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DE69029105T2 - Schnellverfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Einzelbase in einer Nukleinsäuresequenz und seine Verwendungen - Google Patents

Schnellverfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Einzelbase in einer Nukleinsäuresequenz und seine Verwendungen

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DE69029105T2
DE69029105T2 DE69029105T DE69029105T DE69029105T2 DE 69029105 T2 DE69029105 T2 DE 69029105T2 DE 69029105 T DE69029105 T DE 69029105T DE 69029105 T DE69029105 T DE 69029105T DE 69029105 T2 DE69029105 T2 DE 69029105T2
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DE
Germany
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blocking
nucleotide
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bases
base
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Frederic Dufau
Frederic Ginot
Jean Hache
Marc Jeanpierre
Marie-Christine Martinez
Brigitte Roussel
Agnes Troton
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Bertin Technologies SAS
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Bertin et Cie SA
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation einer einzelnen Base in einer Nukleinsäuresequenz sowie dessen Anwendungen, insbesondere bei der Diagnose von genetischen Krankheiten und bei der Kontrolle einer Hybridisierung.
  • Die Nukleinsäurehybridisierung wurde verwendet, um die Identität von Nukleinsäuren zu untersuchen und deren Anwesenheit zu ermitteln. Die Hybridisierung beruht auf der Paarung komplementärer Basen. Wenn komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren zusammen inkubiert werden, paaren sich die ein -zelsträngigen Nukleinsäuren, um ein doppelsträngiges hybrides Molekül zu bilden. Die Fähigkeit der einzelsträngigen DNA oder der RNA zur Bildung einer Struktur mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz wurde als Analyse- und Diagnoseverfahren verwendet. Die Verfügbarkeit von radioaktiven Nukleosidtriphosphaten mit einer hohen spezifischen Aktivität und die Markierung der DNA mit 32p in Gegenwart von Enzymen mit Polymerasefunktion, z.B. T&sub4;-Kinase, erlaubt die Identifikation, Isolierung und Charakterisierung zahlreicher Nukleinsäuresequenzen von biologischem Interesse.
  • Die Hybridisierung stellt ein wichtiges Kriterium beim Nachweis der Anwesenheit einer Sequenz aus speziellen Nukleinsäuren, wie beispielsweise
  • - bei genetischen Krankheiten bei Menschen oder bei Tieren, bei denen eine erbliche Modifikation des genetischen Elternteils morbide Folgen hat (durch Insertion, Deletion oder Punktmutation einer speziellen Sequenz);
  • - bei Krebserkrankungen, bei denen Neuanordnungen von genomischer DNA beobachtet werden;
  • - im Verlauf von Infektionen, bei denen man die Anwesenheit von Fremdgenomen, wie von Mikroorganismen (Bakterien, Pilze und Viren beispielsweise) nachweist;
  • - zur Identifikation von Individuen im allgemeinen:
  • . in der Gerichtsmedizin (Vaterschaft, Verwandtschaft beispielsweise),
  • . auf dem Gebiet der Nahrungsmittel (Pflanzen, Hygienekontrolle beispielsweise) dar.
  • Jedoch kann die Hybridisierung als diagnostisches Mittel durch die Schwierigkeit der Durchführung (schwere Techniken) oder durch das Fehlen einer Hybridisierungsspezifität (Arbeitsvorschrift) begrenzt sein.
  • In der Tat, die chemische Untersuchung der Hybridisierung wies den Einfluß der Konzentration jedes der beteiligten Nukleinsaurestränge, ihrer Längen, ihrer Basenzusammensetzungen, der Temperatur, des pH-Werts, der Ionenstärke, der Viskosität des Mediums nach.
  • Insbesondere die Temperatur ist kritisch und muß unter der Schmelztemperatur bleiben (Tm: Temperatur, bei der 50% der Sequenzen in doppelsträngiger Form vorliegen). In Lösung beträgt die optimale Hybridisierungstemperatur 25ºC unter der Tm für eine Sonde aus 150 Nukleotiden und etwas weniger für kürzere Sonden.
