DE60123056T2

DE60123056T2 - Basenanaloge

Info

Publication number: DE60123056T2
Application number: DE60123056T
Authority: DE
Inventors: Amersham Pharmacia Biotech Shiv Piscataway KUMAR; Amersham Pharmacia Biotech Mark Piscataway MCDOUGALL; Amersham Pharmacia Biotech Satyam Piscataway NAMPALLI; Amersham Pharmacia Biotech Constantin Piscataway NEAGU; David Loakes; Dan Brown
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2021-06-30
Also published as: DK1296997T3; EP1296997A1; US6664058B2; GB0016258D0; DE60123056D1; WO2002002584A1; JP2004502701A; ATE339434T1; US20020137695A1; ES2271036T3; CA2412292A1; EP1296997B1; AU2001269264A1

Description

Einführung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, zum Beispiel modifizierte Basenanaloga, welche verwendet werden können, um Nukleinsäuren zu markieren, die in einer breiten Vielzahl molekularbiologischer Anwendungen eingesetzt werden können.
Hintergrund
Nukleinsäuremoleküle, die mit Reportergruppen markiert sind, wurden in vielen molekularbiologischen Verfahren verwendet, wie zum Beispiel der Sequenzierung und in Hybridisierungsstudien. Die markierten Nukleinsäuremoleküle wurden durch verschiedene Verfahren hergestellt. Diese Verfahren umfassten markierte Nukleoside, Desoxynukleoside oder Didesoxynukleosidtriphosphate, markierte Phosphoramidite sowie eine direkte Kopplung der Markierungen an die Nukleinsäuren (Renz, EP 120 376 ). Die hergestellten, markierten Nukleotide und markierten Nukleinsäuremoleküle können in Hybridisierungsstudien mit Nukleinsäuren oder zum Sequenzieren der Nukleinsäuren verwendet werden. Eine breite Vielzahl von Markierungen wurde bei diesen Verfahren verwendet, einschließlich radioaktiver Isotope, zum Beispiel ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P und ³⁵S, Hapten, Biotin, Mass-Tags (absolut quantifizierte Peptide) oder Fluoreszenz.
Es gab ein zunehmendes Interesse an der Verwendung modifizierter Basen und Nukleotidanaloga bei der Markierung von Nukleinsäuren. Einige dieser Analoga sind basenspezifisch und können in Nukleinsäuren anstelle einer einzelnen, natürlichen Base eingebaut werden, d.h. A, T, G oder C. Andere Analoga besitzen das Potential, eine Basenpaarung mit mehr als einer natürlichen Base einzugehen, und können daher anstelle von mehr als einer natürlichen Base eingebaut werden.
WO 97/28177 offenbart Nukleosidanaloga, welche die Struktur enthalten:
wobei X ein O, S, Se, SO, CO oder NR⁷ ist,
R¹, R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind, und jeweils ein H, OH, F, NH₂, N₃, O-Kohlenwasserstoffrest oder eine Reportergruppe sind,
R⁵ ein OH oder ein Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Thiophosphat oder ein entsprechendes Boranphosphat ist,
oder einer der Reste R² und R⁵ ein Phosphoramidit ist,
Z ein O, S, Se, SO, NR⁹ oder CH₂ ist,
und R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ gleich oder verschieden sind, und jeweils ein H, Alkyl, Aryl oder eine Reportergruppe sind.
WO 99/06422 offenbart Basenanaloga der Struktur
wobei X = O oder NH oder S,
Y = N oder CHR⁶ oder CR⁶,
W = N oder NR⁶ oder CHR⁶ oder CR⁶,
n = 1 oder 2,
R⁶ jeweils unabhängig voneinander ein H oder O oder Alkyl oder Alkenyl oder Alkoxy oder Aryl oder ein Reporterrest ist,
wenn nötig (d.h., wenn Y und/oder W ein N oder CR⁶ ist) liegt eine Doppelbindung zwischen Y und W oder zwischen W und W vor,
und wobei Q ein Zucker oder Zuckeranalogon ist.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Verbindungen der Formel Formel (I)
wobei Q ein H oder ein Zucker oder ein Zuckeranalogon oder ein Rückgrat einer Nukleinsäure oder ein Rückgrat-Analogon ist, Y = O, S, NR¹⁰ ist, wobei R¹⁰ ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl ist, X ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl oder eine Kombination derselben oder bevorzugt eine Reportergruppe ist.
Genaue Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung neue Verbindungen der Formel (I) bereit, wobei Q ein H oder ein Zucker oder ein Zuckeranalogon oder ein Rückgrat einer Nukleinsäure oder ein Rückgrat-Analogon ist, Y = O, S, NR¹⁰ ist, wobei R¹⁰ ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl ist, X ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl oder eine Kombination derselben oder bevorzugt eine Reportergruppe ist. Die Reportergruppe kann mit dem Heterocyclus über einen geeigneten Linkerarm verbunden sein, welcher ähnlich zu den Optionen sein kann, die bereits für X definiert wurden, oder er kann größer sein. In dieser Hinsicht kann X in geeigneter Weise eine Kette von bis zu 30 Atomen umfassen, stärker bevor zugt eine Kette von bis zu 12 Atomen. Der Reporter kann mehr als 12 Atome umfassen. X kann ebenfalls eine geladene Gruppe enthalten, welche der Nukleotidbase eine positive oder negative Nettoladung verleiht.
In geeigneter Weise kann Q ein H oder eine Gruppe sein, die ausgewählt wird aus
wobei Z ein O, S, Se, SO, NR⁹ oder CH₂ ist, wobei R⁹ ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder ein Reporter ist,
R¹, R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils ein H, OH, F, NH₂, N₃, O-Kohlenwasserstoffrest, NHR¹¹ sind, wobei R¹¹ eine Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder eine Reportergruppe ist. In geeigneter Weise besitzt die Gruppe des Kohlenwasserstoffrestes bis zu 6 Kohlenstoffatome. R¹¹ und R⁹ können eine Kette von bis zu 30 Atomen, vorzugsweise von bis zu 12 Atomen umfassen.
