elektronentransfer zwischen dem Donor und dem Akzeptor fähig.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäurensonde bereitzustellen, welche Basenpaar-Fehlpaarungen detektieren kann. In dieser Ausführungsform wird die einstrangige Nukleinsäure mit einer kovalent gebundenen Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppe an eine komplementäre Zielsequenz in einer einstrangigen Nukleinsäure hybridisiert. Enthält der Hybridisierungsbereich zumindest eine Basenpaar-Fehlpaarung, wird die Geschwindigkeit des Elektronentransfers zwischen der Donorgruppe und der Akzeptorgruppe im Vergleich dazu, wenn es perfekte Komplementarität zwischen der Sonde und der Zielsequenz gibt, verringert oder dieser eliminiert.
Es ist ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Komplex bereitzustellen, der eine erste einstrangige Nukleinsäure mit zumindest einer Elektronendonorgruppe und eine zweite einstrangige Nukleinsäure mit zumindest einer Elektronenakzeptorgruppe enthält. Wie bei den anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Gruppen kovalent an die Ribose-Phosphat-Hauptkette der Nukleinsäuren gebunden.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die erste und die zweite einstrangige Nukleinsäure zur Hybridisierung aneinander, um eine doppelstrangige Nukleinsäure zu bilden, und weiters zum Elektronentransfer zwischen der Elektronendonorgruppe und der Elektronenakzeptorgruppe fähig.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine Zielsequenz in einer einstrangigen Nukleinsäure zumindest eine erste und eine zweite Zieldomäne, die direkt benachbart sind. Die erste einstrangige Nukleinsäure hybridisiert an die erste Zieldomäne, und die zweite einstrangige Nukleinsäure hybridisiert an die zweite Zieldomäne, so dass die erste und die zweite einstrangige Nukleinsäure benachbart liegen. Dieser resultierende Hybridisierungskomplex ist zum Elektronentransfer zwischen der Elektronendonor- und der Elektronenakzeptorgruppe auf der ersten und der zweiten Nukleinsäure fähig.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine Zielsequenz in einer einstrangigen Nukleinsäure eine erste Zieldomäne, eine intervenierende Zieldomäne und eine zweite Zieldomäne. Die intervenierende Zieldomäne umfasst ein oder mehrere Nukleotide. Die erste und die zweite einstrangige Nukleinsäure hybridisieren an die erste und die zweite Zieldomäne. Eine intervenierende Nukleinsäure, die eine oder mehrere Nukleotide umfasst, hybridisiert an die intervenierende Zieldomäne, so dass Elektronen zwischen der Elektronendonorgruppe und der Elektronenakzeptorgruppe auf der ersten und der zweiten Nukleinsäure transferiert werden können.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer einstrangigen Nukleinsäure bereit, welche eine Elektronentransfergruppe umfasst, die kovalent an den 5'-Terminus der Nukleinsäure gebunden ist. Das Verfahren umfasst den Einbau eines modifizierten Nukleotids in eine wachsende Nukleinsäure an der 5'-Position, um eine modifizierte einstrangige Nukleinsäure zu bilden. Die modifizierte einstrangige Nukleinsäure wird daraufhin mit einer komplementären einstrangigen Nukleinsäure hybridisiert, um eine doppelstrangige Nukleinsäure zu bilden. Die doppelstrangige Nukleinsäure wird mit einer Elektronentransfergruppe umgesetzt, so dass die Gruppe kovalent an die modifizierte einstrangige Nukleinsäure gebunden wird. Die modifizierte einstrangige Nukleinsäure, die die Elektronentransfergruppe enthält, wird von der komplementären unmodifizierten einstrangigen Nukleinsäure getrennt. Der Nukleinsäurestrang wird an eine Elektrode gebunden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer einstrangigen Nukleinsäure bereit, die eine Elektronentransfergruppe kovalent an ein inneres Nukleotid gebunden enthält. Das Verfahren umfasst die Herstellung eines Nukleotid-Dimers, das über eine Phosphoramid-Bindung verbunden ist, und den Einbau des Nukleotid-Dimers in eine wachsende Nukleinsäure, um eine modifizierte einstrangige Nukleinsäure zu bilden. Die modifizierte einstrangige Nukleinsäure wird daraufhin mit einer komplementären einstrangigen Nukleinsäure hybridisiert, um eine doppelstrangige Nukleinsäure zu bilden. Die doppelstrangige Nukleinsäure wird mit einer Elektronentransfergruppe umgesetzt, so dass die Gruppe kovalent an die modifizierte einstrangige Nukleinsäure gebunden wird. Die modifizierte einstrangige Nukleinsäure, die die Elektronentransfergruppe enthält, wird von der komplementären unmodifizierten einstrangigen Nukleinsäure getrennt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion einer Zielsequenz bereit. Das Verfahren umfasst die Herstellung einer einstrangigen Nukleinsäure mit einer Elektronendonorgruppe und einer Elektronenakzeptorgruppe, die kovalent gebunden sind. Die einstrangige Nukleinsäure, die die Elektronentransfergruppen enthält, wird daraufhin an die Zielsequenz hybridisiert, und die Elektronentransferrate zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor wird bestimmt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht mögliche Orientierungen von Elektronendonor- (EDM) und Elektronenakzeptorgruppen (EAM) auf einer einstrangigen Nukleinsäure.
Fig. 2 veranschaulicht Orientierungen der Elektronentransfergruppen EDM und EAM auf zwei benachbarten einstrangigen Nukleinsäuren. Diese Orientierungen gelten auch, wenn die zwei Sonden durch eine intervenierende Sequenz getrennt sind.
Fig. 3 stellt eine Reihe von aminomodifizierten Nukleosid-Vorläufern vor dem Einbau in ein Oligonukleotid dar.
Die Fig. 4A und 4B zeigen die Struktur von Elektronentransfergruppen. Fig. 4A zeigt die allgemeine Formel einer repräsentativen Klasse von Elektronendonoren und -akzeptoren. Fig. 4B zeigt ein spezifisches Beispiel für eine Ruthenium-Elektronentransfergruppe, die Bisbipyridin und Imidazol als Liganden verwendet.