  • So kann man, wenn man eine Mutation an einer einzelnen Base nachweisen möchte, im allgemeinen je nach Fall zwei Sondentypen verwenden: sogenannte lange Nukleinsäuresonden von im allgemeinen mehr als 150 Nukleotiden oder sogenannte kurze Nukleinsäuresonden von im allgemeinen zwischen 17 und 24 Nukleotiden. Wenn die Mutation an einer spezifisch durch ein sogenanntes Restriktionsenzym erkannten Stelle vorkommt, kann man die Southern-Technik verwenden: diese umfaßt die Stufen der Isolierung der DNA, der Spaltung durch das Restriktionsenzym, der Gelelektrophorese, des Transfers auf eine Membran und der Hybridisierung mit Hilfe einer langen Sonde, die die Mutationsregion betrifft. Nach Waschen und Autoradiographie erlaubt die Analyse der Größe der so erhaltenen Fragmente die Wiederlegung oder Bestätigung der Anwesenheit der Mutation. Das sehr aufwendige Verfahren macht es erforderlich, daß die Mutation eine Restriktionsspaltstelle betrifft. Wenn dies nicht der Fall ist, kann man eine kurze Oligonukleotidsonde mit 17 bis 24 Nukleotiden synthetisieren, deren Zentrum mit der Mutation, die man nachweisen möchte, zusammenfällt. Durch Wahl geeigneter Hybridisierungs- und Spülbedingungen (spezifisch für jedes System) kann man nur im Falle einer perfekten Homologie eine Hybridisierung mit Hilfe des markierten Oligonukleotids erhalten (ein einzelner Nukleotidunterschied, insbesondere am Ort der Mutation, führt zur Destabilisierung der Hybridisierung).
  • Die europäische Patentanmeldung EP 141 382 beschreibt ein Autoradiographieverfahren zum Erhalt einer Information, die die Lokalisation von radioaktiv markierten Substanzen, die an einem festen Träger nachgewiesen werden, erlaubt. Dieses Verfahren ist insbesondere auf die DNA-Sequenzierverfahren unter Verwendung der Autoradiographie anwendbar.
  • Die Internationale PCT-Anmeldung WO 88/05470 betrifft T7-DNA-Polymerasen und ihre Anwendungen bei der DNA-Sequenzierung.
  • Die in dieser Internationalen PCT-Anmeldung beschriebene DNA-Polymerase kann kontinuierlich zahlreiche Nukleotide (fortschreitend mehr als 500 Basen) unter Verwendung des gleichen Systems aus Starter und Matrix einarbeiten, kann mit Startern kleinerer Größen (10 Basen oder weniger, bevorzugt 4 bis 20) verwendet werden, erlaubt den Einbau von Nukleotidanaloga und besitzt keine Nukleaseaktivität.
  • Jedoch besitzen diese verschiedenen Methoden eine Reihe von Nachteilen:
  • - schwierig zu beherrschende Temperaturbedingungen, um eine geeignete Hybridisierung zu erhalten;
  • - gegebenenfalls obligatorische Anwesenheit einer Restriktionsspaltstelle;
  • - Immobilisierung der Nukleinsäure auf einer Membran (Southern Blot).
  • Das amerikanische Patent AMERSHAM Nr. 4 656 127 erlaubt die Beseitigung einiger dieser Nachteile, insbesondere dahingehend, daß es die Detektion einer Mutation, die an einem Ort, der keine Restriktionsenzymspaltstelle besitzt, vorhanden ist, erlaubt.
  • Dieses amerikanische Patent Nr. 4 656 127 beschreibt ein Nachweisverfahren der Mutation einer spezifischen Nukleotidbase in einem Zielnukleinsaurefragment (DNA oder RNA) durch:
  • (a) Hybridisierung einer Sonde mit der Zielsequenz zur Bildung eines Nukleinsäurehybrids, worin ein Ende der Sonde in der Nähe einer spezifischen Nukleotidbase hybridisiert wird;
  • (b) Vermischen des Hybrids mit einem Nukleotidderivat unter geeigneten Bedingungen zur Verlängerung der Sonde so, daß die Verbindung Nukleotidderivat - Sondenende nur erlaubt wird, wenn die spezifische Base in der Zielsequenz die nachzuweisende Mutation ist oder nicht, wobei eine mit dem Nukleotidderivat assozuerte Sonde gegenüber einer Spaltung unter speziellen Bedingungen resistent ist;
  • (c) Spaltung des Hybrids durch eine Exonuklease unter Bedingungen, so daß das doppelsträngige Fragment vom Ende der Sonde schrittweise abgebaut wird, es sei denn, daß das Ende in Verbindung mit dem Nukleotidderivat steht;
  • (d) Entfernung der Sondenanteile, die mit der Nukleinsäurekette nicht mehr hybridisiert sind;
  • (e) und Nachweis einer Mutation der spezifischen Base in der Zielsequenz durch Detektion der Anwesenheit oder des Fehlens der Sonde nach Spaltung.
