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TWI518325B - 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 - Google Patents

對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 Download PDF

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TWI518325B
TWI518325B TW100103831A TW100103831A TWI518325B TW I518325 B TWI518325 B TW I518325B TW 100103831 A TW100103831 A TW 100103831A TW 100103831 A TW100103831 A TW 100103831A TW I518325 B TWI518325 B TW I518325B
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馬諾真田廣之
崔英李
蘇達學
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自治醫科大學
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Description

對ALK抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療
本發明係有關對ALK抑製劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療。本發明亦有關預測此種癌症患者的病情隨時間發展進程的方法。
酪氨酸激酶是一類通過轉移末端三磷酸腺苷來催化蛋白質底物上的酪氨酸殘基磷酸化的酶。在許多情況下，酪氨酸激酶在細胞功能包括細胞增殖，癌變和細胞分化的信號轉導方面具有關鍵作用。
EML4-ALK是一種融合型蛋白酪氨酸激酶，在5%的非小細胞肺癌(NSCLC)病例中出現，其可引起人類2號染色體短臂的微小倒位的結果(Soda,M.et al.(2007)Nature 448：561-566；Mano,H.(2008)Cancer Sci.99：2349-2355)。EML4-ALK是通過每個單體EML4在捲曲螺旋結構域中相互作用而造成的二聚結構體，從而獲得明顯的致癌活性。用轉基因老鼠來表達EML4-ALK，特別是肺上皮細胞，出生後不久就在雙肺上生成了許許多多的腺癌小瘤，然後在給予口服特效的ALK酪氨酸激酶活性抑制劑後這些小瘤迅速地從肺上消除(Soda,M.et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：19893-19897)。這些觀察表明，在NSCLC癌變中EML4-ALK具有生成這種融合激酶的重要作用，並進一步證明用ALK抑制劑來分子靶向治療癌症的可行性。例如，臨床驗證，抑制劑PF-02341066，對ALK和MET都具有酪氨酸激酶活性，在對EML4-ALK的陽性NSCLC進行治療，其間歇性結果較理想(Kwak,E.L.et al.(2009)J.Clin.Oncol.27(suppl)：15s(abstract 3509))。然而，EML4-ALK的陽性腫瘤對治療失敗的未知分子成份的抑制劑沒有回應。
除了PF-02341066，其他酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)已被證明在對癌症 患者治療具有顯的活性。甲磺酸伊馬替尼，一種用於ABL1和KIT的TKI，例如，BCR-ABL1融合型激酶的陽性慢性骨髓性白血病或KIT的陽性胃腸道間質腫瘤的個案中具有明顯的改善效果(Druker,B.J.et al.(2001)N.Engl.J.Med.344：1031-1037；Heinrich,M.C.et al.(2008)J.Clin.Oncol.26：5360-5367)。此外，吉非替尼和厄洛替尼，都是表皮生長因數受體(EGFR)的TKIs，在治療EGFR活性的NSCLC中具有效果(Mok,T.S.et al.(2009)J.Clin.Oncol.27：5080-2087；Mok,T.S.et al.(2009)N.Engl.J.Med.361：947-957)。遺憾的是，腫瘤的靶向群要麼從治療開始就對相應的TKIs難以融合要麼在開始響應後就產生耐藥性。其次，在一些失敗的案例中還發現腫瘤靶向激酶直接發生突變或變構影響ATP-結合組織的形狀，從而導致影響TKI的結合(Deininger,M.et al.(2005)Blood 105：2640-2653；Kobayashi,S.et al.(2005)N.Engl.J.Med.352：786-792；Pao,W.et al.(2005)PLoS Med.2：e73；Shah,N.P.et al.(2002)Cancer Cell 2：117-125)。因此，迫切需要能識別出在酪氨酸激酶上的具有抗突變的位置，如EML4-ALK，以便更好的發展用於識別、判斷，預防和治療相關異常和/或活性表達的疾病的化合物，試劑盒和方法。
本發明至少提供了通過識別出對公知的ALK抑制劑產生抗性的新型的間變性淋巴瘤激酶(ALK)突變而識別、判斷和治療癌症的化合物，方法和試劑盒。同樣，這些ALK突變能夠在臨床上鑒定藥物組合物，這些藥物組合物可以放入那些由新型ALK突變產生的異常ATP-結合區，來抑制ALK活性。
一方面，本發明提供了一種用於識別一個患有癌症或具有罹患癌症風險的對象在使用ALK抑制劑治療時是否會產生對治療無反應的額外風險的方法，其包括從患者身上採集樣本並分析樣本來檢查是否存在一個或多個突變的ALK多核苷酸分子，其中存在一個或多個突變的ALK多核苷酸分 子表明對象已經具有對ALK抑制劑治療無反應的額外風險。
另一個方面，本發明提供了一種用於識別一個患有癌症或具有罹患癌症風險的對象在使用ALK抑制劑治療時是否會產生對治療無反應的額外風險的方法，其包括從患者身上採集樣本並分析樣本來檢查一個或多個突變的ALK多肽的表達水準、結構和/或活性，其中存在一個或多個突變的ALK多肽表明對象已經具有對ALK抑制劑治療無反應的額外風險。
在本發明的一些實施例中，對象可以是之前沒有使用一種ALK抑制劑來治療，也可以是之前已經用一種ALK抑制劑治療，並至少部分地對ALK抑制劑(如PF-02341066，PDD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4,5,6,11,12,13-六氫-2H-吲唑[5,4-α]吡咯[3,4-c]哢唑-8-基[4-(二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(1S,2S,3R,4R)-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2,3,4,5-四氫-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯並氮雜卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-甲醯胺和NVP-TAE684)產生了抗性。在另一些實施例中，所述的癌症包括間變性大細胞淋巴瘤，神經母細胞瘤，乳腺癌，大腸癌，炎性肌纖維瘤，非小細胞肺癌。還有另一些實施例中，所述的樣本包括痰液，支氣管肺泡灌洗，胸腔積液，組織，全血，血清，血漿，口腔刮，唾液，腦脊液，尿液，糞便，迴圈腫瘤細胞，迴圈核酸和骨髓等。
在還有另一些實施例中，所述的樣本包括細胞或組織。在一些實施例中，組織是腫瘤或癌組織。在另一些實施例中，一個或多個突變的ALK多核苷酸分子或多肽包括如表1所列的突變ALK多核苷酸分子或多肽。還有一些實施例中，一個或多個突變的ALK通過核酸雜交法來判斷。在另一些實施例中，一個或多個突變的ALK通過聚合酶鏈反應來判斷。在另一些實施例中，一個或多個ALK多肽表達水準用特異性結合到一個或多個ALK多肽(如抗體，抗體衍生物，和抗體片段)的試劑來查明。在還有一些實施例中，一個或多個ALK多肽的數量，結構和/或活性與控制樣本相比較。在還有一些實施例中，一個或多個突變的ALK通過啟始點的時間和至少一 個隨後點的時間來判斷。在另一些實施例中，樣本包括生殖細胞或體細胞基因組DNA。
另一個方面，本發明還提供了一種治療癌症患者或有潛在的癌症患者的方法，包括從患者身上收集樣本，分析樣本來查明是否存在一個或多個如表1所列的突變ALK多核苷酸分子，然後給所述病人使用一個治療有效的ALK抑制劑。在一些實施例中，ALK抑制劑包括PF-02341066，PDD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4,5,6,11,12,13-六氫-2H-吲唑[5,4-α]吡咯[3,4-c]哢唑-8-基[4-(二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(1S,2S,3R,4R)-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2,3,4,5-四氫-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯並氮雜卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-甲醯胺和NVP-TAE684。在另一些實施例中，對象可以是之前沒有使用一種ALK抑制劑來治療，也可以是之前已經經用一種ALK抑制劑治療，並至少部分地對ALK抑制劑產生了抗性。
另一個方面，本發明還提供了一種用於確定一個癌症患者的化學敏感性，從而使用一種ALK抑制劑進行治療的試劑盒，包括：一種與一個或多個突變的ALK多核苷酸分子或多肽產生特定結合的試劑；和使用說明書。在一些實施例中，該試劑盒還包括一種ALK抑制劑。在另一些實施例中，該試劑包括一個或多個多核苷酸探針，每個探針包括一個多核苷酸序列，這個多核苷酸序列與表1所列的其中一個核苷酸序列互補，或者與一個編碼表1所列的其中一個多肽的核苷酸序列互補(例如寡核苷酸，cRNA分子，RNA分子和由堿基組成的合成基因探針)。還有一些實施例中，探針包括長度約為50至107個核苷酸的多核苷酸。有還有一些實施例中，試劑包括一種由表1所列的一個或多個核苷酸序列編碼而成的一種抗體，抗體衍生物和抗體片段到一種多肽。
另一個方面，本發明還提供了一種方法來確定一種檢測化合物是否控制了一個或多個突變ALK多肽的活性，包括與哺乳動物細胞接觸，使其轉染一個結構，並用檢測化合物來編碼一個或多個突變的ALK多肽，並測定 該哺乳動物細胞來確定一個或多個突變的ALK多肽的活性，其中由於被檢測化合物能在一個控制表達中顯著地調節活性，因此它可以作為一個或多個突變ALK多肽的調節器。在一些實施例中，所述的一個或多個突變的ALK多核苷酸分子或多肽包括表1所列的突變ALK多核苷酸分子或多肽。在另一些實施例中，所述的控制包括哺乳動物細胞表達一種野生型ALK多肽，多肽可以是表1所列的多肽。在另一些實施例中，一個或多個突變ALK多肽的活性可以是ATP結合，酪氨酸激酶活性，癌症細胞增殖，腫瘤生長，腫瘤數量，細胞凋亡和腫瘤轉移。在另一些實施例中，所述的控制表達包括哺乳動物細胞在檢測化合物的存在下，表達一個或多個突變ALK多肽，其中可以例如用一個或多個突變ALK多肽的活性(例如ATP結合，酪氨酸激酶活性，癌症細胞增殖，腫瘤生長，腫瘤數量，細胞凋亡和腫瘤轉移)來確定檢測化合物的存在。
本發明至少有部分內容是識別特定基因序列，包括如間變性淋巴瘤激酶(ALK)突變，然後判定ALK抑制劑是否能有效地治療癌症。尤其是在本發明中，已經識別出的新型ALK基因突變(如EML4-ALK多肽編碼的突變)會使多肽至少能部分地對ALK抑制劑療法產生抗性。本發明還公開了那些使用本領域的公知技術來識別這些特定基因序列的方法，這些方法非限制性地包括寡核苷酸基因晶片(BreNnan,et al.(2004)Cancer Res. 64(14)：4744-8；Lucito,et al.(2003)Genome Res.13：2291-2305；Bignell et al.(2004)Genome Res.14：287-295；Zhao,et al(2004)Cancer Research,64(9)：3060-71)和本發明所述的其他方法，例如包括聚合酶鏈式反應(PCR)和直接測序法。本發明還公開了這些方法中使用的診斷試劑盒。
本發明所述的其他方面將在下文中進一步詳細說明。
I.定義
本文中的“一個”和“一種”指一種或一種以上(如至少一種)的語 法對象。例如，“一種成分”即一種成分或一種以上的成分。
術語標記的“變化量”或標記的“變化水準”涉及標記或染色體區增加或減少的拷貝數，如ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)，和/或在一個癌症樣本中，一個或一些特定標記基因與在一個控制樣本中，與標記拷貝量的表達水準相比，增加或減少的表達量。術語標記的“可選量”也包括在一個如癌症樣本等樣本中，一個標記與正常控制樣本中的標記蛋白質水準相比，增加或減少的蛋白質水準。
術語ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的“變化的表達水準”是指在一個檢測樣本，如從一個病症患者身上採集的樣本中涉及一個標記的表達水準或拷貝數，它們大於或小於標準錯誤試驗的表達水準或拷貝數，可以至少是一個控制樣本(如從一個未患癌症的健康對象身上採集的樣本)中ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的表達水準或拷貝數的兩倍，兩三倍，二四倍，二五倍或二十倍或更多倍，或者是在各種控制樣本中，ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的平均表達水準或拷貝數。變化的表達水準大於或小於標準錯誤試驗的表達水準或拷貝數，可以至少是一個控制樣本(如從一個未患癌症的健康對象身上採集的樣本)中ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的表達水準或拷貝數的兩倍，三倍，四倍，五倍或十倍或更多倍，或者是各種控制樣本中，ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的平均表達水準或拷貝數。