Detaillierte Beschreibung

Sofern nicht anders angegeben bezeichnet der Begriff "Nukleinsäure" oder "Oligonukleotid" oder grammatische Äquivalente davon hierin zumindest zwei Nukleotide, die kovalent miteinander verbunden sind. Eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiester-Bindungen, obwohl in manchen Fällen, wie nachstehend ausgeführt, eine Nukleinsäure eine analoge Hauptkette aufweisen kann, die z. B. Phosphoramid-Bindungen (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10), 1925 (1993) und Verweise darin; Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970)), Thiophosphat-, Dithiophosphat-, O-Methylphosphoramidit-Bindungen (siehe Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", Oxford University Press) oder Peptid-Nukleinsäuren- Bindungen umfasst (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993)). Die Nukleinsäuren können, wie angegeben, ein- oder doppelstrangig sein. Die Nukleinsäure kann DNA, RNA oder ein Hybrid sein, worin die Nukleinsäure eine beliebige Kombination von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und eine beliebige Kombination von Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin enthält. In einigen Fällen, beispielsweise im Fall einer "intervenierenden Nukleinsäure", bezieht sich der Terminus Nukleinsäure auf eine oder mehrere Nukleotide.
Die Begriffe "Elektronendonorgruppe", "Elektronenakzeptorgruppe" und "Elektronentransfergruppen" oder grammatikalische Äquivalente davon beziehen sich hierin auf Moleküle, die unter bestimmten Bedingungen zum Elektronentransfer fähig sind. Er ist so zu verstehen, dass Elektronendonor- und Elektronenakzeptorfähigkeiten relativ sind; d. h. ein Molekül, das unter bestimmten Versuchsbedingungen ein Elektron abgeben kann, kann unter anderen Versuchsbedingungen ein Elektron aufnahmen. Im Allgemeinen, jedoch nicht immer, enthalten Elektronentransfergruppen Übergangsmetalle als Komponenten. Alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Elektronentransfergruppe, die eine Elektrode ist.
Der Begriff "Zielsequenz" oder grammatikalische Äquivalente davon bezeichnen hierin eine Nukleinsäurensequenz auf einem einfachen Nukleinsäurestrang. Die Zielsequenz kann ein Teil eines Gens, eine Regulationssequenz, Gen-DNA, mRNA oder etwas anderes sein. Sie kann jede beliebige Länge aufweisen, jedoch sind längere Sequenzen spezifischer. Allgemein gesprochen ist dieser Begriff für Fachleute auf dem Gebiet der Technik verständlich.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung sind so konstruiert, dass sie mit der Zielsequenz komplementär sind, so dass Hybridisierung der Zielsequenz und der Sonden der vorliegenden Erfindung erfolgt. Wie nachstehend ausgeführt muss diese Komplementarität nicht perfekt sein; es kann eine beliebige Anzahl an Basenpaar-Fehlpaarungen geben, die die Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und den einstrangigen Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung stören. Ist die Anzahl der Mutationen jedoch so groß, dass eine Hybridisierung selbst unter den am wenigsten rauen Hybridisierungsbedingungen nicht mehr erfolgen kann, ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz.
Die Begriffe "erste Zieldomäne" und "zweite Zieldomäne" oder grammatikalische Äquivalente davon beziehen sich hierin auf zwei Teile einer Zielsequenz innerhalb einer untersuchten Nukleinsäure. Die erste Zieldomäne kann direkt an die zweite Zieldomäne angrenzen, oder die erste und die zweite Zieldomäne werden durch eine intervenierende Zieldomäne getrennt. Die Begriffe "erste" und "zweite" bezeichnen keine Orientierung der Sequenzen bezogen auf die 5'-3'-Orientierung der Zielsequenz. Geht man beispielsweise von einer 5'-3'-Orientierung der komplementären Zielsequenz aus, kann die erste Zieldomäne entweder 5' zur zweiten Domäne oder 3' zur zweiten Domäne liegen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich teilweise auf die ortsselektive Modifikation von Nukleinsäuren mit aktiven Redox-Gruppen, wie z. B. Übergangsmetall-Komplexen, zur Herstellung einer neuen Reihe von Biomaterialien, die zum Elektronentransfer über weite Distanzen durch eine Nukleinsäurenmatrix fähig sind. Die vorliegende Erfindung sieht die präzise Anordnung von Elektronentransferdonor- und -akzeptorgruppen an vorbestimmten Stellen auf einer einstrangigen oder doppelstrangigen Nukleinsäure vor. Im Allgemeinen erfolgt zwischen Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen in einer Doppelhelix-Nukleinsäure kein Elektronentransfer in nennenswerter Geschwindigkeit, es sein denn, in der Sequenz zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor liegt in der Doppelhelix-Struktur eine Nukleotid-Basenpaarung vor.
Diese differentielle Elektronentransfergeschwindigkeit bildet die Basis für einen Nutzen der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung als Sonde. Im System der vorliegenden Erfindung, in welchem Elektronentransfergruppen kovalent an die Hauptkette einer Nukleinsäure gebunden sind, wandern die Elektronen vermutlich über die π-Orbitale der gestapelten Basenpaare der doppelstrangigen Nukleinsäure. Die Elektronentransfergeschwindigkeit hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Entfernung zwischen dem Elektronendonor-Akzeptor-Paar, der freien Energie (ΔG) der Reaktion, der Reorganisationsenergie (λ), dem Beitrag des intervenierenden Mediums, der Orientierung und elektronischen Kupplung des Donor- und Akzeptor-Paars sowie der Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Basen. Letztere überträgt auf die tatsächliche Nukleinsäurensequenz eine Abhängigkeit, da A-T-Paare eine Wasserstoffbrückenbindung weniger enthalten als C-G-Paare. Diese Sequenzabhängigkeit wird durch die Feststellung überschattet, dass es einen messbaren Unterschied zwischen der Geschwindigkeit des Elektronentransfers innerhalb einer DNA-Basenpaar-Matrix und der Geschwindigkeit durch die Ribose-Phosphat-Hauptkette, das Lösungsmittel und andere Elektronentunnel gibt. Man nimmt an, dass dieser Geschwindigkeitsunterschied durch die gestapelten Nukleotidbasen zumindest um mehrere, sogar um bis zu vier Größenordnungen stärker ausgeprägt ist als im Vergleich dazu auf anderen Elektronentransferwegen. Somit kann das Vorhandensein von doppelstrangigen Nukleinsäuren, z. B. in Gensondentests, durch Vergleich der Geschwindigkeit des Elektronentransfers für die nicht-hybridisierte Sonde mit der Geschwindigkeit für die hybridisierte Sonde bestimmt werden.
In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung neue Gensonden vor, die in der Molekularbiologie und der diagnostischen Medizin nützlich sind. In dieser Ausführungsform werden einstrangige Nukleinsäuren mit einer vorbestimmten Sequenz und kovalent gebundenen Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen synthetisiert. Die Sequenz wird basierend auf einer bekannten Zielsequenz so ausgewählt, dass, wenn Hybridisierung an eine komplementäre Zielsequenz im Bereich zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor erfolgt, der Elektronentransfer in signifikanter und detektierbarer Geschwindigkeit erfolgt. Somit findet die vorliegende Erfindung eine breite allgemeine Verwendung als neue Form einer markierten Gensonde. Zusätzlich erlauben die Sonden der vorliegenden Erfindung die Detektion von Zielsequenzen ohne Entfernung der nicht-hybridisierten Sonde, da detektierbarer Elektronentransfer in nicht-hybridisierten Sonden nicht festzustellen ist. Somit ist die vorliegende Erfindung auch für automatisierte Gensondentests in einzigartiger Weise geeignet.
Die vorliegende Erfindung findet auch als eine einzigartige Methode für die Detektion von Mutationen in Zielnukleinsäurensequenzen Anwendung. Wird eine einstrangige Nukleinsäure, die Elektronentransfergruppen enthält, an eine Zielsequenz mit einer Mutation hybridisiert, nimmt die sich daraus ergebende Störung der Basenpaarung der Nukleotide beträchtlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit des Elektronentransfers. Dies ist der Fall, wenn die Mutation eine Substitution, eine Insertion oder eine Deletion ist. Demnach sieht die vorliegende Erfindung die Detektion von Mutationen in Zielsequenzen vor.
Somit stellt die vorliegende Erfindung extrem spezifische und sensitive Sonden bereit, die in manchen Ausführungsformen Zielsequenzen ohne Entfernung der nicht-hybridisierten Sonde detektieren. Dies ist bei der Herstellung automatisierter Gensondentests zweckdienlich.