  • Dieses Verfahren betrifft insbesondere außer der Sonde die Verwendung eines Nukleotidderivats mit speziellen Eigenschaften und umfaßt deshalb noch zahlreiche Stufen. Außerdem ist für dessen Durchführung eine Immobilisierung der Nukleinsäure an einer Membran und auch eine Markierung (der Sonde oder des Nukleotidderivats) notwendig.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifikation einer spezifischen Nukleotidbase, das leicht und rasch durchzuführen ist, das bessser den Notwendigkeiten der Praxis entspricht als die Verfahren aus dem Stand der Technik, insbesondere, daß das erfindungsgemäße Verfahren kein kompliziertes Arbeitsprotokoll benötigt, d.h., weder die Immobilisierung der DNA noch die Markierung der Sonde notwendig macht und sich auf die Detektion von speziellen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere bei genetischen Krankheiten, bei Krebserkrankungen, bei Infektionen, der Identifikation von menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Individuen anwenden läßt.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation einer spezifischen Nukleotidbase in einer Zielnukleinsäuresequenz, umfassend eine Stufe der Hybridisierung der Zielsequenz, in der sich die zu identifizierende Base befindet, mit einer Sondennukleotidsequenz einer ausreichenden Länge, um eine korrekte Hybridisierung unabhängig von der Reaktionstemperatur zu erlauben, eine Stufe der Synthese des Komplementärstranges des erhaltenen Hybrids - wobei die Sondennukleotidsequenz als Startersequenz dient - in Gegenwart einer Polymerase ohne 3'5'-Exonukleasewirkung und eine Stufe des Nachweises der zu identifizierenden Base durch jedes geeignete Mittel, das durch gekennzeichnet ist,
  • - daß die als Startersequenz dienende Nukleotidsequenz mit der Zielsequenz so hybridisiert, daß deren 3'-Ende der spezifischen, nachzuweisenden und/oder zu identifizierenden Nukleotidbase benachbart ist; und
  • - daß die Synthese des dem Hybrid komplementären Stranges in Gegenwart mindestens einer blockierenden Nukleotidbase, ausgewählt aus den Didesoxynukleotiden, und in Abwesenheit von dNTP durchgeführt wird, wobei die blockierende Nukleotidbase bei Einbau nachgewiesen wird und die Identifikation der spezifischen, komplementären, in der zu analysierenden Zielsequenz vorhandenen Nukl eotidbase erlaubt.
  • Unter Nukleotid wird im Sinne der vorliegenden Erfindung auch ein Oligonukleotid, das 10 bis 50 Basen und auch ein Nukleotid, das mehr als 100 Basen umfassen kann, verstanden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden die blockierenden Nukleotidbasen in geeigneter Weise, insbesondere durch einen Marker, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend radioaktive Substanzen, Enzyme, chemische chromophore fluoreszierende oder chemilumineszierende Produkte und geeignete Antikörper, markiert.
  • Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform ist der Marker für jede der blockierenden Nukleotidbasen gleich oder unterschiedlich.
  • Gemäß einer Variante dieser Variante erfolgt, wenn die vier blockierenden Basen mit Hilfe unterschiedlicher Marker markiert sind, die Detektion der vier blockierenden Nukleotide vorteilhafterweise gleichzeitig.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens erfolgt, wenn die vier blockierenden Basen auf gleiche Weise markiert sind oder auch wenn sie nicht markiert sind, die Detektion der vier blockierenden Nukleotide aufeinanderfolgend und/oder getrennt.
  • Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform wird in geeigneter Weise das während der Polymerisationsreaktion gebildete Pyrophosphat nachgewiesen.
  • In der Tat führt die Polymerisationsreaktion zur Bildung eines Pyrophosphats wie folgt:
  • Matrix - Starter + DNTP T Matrix - (Starter + dNMP) + PPi.
  • Unter Messung des Pyrophosphats in jedem Reagensglas ist es möglich, zu bestimmen, für welche der Basen eine Polymerisationsreaktion abgelaufen ist.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform wird jede markierte Nukleotidbase nachgewiesen.