R⁵ ist ein OH, SH oder NH₂ oder ein Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Thiophosphat oder ein entsprechendes Boranphosphat, oder einer der Reste R², R⁴ und R⁵ ist ein Phosphoramidit oder eine andere Gruppe zum Einbau in eine Polynukleotidkette, oder eine Reportergruppe;
oder Q kann eine der folgenden, modifizierten Zuckerstrukturen sein:
Acyclische Zucker mit den Strukturen (ii) oder (iii)
wobei R¹² ein C₁-C₄-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄-Alkyl oder H, vorzugsweise ein Methyl, Hydroxymethyl oder H ist, oder
Zucker mit den Strukturen (iv) bis (vi)
wobei R¹⁴ ein C₁-C₆-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkylamin, C₁-C₆-Carboxyalkyl oder vorzugsweise ein Reporterrest ist,
(vii) oder Q ist ein Rückgrat einer Nukleinsäure, das aus sich wiederholenden Einheiten von Zuckerphosphat oder sich wiederholenden Einheiten aus modifiziertem Zuckerphosphat (zum Beispiel LNA) (Koshkin et al., 1998, Tetrahedron 54, 3607–30) oder aus einem Rückgrat-Analogon, wie zum Beispiel Peptide oder Polyamidnukleinsäure (PNA) (Nielsen et al., 1991, Science 254, 1497–1500) oder aus einem polykationischen Ribonukleinsäure-Guanidin (RNG) (Bruice et al., 1995, PNAS 92, 6097) oder aus Pentopyranosyl-Oligonukleotiden (HNA) (Eschenmoser A., 1999, Science, 284, 2118–2124) besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn Q ein H ist, sind diese Verbindungen Basenanaloga. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform ist Q ein Zucker oder ein Zuckeranalogon oder ein modifizierter Zucker, zum Beispiel eine Gruppe mit einer Struktur gemäß (i) bis (vi), und die Verbindungen sind Nukleotidanaloga oder Nukleosidanaloga. Wenn Q ein Rückgrat einer Nukleinsäure oder ein Rückgrat-Analogon ist, oder gleich (vii) ist, werden diese Verbindungen nachfolgend Nukleinsäuren oder Polynukleotide genannt.
Wenn Q eine Gruppe der Struktur (i) aufweist, können R¹, R², R³ und R⁴ jeweils ein H, OH, F, NH₂, N₃, O-Alkyl oder ein Reporterrest sein. Somit werden Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside und Didesoxyribonukleoside zusammen mit anderen Nukleosidanaloga ins Auge gefasst. Diese Zuckersubstituenten können eine Reportergruppe zusätzlich zu einer beliebigen anderen enthalten, die auf dieser Base vorhanden sein kann. Vorzugsweise ist R¹ = H, R² = H, OH, F, N₃, NH₂, NH(CH₂)_nR¹³ oder O-(CH₂)_nNH₂, wobei n gleich 0–12 ist, R⁴ = H, OH, N₃, NH₂, F, OR¹³, R³ = H, OH oder OR¹³, wobei R¹³ ein Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder ein Reporter ist. Stärker bevorzugt ist mindestens einer der Reste R¹ und R² und mindestens einer der Reste R³ und R⁴ ein H.
R⁵ ist ein OH, SH, NH₂ oder ein Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Thiotriphosphat oder ein entsprechendes Boranphosphat. Wenn R⁵ ein Triphosphat ist, werden solche Triphosphatnukleotide in eine Polynukleotidkette eingebaut, indem ein geeigneter Templatprimer zusammen mit einer DNA-Polymerase oder reversen Transkriptase und geeigneten dNTPs und ddNTPs, falls nötig, eingesetzt werden. NTPs können mit geeigneten RNA-Polymerasen eingesetzt werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Standardtechnologien in ein PCR-Produkt eingebaut werden, oder zur Herstellung einer cDNA aus einem geeigneten RNA-Templat, Primer, dNTP-Mix und reverser Transkriptase verwendet werden. Oligonukleotid- und Polynukleotidketten können ebenso durch Nukleotidanaloga der vorliegenden Erfindung durch Verwendung einer terminalen Transferase verlängert werden.
In alternativer Weise kann einer der Reste R², R⁴ und R⁵ ein Phosphoramidit oder ein H-Phosphonat oder ein Methylphosphonat oder ein Phosphorthioat oder -Amid, oder eine ge eignete Verbindung zu einer festen Oberfläche, zum Beispiel ein mit Hemisuccinat behandeltes Glas mit kontrollierten Poren, oder eine andere Gruppe für den Einbau, der im Allgemeinen durch chemische Mittel erfolgt, in eine Polynukleotidkette sein. Die Verwendung von Phosphoramiditen und verwandten Derivaten bei der Synthese von Oligonukleotiden ist wohl bekannt und in der Literatur beschrieben.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Nukleosidanaloga oder Nukleotidanaloga, welche ein Basenanalogon wie definiert enthalten, das mit mindestens einer Reportergruppe markiert ist. Geeignete Reporterreste können aus verschiedenen Arten von Reportern ausgewählt werden. Die Reportergruppe kann ein Radioisotop sein, mittels dessen das Nukleosidanalogon leicht nachweisbar gemacht wird, zum Beispiel ein ³²P oder ³³P oder ³⁵S, die in eine Phosphat- oder Thiophosphat- oder Phosphoramidit- oder H-Phosphonat-Gruppe eingebaut sind, oder alternativ ein ³H oder ¹⁴C oder ein Iod-Isotop. Es kann ein Isotop sein, das mittels Massenspektrometrie oder NMR nachweisbar ist. Es kann eine Signalgruppe oder ein Rest sein, zum Beispiel ein Enzym, Hapten, Fluorophor, Chromophor, oder eine chemolumineszente Gruppe, eine Raman-Markierung oder eine elektrochemische Markierung. Besonders bevorzugte Reporter sind Fluoreszenzfarbstoffe, wie zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin, Bodipy und Cyanine.