In einer alternativen Ausführungsform weisen doppelstrangige Nukleinsäuren kovalent gebundene Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen an gegenüberliegenden Strängen auf. Solche Nukleinsäuren sind dafür zweckdienlich, erfolgreiche Genamplifikation bei Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) festzustellen. Enthält beispielsweise einer der zwei PCR-Primer einen an 5' terminal gebundenen Elektronendonor, und enthält der andere einen 5'-terminal gebundenen Elektronenakzeptor, so erzeugen einige PCR-Runden doppelt markierte Doppelstrang-Fragmente (welche gelegentlich als "Amplicons" bezeichnet werden). Nach geeigneter Photoinduktion stellt die Detektion des Elektronentransfers eine Anzeige für die erfolgreiche Amplifikation der Zielsequenz im Vergleich zu jenem Fall dar, wo keine Amplifikation erfolgt ist. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Trennung der Einstrang-Primer von der amplifizierten Doppelstrang-DNA nicht erforderlich ist, wie dies oben für Sondensequenzen, die Elektronentransfergruppen enthalten, bereits ausgeführt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Doppelstrang- Nukleinsäuren mit kovalent gebundenen Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen bereit, die als Biokonduktoren oder "molekularer Draht" dienen. Der Elektronentransport kann über Entfernungen von bis zu 28 Å und darüber hinaus pro Elektronendonor- und -akzeptorpaar erfolgen. Zusätzlich ist die Geschwindigkeit des Elektronentransfers sehr schnell, obwohl sie von der Entfernung zwischen den Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen abhängig ist. Indem die Nukleinsäure in regelmäßigen Abständen mit Elektronendonor- und/oder Elektronenakzeptorgruppen modifiziert wird, kann es möglich sein, die Elektronen über weite Entfernungen zu transportieren, auf welche Weise Biokonduktoren erzeugt werden. Diese Biokonduktoren sind in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich traditioneller Anwendungen für Leiter, so etwa als Mediatoren für elektrochemische Reaktionen und Prozesse.
Weiters können diese Biokonduktoren als Sonden für Photosynthese-Reaktionen wie auch in der Konstruktion von synthetischen Lichtemissionssystemen zweckdienlich sein. Die gegenwärtigen Modelle für die Elektronentransferkomponente eines künstlichen Lichtemissionssystems weisen einige Probleme auf, wie sie schon vorab ausgeführt wurden, einschließlich der Abhängigkeit von Polarität und Zusammensetzung des Lösungsmittels und dem Fehlen ausreichender Starrheit ohne schwierige Synthese. Somit ist die vorliegende Erfindung sowohl als neue Form eines Biokonduktorens wie auch als neue Gensonde zweckdienlich.
Zusätzlich dazu stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren für die ortsspezifische Addition an die Ribose-Phosphat-Hauptkette einer Nukleinsäure von Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen an das zuvor modifizierte Nukleotid bereit.
In einer Ausführungsform werden die Elektronendonor- und -akzeptorgruppen an den 3'- und/oder den 5'-Terminus der Nukleinsäure hinzugefügt. In alternativen Ausführungsformen werden die Elektronendonor- und -akzeptorgruppen an die Hauptkette einer oder mehrere innerer Nukleotide, d. h. jedes Nukleotid, das nicht das 3'- oder 5'- terminale Nukleotid ist, angefügt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Elektronendonor- und -akzeptorgruppen an die Hauptkette der inneren als auch terminalen Nukleotide angefügt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Übergangsmetall-Elektronentransfergruppen durch ein Verfahren angebunden, welches modifizierte Nukleotide, vorzugsweise aminomodifizierte Nukleotide, verwendet. In dieser Ausführungsform werden die Elektronentransfergruppen an die Zucker-Phosphat-Hauptkette über die Stickstoffgruppe in den Phosphoramid-Bindungen angebunden. Die modifizierten Nukleotide werden daraufhin verwendet, um eine Übergangsmetall-Elektronentransfergruppe entweder an den 3'- oder den 5'-Terminus der Nukleinsäure oder an ein beliebiges anderes, inneres Nukleotid anzufügen.
Molekularmechanische Berechnungen zeigen, dass die Störungen aufgrund der Modifikation der terminalen Nukleotide von Nukleinsäuren minimal sind und dass die Watson-Crick-Basenpaarung nicht unterbrochen ist (unveröffentlichte Daten unter Verwendung von Biograf von Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, USA). Demgemäß werden in einer Ausführungsform modifizierte Nukleotide dazu verwendet, eine Elektronentransfergruppe an den 5'-Terminus einer Nukleinsäure anzufügen. In dieser Ausführungsform wird die 2'-Position der Ribose des Desoxyribo- oder Ribonukleosids vor der Hinzufügung der Elektronentransferspezies modifiziert, wobei die 3'-Position der Ribose für eine nachfolgende Kettenanbindung unmodifiziert bleibt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Aminogruppe an den 2'-Kohlenstoff des Zuckers unter Verwendung bekannter chemischer Techniken addiert (Imazawa et al., J. Org. Chem. 44, 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4), 714 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36 (2), 250 (1971)).
Sind die modifizierten Nukleotide hergestellt, geschützt und aktiviert, können sie in ein wachsendes Oligonukleotid durch Standardsynthesetechniken (Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", Eckstein (Hrsg.), IRL Press, Oxford, UK (1984)) als 5'- terminales Nukleotid aufgenommen werden. Dieses Verfahren ermöglicht somit die Addition einer Übergangsmetell-Elektronentransfergruppe an den 5'-Terminus einer Nukleinsäure.
In einen alternativen Ausführungsform wird das 3'-terminale Nukleosid modifiziert, um eine Übergangsmetall-Elektronentransfergruppe hinzuzufügen. In dieser Ausführungsform wird das 3'-Nukleosid entweder am 2'- oder 3-Kohlenstoff des Ribosezuckers modifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Aminogruppe an den 2'- oder 3'-Kohlenstoff des Zuckers unter Verwendung bekannter chemischer Techniken angefügt (Imazawa et al., J. Org. Chem. 44, 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4), 714 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36 (2), 250 (1971)).
Die oben angeführten Verfahren sind sowohl auf DNA- als auch RNA-Derivate anwendbar, wie dies in Fig. 3 gezeigt ist.
Die aminomodifizierten Nukleotide können wie oben beschrieben in die 2'- oder 3'- modifizierte Nukleotid-Triphosphat-Form unter Verwendung biochemischer Standardverfahren umgewandelt werden (Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4, 2671 (1973)). Ein oder mehrere modifizierte Nukleoside werden daraufhin an das 3'-Ende unter Anwendung molekularbiologischer Standardverfahren angefügt, wie z. B. unter Verwendung des Enzyms DNA-Polymerase I oder terminaler Desoxynukleotidyltransferase (Ratliff, "Terminal deoxynucleotidyltransferase", "The Enzymes", Bd. 14A, P. D. Boyer (Hrsg.), 105-118, Academic Press, San Diego, CA, USA (1981)).
In anderen Ausführungsformen werden die Übergangsmetall-Elektronentransfergruppe oder -gruppen an die Mitte der Nukleinsäure zugefügt, d. h. an ein inneres Nukleotid. Dies kann auf drei Arten erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Oligonukleotid am 5'-Terminus wie oben beschrieben aminomodifiziert. In dieser Ausführungsform verlängert die Oligonukleotid-Synthese einfach das 5'-Ende am aminomodifizierten Nukleotid unter Verwendung von Standardtechniken. Dies resultiert in einem intern aminomodifiziertem Oligonukleotid.
In einer anderen Ausführungsform werden Elektronentransfergruppen an die Hauptkette an einer anderen Stelle als an der Ribose angefügt. So können beispielsweise Phosphoramid- anstelle von Phosphodiesterbindungen als Stelle für die Übergangsmetallmodifikation verwendet werden. Diese Übergangsmetalle dienen als Donoren und Akzeptoren für Elektronentransferreaktionen. Während strukturelle Abweichungen von eigenen Phosphodiester-Bindungen auftreten und mittels DC und NMR untersucht wurden (Heller, Acc. Chem. Res. 23, 128 (1990); Schuhmann et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 1394 (1991)), wurde berichtet, dass die Phosphoramidit-Internukleotid-Bindung an komplementäre Polynukleotide bindet und stabil ist (Beaucage et al., s.o., sowie Verweise darin; Letsinger, s.o.; Sawai, s.o.; Jager, Biochemistry 27, 7237 (1988)). In dieser Ausführungsform werden Dimere von Nukleotiden mit Phosphoramid-Bindungen entweder an den 2'-5'- oder 3'-5'-Positionen erzeugt. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet die 3'-5'-Position für die Phosphoramid-Bindung, so dass strukturelle Zerstörung der anschließenden Watson-Crick-Basenpaarung minimiert wird. Diese Dimereinheiten werden in eine wachsende Oligonukleotid-Kette eingebaut, wie oben ausgeführt, in festgelegten Intervallen, wie zuvor erläutert.
Es ist anzumerken, dass es möglich ist, eine Nukleinsäure zu erzeugen, die eine Elektronentransferspezies am vorletzten 3'-Terminus-Nukleotid aufweist, wenn die oben angeführten Techniken für die Modifikation von inneren Resten verwendet werden. Dadurch wird der Bedarf für zusätzliche Schritte zur Produktion der 3'-terminal markierten Nukleotide eliminiert.