術語標記的“變化活性”涉及一個標記的活性，在生病狀態時，如一個癌症樣本裏會比正常控制樣本中的標記活性更高或更低。標記的變化活性可以是例如由標記的表達變化，標記的蛋白質水準變化，標記的結構變化，如與其他在相同或不同的路徑中作為標記的蛋白質發生一個變化的反應而引起的。
術語標記的“結構變化”涉及突變的存在，或者是標記基因或標記蛋 白質的突變，如較之正常或野生型基因或蛋白質，影響標記表達或活性的突變。例如，突變非限制性地包括插入和內部染色體重組，替換，刪除和插入突變。突變可以在標記的編碼區或未編碼區發生。
本發明中，“間變性淋巴瘤激酶”和“ALK”是同一個含意，均指任何來源(如齧齒類動物，人類和其他哺乳動物)的原生間變性淋巴瘤激酶和它的一些變化和突變。在一些實施例中，ALK蛋白質由參考序號識別號NP_004295的NCBI表達。除了識別之外，該術語還涉及人體蛋白。在本發明中，所述的基因編碼ALK也可以稱為“ALK”。在一些實施例中，ALK核苷酸序列可以由參考序號識別號NM_004304.3和的NCBI和GenBank登錄號為29029631表達，本領域的普通技術人員能簡單地識別本發明相關的序列(如編碼，5'端非編碼區，3'端非編碼區，轉錄啟動，翻譯啟動，轉錄停止，翻譯停止等序列)。
此外在本發明中，“間變性淋巴瘤激酶”和“ALK”還包括本領域普通技術人員公知的ALK融合蛋白激酶及其各種突變體。這些ALK融合蛋白激酶及其各種突變體包括ALK蛋白激酶活性，並將本發明所述的突變翻譯成抗ALK抑制劑的ALK蛋白激酶活性。典型的實例包括EML4-ALK突變1(AB274722.1；BAF73611.1),EML4-ALK突變2(AB275889.1；BAF73612.1),EML4-ALK突變3a(AB374361.1；BAG55003.1),EML4-ALK突變3b(AB374362.1；BAG55004.1),EML4-ALK突變4(AB374363.1；BAG75147.1),EML4-ALK突變5a(AB374364.1；BAG75148.1),EML4-ALK突變5b(AB374365.1；BAG75149.1),EML4-ALK突變6(AB462411.1；BAH57335.1),EML4-ALK突變7(AB462412.1；BAH57336.1),KIF5B-ALK(AB462413.1；BAH57337.1),NPM-ALK,TPM3-ALK,TFGXL-ALK,TFGL-ALK,TFGS-ALK,ATIC-ALK,CLTC-ALK,MSN-ALK,TPM4-ALK,MYH9-ALK,RANBP2-ALK,ALO17-ALK和CARS-ALK(例如參見Pulford et al.,(2004)J.Cell.Physiol.199：330-358，本發明引用參考)。此外，本領域 的普通技術人員明白一種ALK激酶與其融合體發生的特別融合能使ALK蛋白激酶突變增加(如EML4至少能與外顯子2,6a,6b,13,14和/或15融合，例如如Horn and Pao,(2009)J.Clin.Oncol.27：4247-4253所述，本發明引用參考)。例如，下面是本發明所述的典型ALK序列：
表1
SEQ ID NO：1野生型ALK cDNA序列(NM_004304.3；GI：29029631)：
野生型cDNA序列TGC(4373至4375)編碼除半胱氨酸之外的氨基酸的密碼子突變或者與一種與之相同的對應突變。
野生型cDNA序列CTG(4493至4495)編碼除亮氨酸之外的氨基酸的密碼子突變或者與一種與之相同的對應突變。
野生型cDNA序列G4374A突變或一種與之相同的對應突變。
野生型cDNA序列G4493A突變或一種與之相同的對應突變。
SEQ ID NO：2野生型ALK蛋白質序列(NP_004295.2；GI：29029632)：
野生型蛋白質序列Cys1156Xaa突變，其中Xaa除一種半胱氨酸之外的氨基酸或一種與之相同的對應突變。
野生型蛋白質序列Leu1196Xaa突變，其中Xaa除一種亮氨酸之外的氨基酸或一種與之相同的對應突變。
野生型蛋白質序列Cys1156Tyr突變或一種與之相同的對應突變。
野生型蛋白質序列Leu1196Met突變或一種與之相同的對應突變。
SEQ ID NO：3 EML4-ALK突變1 cDNA序列(AB274722.1；GI：152002652)
SEQ ID NO：4 EML4-ALK突變1蛋白質序列(BAF73611.1；GI：152002653)
SEQ ID NO：5 EML4-ALK突變2 cDNA序列(AB275889.1；GI：152002654)
SEQ ID NO：6 EML4-ALK突變2蛋白質序列(BAF73612.1；GI：152002655)
SEQ ID NO：7 EML4-ALK突變3a核苷酸序列(AB374361.1；GI：194072592)
SEQ ID NO：8 EML4-ALK突變3a蛋白質序列(BAG55003.1；GI：194072593)
SEQ ID NO：9 EML4-ALK突變3b核苷酸序列(AB374362.1；GI：194072594)
SEQ ID NO：10 EML4-ALK突變3b蛋白質序列(BAG55004.1；GI：194072595)
SEQ ID NO：11 EML4-ALK突變4核苷酸序列(AB374363.1；GI：209837703)
SEQ ID NO：12 EML4-ALK突變4蛋白質序列(BAG75147.1；GI：209837704)
SEQ ID NO：13 EML4-ALK突變5a核苷酸序列(AB374364.1；GI：209837705)
SEQ ID NO：14 EML4-ALK突變5a蛋白質序列(BAG75148.1；GI：209837706)
SEQ ID NO：15 EML4-ALK突變5b核苷酸序列(AB374365.1；GI：209837707)
SEQ ID NO：16 EML4-ALK突變5b蛋白質序列(BAG75149.1；GI：209837708)
SEQ ID NO：17 EML4-ALK突變6核苷酸序列(AB462411.1；GI：227452648)
SEQ ID NO：18 EML4-ALK突變6蛋白質序列(BAH57335.1；GI：227452649)
SEQ ID NO：19 EML4-ALK突變7核苷酸序列(AB462412.1；GI：227452650)
SEQ ID NO：20 EML4-ALK突變7蛋白質序列(BAH57336.1；GI：227452651)
SEQ ID NO：21 KIF5B-ALK核苷酸序列(AB462413.1；GI：227452652)
SEQ ID NO：22 KIF5B-ALK蛋白質序列(BAH57337.1；GI：227452653)
NPM-ALK序列(t(2；5)(p23；q35染色體易位)*
TPM3-ALK序列(t(1；2)(p25；p23)染色體易位)*
SEQ ID NO：23 TFGXL-ALK核苷酸序列(AF390893.1；GI：20269389)
SEQ ID NO：24 TFGXL-ALK蛋白質序列(AAM17922.1；GI：20269390)*
SEQ ID NO：25 TFGL-ALK核苷酸序列(AF143407.1；GI：6739534)
SEQ ID NO：26 TFGL-ALK蛋白質序列(AAF27292.1；GI：6739535)*
SEQ ID NO：27 TFGS-ALK核苷酸序列(AF125093.1；GI：7229260)
SEQ ID NO：28 TFGS-ALK蛋白質序列(AAF42734.1；GI：7229261)*
ATIC-ALK序列(inv(2)(p23；q35)染色體易位)*
CLTC-ALK序列(t(2；17)(p23；q23)染色體易位)*
SEQ ID NO：29 MSN-ALK核苷酸序列(AF295356.1；GI：14625823)
SEQ ID NO：30 MSN-ALK蛋白質序列(AAK71522.1；GI：14625824)*
SEQ ID NO：31 TPM4-ALK小核苷酸突變序列(AF362887.1；GI：14010353)
SEQ ID NO：32 TPM4-ALK小蛋白質突變序列(AAK51964.1；GI：14010354)
SEQ ID NO：33 TPM4-ALK大核苷酸突變序列(AF362886.1；GI：14010351)
SEQ ID NO：34 TPM4-ALK大蛋白質突變序列(AAK51963.1；GI：14010352)
MYH9-ALK序列(t(2；22)(p23；q11.2)染色體易位)*
RANBP2-ALK序列(t(2；2)(p23；q13)或inv(2)(p23；q11-13)染色體易位)*
ALO17-ALK序列(t(2；17)(p23；q25)染色體易位)*
CARS-ALK序列(t(2；11；2)(p23；p15；q31)染色體易位)*
除了MSN-ALK和MYH-9之外，所有融合蛋白質含有ALK的最後563個氨基酸。MSN-ALK和MYH9分別含有最後的567和566個氨基酸。
“ALK突變”通常涉及一個相關間變性淋巴瘤激酶序列中一種核苷酸和/或氨基酸序列的變化。但是在一些實施例中，“ALK突變”涉及特定的間變性淋巴瘤激酶在ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)處理時所產生的提前突變。例如，野生型ALK蛋白(NP_004295)中1156處半胱氨酸(C1156)和/或1196處亮氨酸(L1196)分別突變為一種不同的氨基酸，它們如本發明所述地對ALK抑制劑產生抗性。在一個實施例中，C1156位置包括一個酪氨酸和/或L1196位置包括一個蛋氨酸。本領域的普通技術人員也能看出與野生型ALK蛋白中C1156和L1196分別對應的氨基酸位置數量與其他相關序列(如ALK同族體，ALK融合蛋白等)不同，不會影響其回應ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)的提前突變值。本領域的普通技術人員還能看出一個特定蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列之間公知的確定對應能根據遺傳密碼(圖中未顯示)確定地用於蛋白質編碼。同樣，一個特定核苷酸的核苷酸序列與氨基酸序列之間公知的確定對應也能根據遺傳密碼確定的核苷酸來編碼。
遺傳密碼
丙氨酸(Ala,A) GCA,GCC,GCG,GCT
精氨酸(Arg,R) AGA,ACG,CGA,CGC,CGG,CGT
天冬醯胺(Asn,N) AAC,AAT
天冬氨酸(Asp,D) GAC,GAT
半胱氨酸(Cys,C) TGC,TGT
谷氨酸(Glu,E) GAA,GAG
穀氨醯胺(Gln,Q) CAA,CAG
甘氨酸(Gly,G) GGA,GGC,GGG,GGT
組氨酸(His,H) CAC,CAT
異亮氨酸(Ile,I) ATA,ATC,ATT
亮氨酸(Leu,L) CTA,CTC,CTG,CTT,TTA,TTG
賴氨酸(Lys,K) AAA,AAG
甲硫氨酸(Met,M) ATG
苯丙氨酸(Phe,F) TTC,TTT
脯氨酸(Pro,P) CCA,CCC,CCG,CCT
絲氨酸(Ser,S) AGC,AGT,TCA,TCC,TCG,TCT
蘇氨酸(Thr,T) ACA,ACC,ACG,ACT
色氨酸(Trp,W) TGG
酪氨酸(Tyr,Y) TAC,TAT
纈氨酸(Val,V) GTA,GTC,GTG,GTT
終止信號(end) TAA,TAG,TGA
遺傳密碼的一個重要而公知的特點是它過多，因此為了使用最多的氨基酸來製備蛋白質，就需要使用一個以上的編碼核苷酸三聯體(例如如圖所示)。因此，一些不同的核苷酸序列可以用於編碼一個特定的氨基酸序列。這些核苷酸序列被認為是功能相同，因為它們能在所有生物體中產生相同的氨基酸序列(雖然有些生物體能比它們更高效地翻譯一些序列)。此外，有時會在一個特定的氨基酸序列中發現一個甲基化的嘌呤或嘧啶突變體。這種甲基化不會影響三核苷酸密碼子和相應的氨基酸之間的編碼關 係。此外本領域的普通技術人員知道在一個特定的密碼子中核苷酸如何突變，從而明確地改變相關密碼子表上的一個編碼氨基酸堿基。例如，Cys-1156的密碼子是“TGC”，而Tyr可能是“TAT”或“TAC”。因此，將位置2處的密碼子G替換為A就能編碼酪氨酸，而不是半胱氨酸。本領域的普通技術人員可以進行類似的操作來設計其他突變。
“結合化合物”指一種結合化合物，如一種小分子，一種抗體，一種肽，一種肽或非肽配體，一種蛋白質，一種寡核苷酸，一種寡核苷酸類似物，如一種肽核苷酸，一種凝集素或任何其他的分子實體，它們能與一個目標蛋白或分子結合，或者能與一種分析物，如一種複雜蛋白結合形成穩定的複合物。
“結合基”是指任何分子標記可直接或間接地連接的分子，它可以與一種分析物特定地結合。結合基非限制性地包括分子量大約高達1000道爾頓的抗體，抗體結合化合物，肽，蛋白質，核酸和有機分子，它含有的原子包括氫，碳，氧，氮，硫和磷。
一個“生物標記“或”標記“是可以變化的基因，mRNA或蛋白質，其中所述的變化與癌症有關。所述的變化可以是腫瘤組織或腫瘤細胞與一種正常或健康組織或細胞(如一個控制)及在患有癌症時的數量、結構和/或活性相比，其數量，結構和/或活性的變化。例如本發明所述的與癌症有關的一個標記或是提前應答抗癌療法的一個標記可以在腫瘤組織或腫瘤細胞中有一個與在一個正常健康組織或細胞中不同的核苷酸序列，氨基酸序列，染色體易位，內染色體倒位元，拷貝數，表達水準，蛋白質水準，蛋白質活性或甲基化狀態。此外，一個“標記“包括一個結構改變的分子，例如突變(包含一個突變)，例如與野生型序列不同的核苷酸或者氨基酸水準，例如在患有癌症等疾病的組織或細胞中進行替換，刪除或插入。