Die Reportergruppe kann eine Signalgruppe oder einen Signalrest sowie eine Linkergruppe umfassen, die mit dem Rest des Moleküls verbunden ist. Die Linkergruppe kann eine Kette von bis zu 30 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefel-Atomen sein, und sie kann starr oder flexibel, gesättigt oder ungesättigt sein. Solche Linker sind für den Fachmann wohl bekannt. Die Linkergruppe kann eine endständige oder eine andere Gruppe aufweisen, zum Beispiel ein NH₂, OH, COOH, SH, Maleimid, Haloacetyl oder eine andere Gruppe, durch welche ein Signalrest vor oder nach dem Einbau des Nukleosidanalogons in eine Nukleinsäurekette gebunden sein kann. Es ist ebenfalls möglich, die Moleküle der vorliegenden Erfindung an eine feste Oberfläche über eine geeignete Linkergruppe wie vorstehend beschrieben zu verknüpfen.
Es ist ebenfalls möglich, dass die Moleküle der vorliegenden Erfindung selbst als Reporter wirken können. Antikörper können als ganze Moleküle oder als Teil des Moleküls, zum Bei spiel eine Ringstruktur oder ein modifizierter Zucker, herangezogen werden. Die Antikörper können selbst Markierungen tragen oder durch Sekundärantikörper anhand von Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, nachgewiesen werden. Diese Verfahren verwenden häufig einen enzymatischen Nachweis oder Fluoreszenz.
Die Nukleosidanaloga dieser Erfindung können in jeder der vorhandenen Anwendungen eingesetzt werden, welche native Nukleinsäuresonden verwenden, die mit Haptenen, Fluorophoren oder anderen Reportergruppen markiert sind. Diese umfassen Southern Blots, Dot Blots und Verfahren, die auf Polyacrylamid- oder Agarose-Gelen beruhen, oder Hybridisierungs-Assays in Lösung sowie andere Assays in Mikrotiterplatten oder Röhrchen, oder Assays von Oligonukleotiden oder Nukleinsäuren auf Arrays auf festen Trägern. Die Sonden können mittels Antikörper nachgewiesen werden, die entweder gegen Haptene gerichtet sind, welche mit dem Analogon verbunden sind, oder die gegen die Analoga selbst gerichtet sind. Der Antikörper kann mit einem Enzym oder Fluorophor markiert werden. Fluoreszenzdetektion kann ebenso verwendet werden, falls das Basenanalogon selbst fluoreszierend ist oder falls eine fluoreszierende Gruppe vorliegt, die mit dem Analogon verbunden ist.
Die Verwendung von unterschiedlichen Massen der Nukleosidanaloga kann ebenso beim Nachweis verwendet werden, sowie die Zugabe eines spezifischen Mass-Tags (eines genau quantifizierbaren Proteins), welcher eine Identifizierung erlaubt. Es wurden Verfahren für die Analyse und den Nachweis der Oligonukleotide, Nukleinsäurefragmente und der Produkte der Primerverlängerung beschrieben ( US 5,288,644 und WO 94/16101). Diese Verfahren beruhen in der Regel auf einer MALDI-ToF-Massenspektrometrie. Sie messen die gesamte Masse eines Oligonukleotids, und aus dieser kann die Sequenz des Oligonukleotids ermittelt werden. In manchen Fällen kann die Masse des Oligonukleotids oder des Fragments für eine spezifische Sequenz nicht eindeutig sein. Dieser Fall wird dann eintreten, wenn das Verhältnis der natürlichen Basen, ACGT in unterschiedlichen Sequenzen ähnlich ist. Zum Beispiel besitzt das einfache 4-mer Oligonukleotid dieselbe Masse wie 24 andere mögliche 4-mere, zum Beispiel CAGT, CATG, CGTA, etc..
Bei längeren Nukleinsäurefragmenten kann es schwierig sein, Unterschiede bezüglich der Masse zwischen zwei Fragmenten aufgrund eines Mangels an Auflösung im Massenspektrum bei höheren Molekulargewichten aufzulösen. Der Einbau von Basen-modifizierten Analoga entsprechend der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die spezifischen Oligonukleotide oder das Proteinsäurefragment zu identifizieren, da ihre Massen von jenen der natürlichen Basen verschieden sind. Zum Beispiel können die beiden Sequenzen ACGT und CAGT für den Fall ihres gleichzeitigen Vorliegens mittels Massenspektrometrie identifiziert werden, falls eines der natürlichen Nukleotide in einer der Sequenzen durch eines der Analoga der vorliegenden Erfindung ersetzt wird. Zum Beispiel kann in dem Oligonukleotid CAGT das T durch ein Analogon der vorliegenden Erfindung ersetzt werden, wobei nur eine geringe Auswirkung auf eine spezifische Anwendung gegeben ist, zum Beispiel bei der Hybridisierung oder dem enzymatischen Einbau. Schon jetzt können die beiden Sequenzen mittels Massenspektrometrie leicht identifiziert werden, weil sich die Masse aufgrund des Einbaus des Analogons verändert.