In einer weiteren Ausführungsform für die Modifikation innerer Reste, werden 2'- oder 3'-modifizierte Nukleosid-Triphosphate unter Verwendung der Techniken, die vorab für die 3'-Nukleotidmodifikation beschrieben wurden, erzeugt. Die modifizierten Nukleoside werden intern in eine Nukleinsäure insertiert, wobei molekularbiologische Techniken zur DNA- und RNA-Markierung eingesetzt werden. Enzyme, die als derartige Markierung verwendet werden, umfassen DNA-Polymerasen, wie z. B. Polymerase I, T4- DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, TAq-DNA-Polymerase, reverse Transkriptase, und RNA-Polymerasen, wie z. B. E. coli RNA-Polymerase oder die PNA-Polymerasen der Phagen SP6, T7 oder T3 ("Short Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (Hrsg.), 3.11.-3.30 (1992)).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen an das modifizierte Nukleotid durch Verfahren gebunden, die einen einzigartigen Schutz-Hybridisierungsschritt verwenden. In dieser Ausführungsform wird die modifizierte einstrangige Nukleinsäure an eine unmodifizierte komplementäre Sequenz hybridisiert. Diese blockiert die Stellen auf den heterozyklischen Basen, die für die Übergangsmetall-Elektronentransferspezies für einen Angriff zugänglich sind. Der freiliegende Amino- oder andere Ligand an der 2'- oder 3'-Stelle der Ribose, die Phosphoramid-Bindungen oder die anderen Bindungen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, werden leicht mit einer Vielzahl von Übergangsmetall-Komplexen mittels Techniken, die auf diesem Fachgebiet allgemein bekannt sind, modifiziert (siehe z. B. Millet et al., "Metals in Biological Systems", Sigel et al. (Hrsg.), Bd. 27, 223-264, Marcell Dekker Inc., New York (1991); und Durham et al., "ACS Advances in Chemistry Series", Johnson et al. (Hrsg.), Bd. 226, 180-193, American Chemical Society, Washington D. C.; und Meade et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 4353 (1989)). Nach erfolgreicher Hinzufügung des gewünschten Metallkomplexes wird die modifizierte Duplex-Nukleinsäure in einzelne Stränge getrennt, wozu auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Techniken eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden einstrangige Nukleinsäuren hergestellt, welche eine Elektronendonorgruppe und eine Elektronenakzeptorgruppe enthalten. Die Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen können am 5'- oder 3'-Ende der einstrangigen Nukleinsäure angebracht werden. Alternativ dazu können die Elektronentransfergruppen an innere Nukleotide gebunden werden, oder eine an ein inneres Nukleotid und die andere an ein terminales Nukleotid. Es versteht sich, dass die Orientierung der Elektronentransferspezies bezogen auf die 5'- 3'- Orientierung der Nukleinsäure nicht determinierend ist. Somit kann wie in Fig. 1 ausgeführt jede beliebige Kombination innerer und terminaler Nukleotide in dieser Ausführungsform verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden einstrangige Nukleinsäuren mit zumindest einer Elektronendonorgruppe und zumindest einer Elektronenakzeptorgruppe verwendet, um Mutationen in einer komplementären Zielsequenz zu detektieren. Eine Mutation, sei es eine Substitution, Insertion oder Deletion eines Nukleotids oder von Nukleotiden, resultiert in einer unkorrekten Basenpaarung in einer hybridisierten Doppelhelix der Nukleinsäure. Demgemäß wird der Elektronentransfer eliminiert oder reduziert, so dass eine Änderung in der relativen Geschwindigkeit zu erkennen ist, wenn der Weg eines Elektrons von einer Elektronendonorgruppe zu einer Elektronenakzeptorgruppe den Bereich überspannt, in welchem die Fehlpaarung liegt. Aus diesem Grund wird in dieser Ausführungsform die Elektronendonorgruppe an die Nukleinsäure an der 5'-Position von der Mutation und die Elektronenakzeptorgruppe an der 3'-Position oder umgekehrt gebunden.
In dieser Ausführungsform ist es auch möglich, eine zusätzliche Markierung auf der modifizierten einstrangigen Nukleinsäure zu verwenden, um Hybridisierung dort zu detektieren, wo ein oder mehrere Fehlpaarungen auftreten. Enthält die komplementäre Zielnukleinsäure eine Mutation, wird der Elektronentransfer reduziert oder eliminiert. Zur Kontrolle kann die modifizierte einstrangige Nukleinsäure eine Strahlen- oder Fluoreszenzmarkierung erhalten, so dass Hybridisierung gemäß traditioneller molekularbiologischer Techniken an der Zielsequenz nachgewiesen werden kann. Dies ermöglicht die Bestimmung, dass die Zielsequenz existiert, aber eine Substitution, Insertion oder Deletion eines oder mehrere Nukleotide enthält. Alternativ dazu können einstrangige Nukleinsäuren mit zumindest einer Elektronendonorgruppe und einer Elektronenakzeptorgruppe, die an Bereiche mit exakten Gegenstücken hybridisieren, als Kontrolle für das Vorhandensein einer Zielsequenz verwendet werden.
Es ist zu verstehen, dass die Geschwindigkeit des Elektronentransfers durch eine doppelstrangige Nukleinsäurenhelix von der Nukleotiddistanz zwischen den Elektronendonor- und -akzeptorgruppen abhängt. Längere Entfernungen weisen langsamere Geschwindigkeiten auf, und für die Konstruktion von Sonden und Biokonduktoren geben diese Geschwindigkeiten einen Parameter ab. Obwohl es möglich ist, Geschwindigkeiten für Entfernungen von über 100 Nukleotiden zu messen, sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Elektronendonorgruppe und die Elektronenakzeptorgruppe mindestens 3 und nicht mehr als 100 Nukleotide beabstandet. Vorzugsweise sind die Gruppen 8 bis 64 Nukleotide beabstandet, wobei 15 die bevorzugteste Entfernung darstellt.
Zusätzlich ist anzumerken, dass gewisse Entfernungen die Verwendung verschiedener Detektionssysteme erlauben können. So kann beispielsweise die Sensitivität mancher Detektionssysteme die Detektion extrem schneller Geschwindigkeiten ermöglichen; d. h. die Elektronentransfergruppen können sehr eng beieinander liegen. Andere Detektionssysteme können geringfügig langsamere Geschwindigkeiten erfordern und erlauben auf diese Weise den Elektronentransfergruppen, weiter beabstandet zu sein.
In einer anderen Ausführungsform wird eine einstrangige Nukleinsäure mit mehr als einer Elektronendonor- oder -akzeptorgruppe modifiziert. So können beispielsweise zahlreiche Sets von Elektronendonor-Akzeptorpaaren verwendet werden, um das von diesen Sonden erhaltene Signal zu verstärken oder die erforderliche Detektorsensitivität zu senken.
Wie zuvor ausgeführt werden in manchen Ausführungsformen verschiedene Elektronentransfergruppen an eine einstrangige Nukleinsäure addiert. Wenn beispielsweise eine Elektronendonorgruppe und eine Elektronenakzeptorgruppe oder verschiedene Elektronendonoren und Elektronenakzeptoren angefügt werden sollen, erfolgt die Synthese der einstrangigen Nukleinsäure in mehreren Schritten. Zuerst werden Teile von Nukleinsäuresequenzen hergestellt, die jeweils eine einzelne Elektronentransferspezies enthalten, d. h. entweder eine einzelne Transfergruppe oder einige derselben Transfergruppen, wobei die oben beschriebenen Techniken eingesetzt werden. Danach werden diese Teilnukleinsäuresequenzen unter Verwendung allgemein bekannter Techniken ligiert, beispielsweise durch Hybridisierung der einzelnen modifizierten Teilnukleinsäuren an einen komplementären einfachen Strang, gefolgt von Ligation mit einer im Handel erhältlichen Ligase.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden einstrangige Nukleinsäuren hergestellt, die eine Elektronendonorgruppe oder eine Elektronenakzeptorgruppe enthalten. Die Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen werden entweder an das 5'- oder das 3'-Ende der einstrangigen Nukleinsäure gebunden. Alternativ dazu wird die Elektronentransfergruppe an ein inneres Nukleotid gebunden.
Es ist zu verstehen, dass verschiedene Arten von Elektronendonor- und -akzeptorgruppen an eine einstrangige Nukleinsäure gebunden werden körnen. Somit können mehrere Typen von Elektronendonorgruppen oder Elektronenakzeptorgruppen an eine beliebige einstrangige Nukleinsäure gebunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine erste einstrangige Nukleinsäure hergestellt, an die eine oder mehrere Elektronendonorgruppen gebunden sind. Eine zweite einstrangige Nukleinsäure weist eine oder mehrere Elektronenakzeptorgruppen auf. In dieser Ausführungsform werden die einstrangigen Nukleinsäuren hergestellt, um einen Einsatz als Sonden für eine komplementäre Zielsequenz zu finden. In einer Ausführungsform setzt sich die komplementäre Zielsequenz aus einer ersten Zieldomäne und einer zweiten Zieldomäne zusammen, wobei die erste und zweite Sequenz direkt benachbart sind. In dieser Ausführungsform hybridisiert die erste modifizierte einstrangige Nukleinsäure, die nur Elektronendonorgruppen oder Elektronenakzeptorgruppen enthält, jedoch nicht beide gleichzeitig, an die erste Zieldomäne, und die zweite modifizierte einstrangige Nukleinsäure, die nur die entsprechenden Elektronentransferspezies enthält, bindet sich an die zweite Zieldomäne. Die relative Orientierung der Elektronentransferspezies ist nicht von Bedeutung, wie in Fig. 2 ausgeführt, und die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, alle möglichen Orientierungen zu umfassen.
Für den Entwurf der Sonden, die sich aus zwei einstrangigen Nukleinsäuren zusammensetzen, die an benachbarte erste und zweite Zielsequenzen hybridisieren, sollten gewisse Faktoren in die Überlegungen mit einbezogen werden. Diese Faktoren umfassen die Distanz zwischen der Elektronendonorgruppe und der Elektronenakzeptorgruppe in der hybridisierten Form sowie die Länge der individuellen einstrangigen Sonden. So kann es beispielsweise erwünscht sein, nur 5'-terminal markierte Sonden zu synthetisieren. In diesem Fall kann die einstrangige Nukleinsäure, die an die erste Sequenz hybridisiert, relativ kurz sein, so dass die gewünschte Entfernung zwischen den Sonden erreicht werden kann. Beträgt die optimale Distanz zwischen den Elektronentransfergruppen beispielsweise 15 Nukleotide, kann die erste Sonde 15 Nukleotide lang sein.
In einem Aspekt dieser Ausführungsform werden die zwei einstrangigen Nukleinsäuren, die an die benachbarten ersten und zweiten Zielsequenzen hybridisiert sind, vor der Elektronentransferreaktion mit einander ligiert. Dies kann unter Verwendung molekularbiologischer Techniken mit Hilfe einer DNA-Ligase, wie z. B. einer T4-DNA-Ligase, erfolgen.