術語“癌症”或“腫瘤”是指具有典型致癌細胞的細胞，如不受控制其擴散，不死，轉移潛能，快速生長和增殖率高，細胞形態特徵的某些特 徵。癌細胞通常是一個腫瘤，但這種細胞可以單獨地存在於一個動物中，也可以是一種非致瘤腫瘤細胞，如一種白血病細胞。本發明中術語“癌症”包括癌前病變及惡性腫瘤。癌症非限制性地包括B細胞腫瘤，如多發性骨髓瘤，瓦爾登斯特巨球蛋白血症，重鏈病，例如α鏈病，γ鏈病，mu鏈病，良性單克隆丙種球蛋白病，免疫細胞澱粉樣變性，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌(如非小細胞肺癌或NSCLC))，支氣管癌，大腸癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，膀胱癌，腦或中樞神經系統腫瘤，周圍神經系統腫瘤，食管癌，宮頸癌，子宮或子宮內膜癌，口腔或咽喉癌，肝癌，腎癌，睾丸癌，膽道癌，小腸或闌尾癌，唾液腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，骨肉瘤，軟骨肉瘤，血液組織癌，腺癌，炎症肌纖維母細胞瘤，胃腸道間質瘤(GIST)，結腸直腸癌，多發性骨髓瘤(MM)，骨髓增生異常綜合症(MDS)，骨髓增生性疾病(MPD)，急性淋巴細胞白血病(ALL)，急性髓系白血病(AML)，慢性粒細胞白血病(CML)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)，真性紅細胞增多症，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，軟組織肉瘤，纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，鱗狀細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細胞癌，肝癌，膽道癌，絨毛膜癌，精原細胞瘤，胚胎癌，腎母細胞瘤，膀胱癌，上皮癌，神經膠質瘤，星形細胞瘤，髓母細胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，血管母細胞瘤，聽神經瘤，小突神經瘤，腦膜瘤，神經母細胞瘤，視網膜母細胞瘤，濾泡性淋巴瘤，彌漫性大B細胞淋巴瘤，套細胞淋巴瘤，肝癌，甲狀腺癌，胃癌，頭頸部癌，小細胞癌，原發性血小板增多症，不明原因的骨髓組織異生症，慢性嗜酸粒細胞白血病，系統性肥大細胞增多症，類似嗜曙紅細胞過多症，慢性嗜酸性粒細胞白血病，神經內分泌腫瘤，良性腫瘤等。
“化療藥物”是指一種化學物質，如一種細胞毒性或抑制細胞生長的試劑，它可以在一種情況如癌症時用於治療。
“互補”是指兩個核苷酸序列鏈之間或兩個相同核苷酸序列鏈之間的序列互補的廣泛概念。眾所周知，一個第一核苷酸序列中的一個腺嘌呤殘基可以和一個與之反平行的第二核苷酸序列中的一個殘基形成特定的氫鍵(“堿基配對”)，其中的殘基是胸腺嘧啶或尿嘧啶。同樣眾所周知的是，一個第一核苷酸鏈中的一個胞嘧啶殘基可以和一個與之反平行的第二核苷酸序列中的一個殘基形成特定的堿基配對，其中的殘基是鳥嘌呤。一個核酸的一個第一序列和與其相同或相異的核苷酸的一個第二序列互補，如果這兩個序列是反平行的，並且第一序列中至少有一個核苷酸殘基可以與第二序列中的一個殘基堿基配對。在一些實施例中，所述的第一序列包括一個第一部分，所述的第二區域包括一個第二部分，即當第一和第二部分是反平行的，那麼第一部分中至少有約50%，75%，90%或95的核苷酸殘基可以與第二部分的核苷酸殘基堿基配對。在其他實施例中，第一部分中的所有核苷酸殘基都可以與第二部分中的核苷酸殘基堿基配對。
所述的“基因的拷貝數”或“標記的拷貝數”是指DNA序列在一個細胞中編碼一個特定基因產品的數量。通常一個哺乳動物中的一個特定基因會有兩個拷貝。但是所述的拷貝數可以通過基因擴增或複製來增加，或者通過刪除來降低。
一個標記是“固定”到底物上，如果它與底物是通過共價鍵或非共價鍵相連，那麼底物就可以用一種液體漂洗(如標準檸檬酸鹽，pH值7.4)，而不需要將大量的標記從底物中分離出來。
本發明所述的“危險係數”是指使用一種統計方法來獲得一種對風險的評估。“危險係數”是一組預計的風險與另一組的比。例如將使用了一種ALK抑制劑進行治療的病人與未使用一種ALK抑制劑的進行比較，確定ALK抑制劑是否能有效地增加疾病復發的間隔時間，尤其是對於ALK 突變。例如如本發明所述，使用ALK抑制劑治療那些腫瘤組織中已經產生ALK突變的對象，其效果會比未產生ALK突變的效果更差。
本發明所述的“ALK抑制試劑”或“ALK抑制劑”是指一種能抑制ALK生物活性的化合物。生物活性也包括本申請所列的病人反應。典型的ALK抑制試劑非限制性地包括PF-02341066，PDD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4,5,6,11,12,13-六氫-2H-吲唑[5,4-α]吡咯[3,4-c]哢唑-8-基[4-(二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(1S,2S,3R,4R)-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2,3,4,5-四氫-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯並氮雜卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-甲醯胺和NVP-TAE684(參見例如PNAS 104：270-275,2007；Choi,Y.L.et al.(2008)Cancer Res.68：4971-2976；and Biochemistry 48：3600-3609,2009，本發明引用參考)。
術語“同源”或“同源性”可以交換使用，它們是指兩個多核苷酸序列或兩個多肽序列之間的相似序列具有更嚴格的同源性比較。術語“同源性或同源百分率”和“同源性或同源%”是指兩個或兩個以上多核苷酸序列或兩個或兩個以上多肽序列序列中相似序列的百分率。“序列相似性”是指兩個或兩個以上的多核苷酸序列中堿基對序列的相似百分率(用任意合適的方法確定)。兩個或兩個以上的序列可以在任何地方具有0-100%的相似性或整體相似。同源性或相似性可以通過比較每個序列的相同位置來獲得。當比較序列中的一個位置上是相同的核苷酸或氨基酸，那麼這些分子在這個位置上就是同源的。多核苷酸序列的相似率或同源率是指這些多核苷酸序列共有位置上核苷酸同源或匹配的一個數量函數。多肽序列的一個同源率是指這些多肽序列共有位置上氨基酸同源的一個數量函數。多肽序列的一個同源率或相似率是指這些多肽序列共有位置上氨基酸的一個數量函數。本發明所述的術語“實質同源”是指至少50%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%或更多同源。
癌症的“抑制”，如果至少有一個癌症症狀緩解，終止，延緩或阻止。 如本發明所使用的，如果能減少，減緩，減慢或預防癌症復發或轉移，那麼癌症也被“抑制”。
一個“標記核酸”或“生物標記核酸”是一種由本發明所述的一個標記編碼或與之對應的核酸(如DNA，mRNA，cDNA)。例如這種標記核酸分子包括DNA(例如，基因組DNA和cDNA)，該DNA包括表1所列的任意核苷酸序列或這些序列中的一部分，或是這些序列的互補序列或雜交序列。這種標記核酸分子也包括RNA，該RNA包括表1所列的任意核苷酸序列或這些序列中的一部分，或是這些序列的互補序列，其中所有的胸嘧啶殘基被尿嘧啶殘基替換。一種“標記蛋白質”是由本發明所述的一個標記編碼的蛋白或對應的蛋白。一種標記蛋白質包括表1所列的任意序列或序列片段編碼的整個蛋白序列或部分蛋白序列。術語“蛋白”和“多肽”在本發明中含意相同。
一個標記的“正常”拷貝數或一個標記的“正常”表達水準是指在一個生物樣本中，如從一個未患有癌症的目標對象，如人體中採集的含有痰液，支氣管肺泡灌洗，胸腔積液，組織，全血，血清，血漿，口腔刮，唾液，腦脊液，尿液，糞便和骨髓的樣本中，所述標記的表達水準和拷貝數。
ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的一種“過度表達”或“明顯太高的表達水準，拷貝數和/或活性”是在一個檢測樣本中，一種表達水準，拷貝數和/或活性比標準的表達水準或拷貝數檢測錯誤更大，它可以至少是一個控制樣本(如從一個未患有癌症的健康對象中採集的樣本)中ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)表達水準或拷貝數的兩，三，四，五或十或更高倍數，或者至少是數個控制樣本中ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的平均表達水準或拷貝數的兩，三，四，五或十或更高倍數。
術語“探針”是指任何可以選擇性地與一個特定目標分子結合的分子，例如本發明所述的一個標記。探針既可以由本發明的普通技術人員合 成，也可以由合適的生物製劑製備。為了檢測目標分子，可以如本發明所述的使探針特別地帶有標記。可以用作探針的典型分子非限制性地包括核糖核酸，去氧核糖核酸，蛋白質，抗體和有機單體。
“RECIST”是一個縮寫，意為“固體腫瘤反應的評估標準”，它公佈的標準是當癌症患者在治療過程中病情好轉(“反應”)，保持不變(“穩定”)或惡化(“進展“)。例如2000年2月2日國家癌症研究雜誌92期3號已經公佈了根據RECIST標準確定的反應，RECIST標準可以包括其他相似的定義和規則設置。本領域的普通技術人員明白本發明可以使用RECIST標準確定的定義，如"PR"、"CR"、"SD"和"PD"。
本發明所述的“回應”治療的“反應”及它的其他時態是指一個對象使用一種ALK抑制劑後產生的反應。在一個實施例中，一個對象使用一種ALK抑制劑後會產生反應，即該對象中的腫瘤會大約緩慢增長10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或更多。在另一個實施例中，一個對象使用一種ALK抑制劑後會產生反應，即使用合適的檢測，如品質或體積等會發現該對象中的腫瘤大約減少5%，10%，20%，30%，40%，50%或更多。在另一個實施例中，一個對象使用一種ALK抑制劑後會產生反應，即其平均壽命會比未接受治療的平均壽命大約增加5%，10%，20%，30%，40%，50%或更多。在另一個實施例中，一個對象使用一種ALK抑制劑後會產生反應，即這個對象有一個增加的無病存活率，整體存活率或增加惡化時間。可以使用幾種方法來確定病人是否對治療有反應，這些方法包括上述的RECIST標準。
“樣本”，“組織樣本”，“病人樣本”，“病人細胞或組織樣本”或“標本”均是指從一個對象或病人的一個組織中採集獲得的相似細胞。該組織樣本的來源可能是從一個新鮮的，冷凍和/或保存器官中獲得的固體組織，組織樣本，切片，或吸出物；血液或任何血液成分；體液如腦脊髓液，羊水，腹水或胞間液；或是在目標體中產生或生長任意時間的細胞。 所述的組織樣本可以含有與天然組織混合的非天然化合物，如防腐劑，抗凝血劑，緩衝劑，固定劑，營養劑，抗生素等。
如果通過一個比評估量的標準錯誤更多的量，或者至少是評估量的兩，三，四，五，十或更多更好多倍的量使該標記的量分別比正常水準更高或更低，那麼一個標記的量，例如ALK基因突變或基因產物(如表1所列的標記)的表達或拷貝數，在一個對象中是“明顯”地高於或低於一個標記的正常量。或者在對象體中該標記的量可以被認為是“明顯”高於或低於正常量，如果這個量至少是標記正常量的兩，三，四，五倍，更高或更低倍。
本發明中，“重要事件”是指病人患病時一個事件，本領域的普通技術人員認為其是重要的。典型的重要事件非限制性地包括初次診斷，死亡，復發，確定病人的病變發生轉移，病人疾病復發或病人疾病從上述任何一個階段發展到另一個階段。一個重要事件可以是由本領域的普通技術人員使用OS，TTP和/或RECIST或其他反應標準評估確定的任何重要事件。
本發明中，“對象”和“病人”可以互換使用。本發明中所使用的術語“對象”和“對象們”是指動物，如包括非靈長類動物(如牛，豬，馬，驢，羊，駱駝，貓，狗，豚鼠，大鼠，小鼠，羊)和靈長類動物(如猴，如食蟹猴，大猩猩，黑猩猩和人類)在內的哺乳動物。
本發明中所使用的“時間過程”是指初始事件和隨後事件之間的時間量。例如一個病人的癌症，其時間過程可以涉及一個病人的疾病以及在該疾病過程中可以使用顯著測量物來測量的，其中例如第一事件可以是被診斷，而後面的事件可以是轉移。
“發展時間”或“TTP”是指從治療開始到發展或一種癌症或檢查的一個測量時間。檢查可能來自一個研究結束或來自治療的一個變化。發展時間也可以表示為一種概率，例如在一個評估事件發展點中，發展時間可以代表其在一個特定的時間內自由發展的可能性，時間是指治療開始到發 展或檢查之間的時間。
一個“多核苷酸轉錄”是一個多核苷酸(例如一個RNA，一個cDNA或者是一個RNA或cDNA的同源)，它與一個成熟RNA的全部或一部分互補或同源，其中成熟RNA是由本發明的一個標記轉錄以及正常的轉錄後處理(如拼接)，如果有的話，轉錄和轉錄的反轉錄獲得的。
“治療”，“處理”以及這個單詞的其他形式都是指使用ALK抑制劑來限制一種癌症的生長，使一種癌症縮小重量或體積，延長對象的預計存活時間或者是腫瘤的發展時間等。
ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的一個“低表達”或“明顯降低的表達水準，拷貝數和/或活性”是指一個檢測樣本的表達水準或拷貝數比用來評估表達或拷貝數的標準誤差更大，至少比一個控制樣本中ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的表達水準，拷貝數和/或活性低兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍或更多倍，或者是比幾個控制樣本中ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的平均表達水準，拷貝數和/或活性低兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍或更多倍。
II.發明實施方法
本發明至少部分是基於對特定區域基因組的識別，包括如ALK突變體，及在治療癌症中ALK抑制劑的效果判斷。ALK基因表達序列的分析來鑒定對ALK多肽的新型突變(如表1所列的生物標記，包括ALK多肽)，可以使至少部分的多肽具有對ALK抑制劑治療的抵抗性。因此，在本發明的範圍內這裏所述不同的方法中存在和/或不存在一個或多個這樣的生物標記。
在一些實施方案，本發明的方法可以用來監測一個對象的癌症進程，其中，在癌症進程中可識別出對象的樣本存在一個或多個突變ALK(如EML4-ALK突變)，如在最初點時間內和隨後點時間內，然後癌症越來越少對ALK抑制劑介入治療的響應，反之亦然。在另一些實施例中，在最初 點時間和隨後點時間之間，對象已接受如化療，放療，手術，或其他任何有用的抑制癌症的療法等治療，或已完成治療，或正在緩解。
在這裏進一步說明，本發明的一個或多個生物標記(如突變ALK，包括突變EML4-ALK)可通過存在的基因組(如生殖和/或體細胞)序列與參考序列相比較來特定識別，如SEQ序號1。例如，這裏所述的方法可以影響探測本發明所述的生物標記，通過對核酸靶向目標的DNA的延伸擴增反應包括表1所列的一個或多個突變，並分析存在的一個或多個突變核酸靶向目標來實現。