Die Modifikation kann an den Basen und ebenso an den Zuckern oder zwischen den Nukleotid-Verknüpfungen erfolgen. Zum Beispiel führen Thiozucker oder Phosphothioat-Verknüpfungen ebenso zu bestimmten Massenveränderungen. Eine breite Vielzahl von Veränderungen an der Base, dem Zucker oder dem Linker kann eine Anzahl von Molekülen mit unterschiedlichen Massen ergeben, welche nützlich sein werden, um eine spezifische Sequenz genau durch ihre Masse zu definieren, insbesondere bei einer Hybridisierung mit vielerlei verschiedenen Nukleinsäuren oder bei Sequenzierungsanwendungen.
RNA ist ein äußerst vielseitiges biologisches Molekül. Experimentelle Studien durch verschiedene Laboratorien haben gezeigt, dass an vitro Selektionsverfahren verwendet werden können, um kurze RNA-Moleküle aus RNA-Bibliotheken zu isolieren, welche mit hoher Affinität und Spezifität an Proteine binden, die normalerweise nicht mit RNA-Bindung assoziiert sind, einschließlich einiger Antikörper (Gold, Allen, Binkley et al., 1993, 497–510 in The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY; Gold, Polisky, Uhlenbeck und Yarus, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64: 763–795; Tuerk und Gold, 1990, Science 249: 505–510; Joyce, 1989, Gene 82: 83–87; Szostak, 1992, Trends Biochem. Sci. 17: 89–93; Tsai, Kenan und Keene, 1992, PNAS 89: 8864–8868; Doudna, Cech und Sullenger, 1995, PNAS 92: 2355–2359). Einige dieser RNA-Moleküle wurden als Kandidaten für Arz neimittel für die Behandlung von Krankheiten, wie zum Beispiel Myasthemia gravis oder einige andere Autoimmunkrankheiten, vorgeschlagen.
Das Grundprinzip beinhaltet die Zugabe einer RNA-Bibliothek zum Protein oder dem betreffenden Molekül. Es wird gewaschen, um nicht gebundene RNA zu entfernen. Anschließend wird die an das Protein oder das betreffende andere Molekül gebundene RNA spezifisch eluiert. Diese eluierte RNA wird dann revers transkribiert und mittels PCR amplifiziert. Die DNA wird dann unter Verwendung modifizierter Nukleotide (entweder 2'-Modifikationen, um eine Nukleaseresistenz zu ergeben, zum Beispiel 2'-F, 2'-NH₂, 2'-OCH₃ und/oder C5-modifizierte Pyrimidine und/oder C8-modifizierte Purine) transkribiert. Jene Moleküle, von denen gefunden wurde, dass sie das Protein oder das betreffende andere Molekül binden, werden kloniert und sequenziert, um nach gemeinsamen („consensus") Sequenzen zu suchen. Diese Sequenz wird optimiert, um ein kurzes Oligonukleotid zu erzeugen, welches eine verbesserte spezifische Bindung zeigt, welche dann als ein therapeutisches Mittel verwendet werden kann.
Die hier beschriebenen Basenanaloga werden die molekulare Diversität, die für dieses Auswahlverfahren verfügbar ist, signifikant erhöhen, wenn sie in das Ribonukleosidtriphosphat oder Ribonukleosidphosphoramidit überführt werden. Dies kann zu Oligonukleotiden mit erhöhter Bindungsaffinität gegenüber dem Zielmolekül führen, welche mit den derzeitigen Bausteinen nicht erhältlich ist.
Die Analoga der vorliegenden Erfindung können Eigenschaften aufweisen, welche von jenen der nativen Basen verschieden sind, und sie können andere, wichtige Anwendungen besitzen. Sie können auf dem Gebiet der Antisense-Technologie Anwendung finden. Sie können ebenso nützlich auf therapeutischem Gebiet als antivirale Mittel (anti-HIV-Mittel und und anti-HBV-Mittel, etc.) (WO 98/49177) sowie als Antikrebs-Mittel sein. Viele Nukleoside und Nukleotidanaloga wurden als antivirale Mittel entwickelt. Sie wirken häufig durch die Inhibition der Aktivität der DNA-Polymerase und/oder der reversen Transkriptase auf zahlreichen Wegen. Eine Zahl von Nukleosidanaloga, wie zum Beispiel AZT, ddC, ddI, D4T und 3TC werden allein oder in Kombination mit anderen Nukleosiden oder Nicht-Nukleosidanaloga als anti-HIV Mittel eingesetzt. Die Analoga der vorliegenden Erfindung können ebenso antivirale Aktivitäten allein oder in Kombination mit anderen Verbindungen aufweisen. Da die Kombinationstherapie mit Arzneimitteln häufiger verwendet wird, um virale Infektionen zu behandeln, ist eine erhöhte Anzahl von Verbindungen verfügbar, einschließlich der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche die Möglichkeit einer erfolgreichen Behandlung steigern können.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind Verbindungen der Formel (II)
wobei X die hier vorstehend definierte Bedeutung besitzt.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele weiter beschrieben werden.