In einer alternativen Ausführungsform weist die komplementäre Zielsequenz eine erste Zieldomäne, eine intervenierende Zieldomäne und eine zweite Zieldomäne auf. In dieser Ausführungsform hybridisiert die erste modifizierte einstrangige Nukleinsäure, die nur Elektronendonorgruppen oder Elektronenakzeptorgruppen enthält, aber nicht beide, an die erste Zieldomäne, und die zweite modifizierte einstrangige Nukleinsäure, die nur die entsprechenden Elektronentransferspezies enthält, bindet sich an die zweite Zieldomäne. Hybridisiert eine intervenierende einstrangige Nukleinsäure an die intervenierende Zielsequenz, ist ein Elektronentransfer zwischen Donor und Akzeptor möglich. Die intervenierende Sequenz kann jede beliebige Länge aufweisen und kann ein einziges Nukleotid umfassen. Ihre Länge sollte jedoch die gewünschten Entfernungen zwischen der Elektronendonor- und der Elektronenakzeptorgruppe auf der ersten und zweiten modifizierten Nukleinsäure berücksichtigen. Intervenierende Sequenzen mit Längen von über 14 sind erwünscht, da die intervenierende Sequenz in diesem Fall eher dazu neigt, hybridisiert zu bleiben, um eine doppelstrangige Nukleinsäure zu bilden, wenn längere intervenierende Sequenzen verwendet werden. Das Vorhandensein oder Fehlen einer intervenierenden Sequenz kann dazu dienen, Insertionen und Deletionen nachzuweisen.
In einem Aspekt dieser Ausführungsform können die erste einstrangige Nukleinsäure, die an die erste Zieldomäne hybridisiert, die intervenierende Nukleinsäure, die an die intervenierende Domäne hybridisiert, und die zweite einstrangig Nukleinsäure, die an die zweite Zieldomäne hybridisiert, vor der Reaktion des Elektronentransfers ligiert werden. Dies kann unter Verwendung molekularbiologischer Techniken erfolgen. Wenn die Nukleinsäuren DNA sind, kann eine DNA-Ligase, wie z. B. eine T4-DNA-Ligase, verwendet werden.
Die komplementäre einstrangige Zielnukleinsäure der vorliegenden Erfindung kann viele Formen annehmen. So kann die komplementäre einstrangige Zielnukleinsäure beispielsweise in einer größeren Nukleinsäuresequenz enthalten sein, d. h. unter anderem ein ganzes Gen oder eine ganze mRNA oder ein Teil davon, ein Restriktionsfragment eines Plasmids oder einer genomischen DNA. Fachleute auf dem Gebiet der Molekularbiologie verstehen, wie zweckdienliche Sonden für eine Vielzahl von Zielsequenzen unter Anwendung der vorliegenden Erfindung zu konstruieren sind.
In einer Ausführungsform weisen zwei einstrangige Nukleinsäuren mit kovalent gebundenen Elektronentransfergruppen komplementäre Sequenzen auf, so dass sie aneinander hybridisieren können, um einen Biokonduktor zu bilden. In dieser Ausführungsform ist der hybridisierte Duplex dazu fähig, mindestens ein Elektron von der Elektronendonorgruppe auf die Elektronenakzeptorgruppe zu übertragen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen einstrangigen Nukleinsäuren so ausgerichtet, dass sie stumpfe Enden aufweisen; in alternativen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren so ausgerichtet, dass die Doppelhelix kohäsive Enden aufweist. In beiden Ausführungsformen wird eine nicht unterbrochene Doppelhelix-Basenpaarung zwischen der Elektronendonorgruppe und der Elektronenakzeptorgruppe bevorzugt, so dass Elektronen durch die gestapelten Basenpaare wandern können.
In einer Biokonduktor-Ausführungsform umfasst die doppelstrangige Nukleinsäure eine einstrangige Nukleinsäure, die alle Elektronentransfergruppen trägt. In einer anderen Ausführungsform können die Elektronentransfergruppen auf jedem Strang und in jeder Orientierung getragen werden. So kann beispielsweise ein Strang nur Elektronendonoren tragen, und der andere kann nur Elektronenakzeptoren tragen, oder beide Stränge können sowohl Elektronendonoren als auch -akzeptoren tragen.
In einer Ausführungsform kann die doppelstrangige Nukleinsäure verschiedene Elektronentransfergruppen kovalent in einer fixierten Orientierung gebunden aufweisen, um den Transfer von Elektronen über lange Entfernungen zu erleichtern. Diese Systemart zieht ihren Vorteil aus der Tatsache, dass Elektronentransferspezies abhängig von ihrem Oxidationszustand sowohl als Elektronendonoren als auch als Elektronenakzeptoren fungieren können. So kann eine Elektronendonorgruppe nach dem Verlust eines Elektrons auch als Elektronenakzeptor wirken und umgekehrt. Somit können die Elektronentransfergruppen sequentiell an beiden Strängen der doppelstrangigen Nukleinsäure orientiert sein, so dass gerichteter Transfer eines Elektrons über eine sehr weite Entfernung erzielt werden kann. So könnte beispielsweise eine doppelstrangige Nukleinsäure eine einzelne Elektronendonorgruppe an einem Ende und Elektronenakzeptorgruppen derselben oder einer anderen Zusammensetzung über das Molekül verteilt enthalten. Auf diese Weise könnte ein Kaskadeneffekt des Elektronentransfers erzielt werden, der zu Transfer von Elektronen über extrem weite Strecken führen kann.
Die Wahl der jeweiligen Elektronendonor- und Elektronenakzeptorpaare wird durch die Art der eingesetzten Elektronentransfermessung beeinflusst; für einen Überblick siehe Winkler et al., Chem. Rev. 92, 369-379 (1992). Kann ein langlebiger angeregter Zustand an einer der Redox-Stellen hergestellt werden, so kann eine direkte Messung der Geschwindigkeit des Elektronentransfers nach Photoinduktion erfolgen, z. B. unter Verwendung des Flash-Quenching-Verfahrens von Chang et al., J. Amer. Chem. Soc. 113, 7057 (1991). In dieser bevorzugten Ausführungsform kann die angeregte Redox-Stelle, die sowohl ein besserer Akzeptor als auch Donor als die Spezies im Grundzustand ist, Elektronen auf den oder vom Redox-Partner übertragen. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die zwei Elektronentransfergeschwindigkeiten gemessen werden können die photoinduzierten Elektronentransfergeschwindigkeiten und die thermischen Elektron-Lücken- Rekombinationsreaktionen. Somit können für hybridisierte Nukleinsäuren mit perfekter Komplementarität und für Nukleinsäuren mit Fehlpaarungen unterschiedliche Geschwindigkeiten gemessen werden.
In alternativen Ausführungsformen weist keine Redox-Stelle einen langlebigen angeregten Zustand auf, und Elektronentransfermessungen hängen von der biomolekularen Erzeugung eines kinetischen Zwischenprodukts ab. Um einen Überblick zu gewinnen, siehe Winkler et al., s.o. Dieses Zwischenprodukt entspannt: daraufhin über intramolekularen Elektronentransfer zum thermodynamischen Produkt, wobei ein Quencher verwendet wird, wie nachfolgend ersichtlich:
D-A + hν → D-A
D-A + Q → D-A&spplus; + Q&supmin;
D-A&spplus; → D&spplus;-A
D&spplus;-A + Q&supmin; → D-A + Q
Die Obergrenze für messbare intramolekulare Elektronentransfergeschwindigkeiten unter Anwendung dieses Verfahrens liegt bei etwa 10&sup4; pro Sekunde.
Alternative Ausführungsformen verwenden die Impuls-radiolytische Erzeugung von reduzierenden oder oxidierenden Resten, die Elektronen in einen Donor injizieren oder Elektronen aus einem Donor entfernen, wie dies von Winkler et al., s.o., beschrieben wurde.
Der Elektronentransfer wird mit Hilfe von elektrischer, elektrochemischer, Photonen- (einschließlich Laser-) oder chemischer Aktivierung der Elektronentransfergruppen eingeleitet. Diese Ereignisse werden durch Änderungen in der vorübergehenden Absorption oder durch Fluoreszenz, Phosphoreszenz oder Chemolumineszenz der Elektronentransfergruppen nachgewiesen.
In der bevorzugten Ausführungsform erfolgt Elektronentransfer nach Photoinduktion mit einem Laser. In dieser Ausführungsform können Elektronendonorgruppen nach Abgabe eines Elektrons unter gewissen Bedingungen als Elektronenakzeptoren wirken. Auf ähnliche Weise können Elektronenakzeptorgruppen unter gewissen Umständen als Elektronendonoren dienen.
In einer bevorzugten Ausführung wird die DNA durch Hinzufügen von Elektronendonor- und Elektronenakzeptorgruppen modifiziert. In einer alternativen Ausführungsform wird RNA modifiziert. In einer weiteren Ausführungsform enthält eine doppelstrangige Nukleinsäure, die als Biokonduktor verwendet werden soll, einige Desoxyribosenukleotide, einige Ribosenukleotide und ein Gemisch aus Adenosin-, Thymidin-, Cytosin-, Guanin- und Uracil-Basen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung besitzen die bevorzugten Formulierungen für Donoren und Akzeptoren ein Übergangsmetall, das kovalent an eine Reihe von Liganden und weiters kovalent an eine Aminogruppe als Teil des Riboserings (2'- oder 3'- Position) oder an ein Stickstoff- oder Schwefelatom als Teil eines Nukleotiddimers, das über eine Peptid-, Phosphoramidat-, Thiophosphat-, Dithiophosphat- oder O-Methylphosphoramidat-Bindung verbunden ist, gebunden.
Eine allgemeine Formel, die für eine Klasse von Donoren und Akzeptoren repräsentativ ist, die eingesetzt werden können, wird in Fig. 4A gezeigt. In dieser Figur kann M Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe oder Ru sein, wobei Ru am meisten bevorzugt ist. Die Gruppen R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; können jeder beliebige koordinierende Ligand sein, der dazu fähig ist, sich kovalent an das gewählte Metall zu binden, und sie können Liganden wie etwa NH&sub3;, Pyridin, Isonicotinamid, Imidazol, Bipyridin und substituierte Derivate von Bipyridinen und Phenanthrolinen, substituierte Derivate von Phenanthrolinen und Porphyrinen sowie substituierte Derivate der Porphyrinfamilie umfassen. Die Struktur einer Ruthenium-Elektronentransferspezies, die Bisbipyridin und Imidazol als Liganden verwendet, wird in Fig. 4B gezeigt. Spezifische Beispiele zweckdienlicher Elektronentransferkomplexe umfassen jene, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, sind aber nicht darauf beschränkt.