  • In der Tat, jedes Reagensglas enthält in diesem Falle. eine einzelne markierte Nukleotidbase, wobei die anderen drei nicht markiert sind. Die Messung der markierten Base (durch Fluoreszenz, Radioaktivität) erlaubt die Bestimmung, für welche der Basen eine Polymerisationsreaktion abgelaufen ist, wobei die markierten nichtinkorporierten Basen durch Waschung beseitigt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt insbesondere den Vorteil, daß es die Definition von Arbeitsbedingungen unabhängig von der zu identifizierenden Nukleotidbase erlaubt und keine Immobilisierung der Nukleinsäure auf eine Membran benötigt.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner ein gebrauchsfertiges Kit oder eine gebrauchsfertige Diagnosereagenszusammenstellung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, daß es außer geeigneten Mengen an Reagentien und Puffern, die für die Durchführung des Verfahrens geeignet sind,
  • - geeignete Mengen eines Nukleotids, das als Startersequenz dient, mit der Fähigkeit, mit der Zielsequenz so zu hybridisieren, daß deren 3' -Ende der spezifisch nachzuweisenden Nukleotidbase benachbart ist;
  • - geeignete Mengen der vier blockierenden Nukleotidbasen, ausgewählt aus den Didesoxynukleotiden (ddTTP, ddGTP, ddATP, ddCTP), so daß sie in das Extensionsprodukt des Starters eingebaut werden können, wobei vollständig die Verlängerung des Extensionsproduktes blockiert wird; und
  • - geeignete Mengen einer Polymerase ohne 3'5'-Exonukleasewirkung, umfaßt.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Kits oder der Reagenszusammenstellung sind die modifizierten Nukleotidbasen in geeigneter Weise, insbesondere durch einen Marker, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend radioaktive Substanzen, Enzyme, chemische chromophore, fluoreszierende oder chemilumineszierende Produkte und geeignete Antikörper, markiert.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Variante des Kits oder der Reagenszusammenstellung umfaßt es weiterhin geeignete Reagentien zur Pyrophosphatbestimmung.
  • Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung weitere Ausführungsformen, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen.
  • Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beschreibungsergänzung, die sich auf Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht, besser verstanden.
  • Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung davon darstellen.
    • Beispiel 1: Diagnose der Drepanozytose durch das erfindungsgemäße Verfahren (Messung fluoreszierender Didesoxynukleotide)
  • Die Drepanozytose oder die Sichelzellenanämie ist auf eine Mutation in einem der Exons des β-Gens, das die β-Kette von Hämoglobin (Hb) codiert, zurückzuführen. Diese Mutation stellt eine Substitution eines Adenins (A) durch Thymin (T) dar, modifiziert das Codon GAG, das in eine Glutaminsäure (in Position G) in normalem Hb übersetzt wird, in das Codon GTG, das in ein Valin in abnormalem Hb (HbS) übersetzt wird.
  • Die DNA, die in diesem Beispiel verwendet wurde, entspricht einer einzel strängi gen amplifizierten DNA-Sequenz.
    • a) Blockierung der Amplifikations-Startersequenzen
  • * Vermischen in einem Mikrozentrifugenröhrchen für jede DNA-Matrix:
  • - 100 ng DNA (einzeisträngig, amplifiziert)
  • - 7 µl 5X Sequenase-Puffer (= 200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NaCl, 100 mM MgCl&sub2;)
  • - H&sub2;O qs für 22 µl
  • * Rühren mit Hilfe einer Verwirbelungsvorrichtung und rasche Zentrifugation
  • * 2minütige Inkubation in Wasserbad bei 95ºC
  • * rasche Entnahme und Überführung in ein Wasserbad mit 37ºC für 10 Minuten
  • * Herstellung des Reaktionspuffers für eine DNA-Probe, bestehend aus
  • - 2,5 µl 0,1 M DTT
  • - 1 µl eines Gemisches aus ddNTP, verdünnt zu 1/400 (ddTTP:112 µM, ddGTP:1,12 µM, ddATP:3,36 µM, ddCTP:8,96 µM) und
  • - H&sub2;O qs für 6,5 µl
  • - 1 µl Sequenase (3 Einheiten)
  • * Entnahme der Röhrchen aus dem Wasserbad und rasche Zentrifugation,
  • * Hinzufügen des Reaktionspuffers und Vermischen,
  • * Einbringen in ein Wasserbad mit 37ºC für 5 Minuten,
  • * Entnahme der Röhrchen und ihre Überführung in Eis.