Synthesebeispiel 1 Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido-[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (5)
(a) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (3)
7,1 g (20 mmol) 5-Iod(β-D-2-desoxyribofuranosyl)uridin, 2,32 g (2 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) und 0,76 g (4 mmol) Kupfer(I)iodid wurden unter Argon in ein Glasgefäß für Druckreaktionen mit 100 ml Fassungsvermögen gegeben. Wasserfreies DMF (50 ml) und Triethylamin (4,2 ml, 30 mmol) wurden anschließend in das Reaktionsgefäß eingespritzt. In die gerührte und gekühlte (0°C) Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang Propingas eingeleitet. Nach dem Abdichten des Druckgefäßes wurde die Temperatur der Reaktionspartner auf 55–60°C mit einem Ölbad erhöht. Man ließ die Reaktionsmischung unter diesen Bedingungen 18 Stunden lang rühren. Beim Abkühlen wurde beim Nachweis mittels dünnschichtchromatographischer Analyse kein Ausgangsmaterial nachgewiesen. Es wurden Methanol (25 ml), Chelex^TM 100 Harz (5 g, 200–400 mesh, Natrium-Form) und AG 1-X8 Harz (5 g, 20–50 mesh, Bicarbonat-Form) zu der Reaktionsmischung gegeben und behutsam 1 Stunde lang gerührt. Nach dem Filtrieren wurde die Lösung unter Hochvakuum zu einem Öl eingeengt. Der Rückstand wurde durch eine Säulenchromatographie mit Silica-Gel gereinigt (Chloroform: MeOH: 100 % bis 10 : 1) und ergab 5-Propinyl-(β-D-2-desoxyribofuranosyl)uridin (2) (rf: 0,4) als einen bräunlichen Schaum mit 45 % Ausbeute, und 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (3) (rf: 0,2) als einen gelben Feststoff in 50 % Ausbeute. 5-Propinyl-(β-D-2-desoxyribofuranosyl)uridin wurde zu 3-(β-D-2-desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on durch 2-stündiges Rückflusskochen in Methanol: Triethylamin (7 : 3), das 5 % Kupfer(I)iodid enthielt, umgesetzt. Nach der Säulenchromatographie wurde eine Ausbeute von 61 % erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆): 2,06 (m, 1H, 2'), 2,33 (s, 3H, Me), 3,38 (m, 1H, 2'), 3,65 (m, 2H, 5'), 3,91 (q, 1H, 4'), 4,24 (m, 1H, 3'), 5,09 (t, 1H, OH-5'), 5,26 (d, 1H, OH-3'), 6,18 (t, 1H, 1'), 6,41 (s, 1H, H-5), 8,66 (s, 1H, H-4). ¹³C NMR (DMSO-d₆): 29,8 (Me), 40,3 (2'), 60,8 (5'), 69,9 (3'), 85,3 (1'), 88,1 (4'), 88,8 (C-5), 98,3 (C-4a), 144,8 (C-4), 147,8 (C-6), 150,1 (C-2), 162,1 (C-7a).
(b) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-bydro-3-metbyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (4)
Zu 500 mg (1,35 mmol) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (3) in einem 25 ml Rundkolben wurden 6 ml wasserfreies Hydrazin gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rühren. Das überschüssige Hydrazin wurde anschließend durch Verdampfung unter Hochvakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie mit Silica-Gel gereinigt (Chloroform: MeOH: 10 : 1), um ein cremefarbenes, kristallines Produkt mit 85 % Ausbeute zu ergeben. Kristalle, die sich für eine Röntgenstrukturanalyse eigneten, wurden aus Methanol erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,80 (m, 1H, 2'), 2,14 (m, 1H, 2'), 2,49 (s, 3H, Me), 3,49 (m, 2H, 5'), 3,62 (q, 1H, 4'), 4,16 (m, 1H, 3'), 4,40 (s, 2H, H-5), 4,79 (t, 1H, OH-5'), 5,13 (d, 1H, OH-3'), 6,24 (t, 1H, 1'), 7,34 (s, 1H, H-4), 10,29 (bs, 1H, NH-8). ¹³C NMR (DMSO-d₆): 21,1 (Me), 35,1 (2'), 47,8 (C-5), 61,8 (5'), 70,6 (3'), 83,1 (1'), 86,0 (4'), 120,8 (C-4a), 124,8 (C-4), 151,8 (C-7), 153,2 (C-3), 155,2 (C-8a).
(c) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (5)
Zu 140 mg (0,5 mmol) getrocknetem 6-(β-D-2-Desoxyfuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (4) in einem 50 ml Rundkolben wurden 5 ml Trimethylphosphat unter Argon gegeben. Die homogene Lösung wurde gekühlt (Eisbad) und 70-μl (0,75-mmol, 1,5 Äquiv.) Phosphoroxychlorid (destilliert) wurden zugegeben. Die Reaktion wurde unter Kühlen 1 Stunde lang gerührt. Die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie wies darauf hin, dass die Reaktion zu etwa 70 % vollständig war. Daher wurden 25 μl (0,27 mmol, 0,51 Äquiv.) weiteres Phosphoroxychlorid zugegeben, und man ließ die Reaktion für eine weitere Stunde rühren. Sowohl 1 M Tributylammoniumpyrophosphat in wasserfreiem DMF (2,5 ml, 2,5 mmol, 5 Äquiv.) als auch Tri(n-butyl)amin (0,6 ml, 2,5 mmol, 5 Äquiv.) wurden gleichzeitig zu der gekühlten Lösung gegeben. Nach 30 Minuten wurde gekühlter, 1-M Triethylammoniumbicarbonat-Puffer (TEAB, pH 7,0) zu der Reaktionsmischung gegeben, bis die Lösung neutral wurde. Der Puffer wurde anschließend bis zu einem Endvolumen von 40 ml zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Hochvakuum zu einer viskosen Lösung eingeengt, mit Wasser verdünnt und filtriert. Das Filtrat, welches rohes Triphosphat enthielt, wurde anschließend auf eine 50 × 200 mm DeltaPak^TM (15 μ, 100 A) C18 HPLC-Säule aufgetragen, welche unter Verwendung eines linearen Gradienten über 25 Minuten mit 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 130 ml pro Minute eluiert wurde. Ein Peak, welcher das Produkt 5 enthielt, wurde bei 10,5 Minuten gesammelt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das erhaltene Triphosphat erneut auf einer 21 × 250 mm Synchropak^TM A × 100 HPLC-Säule gereinigt, wobei ein linearer Gradient über 30 Minuten bei 15 ml pro Minute von 0,1 M TEAB in 40 % CH₃CN bis 1 M TEAB in 40 % CH₃CN verwendet wurde. ³¹P NMR (D₂O): –9,26 (d); –10,20 (d); –22,43 (t). HPLC (Δ PAK C 18, 3,9 bei 30 cm, 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % CH₃CN in 30 Minuten bei 1 ml pro Minute) 12,7 Minuten. UVλ_max 237 nm und 292 nm.