Tabelle 1

Donoren Akzeptoren

Ru(bpy)&sub2;im-NH&sub2;-U Ru(NH&sub3;)&sub5;-NH&sub2;-U
Ru(bpy)&sub2;im-NH&sub2;-U Ru(NH&sub3;)&sub4;py-NH&sub2;-U
Ru(bpy)&sub2;im-NH&sub2;-U Ru(NH&sub3;)&sub4;im-NH&sub2;-U

mit:

Ru = Ruthenium
bpy = Bisbipyridin
im = Imidazol
py = Pyridin
Es ist zu verstehen, dass die Anzahl der möglichen Elektronendonorgruppen und Elektronenakzeptorgruppen sehr groß ist, und dass Fachleute auf dem Gebiet der Elektronentransferverbindungen eine Reihe der Verbindungen in der vorliegenden Erfindung einsetzen können.
Eine der Elektronentransfergruppen ist eine Elektrode. Befindet sich die andere Elektronentransfergruppe in Lösung, wird das System als heterogenes System bezeichnet, zum Unterschied zu einem homogenen System, in welchem die Elektronendonor- und Elektronentransfergruppen in derselben Phase vorliegen.
Die verwendeten Techniken sind Analogien zur Verdrahtung von Proteinen mit einer Elektrode, nur dass die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung und kein Redox-Protein verwendet werden (siehe z. B. Gregg et al., J. Phys. Chem. 95, 5970 (1991); Heller et al., Sensors and Actuators R. 13-14, 180 (1993); und Pishko et al., Anal. Chem. 63, 2268 (1991)). Vorzugsweise wird ein Redox-Polymer, wie z. B. ein Poly(vinylpyridin)- komplex aus Os(bpy)&sub2;Cl, mit einem Epoxid wie etwa Diepoxid vernetzt, um einen leitenden Redox-Epoxidzement zu bilden, der zu einer starken Bindung mit Elektroden aus einem leitenden Material, wie z. B. Gold, Kohlenstoffglas, Graphit und anderen leitenden Materialien, fähig ist. Diese starke Bindung ist in der Definition "kovalent gebunden" umfasst. Das Epoxid-Vernetzungspolymer wird daraufhin beispielsweise mit einem freien Amin umgesetzt, wie z. B. dem Amin einer aminomodifizierten Nukleinsäure, wie sie oben beschrieben wurde, das kovalent die Nukleinsäure mit dem Komplex verbindet, wodurch ein "Redox-Hydrogel" auf der Oberfläche der Elektrode ausgebildet wird. Weitere Informationen hinsichtlich der Immobilisierung von DNA auf Elektroden sind in Electroanal. 5, 929 (1992), oder in der EP-A-478.319 zu finden.
In dieser Ausführungsform wird eine einstrangige Nukleinsäurensonde, die zumindest eine Elektronentransfergruppe enthält, über dieses Redox-Hydrogel mit der Oberfläche einer Elektrode verbunden. Hybridisierung einer Zielsequenz kann daraufhin als Funktion der Leitfähigkeit zwischen der Elektronentransfergruppe, die kovalent an ein Ende der Nukleinsäure gebunden ist, und der Elektrode am anderen Ende gemessen werden. Dies kann unter Verwendung von Ausrüstung und Techniken, die auf dem Gebiet allgemein bekannt sind und beispielsweise in den oben zitierten Referenzen beschrieben werden, erfolgen.
In ähnlichen Ausführungsformen werden zwei Nukleinsäuren als Sonden, wie sie vorab beschrieben wurden, verwendet. So wird beispielsweise eine Nukleinsäure mit einer festen Elektrode verbunden, und die andere, die über eine kovalent gebundene Elektronentransfergruppe verfügt, ist frei in Lösung. Bei Hybridisierung einer Zielsequenz werden die zwei Nukleinsäuren so ausgerichtet, dass ein Elektronentransfer zwischen der Elektronentransfergruppe der hybridisierten Nukleinsäure und der Elektrode erfolgt. Der Elektronentransfer wird wie zuvor ausgeführt oder unter Verwendung amperometrischer, potentiometrischer oder konduktometrischer elektrochemischer Sensoren nachgewiesen, die auf dem Gebiet allgemein bekannte Technologien verwenden.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung angegeben, obwohl, wie in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angemerkt, eine Elektronentransfergruppe, die an einen Nukleinsäurestrang gebunden ist, eine Elektrode ist.

Beispiele

Die aminomodifizierten Monomereinheiten werden durch Variation von veröffentlichten Verfahren hergestellt und durch Standard-Synthesetechniken in ein wachsendes Nukleotid eingebaut. Das Verfahren ist sowohl auf DNA- als auch RNA-Derivate anwendbar.

Beispiel 1

Synthese eines Oligonukleotid-Duplex mit Elektronentransfergruppen an den 5'-Termini

In diesem Beispiel wurde eine doppelstrangige Nukleinsäure mit acht Nukleotiden hergestellt, wobei jeder einzelne Strang eine einzelne Elektronentransfergruppe aufwies, die am 2'-Kohlenstoff des Ribosezuckers an das 5'-terminale Uridinnukleotid kovalent gebunden ist.

Stufe 1: Synthese von 5'-Di(p-methoxyphenyl)methylether-2'-(trifluoracetamido)- 2'-desoxyuridin

2'-(Trifluoracetamido)-2'-desoxyuridin (2,0 g, 5,9 mMol), hergestellt durch geringe Modifikation von veröffentlichten Verfahren (Imazawa, s.o.), wurde der minimalen Menge an sehr trockenem CH&sub3;CN wiederholt gelöst und in einem Rotationsverdampfer getrocknet und daraufhin an eine Inertatmosphären-Vakuumleitung transferiert, wo es 1 Stunde lang weiter getrocknet wurde. Das folgende Verfahren zur Synthese des Materials wurde von Gait (s.o.) adaptiert: Unter positivem Argondruck wurde das Material in frisch getrocknetem und destilliertem Pyridin gelöst, und unter Rühren wurden 0,05 (Gewichts-) Äquivalente 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 1,5 Äquivalente Triethylamin (TEA) und 1, 2 Äquivalente 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (DMTr-Cl) dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Fortschreiten der Reaktion wurde mittels Kieselgel-DC (mobile Phase: Methylenchlorid : Methanol = 98 : 2) überwacht. Nach 30 Minuten wurden jeweils weitere 0,5 Äquivalente von DMTr-Cl und TEA zugesetzt, und die Reaktion wurde weitere drei Stunden lang laufen gelassen. Diesem Reaktionsgemisch wurde dasselbe Volumen an Wasser zugesetzt und die Lösung einige Male mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen wurde in einem Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft, in der minimalen Menge an Methylenchlorid erneut gelöst und mittels Flash-Chromatographie (mobile Phase: Methylenchlorid : Methanol = 99 : 1) gereinigt, um 5'-Di(p-methoxyphenyl)methylether-2'-(trifluoracetamido)-2'-desoxyuridin als Produkt zu erhalten.

Stufe 2 : 5'-2'-Aminouridin-GCTACGA und

5'-2'-Aminouridin-CGTAGCA

5'-Di(p-methoxyphenyl)methylether-2'-(trifluoracetamido)-2'-desoxyuridin wurde unter reduziertem Druck (Glas) getrocknet, in frisch getrocknetem und destilliertem CH&sub3;CN gelöst, danach in eine eigens angefertigte konische Phiole eingefüllt und auf einem ABI- DNA-Synthesizer angeordnet. Das Programm zur Herstellung von Standard-Oligonukleotiden (d. h. unmodifizierten Oligonukleotiden) wurde während der Addition der letzten Base (aminomodifiziert) auf eine 15-30-minütige Kupplungszeit geändert. Das Oligonukleotid wurde von der Säule nach Standardverfahren abgespalten und mittels C-18- RP-HPLC gereinigt. Auf diese Weise wurden 5'-2'-Aminouridin-GCTACGA und 5'-2'- Aminouridin-CGTAGCA hergestellt. Zusätzlich wurden unmodifizierte komplementäre Stränge zu beiden Produkten in der nachfolgenden Synthese der Elektronentransfergruppe verwendet.

Stufe 3 : 5'-2'-Ruthenium-bisbipyridinimidazol-aminouridin-GCTACGA

5'-2'-Aminouridin-GCTACGA, das im vorangegangenen Schritt hergestellt wurde, wurde mittels Standardtechniken an den komplementären unmodifizierten Strang anneliert. Alle Manipulationen des annelierten Duplex erfolgten vor der Zugabe des Übergangsmetallkomplexes bei 4ºC. Um zu gewährleisten, dass die DNA während der Modifizierung anneliert bleibt, wurden die Reaktionen in 1 M Salz ausgeführt. Die aminomodifizierte 5'-Duplex-DNA wurde in 0,2 M HEPES, 0,8 M NaCl bei einem pH-Wert von 6,8 gelöst und wiederholt auf einer Schlenk-Linie evakuiert. Zuvor hergestelltes Rutheniumbisbipyridincarbonat wurde im obigen Puffer gelöst, und Sauerstoff wurde durch wiederholtes Evakuieren und Spülen mit Argon über eine Schlenk-Leitung entfernt. Der Ruthenium-Komplex wurde in die DNA-Lösung über Kanülierung (Argon/Vakuum) transferiert, und die Reaktion wurde unter positivem Argondruck unter Rühren 24 Stunden lang ablaufen gelassen. Diesem Reaktionsgemisch wurden 50 Mol Imidazol in den Kolben zugesetzt, und die Reaktion wurde weitere 24 Stunden lang ablaufen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde von der Vakuumleitung entfernt und auf eine PD-10-Gelfiltrationssäule aufgetragen und mit Wasser eluiert, um überschüssigen Ruthenium-Komplex zu entfernen. Das Volumen der gesammelten Fraktionen wurde über einen SpeedVac bis zur Trockene eingeengt, und der Feststoff wurde in 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAC) mit einem pH von 6,0 aufgenommen. Die Duplex-DNA wurde 15 Minuten lang mit 50% Formamid auf 60ºC erhitzt, um die Duplex zu denaturieren. Die einstrangige DNA wurde mittels einer C-18-RP-HPLC-Säule, die mit einem Diodenarraydetektor ausgestattet war, gereinigt, wobei ein Gradient von 335% Acetonitril in 0,1 M TEAC, pH 6,0, eingesetzt wurde.