在文獻中各種用於核酸擴增技術是眾所周知的，如：PCR(聚合酶鏈反應)，公開於美國專利號4683195(引用參考)，美國專利號4683202(引用參考)和美國專利號4800159(引用參考)，和它的替代RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)，特別是它的一步式在專利EP-B-0.569.272中公開，LCR(連接酶鏈反應)如在專利申請EP-A-0.201.184公開，RCR(修復鏈反應)如在國際專利申請WO-A-90/01069公開(引用參考)，3SR(自主序列複製系統)如在國際專利申請WO-A-90/06995公開(引用參考)，NASBA(基於核酸序列擴增技術)如在專利EP-β-0.397.269和美國專利號5466586(引用參考)使用的DNA雙鏈為範本，和TMA(轉錄介導擴增技術)如在美國專利號5399491公開(引用參考)。
在文獻中知道在不同的方式下可發現存在一個或多個突變的擴增產品，例如DNA測序方法如桑格測序和深度測序，限制性內切酶的應用，等位基因特異性擴增，肽核酸(PNA)-介導PCR，構象差異的發現，如鏈構象多態性檢測(SSCP)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)，用標記的寡核苷酸探針來分析檢測細胞膜(斑點雜交)，分析檢測微孔板，如反向雜交法，寡核苷酸鏈結檢測法(OLA,MLPA)，第一核苷酸變化(FNC)技術，交聯技術，快速迴圈PCR和同步螢光分析(如5'核苷酸酶/螢光定量)，和PCR後用微型測序用質譜測定法或毛細管電泳法。
III.核酸分子分離的實施
本發明的一方面涉及分離核酸分子，相當於本發明的生物標記，包括相當於本發明的標記核酸編碼的多肽或一部分這樣的多肽。本發明的核酸分子包括那些核酸分子屬於這裏所識別的ALK或ALK-相關基因組(如生殖和/或體細胞)和/或編碼ALK或ALK-相關(如EML4-ALK)多肽。在一些實施例中，本發明的核酸分子由表1所列的包括必須的或包括核序列或其片段組成。本發明的分離核酸分子也包括必須用於雜交探針來識別核酸分子的核酸分子，相當於本發明的標記，包括編碼相當於標記的多肽的核酸分子，和這些核酸分子的片段，如那些適用作PCR擴增的引物或核酸分子突變。這裏所使用的術語“核酸分子”是包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)和用核苷酸生產的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，在某些實施例中的核酸分子是雙鏈DNA。
“分離”核酸分子是從其他核酸分子中分離出來的一種，其存在于核酸分子的天然來源中。在一些實施例中，“分離”核酸分子是自由序列(如蛋白質編碼序列)，其自然側鏈核酸(如序列位於5'和3'末端的核酸)在核酸衍生而來的生物體基因組DNA中。例如，在各種實施例中，分離核酸分子包含少於5KB，少於4KB，少於3KB，少於2KB，少於1KB，少於0.5KB或少於0.1KB的核苷酸序列，其自然側鏈核酸在細胞衍生而來的生物體基因組DNA中。此外，“分離”核酸分子如cDNA分子，當通過重組技術生產時基本沒有其他微孔材料或培養基，或當化學合成時基本沒有化學前體或其他化學物質。
語句“基本沒有其他微孔材料或培養基”包括製備的核酸分子，是從分離或重組產生的細胞微孔結構中分離出來的。因此，核酸分子基本沒有微孔材料包括製備的核酸分子具有少於30%，少於20%，少於10%，少於5%(幹重)的其他微孔材料或培養基。
本發明的核酸分子，如表1所列的突變ALK基因，用標準分子生物技術和這裏所述的資料庫記錄中的序列資訊來分離。使用全部或部分這樣的核酸序列，本發明的核酸分子可使用標準的雜交分離和克隆技術來分離得到(即，在Sambrook et al.,ed.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述)。
本發明的核酸分子可以利用cDNA，mRNA，或基因組DNA(如生殖和/或體細胞基因組DNA)作為模版和依據標準的PCR擴增技術的寡核苷酸引物來擴增得到。通過DNA序列分析法可將擴增的核酸分子克隆到合適的載體中並表達。此外，寡核苷酸相當於全部或部分通過標準合成技術如使用自動DNA合成器分離得到本發明的核酸分子。
在另一實施例中，本發明的分離核酸分子包括具有與本發明標記相一致的核苷酸序列互補的核酸序列的核酸分子或與本發明標記相一致的蛋白質編碼的核酸序列的核酸分子。與給定的核苷酸序列互補的核酸分子是充分的與給定的核苷酸序列互補的，它可與給定的核苷酸序列進行雜交因此形成穩定的雙鏈。
此外，本發明的核酸分子可以僅僅包括核酸序列一部分，其中全長的核酸序列包括本發明標記或相當於本發明標記的編碼多肽。這樣的核酸分子可用作如探針或引物。探針/引物通常用作一個或多個基本純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包括一段在嚴格條件下雜交的核苷酸序列區，至少約7，至少約8，至少約9，至少約10，至少約11，至少約12，至少約13，至少約14，至少約15，至少約16，至少約17，至少約18，至少約19，至少約20，至少約21，至少約22，至少約23，至少約24，至少約25，至少約26，至少約27，至少約28，至少約29，至少約30，至少約31，至少約32，至少約33，至少約34，至少約35，至少約36，至少約37，至少約38，至少約39，至少約40，至少約45，至少約50，至少約55，至少約60，至少約 65，至少約70，至少約75，至少約80，至少約85，至少約90，至少約95，至少約100或更連續的本發明核酸的核苷酸。
基於本發明核酸分子序列的探針可用於檢測相當於一個或多個本發明標記的轉錄產品或基因序列。探針包括一組附屬的標籤如放射性同位素，螢光化合物，酶，或酶輔助因數。這些探針可以作用於識別不當表達蛋白蛋的細胞或組織的診斷試測試劑盒的一部分，如測量對象細胞樣本的核酸分子編碼蛋白質的水準，如檢測mRNA水準或確定基因編碼蛋白質是突變或刪除。
本發明另外包含的核酸分子與突變的ALK基因或基因產物(表1所列的標記)基本上一致，如此以致於它們至少60%，至少65%，至少有70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少有90%，至少91%，至少92%，至少有93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，至少99.5%或更高是相同的。在另外一個實施例中，本發明另外包含的核酸分子與突變的ALK基因或基因產物(表1所列的標記)基本上一致，如此以致於它們之間只有僅僅一點或至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6個，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25，至少26個，至少27，至少28，至少29，至少30，至少31，至少32，至少33，至少34，至少35，至少36，至少37，至少38個，至少39，至少40，至少45，至少50，至少55，至少60，至少65，至少70，至少75，至少80，至少85，至少90，至少95，至少100個核苷酸或任何範圍的區別。
術語“單核苷酸多態性”(SNP)是指單個核苷酸侵佔多態性位置，即在等位基因序列中發生位置變化。該位置的前面和後面通常是高度保守的等位基因序列(如序列變化小於人口的1/100或1/1000)。SNPs也可以由 在所涉及到的等位基因上刪除一個核酸或插入一個核酸引起的。多態性位置通常被不同於所提到底物的底物侵佔。例如，所涉及到的等位基因包括在多態性位置上的底物“T”(胸腺嘧啶)，變化等位基因包括在多態性位置上的“C”(胞嘧啶)，“G”(鳥嘌呤)，或“A”(腺嘌呤)。SNP可發生在蛋白質編碼核酸序列上，在這種情況下，它們可能導致缺陷或其他突變蛋白質，或遺傳疾病。這樣SNP可改變基因的編碼序列並因此得到其他氨基酸(錯義SNP)或SNP可引入終止密碼子(無意義SNP)。當SNP沒有改變蛋白質的基氨酸序列，SNP被稱為“沉默”。SNP也可發生在核酸序列的非編碼區上，這可導致缺陷蛋白質表達，例如，導致具有額外刺激，或可能不會對蛋白質功能影響的結果。
在另一實施例中，本發明的分離核酸分子是至少7，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，至少40，至少45，至少50，至少55個，至少60歲，至少65歲，至少70，至少75，至少80，至少85，至少90，至少95，至少100，至少125，至少150，至少175，至少200，至少250，至少300，至少350，至少400，至少450，至少550，至少650，至少700人，至少800，至少900，至少1000，至少1200，至少1400，至少1600，至少1800，至少2000，至少2200，至少有2400，至少2600，至少2800，至少3000，至少3500，至少4000，至少4500，或更長的核苷酸，並在嚴格條件下將核酸分子雜交成相當於本發明標記或將核酸分子的編碼蛋白質成相應的本發明標記。這裏所用的術語“在嚴格條件下雜交”是指用於雜交或洗滌的條件，其核苷酸序列通常至少60%，65%，70%，75%，80%，85%保持相同彼此互相雜交。這些嚴格的條件在文獻John Wiley & Sons,N.Y.(1989)的分子生物學的普通實驗6.3.1-6.3.6章節中知道並找到那些技術。另此，一個非限制性嚴格雜交條件的例子，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)45℃下，隨後在0.2X SSC，0.1% SDS 50-65℃下洗滌一次或多次。
本發明還包括分子信標核酸分子，其至少具有一個與本發明的核酸分 子互補的區域，這樣的分子信標用來定量樣本中存在本發明的核酸分子。“分子信標”核酸是包括一對互補區域和具有螢光和與此相關的螢光猝滅的核酸分子。螢光和猝滅在方向上與核酸不同的部分有關，當另一個互補區域退火時，螢光的螢光性通過猝滅得以猝滅。當核酸分子的另一個互補區域沒有退火時，螢光的螢光性猝滅程度較輕。分子信標核酸分子被公開，例如，在美國專利5876930(引用參考)。
IV.分離蛋白質與抗體的實施
一個方面，本發明涉及到相當於本發明單獨標記的分離蛋白和其生物活性。在一實施例中，原生態多肽可從細胞或組織源中通過用標準蛋白質純化技術的適當純化方案來分離得到相當於本發明的標記。在另一實施例中，多肽通過重組DNA技術得到相當於本發明標記。重組表達，多肽相當於採用標準肽合成技術化學合成的本發明的標記。
“分離”或“淨化”蛋白質或其生物活性部分基本不含蛋白質來源的細胞或組織源中的細胞物質或其他污染蛋白質，或當化學合成時基本不含化學前體或其他化學物。語句“基本不含細胞物質”包括從分離或重組得到的細胞的細胞成分中分離得到的製備蛋白質。因此，基本不含細胞物質的蛋白質中包括製備的蛋白質具有至少約30%，至少約20%，至少約10%，至少約5%(幹重)的異源蛋白(也就是這裏所提到的“污染蛋白質”)。當蛋白質或其生物活性部分是通得重組得到，它可基本不含有培養基，如培養基至少約20%，至少約10%，至少約5%的製備蛋白質體積。當蛋白質是通過化學合成得到，它可基本不含有化學先體或其他化學物，如從合成蛋白質中所涉及到的化學先體或其他化學物中分離出來。因此，這樣製備的蛋白質具有比添加物多肽少於約30%，少於約20%，少於約10%，少於約5%(幹重)的化學先體或化合物。
相當於本發明標記的多肽生物活性部分包括由本發明的氨基酸序列或釆自與ALK基因突變和/或基因產品(表1所列標記)的蛋白質氨基酸序列 組成的多肽。其包括比全長蛋白質更少的氨基酸，並呈現至少相當於全長蛋白質一倍的活力。通常情況下，生物活性部分包括一個具有至少相當於蛋白質一倍活力的區域或結構。本發明的蛋白質生物活性部分可以是多肽，如10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100或更多氨基酸長度。此外，刪除了蛋白質的其他區域的其他活性部分，可通過重組技術製備並識別一個或多個本發明原生態多肽的起作用的活性點。
在某些實施例中，多肽具有表1所列核酸分子編碼蛋白質的氨基酸序列。其他有用蛋白質與這些序列中的一個基本相同(例如，至少60，至少65，至少70，至少75，至少有80，至少85，至少86，至少87，至少88，至少89，至少90，至少91，至少92，至少93，至少94，至少95，至少96，至少97，至少98，至少99，至少99.5%或更大)，並保留不同氨基酸序列中全長蛋白質的有用的蛋白質活性(如對ALK抑制劑具有抵抗性或敏感性)。
要確定兩個氨基酸序列或核酸的百分率特性，對比序列以獲得最佳比較目的(在第一個氨基酸或蛋白質核酸序列與第二個氨基酸或核酸序列連接處插入分歧點)。然後對氨基酸殘基或核苷酸對應的氨基酸位置或核苷酸位置進行比較。當第一個序列被相當於第二個序列相同的氨基酸殘體或核苷酸佔用，則該位置的分子相同。兩個序列中的百分率特性是序列完全共用位置的數量的函數(如%特性=相同位置數#/總位置數#(如重疊位置)×100)。在一個實施例中，這兩個序列是相同長度。
兩個序列中的百分率特性可以通過一種數學演算法完成。類似的，非限制性實施例，利用數學演算法來比較兩個序列可以是Karlin andAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，改進Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中的演算法。這種演算法引用到Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST 法中。BLAST核苷酸檢索可通過NBLAST法來執行，分值=100，字長=12來獲得與本發明核酸分子相同的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可通過XBLAST法來執行，分值=50，字長=3來獲得與本發明蛋白質分子相同的氨基酸分子。為了獲得比較目的的分歧線，可利用在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所描述的分歧BLAST。另外，PSI-Blast可用作對出現分子間遠親關係重複檢索。當使用BLAST，分歧BLAST和PSI-Blast程式時，可用各個程式的默認參數(如XBLAST和NBLAST)(詳見萬維網ncbi.nlm.nih.gov上的NCBI網頁)。在另一非限制性實施例中，用於序列比較的數學演算法是Myers and Miller,(1988)Comput Appl Biosci,4：11-7上的演算法。這樣一個演算法引入到ALIGN程式(2.0版)中用於比較氨基酸序列，PAM120重殘基表中，可用分歧長度點為12，和分歧長度點為4。另一用於類似和線性局部序列的識別區域的有用演算法是如在Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448所描述的FASTA演算法。當用FASTA演算法來比較核苷酸或氨基酸序列時，例如，PAM120重殘基表可用值為2的K-元陣列。