Synthesebeispiel 2:
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-aminomethyl-8H-pyrimido-[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (8a)
(a) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-trifluoracetamidomethyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (6a)
Triethylamin (3,04 g, 4,2 ml, 30 mmol, 1,5 Äquiv.) wurden zu einer gerührten Lösung von 5-Iod-2'-desoxyuridin (7,1 g, 20 mmol, 1 Äquiv.), Pd[P(C₆H₅)₃]₄ (1,16 g, 1 mmol, 0,05 Äquiv.), CuI (0,38 g, 2 mmol, 0,1 Äquiv.) und 2,2,2-Trifluor-N-propargylacetamid (4,53 g, 30 mol, 1,5 Äquiv.) in trockenem DMF (75 ml) gegeben, und die erhaltene Mischung wurde anschließend 2 Tage lang bei 55°C unter einer inerten Atmosphäre gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurde anschließend die Bicarbonat-Form des AG1 X8 Harzes gegeben, um Triethylammonium-Hydroiodid zu entfernen, Chelex^TM Harz, um Metallkationen zu entfernen und aktivierte Tierkohle, um verfärbende Substanzen zu entfernen. Nach der Filtration über Celit^TM wurde eine leicht gelbe Lösung erhalten. Die Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum und die Chromatographie mit Silica-Gel ergaben 4,2 g (56 %) von 6a. UV (MeOH) λ_max 324 nm; ¹H NMR (d₆-DMSO)δ(ppm) 10,07 (s, 1H, austauschbar, H-NH-COCF₃), 8,78 (s, 1H, H-6), 6,63 (s, 1H, H-CH=C(O)CH₂), 6,18 (t, J = 6,55 Hz, H-1'), 5,00–5,3 (bm, 2H, austauschbar, 2 × OH), 4,48 (m, 2H, H-CH₂-NH), 4,23 (m, 1H, H-4'), 3,95 (m, 1H, H-3'), 3,63 (m, 2H, H-5'), 2,40 (m, 1H, H-2'b), 2,07 (m, 1H, H-2'a)
(b) 3-(β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)-6-trifluoracetamidomethyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (6b)
Die Titelverbindung wurde hergestellt, indem man dem für 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on beschriebenen Verfahren folgte. ¹H NMR (CD₃OD): 1,94 (m, 2H, 3'), 2,01 (s, 3H, Me), 2,18 (m, 1H, 2'), 2,57 (m, 1H, 2'), 3,75–4,06 (ddd, 2H, 5'), 4,27 (m, 1H, 4'), 4,52 (s, 2H, CH₂NH), 6,11 (dd, 1H, 1'), 6,65 (s, 1H, H-5), 9,13 (s, 1H, H-4).
(c) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-trifluoracetamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c](1,2]pyridazhin-7-on (7a)
Zu 754 mg (2 mmol) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-trifluoracetamidomethyl-furo-[2,3-d]pyrimidin-2-on (6a) in einem 25 ml Rundkolben wurden 5 ml wasserfreies Hydrazin gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 3 Stunden lang rühren. Das überschüssige Hydrazin wurde anschließend durch Verdampfung im Hochvakuum entfernt. Zum Rückstand wurden 20 ml Methanol, 0,5 ml Triethylamin, gefolgt von 5 ml Trifluoressigsäureethylester, gegeben. Die Reaktionsmischung wurde durch Rühren nach ungefähr 1 Stunde homogen. Nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung eingeengt und der erhaltene Rückstand wurde durch eine Säulenchromatographie mit Silica-Gel (EtOAc: MeOH: 20 : 1) gereinigt. Eine schwach gelbe, kristalline Verbindung wurde mit einer Ausbeute von 86 % gesammelt. ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,79 (m, 1H, 2'), 2,15 (m, 1H, 2'), 3,49 (m, 2H, 5'), 3,61 (q, 1H, 4'), 4,15 (m, 1H, 3'), 4,46 (d, 2H, H-5), 4,57 (d, 2H, CH₂NH), 4,81 (t, 1H, OH-5'), 5,14 (d, 1H, OH-3'), 6,24 (t, 1H, 1'), 7,43 (s, 1H, H-4), 10,1 (t, 1H, NH-TFA), 10,51 (s, 1H, NH-8). ¹³C NMR (DMSO-d₆): 35,1 (CH₂NH), 39,0 (2'), 42,8 (C-5), 61,7 (5'), 70,5 (3'), 83,0 (1'), 85,9 (4'), 117,9 (CF₃), 121,2 (C-4), 123,4 (C-4a), 152,7, 152,8 (C-3, C-7), 154,2 (C-8a), 156,7 (q, COCF₃).
(d) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-aminomethyl-8H-pyrimido-[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (8a)
Die Phosphorylierung von 200 mg (0,51 mmol) getrocknetem 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-trifluoracetamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (7a) wurde in derselben Weise ausgeführt, wie vorstehend für Verbindung 5 beschrieben. Die rohe Mischung wurde auf eine DeltaPak^TM (50 × 300 mm, 15 μ, 100 A) C 18 HPLC-Säule aufgetragen, welche unter Verwendung eines linearen Gradienten über 25 Minuten mit 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 130 ml pro Minute eluiert wurde. Ein Peak, der das Produkt enthielt, wurde bei 15 Minuten gesammelt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfung wurde das erhaltene Triphosphat erneut auf einer 21 × 250 mm Synchropak^TM A × 100 HPLC-Säule gereinigt, wobei ein linearer Gradient über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 15 ml pro Minute von 0,1 M TEAB in 40 % CH₃CN bis 1 M TEAB in 40 % CH₃CN verwendet wurde. Das Triphosphat wurde mit konzentriertem NH₄OH 30 Minuten lang behandelt, ohne dass eine Veränderung auf der analytischen HPLC beobachtet wurde, so dass bestätigt wurde, dass die Trifluoracetyl-Schutzgruppe vor diesem Schritt entfernt worden war. ³¹P NMR (D₂O): –9,65 (d), –10,86 (d), –22,54 (t). HPLC (Δ PAK C18, 3,9 × 30 cm, 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % CH₃CN in 30 Minuten bei 1 ml pro Minute) 12,2 Minuten. UVλ_max 241 nm und 293 nm.