Stufe 4 : 5'-2'-Ruthenium-tetraminpyridin-aminouridin-CGTAGCA

5'-Aminouridin-CGTAGCA (0,3 um) wurde in 0,2 M HEPES und 0,8 M NaCl-Puffer, pH 6,8, gelöst und an der Vakuumleitung entgast. In einen 10 ml Spitzkolben, der mit einem Rührstäbchen und einem Septum versehen war, wurde aufgeschlämmtes Ru(III)- tetraaminpyridin-chlorid (10 um) im selben Puffer zugesetzt. In einem separaten Kolben wurde Zn/Hg-Amalgam hergestellt und unter reduziertem Druck getrocknet, daraufhin wurde die Ruthenium(III)-Lösung (über Kanülierung) zum Zn/Hg-Amalgam transferiert. Die spontane Bildung einer klaren, gelben Lösung (λMAX = 406 nm) zeigte, dass die reduzierte Form des Rutheniums erhalten worden war, und die Reaktion wurde weitere 30 Minuten lang ablaufen gelassen. Diese Lösung wurde in den Kolben transferiert, der die aminomodifizierte DNA enthielt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden unter Argon ablaufen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde von der Vakuumleitung entfernt, und ein 50-facher Kobalt-EDTA-Überschuss (Kirschner, Inorganic Synthesis, 186 (1957)) wurde der Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde daraufhin auf eine Sephadex-G-25-Gelfiltrationssäule aufgebracht, um den überschüssigen Ruthenium- Komplex zu entfernen und, wie dies oben beschrieben wurde, mittels RP-HPLC weiter zu reinigen. Die zwei Ruthenium-modifizierten Nukleotide wurden durch Standardtechniken anneliert und charakterisiert (siehe Beispiel 5).

Beispiel 2

Synthese von Lang-DNA-Duplexen mit Elektronentransfergruppen an den 5'-Termini

In diesem Beispiel wird eine in vitro-DNA-Amplifikationstechnik, PCR (siehe Abramson et al., Curr. Op. in Biotech. 4, 41-47 (1993)) verwendet, um modifizierte Duplex-DNA mittels Polymerisation von Nukleotiden zu erzeugen, die außerhalb der modifizierten Primerstränge lagen (Saiki et al., Science 239, 487 (1988)). Zwei Oligonukleotide mit einer Länge von 18 Basen und nicht komplementär zueinander wurden mittels Aminomodifikation an der 2'-Ribose-Stelle der 5'-Nukleotide synthetisiert wie in Beispiel 1 beschrieben.
Eine Reihe von Oligonukleotiden zunehmender Länge, beginnend mit 40 Basen, wird chemisch mittels Standardchemie synthetisiert. Jedes der PCR-Template besitzt eine 5'- Sequenz, die mit einem modifizierten 18-mer identisch ist. Das 3'-Ende des Templat- Oligonukleotids besitzt jeweils eine Sequenz, die mit dem anderen 18-mer komplementär ist.
PCR erzeugt rasch eine modifizierte Duplex-DNA durch Katalyse der 5'-3'-DNA-Synthese außerhalb jedes der modifizierten 18-mere, wobei der unmodifizierte Strang als Templat verwendet wird. 100 nMol jedes der zwei modifizierten 18-mere werden in 1 ml einer wässrigen Lösung eingemischt, die 2.000 Einheiten Taq-Polymerase, jeweils 0,2 M Desoxyribonukleosidtriphosphate, 50 mM KCl, 10 mM Tris-CI, pH 8,8, 1,5 mM MgCl&sub2;, 3 mM Dithiothreitol und 0,1 mg/ml Rinderserenalbumin enthält. 1 fMol des Templatstrangs mit einer Länge von 40 Basen wird dem Gemisch zugefügt. Die Probe wird 1 Minute lang zur Denaturierung auf 94ºC erhitzt, daraufhin zwei Minuten auf 55ºC zur Annelierung und drei Minuten auf 72ºC zur Verlängerung. Dieser Zyklus wird 30 Mal wiederholt, wobei ein automatisierter Thermocycler verwendet wird.
Die amplifizierten Templatsequenzen mit Übergangsmetall-Komplexen and beiden 5'- Termini werden mittels Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und direkt in Elektronentransferanwendungen verwendet.

Beispiel 3

Synthese von kovalent gebundenen Elektronentransfergruppen an Internukleotid-Bindungen der Duplex-DNA

In diesem Beispiel werden alternative Hauptketten für Phosphodiester-Bindungen von Oligonukleotiden eingesetzt. Funktionelle Gruppen, die in diese Internukleotid-Bindungen eingebaut sind, dienen als Stelle für eine kovalente Anbindung der Elektronentransfergruppen. Diese alternierenden Internukleotid-Bindungen umfassen Peptid-, Phosphoramidat-, Thiophosphat-, Dithiophosphat- und O-Methylphosphoramidat-Bindungen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Herstellung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) folgt in der Literatur beschriebenen Verfahren (siehe Engholm, s.o.) unter Synthese des Boc-geschützten Pentafluorphenylesters der ausgewählten Base (Thymidin). Die sich daraus ergebende PNA kann hergestellt werden, indem Merrifields Festphasenansatz eingesetzt wird (Merrifield, Science 232, 341 (1986)), wobei eine einzige Kupplungsvorschrift mit 0,1 M des Thyminyl-Monomers in 30 Vol.-% DMF in CH&sub2;Cl&sub2; verwendet wurde. Der Fortschritt der Reaktion wird mittels quantitativer Ninhydrin-Analyse verfolgt (Sann, Anal. Biochem. 117, 147 (1981)). Die resultierende PNA kann mit einem geeigneten Übergangsmetall-Komplex, wie in Beispiel 1 angeführt, modifiziert werden.
Die Synthese von Phosphoramidat- (Beaucage, s.o.; Letsinger, s.o.; Sawai, s.o.) und N- Alkylphosphoramidat- (Jager, s.o.) Internukleotid-Bindungen folgt den in der Literatur beschriebenen Standardverfahren, mit Ausnahme einer geringfügigen Modifikation (die Verfahren werden nach Addition einer einzelnen Base an den festen Träger angehalten und abgespalten, um ein Dinukleotid-Phosphoramidat zu erhalten). Ein typisches Beispiel ist die Herstellung des Phenylesters von 5'O-Isobutyloxycarbonylthymidyl-(3'-5')- 5'-amino-5'-desoxythymidin (Letsinger, J. Org. Chem., s.o.). Die Dimereinheiten werden mit Standard-Oligonukleotiden an ausgewählten Intervallen während der Herstellung der DNA unter Verwendung etablierter automatisierter Techniken substituiert. Modifikationen der modifizierten Bindungen mit Übergangsmetallen erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Synthese von Thiophosphat- und Dithiophosphat- (Eckstein, s.o., und Verweise darin) Internukleotid-Bindungen ist allgemein gut dokumentiert. Eine veröffentlichte Vorschrift verwendet einen Applied Biosystems-DNA-Synthesizer, der einen modifizierten β-Cyanoethylphosphoramidit-Zyklus verwendet, der nach Schwefelung mit Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) verlappt (Iyer, J. Org. Chem. 55, 4693 (1990)). Die Thiophosphat- und Dithiophosphat-Analoge werden als Dimere hergestellt, von den festen Trägern abgespalten und mittels HPLC (Acetonitril/Triethylammoniumacetat als mobile Phase) gereinigt.

Beispiel 4

Synthese von zwei Oligonukleotiden, die jeweils eine Elektronentransfergruppe am 5'-Terminus aufweisen

In diesem Beispiel werden zwei Oligonukleotide hergestellt, die ohne intervenierende Sequenzen an eine einzige Zielsequenz hybridisieren. Ein Oligonukleotid weist eine Elektronendonorgruppe auf, die kovalent an den 5'-Terminus gebunden ist, und das andere weist eine kovalent an den 5'-Terminus gebundene Elektronenakzeptorgruppe auf. In diesem Beispiel sind die Elektronentransferspezies über ein Uradin-Nukleotid gebunden, aber für Fachleute auf dem Gebiet der Technik versteht es sich, dass die vorliegenden Verfahren eingesetzt werden können, um jedes beliebige Nukleotid zu modifizieren. Zusätzlich erkennt der Fachmann, dass das Verfahren nicht auf die Herstellung von 8-meren beschränkt ist, sondern zur Herstellung von Oligonukleotid-Sonden verschiedener Längen dient.
Das Verfahren verläuft exakt wie im Beispiel 1, nur dass die erzeugten 8-mere nicht komplementär zueinander sind, sondern stattdessen komplementär zu einer Zielsequenz aus 16 Nukleotiden sind. Somit wird der Endschritt des Annelierens der Stufe 4 aus Beispiel 1 nicht durchgeführt. Stattdessen werden die zwei modifizierten Oligonukleotide an die Zielsequenz anneliert, und der sich daraus ergebende Komplex ist wie in Beispiel 5 charakterisiert.

Beispiel 5

Charakterisierung der modifizierten Nukleinsäuren

Enzymatische Spaltung

Die modifizierten Oligonukleotide aus Beispiels 1 wurden einem Verfahren der enzymatischen Spaltung unterzogen, wobei bekannte Verfahren angewandt wurden, und sie wurden durch sequentielle Reaktion mit Phosphodiesterase und alkalischer Phosphatase in ihre konstituierenden Nukleoside umgewandelt. Durch Vergleich der in Versuchen gewonnenen integrierten HPLC-Profile und UV-Vis-Spektren der gespaltenen Oligonukleotide mit Standards (umfassend 2'-Aminouridin und 2'-Aminoadenin) wurde die Gegenwart einer aminomodifizierten Base zur vorhergesagten Retentionszeit und in den charakteristischen UV-Vis-Spektren bestätigt. Ein identisches Verfahren wurde an der mit Übergangsmetallen modifizierten Duplex-DNA ausgeführt, und Zuweisungen der konstituierenden Nukleoside zeigten einzelne Modifikationen an der vorhergesagten Stelle.