兩個序列間的百分率特性可用類似以上所述的那些技術來確定具有或不具有分歧。在計算百分率特性中，僅有精確匹配的才計算。
相當於本發明的標記的分離多肽或其碎片可用作使用多克隆和單克隆標準技術來生產製備抗體的免疫原。全長多肽或蛋白質可用作或本發明提供的抗原肽片段用作免疫原。本發明的抗原肽蛋白質含有至少8(或至少10，至少15，至少20，至少30或更多)本發明多肽的一個氨基酸序列的殘體氨基酸，和包括蛋白質抗原表位，以致於抗體突出反向蛋白質結構來明確具有本發明標記的免疫綜合體來與蛋白質相符。抗原肽包括的實施抗源表位元位於蛋白質表面的區域，如親水區。疏水性序列分析，親水性序列分析，或類似的分析可以用來識別親水區。
免疫原通常是通過免疫接種(即免疫)合適的對象如免子、山羊、老 鼠或其他哺乳動物或脊椎動物來製備抗體。適當的免疫製劑包含如重組表達或化學合成多肽。製劑更進一步還包括輔助劑如弗氏完全或不完全輔助劑，或類似的免疫劑。
因此，本發明的另一方面涉及到定向對抗本發明多肽的抗體。術語“抗體”和“抗體物質”在這裏可相互替換，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即分子含有抗原粘合位置，其特異性粘合抗原，如本發明的多肽。特異粘合到特定的本發明多肽上的分子是在同一個樣品中如含有天然多肽的生物樣品只粘合到多肽上但基本不粘合在其他分子上的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分包括F(ab)和F(ab')2片段，其可通用採用酶如胃蛋白酶來處理抗體得到。本發明提供多克隆和單克隆抗體。在這裏所用的術語“多克隆抗體”和“單克隆抗體成份”，涉及到抗體分子群，其僅僅含有一種具有特定抗原表位的免疫能力的抗原粘合位置。
用本發明多肽作為免疫原免疫到合適的對象上來製備上述的多克隆抗體。免疫對象中的抗體濃度量可通過標準技術如用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)來隨時間測定。如果需要，抗體分子可以從對象(如從對象的血液與血清中)中獲得或分離得到並通過已知的技術如蛋白質層析純化獲得IgG片段。在免疫後的適當時間如特定的抗體濃度量最高，抗體生成細胞從對象上獲得並通過標準技術如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495-497上最早公開的雜種瘤技術，人類B細胞雜種瘤技術(見Kozbor et al.,1983,Immunol.Today 4：72)，EBV-雜種瘤技術(見Cole et al.,pp.77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,1985)或三體雜交瘤技術來製備單克隆抗體。用於生產雜交瘤細胞的技術是眾所周知的(見generally Current Protocols in Immunology,Coligan et al.ed.,John Wiley & Sons,New York,1994)。雜種瘤細胞生產本發明單克隆抗體通過篩選雜種瘤培養液的上浮液來得到抗體，其粘合在所目標的多肽上，即用標 準ELISA試驗法。
製備單克隆體抗體-分泌雜種瘤的替代方法，定向對抗本發明的多肽可通過篩選具有所目標多肽的重組組合免疫球蛋白庫(如噬菌體抗體陳列庫)識別並分離得到。用於生產和篩選噬菌體抗體陳列庫的試劑盒在市場上可得到(如法瑪西亞重組噬菌體抗體系統，產品編號27-9400-01；和Stratagene公司SurfZAP噬菌體試劑盒，產品編號240612)。此外，特別適合用在生產和篩選抗體陳列庫的方法和試劑可在如美國專利號5223409(引用參考)，PCT公佈號WO92/18619(引用參考)，PCT公佈號WO91/17271(引用參考)，PCT公佈號WO92/20791(引用參考)，PCT公佈號WO92/15679(引用參考)，PCT公佈號WO93/01288(引用參考)，PCT公佈號WO92/01047(引用參考)，PCT公佈號WO92/09690(引用參考)，PCT公佈號WO90/02809(引用參考)，福克斯等(1991)生物/技術9：1370-1372，Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85，Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281，Griffiths et al.(1993)EMBO J.12：725-734等中找到。
此外，重組抗體如嵌合的和人化的單克隆抗體，包括人類和非人類部分，在本發明範圍內其可用標準重組DNA技術來製造。這種嵌合的和人化的單克隆抗體可通過在現有文獻中所知的重組DNA技術來製備，如在PCT公開號WO 87/02671(引用參考)，歐洲專利申請號184187，歐洲專利申請號171496，歐洲專利申請號173494，PCT公開號WO 86/01533(引用參考)，美國專利號4816567(引用參考)，歐洲專利申請125023，Better et al.(1988)Science 240：1041-1043；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443，Liu et al.(1987)J.Immunol.139：3521-3526，Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218，Nishimura et al.(1987)Cancer Res.47：999-1005，Wood et al.(1985)Nature 314：446-449，和Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559，Morrison(1985)Science 229：1202-1207，Oi et al.(1986)Bio/Techniques 4：214，美國專利5225539(引用參考)，Jones et al. (1986)Nature 321：552-525，Verhoeyan et al.(1988)Science 239：1534，和Beidler et al.(1988)J.Immunol.141：4053-4060。
用來治療人類對象的完全人類抗體特別需要。這種抗體可用轉基因老鼠來生產，其無能力表達內源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但可表達人類重鏈和輕鏈基因。轉基因老鼠在正常方式下有選擇性的抗原免疫，如相當於本發明標記的全部或部分多肽。定向對抗單克隆抗體可用傳統雜種瘤技術獲得。人類免疫球蛋白轉基因在轉基因老鼠B細胞分化期間的重新排列生存，並隨後進行類別轉換和體細胞突變。因此，用這種技術，可生產用於治療IgG,IgA和IgE的抗體。用於生產人類抗體的技術綜述，詳見Lonberg and Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93。用於生產人類抗體和人類單克隆抗體技術的詳細論述和生產這種抗體的規約，詳見美國專利5625126(引用參考)，美國專利5633425(引用參考)，美國專利5569825(引用參考)，美國專利5661016(引用參考)，和美國專利5545806(引用參考)。另外，公司如Abgenix,Inc.(Freemont,CA)可從事提供用類似上述的技術定向對抗選擇性抗原的人類抗體。
選擇性識別抗原表位的完全人類抗體可使用被稱為“導向選擇”的技術來生產。這種方法用選擇性非人類單克隆抗體如鼠科抗體來導向選擇識別相同抗原表位的完全人類抗體(Jespers et al.,1994,Bio/technology 12：899-903)。
相當於本發明標記的定向對抗多肽的抗體(如單克隆抗體)可用於通過標準技術如親和層析或免疫沉澱反應來分離多肽。而且，這種抗體可用於識別標記(如細胞溶解產物或細胞懸浮物)來判斷標記的表達水準和模型。這抗體也可用於診斷監視在診斷測試程中組織或體內流體(如腫瘤細胞體內流體)的蛋白質水準，如確定一個給定治療方案的效果。檢測可促進抗體偶聯到可見物質上。例如可見物質包括但不限於，各種酶，輔基，螢光材料，發光材料，生物發光材料和放射性材料。例如適當的酶包括但 不限於，辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，-半乳糖苷酶，或乙醯膽鹼酯酶；例如適當的輔基化合物包括但不限於抗生蛋白鏈菌素/生物素，抗生素蛋白/生物素；例如適當的螢光材料包括但不限於傘形花內酯，螢光素，異硫氰酸螢光素，羅丹明，二氯三嗪胺螢光素，丹磺醯氯或藻紅蛋白；例如發光材料包括但不限於魯米諾，和例如適當的放射性材料包括但不限於125I，131I，35S或3H。
V.載體和宿主細胞重組表達的實施
本發明的另一方面涉及到載體如表達載體，包括相當於本發明標記的編碼多肽(或該多肽的部分)的氨基酸。這裏所用的術語“載體”是指有能力運送到其已連接的另一核酸的核酸分子。載體的一種類型是“質粒”，是指可增加DNA片段迴圈連接到環形雙鏈DNA上。載體的另一種類型是病毒載體，是指增加DNA片段可連接插入到病毒基因組中。一些載體有能力自主複製並引入宿主細胞中(如具有細菌複製啟點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(如非附加型哺乳動物載體)整合到宿主細胞基因上並引入宿主細胞，並隨宿主基因一起複製。此外，一些載體，也叫表達載體，是有直接表達所合成連接基因的能力。一般來說，重組DNA技術的功能表達載體常常是從質粒(載體)中得到。然而，本發明計畫包含其他形式的表達載體，如病毒載體(如複製缺陷逆轉錄病毒，腺病毒和腺相關病毒)，它們具有相同的功能。
本發明的重組表達載體，包括適合在本發明宿主細胞中核酸表達的形式的核酸。這意味著重組表達基因包括一個或多個控制序列，基於宿主細胞有選擇性的進行有用表達，並合成連接到核酸序列上來表達。在重組表達載體中，“合成連接”的意思是指所目標的核酸序列以一定的方式連接到允許核苷酸序列表達的控制序列上(如在體內轉錄/翻譯系統中或在載體引進宿主細胞時的宿主細胞中)。術語“控制序列”是指含有啟動子，增強子和其他表達控制元件(如多聚腺苷酸信號)。這種控制序列在如Goeddel, Methods in Enzymology：Gene Expression Technology vol.185,Academic Press,San Diego,CA(1991)中被描述。控制序列包括那些在多類型宿主細胞中直接結構表達的核苷酸序列和那些在一些宿主細胞中直接表達的核苷酸序列(如組織特異性控制序列)。通過在載體表達設計文獻中的那些技能，如選擇宿主細胞來改變些依賴因素，希望的蛋白質表達水準等等越來越被重視。本發明的表達載體可引入宿主細胞來生產蛋白質或肽，通過這裏所述的核酸來編碼具有功能性的蛋白質或肽。
本發明的重組表達載體可用原核細胞(如大腸桿菌)或真核細胞(如昆蟲細胞{使有了杆狀病毒表達載體}，酵母細胞或哺乳動物細胞)來設計相當於本發明標記的多肽表達。適合的宿主細胞在Goeddel,supra中有更一步的論述。重組表達載體可以在如具有T7啟動子控制序列和T7聚合酶的體外轉錄和翻譯。
原核生物的蛋白質表達最常用的是在含有構成或誘導啟動子指導融合型或非融合性蛋白質表達的載體大腸桿菌中。其中在融合型載體通常加入一些氨基酸到編碼蛋白質中作為重組蛋白質的氨基酸終止子。這種融合型載體通常具有三個作用：1)增加重組蛋白質的表達；2)增加重組蛋白質的溶解度；和3)通過在親和純化作用中的配合基有助於重組蛋白質的純化。通常，在融合弄表達載體中，蛋白水解切割位點是在引入融合部分與重組蛋白質的聯結點，其可從融合型蛋白質純化後的融合部分中分離得到重組蛋白質。這種酶和他們同源識別序列，包括Xa因數，凝血酶和腸激酶。典型融合型表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith and Johnson,1988,Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和融合谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，麥芽糖E結合蛋白，或蛋白A，分別靶向重組蛋白。
例如，合適的非融合型大腸桿菌表達載體包括pTrc(Amann et al.,1988,Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier et al.,p.60-89,In Gene Expression Technology：Methods in Enzymology vol.185,Academic Press,San Diego,CA,1991)。靶基因的表達載體pTrc依賴來自雜交trp-lac融合型啟動子的宿主RNA聚合酶轉錄。靶基因的表達pET11d載體依賴來自雜交T7 gn10-lac融合型啟動子介導的共同表達病毒RNA聚合酶(T7 gn1)轉錄。這些病毒聚合酶通過來自在lacUV 5啟動子的轉錄控制下位於前噬菌體上存在的T7 gn1基因的宿主片段BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
在大腸桿菌中最大化重組蛋白質表達的實施之一是在具有蛋白水解切割重組蛋白質能力的受損宿主細菌中表達(Gottesman,p.119-128,In Gene Expression Technology：Methods in Enzymology vol.185,Academic Press,San Diego,CA,1990)。另一實施是核酸的核酸序列插入到表達載體中以致於在大腸桿菌中的那些獨自的密碼子都有各自的氨基酸(Wada et al.,1992,Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本發明氨基酸序列的這種改變可通過標準DNA合成技術實現。