(e) 6-(β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-trifluoracetamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (7b)
Die Synthese wurde ausgeführt wie vorstehend für Verbindung 7a beschrieben. Ein bräunlicher Schaum wurde in einer Ausbeute von 65 % gesammelt. ¹H NMR (CD₃OD): 1,84–2,23 (m, 4H, 2', 3'), 2,01 (s, 3H, Me), 3,58–3,78 (m, 2H, 5'), 3,99 (m, 1H, 4'), 4,50–4,71 (dd, 2H, H-5), 4,66 (s, 2H, CH₂NH), 6,22 (dd, 1H, 1'), 7,48 (s, 1H, H-4).
Beispiel 3
Synthese von 6-(β-D-1,2-Didesoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-aminomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (8b)
Die Synthese (im Maßstab von 0,73 mmol) und die Reinigung/Isolierung von 8b wurden ausgeführt wie für Verbindung 5 beschrieben.
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-Cy3-amidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (9a)
6,0 μmol(690 μl wässrige Lösung) von 8a wurden mit 310 μl Na₂CO₃/NaHCO₃-Puffer (pH 9,4) verdünnt, und zu einer gerührten DMF-Lösung (1,0 ml) von Cy3-NHS-Ester (7,2 μmol, 1,2 Äquiv.) gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Cy3-Farbstoff-Nukleotid-Konjugat (9a) isoliert (35 %), indem es auf einer Q-Sepharose^TM HPLC-Säule (10 × 16 mm) gereinigt wurde, wobei ein linearer Gradient von einem Puffer A (40 % CH₃CN in 0,1 M TEAB) bis zum Puffer B (40 % CH₃CN in 1,0 M TEAB) über 60 Minuten bei 5 ml pro Minute verwendet wurde. TOF-MS-ES- m/z, Konus 100v, CH₃CN/H₂O: 1144 (MH-3).
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-Cy5.5-amidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (9a')
Das Konjugat 9a' aus dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5.5 und dem Nukleotid wurde in einem ähnlichen Maßstab synthetisiert und isoliert (33 % Ausbeute), indem 8a mit Cy5.5 NHS-Ester wie für 9a beschrieben umgesetzt wurde.
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-fluorescin(5,6)hexanamidoamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (9a'')
8,0 μmol (wässrige Lösung) von 8a wurden mit 1,0 ml Na₂CO₃/NaHCO₃-Puffer (pH = 9,0) verdünnt, und zu der gerührten Lösung wurde wasserfreie DMSO-Lösung von (5,6)-Carboxy-x-NHS-Ester (17,0 μmol, 2,1 Äquiv.) gegeben. Nach 2 Stunden wurde das mit Farbstoff mar kierte Nukleotid auf einer Q-Sepharose^TM Säule wie für 9a beschrieben gereinigt, um 9a'' zu ergeben. TOF-MS ES- m/z, Konus 100v, CH₃CN/H₂O: 1003 (MH-3).
Beispiel 4:
Synthese von 6-(5-Dimethoxytrityl-β-D-2-desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (10)
1,16 g (4,1 mmol) der Verbindung 4 wurden zusammen mit wasserfreiem Pyridin eingeengt und in 30 ml wasserfreiem Pyridin erneut gelöst. 4,15 g (12,24 mmol, 3 Äquiv.) DMT-Cl wurden zu der gerührten Lösung von 4 bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gegeben. Nach 3,5 Stunden wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wurde in CHCl₃ aufgenommen. Die organische Schicht wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen, mit wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde auf einer Säule mit Silica-Gel gereinigt, mit CHCl₃ eluiert, gefolgt von 5 % MeOH in CHCl₃, um die Verbindung 10 zu ergeben (2,35 g, 99 %). TOF MS ES- m/z, Konus 100v, CH₃CN/0,1 M TEAB: 581,24 (MH-1).
Synthese von 6-(5-O-Dimethoxytrityl-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-β-D-2-desoxy-ribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (11)
583 mg (1,0 mmol) der Verbindung 10 wurden zusammen mit wasserfreiem Pyridin eingeengt, gefolgt von Toluol, und in wasserfreiem Dichlormethan (5 ml) gelöst. Zu der gerührten Lösung wurden unter einem schwachen Strom von Argon bei Raumtemperatur 0,7 ml (4,0 mmol, 4,0 Äquiv.) N,N-Diisopropylethylamin gegeben, gefolgt von einer tropfenweisen Zugabe von 2-Cyanoethoxy-N,N-diisopropylaminchlorphosphin (0,28 ml, 1,25 mmol, s). Nach 30 Minuten wies die Dünnschichtchromatographie in 10 % MeOH/CHCl₃ auf die Vollständigkeit der Reaktion hin. Die Reaktionsmischung wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt, mit 10 % Na₂CO₃ gewaschen, und die organische Schicht wurde nach dem Trocknen (wasserfreies Na₂SO₄) unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde auf einer Säule mit Silica-Gel (4 × 13 cm) gereinigt, die mit CH₂Cl₂: EtOAc: Et₃N (2,9 : 7 : 0,1) eluiert wurde, um 11 (570 mg, 73 %) zu ergeben. ³¹P NMR (CDCl₃): δ 149,66.