    • b) Beseitigung der überschüssigen kalten Didesoxynukleotide
  • Es werden die Mikrotrennsysteme Centricon 3 oder 10 (Amicon), die durch beschleunigte Membranfiltration der Zentrifugation die Zurückhaltung von Molekülarten mit einem Molekulargewicht von größer 3000 oder 10.000 Dalton (beispielsweise ein Nukleotid entsprechend 330 D und ein 20meres Syntheseoligonukleotid entsprechend 6600 D) erlauben.
  • - Überführen des aus a) hervorgegangenen Reaktionsvolumens in ein "Centricon" 3 oder 10 und gegebenenfalls verdünnen,
  • - Zentrifugation mit weniger als 5000 g gemäß den Angaben des Herstellers so, daß ein minimales Volumen wiedergewonnen wird,
  • - Umkehren des Centricon -Systems,
  • - Zentrifugation, um das Reaktionsvolumen zu gewinnen,
  • - Auffüllen des so erhaltenen Volumens auf 12 µl.
    • c) Mikrosequenzierung (erfindungsgemäßes Verfahren)
  • * Für jedes DNA-Röhrchen werden auf 12 µl zugesetzt:
  • - 15 ng Oligonukleotid 5'-CATGGTGCACCTGACTCCTG-3' (OA), entsprechend der Sequenz, die an der der Position der Mutation benachbarten Base stoppt,
  • - 7 µl 5× Sequenase-Puffer, wie unter a) definiert und Vorgehen wie in a), anschließend
  • * Herstellung des Reaktionspuffers, der für jede Probe besteht aus:
  • - 2,5 µl 0,1 M DTT,
  • - 1 µl einer 1/400 fachen Verdünnung eines Gemisches aus fluoreszierenden ddNTPs (ddTTP* :112 µM, ddGTP* :1,12 µM, ddATP* :3,36 µM &supmin; ddCTP* :8,96 µM). Die fluoreszierenden Didesoxynukleotide wurden von Du Pont (Genesis 2000 DNA Analysis System) bezogen;
  • - H&sub2;O qs für 6,5 µl
  • - 1 µl Sequenase (3 Einheiten)
  • * Entnahme der Röhrchen aus dem Wasserbad, rasche Zentrifugation,
  • * Hinzufügung des Reaktionspuffers, Vermischen,
  • * Einbringen in ein Wasserbad mit 37ºC für 5 Minuten,
  • * Entnahme der Röhrchen und Einbringen in Eis.
    • d) Waschung der überschüssigen fluoreszierenden Didesoxynukleotide
  • * Leiten der Proben über eine Sephadex -G50-Säule,
  • * Gewinnung der Eluate.
    • e) Detektion
  • Die Detektion erfolgt für jede Probe nach der elektrophoretischen Wanderung und Anregung durch eine Quelle, wie einen Laser. Das Signal wird fluorimetrisch analysiert.
  • Es werden die Kurven a (Kontrolle) und b (Krankheit), wie aus Figur 1 hervorgeht, erhalten, die den Nachweis des Einbaus eines ddATPs in a für ein gesundes Individuum und für ein homozygotes krankes Individuum den Einbau eines ddTTPs in b an der Position entsprechend einer eventuellen Mutation erlaubt.
    • Beispiel 2: Mikroseciuenzierung einer Base in einer Nukleinsäuresequenz (DNA des Bakteriophagen M13mp8) a) Ausgangsmaterial
  • * Einzeisträngige DNA des Bakteriophagen M13mp8
  • * Syntheseoligonukleotid sogenannter Universaiprimer der Sequenz 3'-TGACCGGCAGCAAAATG-5'
  • Die im Starter in 5' T3' als erstes eingebaute Base ist ein G.
    • b) Protokoll
  • Das Protokoll ist dem Protokoll zum Nachweis einer Punktmutation, beginnend mit Stufe c von Beispiel 1 äquivalent. Die Stufen a und b sind unbrauchbar, da die DNA des Phagen M13 nicht durch Oligonukleotide verunreinigt ist.
  • Als Variante lautet das Protokoll wie folgt:
  • - 3 µg einzelsträngige M13-DNA
  • - 15 ng Oligonukleotid-Universalprimer
  • - 7 µl 5x Sequenasepuffer
  • - H&sub2;O qs für 22 µl Die Detektion weist den Einbau eines Didesoxy-GTPs in den Primer nach, was dem erwarteten Ergebnis entspricht, wie aus Figur 2 hervorgeht, die die mit zwei unterschiedlichen Verdünnungen an ddNTP (1/200 (a) und 1/400 (b)) erhaltenen Ergebnisse zeigt.