在另一個實施例中，表達載體是酵母表達載體。例如，用於表達的載體有釀酒酵母S包括pYepSec1(Baldari et al.,1987,EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjan and Herskowitz,1982,Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz et al.,1987,Gene 54：113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)，和pPicZ(Invitrogen Corp,San Diego,CA)。
另外，表達載體是杆狀病毒表達載體。適用于蛋白質表達在培養昆蟲細胞(如Sf9細胞)內的杆狀病毒載體包括pAc系列(Smith et al.,1983,Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers,1989,Virology 170：31-39)。
在另一個實施例中，本發明的核酸是使用哺乳動物細胞中的哺乳動物表達載體來表達的。例如，哺乳動物表達載體包括pCDM8(Seed,1987,Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman et al.,1987,EMBO J.6：187-195)。當用哺乳動物細胞時，表達載體的控制功能常常由病毒控制元件提供。例如， 常用的啟動子來自多瘤病毒，腺病毒2，巨細胞病毒和猿猴病毒40。對於其他的原核和真核細胞的合適表達系統詳見Sambrook et al.,supra中的第16和17章節。
在另一個實施例中，重組哺乳動物表達載體是在特定的細胞類型中指導核酸表達的能力(如組織特異性控制元件用於核酸表達)。組織特異性控制元件在文獻中可知。非限制性例子，適合的組織特異性啟動子包括白蛋白啟動子(liver-specific；Pinkert et al.,1987,Genes Dev.1：268-277)，淋巴特異性啟動子(Calame and Eaton,1988,Adv.Immunol.43：235-275)，如T細胞受體啟動子(Winoto and Baltimore,1989,EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji et al.,1983,Cell 33：729-740；Queen and Baltimore,1983,Cell 33：741-748)，神經元特異性啟動子(如神經絲啟動子，Byrne and Ruddle,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)，胰腺特異性啟動子(Edlund et al.,1985,Science 230：912-916)，和乳腺特異性啟動子(如牛乳清啟動子，美國專利號4873316(引用參考)和歐洲專利公開號264166)。發展控制啟動子也包括如小鼠同源盒蛋白啟動子(Kessel and Gruss,1990,Science 249：374-379)和-胎蛋白啟動子(Camper and Tilghman,1989,Genes Dev.3：537-546)。
本發明更進一步提供了重組表達載體，包括本發明反義方向克隆到表達載體裏的DNA分子。也就是說，DNA分子以一定的方式合成連接到控制序列上，其允許本發明多肽的反義編碼mRNA的RNA分子表達(通過DNA分子轉錄)。合成連接到反義方向克隆的核酸分子上的控制序列可有選擇性的指導反義RNA分子在各種類弄的細胞中連續表達，比如，病毒啟動子和/或增強子，或控制序列可有選擇性的指導構成的，組織特異性的或細胞典型的反義RNA的特異性表達。反義表達載體可從重組質粒，噬菌體，或減弱病毒中得到，其反義核酸是在高效率控制區域的控制下生產，其活性可通過細胞類型引入載體中來確定。使用反義基因的基因表達控制論述 詳見Weintraub et al.,1986,Trends in Genetics,Vol.1(1)。
本發明的另一個方面涉及到向宿主細胞引入本發明的重組表達載體。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在這裏可互換。據瞭解，這些術語不僅涉及到特定的對象細胞還涉及到這些細胞的後代或潛在的後代。因為一些變化可在隨後引起產生突變或環境影響，如實際上後代與母細胞不完全相同，但這些仍然包含在這裏所用的術語範圍內。
宿主細胞可以是任何原核細胞(如大腸桿菌)或真核細胞(例如，昆蟲細胞，酵母或哺乳動物細胞)。
通過傳統的轉錄或轉染技術載體DNA可引入原核或真核細胞中。這裏所用的術語“轉錄”和“轉染”的本意是指通過各種文獻已知的技術將外源核酸引入宿主細胞，包括磷酸鈣或氯化鈣的共同沉澱，DEAE-葡聚糖介導轉染，脂轉染，或電穿孔。用於轉錄或轉染到宿主細胞的適合方法可在Sambrook,et al.(supra)和其他實驗手冊上找到。
眾所周知，對了哺乳動物細胞的穩定轉染依賴表達載體和所用的技術，只有一小部分細胞的基因組可與外源DNA整合。為了識別和選擇這些整合體，基因編碼有選擇性標記(如對抗生素具有抗性)，通常是把所目標的基因引入宿主細胞。典型實施，把選擇性標記引入那些對藥物如G418，潮黴素和甲氨蝶呤藥物具有抗性的細胞中。具有插入核酸的細胞穩定轉錄可通過選擇藥物來識別(如具有選擇性標記的基因的細胞則生存下來，而其他細胞則死亡)。
本發明的宿主細胞，如在培養液中的原核或真核宿主細胞可用來生產相當於本發明標記的多肽。因此，本發明進一步提供用本發明的宿主細胞來生產相當於本發明標記的多肽的方法。在一個實施例中，生產標記的方法包括培養合適媒介的本發明宿主細胞(引入本發明多肽編碼的重組表達載體)。在另一實施例中，方法更進一步包括從媒介或宿主細胞中分離得到標記多肽。
本發明的宿主細胞也可用來生產非人類轉基因動物，例如，在一個實施例中，本發明的宿主細胞是在受精卵母細胞或胎兒幹細胞中引入相當於本發明標記的編碼多肽序列。隨後這種宿主細胞可在他們的基因組中引入編碼本發明標記的外源序列用來產生非人類轉基因動物，或改變相當於本發明標記的編碼多肽的內源基因序列來產生重組動物。這種動物可用來研究相當於標記的多肽功能和/或活性，用來識別和/或判斷多肽活動調節器，與治療的臨床前試驗或診斷分子一樣用來發現或識別標記，如治療和診斷標記的發現或識別，或藥物效力和特異性的替換。
這裏所用的“轉基因動物”是非人類動物即哺乳動物，如嚙齒目動物，即大老鼠或老鼠，其一個或多個動物細胞含有轉基因。另一個例子，基因改造動物包括非人類靈長目動物，羊，狗，牛，羊，雞，兩栖類動物等。轉基因是外源DNA整合到細胞的基因組上，其來自生長的轉基因動物和成熟動物的基因組的殘體，因此在一個或多個細胞類型或轉基因動物的組織中指導編碼基因的表達。這裏所用的“同源重組動物”是非人類動物，例如哺乳動物即老鼠，其通過將內源基因和引入動物細胞的外源DNA分子間同源整合來改變，即動物的胎兒細胞，動物的前期到壯大。轉基因動物也包括在Chan I.T.,et al.(2004)J Clin Invest.113(4)：528-38 and Chin L.et al(1999)Nature 400(6743)：468-72中所描述的那些轉基因動物。
本發明的轉基因動物可通過引入相當於本發明標記的多肽編碼核酸到受精卵母細胞的雄性原核中來生產，即通過顯微注射，逆轉錄病毒感染並使卵母細胞在假孕的雌性動物中生長。也可包括轉基因的內含子序列和多腺苷酸信號來提高轉基因表達效率。組織特異性控制序列可整合連接到轉基因上來指導本發明多肽表達的特異性細胞。用於生產轉基因動物的方法是胚胎控制和顯微注射，特別是動物如老鼠變為傳統在文獻和如在美國專利號4,736,866(引用參考)和4,870,009(引用參考)，美國專利號4,873,191(引用參考)和在Hogan,Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986中公開。類似的方法用於其他轉基因動物的生產。轉基因創造的動物可基於在它的基因組和/或動物組織或細胞中編碼轉基因的mRNA表達中存在的轉基因來識別。然後轉基因創造的動物可用來繁殖攜帶額外轉基因的動物。此外，攜帶轉基因的動物可進一步繁殖其他攜帶其他轉基因的轉基因動物。
為了創造同源性重組動物，製備的載體至少含有相當於本發明標記多肽編碼的部分基因來刪除，增加或替換已被引入的來改變基因，即打亂功能。在另一實施例中，載體設計成這樣，同源基因結合，內生基因功能打亂(即不再編碼功能蛋白質，也稱為“淘汰”載體)。載體可設計成這樣，同源基因結合，內生基因突變或其他改變但仍然編碼功能蛋白(即向上游控制區域的改變可因此改變內生蛋白質的表達)。在同源結合載體中，通過增加基因的核酸來充許被攜帶到載體的外源基因和胎兒幹細胞中的內生基因間發生同源基國再結合來改變部分基因的5'和3'端的側鏈。增加側鏈核酸序列足夠的長度來來達到內生基因的同源再結合的目的。通常情況下，DNA側鏈(均在5'和3'末端)的幾個堿基包括在載體中(詳見Thomas and Capecchi,1987,Cell 51：503 for a description of homologous recombination vectors)。載體引入到胎兒幹細胞系中(如通過電穿孔)並且在細胞中引入基因與內生基因選擇性的同源再結合(詳見Li et al.,1992,Cell 69：915)。然後選擇性細胞注射到動物的胎泡中(如老鼠)來形成聚合嵌合體(詳見Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach,Robertson,Ed.,IRL,Oxford,1987,pp.113-152)。然後嵌合體胚胎可注入到適合的假孕雌性孕育動物中並胚胎成長至分娩。在他們的胚胎細胞中懷有同源再結合DNA的後代可用來繁殖動物，通過轉基因的種類轉錄使得在所有的動物細胞中含有同源再結合DNA。用於構造同源再結合載體和同源再結合動物的方法在Bradley(1991)Current Opinion in Bio/Technology 2：823-829和PCT公開號WO 90/11354(引用參考)，WO 91/01140(引用 參考)，WO 92/0968(引用參考)，和WO 93/04169(引用參考)中有更詳細描述。
在另一個實施，轉基因非人類的動物可採用轉基因的允許控制表達的選擇性系統來生產。一個例子，這樣的系統是噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統。cre/loxP重組酶系統的詳細描述詳見Lakso et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236。另一例子，重組系統是釀酒酵母的FLP重組酶系統(O'Gorman et al.,1991,Science 251：1351-1355)。如果cre/loxP重組酶系統是用來控制含有轉基因編碼所需要CRE重組酶和選擇性蛋白質的轉基因，動物的表達。這種動物可通過建造“雙”轉基因動物來提供，即通過兩種轉基因動物雜交，一個含有編碼選擇性蛋白質的轉基因和另一個含有編碼重組酶的轉基因。
克隆所述的非人類轉基因動物也可按照在Wilmut et al.(1997)Nature 385：810-813和PCT公開號WO 97/07668(引用參考)和WO 97/07669(引用參考)中所公開的方法來生產。
V.試劑盒的實施
試劑盒是任意產品(如包裝或容器)包括至少一種用於本發明標記的特異性檢測試劑如探針，產品可作為一個用於本發明的操作方法的單元被推銷，輸送或銷售。當本發明的化合物，試劑盒子和方法用來實現本發明方法時本發明的ALK突變基因和/或基因產品(如表1所列的標記)是可選擇性的，以致於對具有癌症的患者對象的時期，階段，組織類型或良性/預惡性/惡性類型的陽性結果獲得至少約20%，至少約40%，至少約60%，至少約80%，至少約90%，至少約95%，至少約99%，或100%。在一些實施例中，本發明的標記或標記板可選擇性的，以致於總體人口的PPV(陽性預測值)獲得大於約10%(即外加特異性分析大於99.5%)。
本發明的多元化ALK突變基因和/或基因產品(如表1所列的標記)用在本發明的化合物，試劑盒和方法中時，每個標記的數量，結構和/或活性 或表達水準或拷貝數可與正常的每個多元化標記的數量，結構和/或活性或表達水準或拷貝數進行比較，在相同類型的非癌症樣本中，要麼是單一反應混合物(即用反應劑，如為每個標記用不同的螢光探針)要麼是相當於一個或多個ALK突變基因和/或基因產品(如表1所列的標記)獨立反應混合物。如果多元化ALK突變基因和/或基因產品(如表1所列的標記)被使用，那麼2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多的獨立標記可用或識別。
本發明包括用於對樣本(即存檔組織樣本或從對象上獲得的樣本)分析癌症細胞的化合物，試劑盒和方法。這些化合物，試劑盒和方法與上述的那些基本上相同，不論那些，哪里需要，該化合物，試劑盒和方法都適合用於某些類型的樣本。
因此，本發明包括用於判斷有或可能有對ALK抑制劑降低敏感性的癌症細胞的試劑盒(即在如對象樣本的樣本中)。試劑盒由一個或多個有能力識別出本發明的ALK突變基因和/或基因產品(即表1所列的標記)的試劑組成，如與相當於本發明ALK突變基因和/或基因產品(即表1所列的標記)的核酸或多肽特異性粘合的包括抗體，抗體衍生物，抗體片段等等。適合與核酸(即基因組DNA，mRNA，粘接mRNA，cDNA或類似的)粘合的試劑包括互補的核酸。例如，核酸試劑包括固定到底物的核苷酸(標記或非標記)，沒有與底物粘合的標記核苷酸，PCR引物，分子信標探針等。在一些實施例中，試劑盒含有操作這裏所描述方法的有用試劑，如至少含有一種能識別和雜交到得延長核酸的引物，周圍至少一種延長的核酸，至少包括一種表1所列的突變體和用於檢測存在所說突變體擴增靶向核酸的方法。
本發明的試劑盒可選擇性的增加對本發明方法操作有用的合化物。通過例如方式，試劑盒可含有適用於互補核酸退火或用於用蛋白質其特異性粘合抗體的液體(如SSC緩衝液)，一個或多個間隔樣本，一本描述本發明方法操作的教學材料，一個正常細胞樣本，一個癌症細胞樣本等等。
本發明的試劑盒可包括用於檢測標記蛋白質水準或蛋白質活性有用的試劑。在另一實施例中，本發明的試劑盒可包括一用於檢測標記的甲基化程度的試劑，或包括用於檢測標記結構變化的試劑，如存在的突變體。
VI.預測醫學
本發明還涉及到預測醫學，包括診斷檢測，藥物基因組學，臨床試驗，它們可以提前預防地治療一個人。因此，本發明的一個方面涉及確定與本發明的一個或多個標記相對應的多肽或核酸的數量，結構和/或活性，從而確定一個患有癌症或具有罹患癌症風險的人是否會有更大的可能來反應ALK抑制劑藥物療法。