Fluoreszenzmarkierte, aminomodifizierte Oligonukleotide

Es wurde gezeigt, dass das Fluorchrom, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), beim Markieren von primären Aminen auf modifizierten Oligonukleotiden spezifisch ist, weil es sich nicht an in den Nukleotidbasen vorhandene Amine oder Amide bindet (Haugland, "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 5. Aufl. (1992)). Diese Reaktion wurde durchgeführt, indem das wie in Beispiel 1 synthetisierte Amino-Oligonukleotid und an einer identischen Basensequenz verwendet wurde, ohne dass die 2'- Aminoribose-Gruppe vorhanden war. Fluoreszenzspektroskopische Messungen wurden an beiden Oligonukleotiden durchgeführt, und die Ergebnisse bestätigen die Gegenwart des Amins auf dem 5'-terminalen Ribosering.

Thermodynamische Schmelzkurven der modifizierten Duplex-DNA

Eine bekannte Technik zur Messung thermodynamischer Parameter der Duplex-DNA ist die Erfassung von DNA-Schmelzkurven. Eine Reihe von Schmelzkurven als Funktion der Konzentration der modifizierten Duplex-DNA wurde über temperaturgesteuerte UV-Vis gemessen (Hewlett-Packard), wobei in der Technik allgemein verbreitete Verfahren eingesetzt wurden. Diese Resultate bestätigen, dass Hybridisierung der aminomodifizierten und Übergangsmetall-modifizierten DNA stattgefunden hat. Zusätzlich zeigen diese Ergebnisse, dass die modifizierte DNA im Vergleich zum Stabilitätsstandard der unmodifizierten Oligonukleotide einen stabile Duplex bildet.

Zweidimensionale Kernresonanz- (NMR-) Spektroskopie

Die aminomodifizierten Oligonukleotide, die als Teil dieser Arbeit synthetisiert wurden, wurden in ausreichenden Mengen (6 uMol) hergestellt, um die Zuweisung der ¹H-Protonen-NMR-Spektren unter Verwendung eines 600 MHz-Varian-NMR-Spektrometers zu erlauben.

Messung der Geschwindigkeit des Elektronentransfers

Ein ausgezeichneter Überblick über die Messtechniken findet sich bei Winkler et al., Chem. Rev. 92, 369-379 (1992). Der Donor ist Ru(bpy)&sub2;(NHuridin)im, Eº ~ 1 V, der Akzeptor ist Ru(NH&sub3;)&sub4;py(NHuridin)im, Eº ~ 330 mV. Die gereinigten Übergangsmetall-modifizierten Oligonukleotide (UNHRu(bpy)2imGCATCGA und UNHRu(NH3)4(py)imCGATGCA wurden anneliert, indem ein äquimolares Gemisch der Oligonukleotide (30 uM: 60 nMol der DNA in 2 ml Pufferlösung) in pH 6,8 (100 mM NaPi, 900 mM NaCl) 10 Minuten lang auf 60ºC erhitzt wurde und danach über einen Zeitraum von 4 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Die Lösung wurde daraufhin in eine Inertatmosphärenküvette, die mit Adaptern zum Anschluss einer Vakuumleitung und einem Magnetrührstäbchen ausgerüstet ist, transferiert. Die Lösung wurde einige Male entgast, und die dicht verschlossenen Vorrichtung wiederholt mit Ar-Gas wiederbefüllt.
Die gesamte Vorrichtung wurde in eine Küvettenhalterung als Teil der Anlage eingesetzt, wobei ein gepulster XeCl-Excimer-Farblaser eingesetzt und die Daten bei verschiedenen Wellenlängen, umfassend 360, 410, 460 und 480 nm, erfasst wurden. Die Geschwindigkeit des photoinduzierten Elektronentransfers beträgt 1,6 · 10&sup6; s&supmin;¹ über eine Entfernung von 28 Å.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend eine erste und eine zweite Elektronentransfergruppe, worin entweder die erste oder die zweite Gruppe eine Elektronendonorgruppe ist und die andere aus der ersten und der zweiten Elektronentransfergruppe eine Elektronenakzeptorgruppe ist, worin die erste Gruppe eine Elektrode ist, die an einen Nukleinsäurestrang gebunden ist, und worin die zweite Gruppe kovalent an den Nukleinsäurestrang gebunden ist.

2. Zusammensetzung, umfassend eine erste und eine zweite Elektronentransfergruppe, worin entweder die erste oder die zweite Gruppe eine Elektronendonorgruppe ist und die andere aus der ersten und der zweiten Elektronentransfergruppe eine Elektronenakzeptorgruppe ist, worin die erste Gruppe eine Elektrode ist, die an einen ersten Nukleinsäurestrang gebunden ist, und worin die zweite Gruppe kovalent an einen zweiten Nukleinsäurestrang gebunden ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin der erste und der zweite Nukleinsäurestrang fähig sind, an jeweilige benachbarte erste und zweite Zieldomänen innerhalb einer Zielsequenz in einer dritten Nukleinsäure zu hybridisieren.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin der erste und der zweite Nukleinsäurestrang fähig sind, aneinander zu hybridisieren.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin ein solcher Nukleinsäurestrang eine Ribose-Phosphat-Hauptkette umfasst.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin eine solche Elektronentransfergruppe an der 2'- oder 3'-Position einer Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette gebunden ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin ein solcher Nukleinsäurestrang ein Nukleinsäureanalog umfasst.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Nukleinsäureanalog eine Peptidnukleinsäure umfasst.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin eine solche Elektronentransfergruppe ein Übergangsmetallkomplex ist.

10. Verfahren zum Detektieren einer Zielsequenz in einer Nukleinsäureprobe, umfassend:

(a) das Hybridisieren von Nukleinsäure einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 an die Zielsequenz, sofern vorhanden, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden;

(b) das Detektieren von Elektronentransfer zwischen der Elektronendonor- und der Elektronenakzeptorgruppe.

11. Verfahren zum Detektieren einer Zielsequenz in einer Nukleinsäureprobe, worin die Zielsequenz eine erste Zieldomäne und eine zweite Zieldomäne umfasst, die zur ersten Zieldomäne benachbart ist, worin das Verfahren umfasst:

(a) das Hybridisieren eines solchen ersten Nukleinsäurestrangs einer Zusammensetzung nach Anspruch 3 an die erste Zieldomäne;

(b) das Hybridisieren eines zweiten solchen Nukleinsäurestrangs einer Zusammensetzung nach Anspruch 3 an die zweite Zieldomäne; und

(c) das Detektieren von Elektronentransfer zwischen der Elektronendonor- und der Elektronenakzeptorgruppe der ersten und des zweiten Nukleinsäurestrangs.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der erste und der zweite Nukleinsäurestrang vor dem Detektieren ligiert werden.

13. Verfahren zum Detektieren einer Zielsequenz in einer Nukleinsäureprobe, umfassend:

(a) das Hybridisieren eines solchen ersten Nukleinsäurestrangs einer Zusammensetzung nach Anspruch 4 an eine Zielsequenz innerhalb eines zweiten Nukleinsäurestrangs einer Zusammensetzung nach Anspruch 4; und

(b) das Detektieren von Elektronentransfer zwischen der Elektronendonor- und der Elektronenakzeptorgruppe des ersten und des zweiten Nukleinsäurestrangs.

14. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend:

(a) das Aufnehmen eines ersten modifizierten Nukleotids in einen Nukleinsäurestrang;

(b) das Hybridisieren des Nukleinsäurestrangs mit einem komplementären Nukleinsäurestrang, um doppelstrangige Nukleinsäure zu bilden;

(c) das Anbinden einer Elektronentransfergruppe über das erste modifizierte Nukleotid;

(d) das Trennen des modifizierten Nukleinsäurestrangs vom komplementären unmodifizierten Nukleinsäurestrang;

(e) das Binden des Nukleinsäurestrangs an eine Elektrode.

15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend:

(a) das Binden eines ersten Nukleinsäurestrangs an eine Elektrode;

(b) das Aufnehmen eines ersten modifizierten Nukleotids in einen zweiten Nukleinsäurestrang;

(c) das Hybridisieren des zweiten Nukleinsäurestrangs an einen komplementären Nukleinsäurestrang, um doppelstrangige Nukleinsäure zu bilden;

(d) das Anbinden einer Elektronentransfergruppe über das erste modifizierte Nukleotid;

(e) das Abtrennen des modifizierten zweiten Nukleinsäurestrangs vom komplementären unmodifizierten Nukleinsäurestrang.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der erste und der zweite Nukleinsäurestrang fähig sind, an jeweilige benachbarte erste und zweite Zieldomänen innerhalb einer Zielsequenz in einer dritten Nukleinsäure zu hybridisieren.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin der erste und der zweite Nukleinsäurestrang fähig sind, aneinander zu hybridisieren.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, worin ein solcher Nukleinsäurestrang eine Ribose-Phosphat-Hauptkette umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin eine solche Elektronentransfergruppe an der 2'- oder 3'-Position einer Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette gebunden ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, worin ein solcher Nukleinsäurestrang ein Nukleinsäureanalog umfasst.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Nukleinsäureanalog eine Peptidnukleinsäure umfasst.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, worin eine solche Elektronentransfergruppe ein Übergangsmetallkomplex ist.