Claims (11)

1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation einer spezifischen Nukleotidbase in einer Zielnukleinsäuresequenz, umfassend eine Stufe der Hybridisierung der Zielsequenz, in der sich die zu identifizierende Base befindet, mit einer Sondennukleotidsequenz einer ausreichenden Länge, um eine korrekte Hybridisierung unabhängig von der Reaktionstemperatur zu erlauben, eine Stufe der Synthese des Komplementärstranges des erhaltenen Hybrids - wobei die Sondennukleotidsequenz als Startersequenz dient - in Gegenwart einer Polymerase ohne 3'5'-Exonukleasewirkung und eine Stufe des Nachweises der zu identifizierenden Base durch jedes geeignete Mittel, dadurch gekennzeichnet
- daß die als Startersequenz dienende Nukleotidsequenz mit der Zielsequenz so hybridisiert, daß deren 3'-Ende der spezifischen, nachzuweisenden und/oder zu identifizierenden Nukleotidbase benachbart ist; und
- daß die Synthese des dem Hybrid komplementären Stranges in Gegenwart mindestens einer blockierenden Nukleotidbase, ausgewählt aus den Didesoxynukleotiden, und in Abwesenheit von DNTP durchgeführt wird, wobei die blockierende Nukleotidbase bei Einbau nachgewiesen wird, und die Identifikation der spezifischen, komplementären, in der zu analysierenden zielsequenz vorhandenen Nukleotidbase erlaubt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die blockierenden Nukleotidbasen in geeigneter Weise, insbesondere mit Hilfe eines Markers, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend radioaktive Substanzen, Enzyme, chemische chromophore, fluoreszierende oder chemilumineszierende Produkte und geeignete Antikörper, markiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker für jede der blockierenden Nukleotidbasen identisch oder unterschiedlich ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn die vier blockierenden Basen mit Hilfe von unterschiedlichen Markern markiert werden, der Nachweis der vier blockierenden Nukleotide vorteilhafterweise gleichzeitig vorgenommen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn die vier blockierenden Basen auf identische Weise markiert werden oder auch wenn sie nicht markiert werden, die Detektion der vier blockierenden Nukleotide aufeinanderfolgend und/oder getrennt durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in geeigneter Weise das während der Polymerisationsreaktion gebildete Pyrophosphat bestimmt, wobei die Bestimmung von Pyrophosphat die Bestimmung erlaubt, für welche der Basen eine Polymerisationsreaktion stattgefunden hat.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man jede blockierende markierte Nukleotidbase nachweist.
8. Gebrauchsfertiges Kit oder Diagnosereagenszusammenstellung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es außer geeigneten Mengen an Reagentien und Puffern, die für die Durchführung des Verfahrens geeignet sind,
- geeignete Mengen eines Nukleotids, das als Startersequenz dient, mit der Fähigkeit, mit der Zielsequenz so zu hybridisieren, daß deren 3'-Ende der spezifisch nachzuweisenden Nukleotidbase benachbart ist;
- geeignete Mengen der vier blockierenden Nukleotidbasen, ausgewählt aus den Didesoxynukleotiden, so daß sie in das Extensionsprodukt des Starters eingebaut werden können, während vollständig die Verlängerung des Extensionsprodukts blockiert wird; und
- geeignete Mengen einer Polymerase ohne 3'5'-Exonukleasewirkung, umfaßt.
9. Kit oder Reagenszusammenstellung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die blockierenden Nukleotidbasen in geeigneter Weise, insbesondere mit Hilfe eines Markers, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend radioaktive Substanzen, Enzyme, chemische chromophore, fluoreszierende oder chemilumineszierende Produkte und geeignete Antikörper, ausgewählt sind.
10. Kit oder Reagenszusammenstellung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin geeignete Reagentien für die Bestimmung von Pyrophosphat umfaβt.
11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen, die speziell mit Krankheiten, wie genetischen Erkrankungen oder Krebserkrankungen, Infektionen, assoziiert sind, oder geeignet sind, menschliche, tierische oder pflanzliche Individuen zu identifizieren.
DE69029105T 1989-08-11 1990-08-02 Schnellverfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Einzelbase in einer Nukleinsäuresequenz und seine Verwendungen Expired - Fee Related DE69029105T2 (de)

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