因此，本發明的一個方面目標了一種確定癌症患者是否對一種ALK抑制劑療法有反應的方法。本發明另一個方面目標了一種預測疾病時間過程的方法。本發明還有一個方法是目標一種預測疾病的時間過程中可能發生的重要事件的方法。在一些實施例中，所述的方法包括檢測一個生物標記或檢測生物標記與本發明所述的一種ALK抑制劑治療的反應物的結合，並檢測所述的對象是否會對所述的ALK抑制劑治療產生反應。
在一些實施例中，所述的方法涉及對診斷有癌症或懷疑有癌症(如存在癌症症狀)的患者身上採集生物組織樣本，進行細胞遺傳學篩查，檢測ALK突變(如表1所列的那些)。
所述的篩查方法及其說明的結果能預測患者對ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)治療的反應。如本發明所述，一種ALK突變的存在表明與那些未產生一種ALK突變的患者相比，ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)療法能更有效地治療癌症細胞。
在一個實施例中，本發明所述的方法包括與一個DNA樣本接觸，如一個生殖細胞系或體細胞基因組DNA，如一個染色體樣本，它是從患者上採集的細胞分離為多核苷酸探針，這些探針能特異地用於在嚴格條件下與基因組DNA雜交，使病人細胞中的染色體序列發生細胞遺傳學異常(如本發 明所述的ALK突變)。這些分析的結果能預測患者對治療試劑，尤其是ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)治療可能產生的反應。
在另一個實施例中，確定患者疾病過程中發生重要事件的時間間隔，從而計算一個時間過程，其中所述的計算可以預測一個患者是否有一個很長的時間過程。在另一個初稿例中，所述的重要事件是從初次診斷發展到死亡。在另一個實施例中，所述的重要事件是從初次診斷發展到疾病移植。在另一個實施中，所述的重要事件是從初次診斷發展到惡化。在另一個實施例中，所述的重要事件是從疾病移植發展到死亡。在另一個實施例中，所述的重要事件是從疾病移植發展到惡化。在另一個實施例中，所述的重要事件是從惡化發展到死亡。在一些實施例中，所述的時間過程是用整個存活率，發展時間和/或使用RECIST或其他反應標準來測量的。
在一些實施例中，至少兩個患者群中的單獨患者樣本會形成一個預測測量。在一些實施例中，群數是兩個，因此患者樣本被分成一個有一個ALK突變的患者群和一個沒有一個ALK突變的患者群。在一些實施例中，對象中的ALK突變程度既和有ALK突變的相比，又和沒有ALK突變的相比；如果所述的患者具有一種ALK突變，然後患者不太可能對一種ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)產生反應和/或患者不太可能有一個很長的時間過程。在一些實施例中，群數大於兩個，非限制性地包括三個群，四個群，五個群和六個群，根據預測ALK抑制劑效果的分層與特別ALK突變的關係。在一些實施例中，可能的反應是用整個存活率，發展時間和/或使用RECIST標準來測量的。在一些實施例中，ALK抑制劑是PF-02341066和/或PDD。
本發明的另一個方面目標了一種確定一個患有ALK突變陽性癌症的對象是否有可能對一種ALK抑制劑(如PF-02341066和/或PDD)產生反應和/或疾病的時間過程是否很長的方法。本發明另一個方面目標了一種方法，它可以用於預測患有ALK突變陽性癌症的對象中一個重要事件的可能 性。
1.檢測ALK突變的方法
本領域的普通技術人員公知能檢測ALK基因突變和/或基因產物(如表1所列的標記)的方法包括雜交底物檢測。例如，用於檢測一個樣本中編碼核苷酸的拷貝數的方法包括一種Southern印跡法。在一種Southern印跡法中，所述的基因組DNA(通常散佈分離在一種電泳凝膠上)與一個特異目標序列的探針雜交。比較目標序列的探針發出的強烈雜交信號與正常mRNA(如相同或相關細胞，組織，器官等中的一個非增強部分)分析發出的控制探針信號能檢測出目標核苷酸是否存在，並檢測出其拷貝數。或者可以使用一種Northern印跡法來檢測一個樣本中的編碼核苷酸拷貝數。在一種Northern印跡法中，mRNA與特異目標序列的探針雜交。比較目標序列的探針發出的強烈雜交信號與正常mRNA(如相同或相關細胞，組織，器官等中的一個非增強部分)分析發出的控制探針信號能檢測出目標核苷酸是否存在，並檢測出其拷貝數。
確定拷貝數的一種選擇性的方法是原位雜交(如Angerer(1987)Meth.Enzymol 152：649)。原位雜交通常包括下述步驟：(1)固定組織或生物結構用於分析；(2)預處理生物結構以提高目標DNA的可接近性，並減少非特異結合；(3)將核苷酸混合物與所述的生物結構或組織中的核苷酸雜交；(4)雜交後漂洗掉那些沒有結合在雜交中的核苷酸片段；(5)檢測雜交核苷酸片段。在上述每一個步驟中使用的試劑和條件可根據實際應用進行改變。
優選的雜交底物檢測非限制性包括現有的“直接探針”法，如Southern印跡法或原位雜交法(如FISH和FISH加SKY)，以及“比較探針”法，如比較基因組雜交(CGH)，例如cDNA底物或寡核苷酸底物CGH。所述的方法可以以各種方式使用，其非限制性地包括底物(如薄膜或玻璃)結合法或矩陣底物法。
一方面是使用FISH分析。細胞樣本可以根據本領域普通技術人員公知 的方法從患者身上獲得，用本領域普通技術人員公知的一種合適的細胞生成檢測法來檢測，例如FISH法。在一個實施例中，FISH可以根據VysisTM系統(Abbott分子)操作，其製作商的使用說明可以成為本發明的參考。
為使用的探針含有DNA片段，其與部分染色體中存在的DNA底物序列互補。Bittner等發明的Vysis公司的兩份美國專利，其專利號5,491,224(引用參考)和6,277,569(引用參考)公開了本發明使用的探針實例，並將這些探針標記雜交到樣本中。
染色體探針的長度通常約為50-105。更長的探針通常包括長為100-500核苷酸的更小片段。與著絲粒DNA和位點特異性DNA雜交的探針是可以商用的，例如用於Vysis公司(唐納斯格韋，伊利諾斯州)，分子探針公司(柳真，俄勒岡州)或者Cytocell(牛津郡，英國)。探針也可以選擇性地使用染色體組或基因組DNA通過標準技術製成，而不是商業製備。例如，可以使用的DNA來源包括基因組DNA，克隆的DNA序列，含有一個或一個中的一部分的體細胞雜交，染色體(如人體染色體)和宿主的正常染色體互補和流式細胞儀或顯微純化的染色體。所述的插入序列可以通過克隆分離，或者用聚合物鏈式反應(PCR)的位點特異擴增分離。例如可參見Nath and Johnson,Biotechnic Histochem.,1998,73(1)：6-22,Wheeless et al.,Cytometry 1994,17：319-326和美國專利5,491,224(引用參考)。
與一個染色體特異序列雜交的探針能確定這個序列是否存在細胞遺傳學異常。細胞遺傳學異常之一是一個刪除。雖然這些刪除可以是一個或多個完整染色體，但是它們通常涉及一個或多個染色體的部分缺失。如果探針中所含的一個染色體的整個序列從一個細胞中刪除，那麼這個探針通常不會再與細胞中的DNA雜交，於是染色體上就不會產生信號。如果一個局部含有一個探針的染色體序列從一個細胞中刪除，那麼這個探針還是會和這個細胞中的DNA雜交，但是信號會降低。例如一個信號的損失較之與控制細胞DNA進行的探針雜交不含有探針預計檢測的基因異常。在一些實施 例中，細胞遺傳學異常會產生至少1,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200或更多的細胞。
能檢測的細胞遺傳學異常非限制性地包括非相互易位，內染色體倒位，點突變，缺失，基因拷貝數變化，基因表達水準變化和生殖系突變。一種特別的細胞遺傳學異常是一種複製。這些複製可以是整個染色體組，也可以是比一個完整染色體更小的序列。如果一個含有一個探針的染色體序列在一個細胞中被複製，那麼探針與這個細胞DNA雜交與不存在含探針的染色體序列的控制細胞中產生的信號數相比，通常會至少產生一個額外的信號。雖然檢測人體染色體組2p23或其直系同源或任何染色體序列的任意探針含有一個2p23或其直系同源的ALK基因易位，但是它也可以使用。現有技術中已經公開了合適的探針(如可以使用Vysis公司(唐納斯格韋，伊利諾斯州)生產的)。
染色體探針是可以標記的，所以染色體序列的雜交是可以檢測的。探針通常可以用一個螢光團，一個有機分子直接標記，其中有機分子能在吸收低波/高能光後發榮光。所述的螢光團使探針不需要一個第二檢測分子就能變成可見的。一個螢光團與一個核苷酸共價結合後，所述的核苷酸可以直接用標準技術，如缺失轉錄，隨機引物和PCR標記等實現與探針結合。或者可以用一個連接使去氧核苷酸與探針促轉氨。所述的螢光團可以與促轉氨後的去氧核苷酸共價結合。參見美國專利5,491,224(引用參考)。
美國專利5,491,224公開了標記為一些胞嘧啶殘基的探針具有一個螢光團標記共價鍵。螢光團標記胞嘧啶底物的數量足夠在一個時就能夠產生一個可檢測的螢光信號，因此標記的DNA片段基本上能保留與能檢測的染色體組或染色體序列相關的特異互補鍵(雜交)特性。這些探針可以這樣製備：吸引未標記的DNA探針序列，用一個連接基團在序列中促轉氨一些去氧核苷酸，將一個螢光標記與至少一部分促轉氨的去氧胞苷底物共價結合。
探針也可以使用缺失轉錄，隨機引物或PCR標記來標記。標記既可以 使用螢光團(直接)標記核苷酸，也可以使用半抗原(間接)標記核苷酸來完成。標記的非限制性典型實例包括：AMCA-6-dUTP，級聯藍-4-dUTP，榮光素-12-dUTP，羅丹明-6-dUTP，德克薩斯紅-6-dUTP，Cy3-6-dUTP，Cy5-dUTP，生物素(BIO)-11-dUTP，地高辛(DIG)-11-dUTP或二硝基苯(DNP)-11-dUTP。
探針也可以用生物素或地高辛間接地標記，也可以用放射性同位素，如32p和3H等標記，雖然然後還是需要第二檢測分子或進一步的處理來識別探針。例如，一個生物素的探針標記可以利用抗生素蛋白與一個檢測標記結合來檢測。例如，抗生素蛋白可以與一個酶標記結合，如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶。酶標記可以使用酶的一個底物和/或催化劑在標準比色反應中檢測。鹼性磷酸酶的催化劑包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和硝基四氮唑藍。二氨基苯甲酸可以作為辣根過氧化物酶的催化劑使用。
探針也可以製備為使雜交前或雜交中，一個螢光團或其他標記不會是一部分DNA，而在雜交後增加檢測這個探針雜交為一個染色體組。例如，使用的探針可以具有與DNA結合的抗原分子。雜交後，這些抗原分子可以使用特異抗體與抗原分子反應來檢測。這些抗體自身可以與一個螢光團結合，或者可以使用一個具有一個共價螢光團的第二抗體檢測。
但是處理後或修飾後，所述的探針DNA可以在雜交使用前進行普通的純化，以去除未反應的剩餘產物(如沒有和DNA結合的螢光團分子)。
在雜交前可以使用本領域普通技術人員公知的方法使染色體探針變性。雜交步驟通常包括：向標記探針混合物中加入一種過量的封阻DNA，在雜交條件下將封阻探針與用於檢測的染色體序列接觸，如在一個固相中，其中的DNA已經變性，漂洗未雜交的探針，檢測與染色體或染色體序列結合的探針。
探針在雜交條件下雜交或退火為所述的染色體DNA。“雜交條件”是有利於一個探針與目標染色體DNA間退火的條件。雖然不同探針的退火根 據探針長度，底物濃度等情況的不同而不同，現有技術已經公開了有利於退火的各種探針濃度，雜交溫度，鹽濃度和其他因素。
各種濃度，底物混合物，複合物和探針長度，以及鹽濃度，溫度和保溫時間都能促進雜交。例如，原位雜交通常在雜交緩衝液中進行的，所述的雜交緩衝液含有1-2x SSC，50-65%甲醯胺和防止產生非特異雜交的封阻DNA。上述雜交條件通常包括約25℃到55℃的溫度，約0.5到96小時的保溫時間。
可以使用各種漂洗來去除染色體探針與目標序列外DNA之間形成的非特異性結合。改變每次漂洗的溫度和鹽濃度來嚴格控制這些漂洗。例如在非常嚴格的條件下，漂洗的溫度約為65-80℃，使用0.2x至約2x的SSC，以及約0.1%-1%的非離子洗滌劑，如諾乃洗滌劑P-40(NP40)。
增加漂洗時的漂洗溫度或鹽濃度可以降低漂洗時的嚴格條件。在一些應用中需要封阻重複序列的雜交量。因此在一些實施例中可以使用tRNA，人體基因組DNA或Cot-I DNA來封阻非特異性雜交。
漂洗後，所述的載玻片可以用完並空氣乾燥，然後加入媒介，使用一種染色液如DAPI和一個蓋玻片。隨即觀察載玻片並在復查前儲存在-20℃。
為了在螢光原位雜交(FISH)技術中使用螢光探針，可以為每個螢光設置一個帶螢光篩檢程式的螢光顯微鏡設備，這樣就可以看到螢光，或者使用雙或三通帶過濾設備來觀察多螢光。例如可參見美國專利5,776,688(引用參考)。或者也可以使用如流動血細胞計數等技術來檢查染色體探針的雜交方式。可以使用FISH來檢測染色體拷貝數或染色體的重測序列。這些探針與互補DNA的雜交或結合，由於它們標記了螢光標籤，因此研究者可以使用一個螢光顯微鏡來觀察這些DNA序列的位置。與染色體研究中使用的大多數其他技術不同，FISH不需要細胞是活性分隔的，它是在未分區的細胞中進行的，因此是一個高效多功能的方法。因此FISH可以使用分區細胞來實現，或者使用分區細胞或細胞分區迴圈來實現。Gray和Pinkel的美 國專利5,447,841公開了FISH分析中的許多技術。
FISH結果可以參考控制細胞來說明設計的探針檢測，其中控制細胞是公知的不含有特異細胞遺傳學異常。將所述的探針與控制細胞中DNA進行FISH雜交的方法與同種探針與未測試或評估特異性細胞遺傳學異常的細胞中的DNA雜交進行比較。當一個設計的探針用於檢測一個染色體或染色體序列的缺失時，通常所述的探針與未測試或評估特異性細胞遺傳學異常的細胞中的DNA雜交比與控制細胞中的DNA雜交更少。在這些測試細胞中通常沒有一個探針信號，說明探針通常與之雜交的一個染色體序列缺失。當一個設計的探針檢測到一種染色體重複或增加，那麼通常所述的探針與已經測試的細胞中的DNA雜交比與控制細胞中的DNA雜交更多。測試細胞中通常會有一個額外的探針信號，說明有一個額外的染色體序列，它通常會和探針雜交。