Beispiel 5:
Primerverlängerungs-Assays, um den Einbau von Triphosphat 5 durch DNA-Polymerasen zu studieren
Ein Primerverlängerungs-Assay wurde verwendet, um das Triphosphat 5 als ein Substrat für die von Exonukleasen freie DNA-Polymerase I des Klenow Fragments (EFK) zu bewerten. Der Assay verwendete einen 15-meren Primer, der am 5'-Ende mit ³³P markiert war, und an ein 24-mer Templat hybridisiert war. Die Sequenzen des Primers und des Templates sind:
Primer 5' TGC ATG TGC TGG AGA 3'
Templat 3' ACG TAC ACG ACC TCT GAA CTA GTC 5'
1 pmol des mit ³³P markierten Primers wurde an 2 pmol des Templats in 2-fachem Klenow-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol) hybridisiert.
Dazu wurden entweder 4 μM dNTPαS oder 40 μM Testverbindung 5c oder eine Mischung von 4 μM dNTPαS und 40 μM Testverbindung gegeben. 1 U EFK und 20 mU anorganische Pyrophosphatase wurden pro Reaktion eingesetzt. Es wurden ebenfalls eine Kontrolle mit dem Primer allein, und eine Kontrolle mit dem Primer, dem Templat und dem Enzym durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 37°C 3 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionen wurden anschließend durch die Zugabe einer Stopplösung aus Formamid und EDTA beendet. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Gel mit 20 % Polyacrylamid und 7 M Harnstoff getrennt, und die Größen der Produktfragmente durch Vergleich mit dem markierten Primer bestimmt, und die Produkte, die in Gegenwart von 4 μM dNTPαS verlängert wurden, wurden nach der Belichtung eines Kodak Biomax^TM Films mittels Autoradiographie bestimmt.
Dies zeigte, dass die Testverbindung ein Substrat für EFK war, und dass sie anstelle von dTTP eingebaut wurde. Andere Verbindungen der Erfindung, die Gruppen, wie zum Beispiel Fluorescein oder Cyanin enthalten, können durch ähnliche Verfahren eingebaut werden.

Claims

Verbindung mit der Struktur
wobei Q ein H oder ein Zucker oder ein Zuckeranalogon oder ein Nukleinsäure-Rückgrat oder ein Rückgrat-Analogon ist, wobei X ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hetero-Aryl oder eine Kombination derselben oder ein Reporter ist, und Y ein O, S, NR ist, wobei R ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, welche a) ein Nukleosid oder Nukleosid-Analogon ist, wobei Q
ist, wobei Z ein O, S, Se, SO, NR⁹ oder CH₂ ist, wobei R⁹ ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder ein Reporter ist, R¹, R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind, und jeweils ein H, OH, F, NH₂, N₃, O-Kohlenwasserstoffrest, NHR oder ein Reporterrest sind, wobei R ein Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, R⁵ ein OH, SH oder NH₂ oder ein Mono-, Di- oder Triphosphat oder Thiophosphat, oder ein entsprechendes Boranphosphat ist, oder einer der Reste R², R⁴ und R⁵ ein Phosphoramidit oder eine andere Gruppe zum Einbau in eine Polynukleotidkette, oder ein Reporterrest ist, oder Q aus einer der folgenden, modifizierten Zuckerstrukturen besteht:
wobei R¹² ein C₁-C₄-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄-Alkyl, oder H ist, vorzugsweise Methyl, Hydroxymethyl oder H, und wobei R¹⁴ ein C₁-C₆-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkylamin, C₁-C₆-Carboxyalkyl oder bevorzugt ein Reporterrest ist, oder welche b) ein Polynukleotid ist, wobei Q ein Nukleinsäure-Rückgrat ist, das aus sich wiederholenden Einheiten eines Zuckerphosphats oder aus sich wiederholenden Einheiten eines modifizierten Zuckerphosphats (LNA) oder aus einem Rückgrat-Analogon besteht, wie z.B. einem Peptid oder einer Polyamid-Nukleinsäure (PNA).
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei ein Reporterrest vorhanden ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei der Reporterrest ein Signalrest ist.
Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Reporterrest eine reaktive Gruppe oder ein Signalrest, oder eine feste Oberfläche ist, die mit dem Rest des Moleküls durch einen Linker von bis zu 30 Atomen verbunden ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei X der Nukleotidbase eine positive oder negative Nettoladung verleiht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei R⁵ ein Triphosphat ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei einer der Reste R², R⁴ und R⁵ aus Phosphoramidit und H-Phosphonat ausgewählt wird.
Polynukleotid, das mindestens einen Rest eines Nukleotid-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 9, welches eine DNA oder RNA ist.
Kettenverlängerungsverfahren, welches die Umsetzung eines Polynukleotids mit einem Nukleotidtriphosphat-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Gegenwart eines Polymerase- oder eines terminalen Deoxynukleotidyltransferase-Enzyms umfasst.
Verfahren zum Nachweis des Polynukleotids nach Anspruch 9 oder 10, welches Verfahren die Verwendung eines Antikörpers zum Nachweis umfasst, der an die Base des Nukleosid-Analogon-Restes bindet.
Verfahren zur Herstellung einer cDNA, welche die Inkubation eines RNA-Templats mit einer Monomermischung umfasst, welche ein Nukleotid-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Gegenwart einer reversen Transkriptase umfasst.
Verfahren zur Amplifikation eines Polynukleotids mittels PCR, wobei das Verfahren die Verwendung einer Monomermischung umfasst, welche ein Nukleotidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als eine Markierung für die Analyse durch Massenspektrometrie.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Verwendung in der Therapie.
Verbindung nach Anspruch 16 für die Verwendung als ein anti-virales Mittel.