在CGH方法中，核苷酸的一個第一聚集區(如從一個樣本，如一個可能的組織)標有一個第一標記，當核苷酸的一個第二聚集區(如一個控制，如從一個健康的細胞/組織)標有一個第二標記。這些核苷酸的雜交率是由矩陣中兩種(第一和第二)標記與每個光纖的結合率決定的。染色體缺失或複製處檢測的信號率與兩種標記處不同，這能檢測拷貝數。矩陣底物CGH也可以使用單獨的顏色標記來實現(使用兩種染料來不同地標記控制和可能的組織樣本，並在雜交前混合它們，由於競爭性雜交會在矩陣上產生一個比率)。在單獨的顏色CGH中，可以將所述的控制標記雜交為可讀的一個矩陣和完整信號，將可能的組織樣本標記雜交為可讀的一個第一矩陣(有識別內容)和完整信號。兩個矩陣中的完整信號計算出不同的拷貝數。
如在Albertson(1984)EMBO J.3：1227-1234；Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：9138-9142；歐洲公開號430,402；Methods in Molecular Biology,Vol.33：In situ Hybridization Protocols,Choo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.(1994)等已經公開了適於使用本發明所述方法的雜交方案。在 一個實施例中，使用了Pinkel,et al.(1998)Nature Genetics 20：207-211或Kallioniemi(1992)Proc.Natl Acad Sci USA 89：5321-5325(1992)公開的雜交法。美國專利6,455,258中公開了矩陣底板CGH，其中所有的內容可作為本發明的參考。
在另一個實施例中，可以使用擴增底物評估來測量存在與否和拷貝數。在這個放大底物評估中，所述的核苷酸序列作為擴增反應(如聚合酶鏈式反應(PCR))中的一個範本。在一個定量擴增中，擴增產物的量與原始樣本中的範本量成比例。比較合適的控制，如健康組織可以測量所述的拷貝數。
本領域的普通技術人員均公知“定量”擴增法。例如，定量PCR涉及使用相同的引物同時共同擴增一個已知品質的控制序列。這就提供了一個可以用來校準PCR反應的內部標準。Innis,et al.(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.已經公開了定量PCR的具體方案。Ginzonger,et al.(2000)Cancer Research 60：5405-5409已經公開了使用定量PCR分析在微衛星中測量DNA的拷貝數。基因的已經核苷酸序列足夠使一個本領域的普通技術人員能慣常地選擇擴增基因任何部分的引物。也可以在本發明所述的方法使用螢光定量PCR。在螢光定量PCR中，定量是基於螢光信號的數量，如TaqMan和sybr基因。
其他適宜的擴增法非限制性地包括連接酶鏈式反應(LCR)(參見Wu and Wallace(1989)Genomics 4：560,Landegren,et al.(1988)Science 241：1077,and Barringer et al.(1990)Gene 89：117)，轉錄擴增(Kwoh,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)，自動持續的基因複製(Guatelli,et al.(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87：1874)，點PCR和連接適配物PCR等。
雜合性缺失(LOH)圖(Wang,Z.C.,et al.(2004)Cancer Res 64(1)：64-71；Seymour,A.B.,et al.(1994)Cancer Res 54,2761-4；Hahn,S.A.,et al.(1995) Cancer Res 55,4670-5；Kimura,M.,et al.(1996)Genes Chromosomes Cancer 17,88-93)也可以用於識別擴增序列或刪除序列。
2．評估基因表達的方法
標記表達的水準也可以評估。本發明所述的一個標記的表達也可以用各種公知的檢測一個轉錄分子或蛋白的方法來評估。這些方法的非限制性實例包括用於檢測分泌，細胞表面，細胞質或核蛋白質的免疫學方法，蛋白質分離純化法，蛋白質功能或活性檢測，核酸雜交法，核酸反轉錄法和核酸擴增法。
在一些實施例中，一個特異基因的活性可以通過測量基因轉錄(如mRNA)，通過測量轉錄蛋白的品質或通過測量基因產物活性來表徵。標記表達可以用各種方法來監控，包括通過檢測mRNA水準，蛋白質水準或蛋白質活性等可以使用標準技術來測量的。檢測的內容包括基因表達水準量(如基因組DNA，cDNA，mRNA，蛋白質或酶活)或者可以是基因表達水準的一個評估量，尤其是與一個控制水準相比。這種被檢測水準的類型可以從上下文中推出。
本領域的普通技術人員(見Sambrook等supra)均公知那些使用核苷酸雜交技術來檢測和/或對基因轉錄定量(這裏的mRNA或cDNA製備)的方法。例如一種評估cDNA是否存在及其量的方法包括本發明所述的Southern印跡法。簡而言之，所述的mRNA被分離(如使用一種酸胍-苯酚-氯仿，Sambrook等supra)且反轉錄為產物cDNA。然後所述的cDNA選擇性地吸收並在緩衝液中跑凝膠，移植到薄膜。於是使用與目標cDNA特異的核苷酸探針能完成雜交。
這些診斷和預測評估的一個基本原理包括製備一種樣本或反應混合物，它們可以含有一個標記和探針來相互作用和結合，從而形成一個複合物，它能從反應混合物中移動和/或刪除。這些評估可以用各種方法實施。
例如，其中一種實現評估的方法是將標記或探針固定到一個固相支撐 上，還是作為一個底物，並在反應結束時檢測固定在固相上的目標標記/探針。在這種方法的一個實施例中，從對象上採集樣本，評估其是否有標記及標記的濃度，並將其固定到一個載體或固相支撐上。在另一個實施例中，可以是相反的情況，其中探針固定在一個固相上，而對象上採集的一個樣本可以作為評估中一個未固定成分反應。
現有技術中公開了許多方法將評估成分固定到一個固相上。它們非限制性地包括將結合的生物素和抗生蛋白鏈菌素固定的標記或探針。這種生物素化的評估成分可以利用現有技術中公知的技術(如生物素化試劑盒，biotinylation kit，皮爾斯化工，羅克福德，伊利諾斯州)由生物素-NHS(N-羥基-琥珀醯亞胺)製備，並在抗生蛋白鏈菌素塗層96孔板的孔處固定(皮爾斯化工)。在一些實施例中，這些固定了評估成分的表面可以事先製備並保存。
這些評估中使用的其他合適載體或固相支撐包括任何可以與標記或探針所屬級分子結合的材料。公知的支撐或載體非限制性地包括玻璃，聚苯乙烯，尼龍，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，澱粉酶，天然和改性纖維素，聚丙烯醯胺，輝長岩和磁鐵礦。
為了使用上述方法實現評估，未固定的成分被加入到已經固定了第二成分的固相中。反應完成後，未複合的成分在條件下被去除(如漂洗)，使任何複合成分固定地保留在固相上。可以使用本發明所述的一些方法將固定在所述固相上的標記/探針複合物刪除。
在另一個實施例中，當所述的探針是未固化的評估成分時，它可以標有本發明所述的本領域普通技術人員公知的可檢測標記，從而可以直接或間接地用於實現評估及讀取評估結果。
也可以直接檢測標記/探針複合物成分，而不需要再操作或標記兩種成分(標記或探針)，例如利用螢光能轉移技術(例如參見Lakowicz等的美國專利5,631,169(引用參考))。選擇第一“捐獻”分子上的一個螢光標 記，於是使用適當波長的光激發，所發射的螢光能被一個第二“接受”分子上的一個螢光標記吸收，由於所述的吸收能所以可以依次發螢光。或者所述的“捐獻”蛋白分子可以簡單地利用色氨酸殘基的天然螢光能。所選的標記可以發出不同波長的光，使“接受”分子標記可以與“捐獻”的不同。既然標記間轉移的能效與分子分離距離有關，那麼分子間的空間間隔也可以被評估。當分子間產生結合時，評估中“接受”分子發出的螢光持續的時間最長。一個FET結合情況甚至可以用公知的標準螢光檢測法來進行常規檢測(如使用一種螢光劑)。
在另一個實施例中，確定一個探針識別一個標記的能力可以不需要標記或評估成分(探針或標記)來實現，而是利用一種技術，如實時生物分子相互作用分析(BIA)(參見如Sjolander,S.and Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63：2338-2345 and Szabo et al.,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)。如本發明所述，“BIA”或“表面等離子體共振”是一種即時研究生物特異性相互作用的技術，而沒有標記任何相互作用(如BIA克隆)。結合表面(一個結合結構的相互作用)上的改變量會使表面附近的光折射率(表面等離子體共振的光學現象(SPR))發生變化，產生一個可檢測的信號，它能作為一種生物分子反應的即時指示劑使用。
或者在另一個實施例中，相似的診斷和預先的評估可以在一種液體相中使用標記和探針作為溶劑。在這樣一種評估中，可以用任何一些標準技術，非限制性地包括差速離心，層析，電泳和免疫沉澱來分離所述的複合標記和探針。在差速離心中，標記/探針複合物可以使用一系列離心步驟從未複合的評估成分中分離出來，因為複合物的不同大小和密度使得它們的沉降平衡也不相同(例如參見Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6)：141-8；Hage,D.S.,and Tweed,S.A.J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2)：499-525)。標準層析技術也可以用於從未複合物中分離出複合分子。例如，凝膠過濾層析根據分子大小來分離分子，其在一個 柱中使用一種合適的凝膠過濾樹脂，例如較大的複合物可以從較小的未複合成分中分離出來。類似地，與未複合成分相比，具有不同電荷性能的標記/探針複合物可以被利用為不同于未複合成分的複合物，例如通過使用離子交換層板樹脂。本領域普通技術人員公知這些樹脂和層析技術(例如參見Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6)：141-8；Hage,D.S.,和Tweed,S.A.J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2)：499-525)。凝膠電泳也可以將複合評估成分從未結合的成分中分離出來(例如參見Ausubel et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1987-1999)。例如在這個技術中是根據蛋白和核苷酸複合物的大小和電荷來分離它們的。為了使電泳過程中保持持續的結合作用，沒有減少試劑的未變性凝膠基質材料和條件是典型的。本領域的普通技術人員公知特定評估的適當條件和成分。
在一個優選的實施例中，mRNA相當於標記的水準可以使用本領域公知的方法在原位或在試管中確定。術語“生物樣本”可以包括組織，細胞，生物液體及其分離物，它們從一個對象身上採集獲得，和一個對象身上存在的組織，細胞和液體一樣。在試管法中，任何RNA分離技術不會選擇防止mRNA分離，它能用於從細胞中純化RNA(例如參見Ausubel et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York 1987-1999)。此外，可以準備大量的組織樣本，並使用本領域普通技術人員公知的方法來處理它們，如彼得亞雷一步RNA分離法(1989，美國專利4,843,155(引用參考))。
可以在雜交或擴增評估中使用的分離核苷酸非限制性地包括Southern或Northern分析，聚合物鏈式反應分析和探針矩陣。一種檢測mRNA水準的診斷方法包括將分離的mRNA與一個核苷酸分子(探針)分離，然後與檢測基因編碼的mRNA雜交。所述的核苷酸探針可以是例如一種完整cDNA或其一部分，如長度至少為7,15,30,50,100,250或500核苷酸的一種寡核 苷酸，它足夠能在嚴格條件下特異雜交為一個編碼本發明所述的一個標記的mRNA或基因組DNA。其他合適的探針也可以在本發明所述的診斷評估中使用。一個帶探針的mRNA的雜交說明問題中的標記被表達。
在一個實例中，將mRNA固定在一個固體表面並與一個探針接觸，例如在一個瓊脂糖凝膠上跑分離的mRNA，並將mRNA從凝膠轉移到薄膜上，如硝化纖維。在另一個實例中，將探針固定在一個固體表面上，將mRNA與探針接觸，例如在一個Affymetrix的基因晶片陣列。一個普通技術人員可以將公知的mRNA方法用於檢測mRNA水準，其中所述的mRNA是由本發明所述的的標記編碼的。
所述的探針可以是全長核苷酸序列或比全長小的核苷酸序列編碼的蛋白。更短的探針可以憑經驗地檢測特異性。例如優選的核苷酸探針有20個堿基或長度更長(例如參見Sambrook et al.for methods of selecting nucleic acid probe sequences for use in nucleic acid hybridization)。雜交蛋白可以定量地檢測是否有cDNA。
一種確定樣本中與本發明所述的一個標記對應的轉錄水準的選擇性方法包括核苷酸擴增法，如利用rtPCR(Mullis，1987的美國專利4,683,202所列的實驗例(引用參考))，連接酶鏈反應(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：189-193)，自動持續的序列複製(Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)，轉錄擴增系統(Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)，Q-β複製酶(Lizardi et al.,1988,Bio/Technology 6：1197)滾動迴圈複製(Lizardi等，美國專利5,854,033(引用參考))或其他任何核苷酸擴增法，隨後通過使用本領域普通技術人員公知的技術來檢測擴增分子。螢光rtPCR也可以在本發明所述的方法中使用。在榮光rtPCR中，定量是根據螢光信號的量，如螢光定量和螢光染料。這些檢測方案尤其可以用於檢測數量非常小的核苷酸分子。如本文所述，擴增引物被確定為一對核苷酸分子，它們能退火到基因的5’或3’端(分別 增加和減少鏈，或反之亦然)，並且之間含有一個短序列。擴增引物通常長度為10-30個核苷酸，其兩側有一個長約50-200核苷酸序列。在擴增條件和擴增試劑中，這些引物使一個核苷酸分子的擴增包括引物兩側的核苷酸序列。
在原位法中mRNA不需要在檢測前從細胞中分離出來。在這些方法中，可以使用公知的雜交方法來製備/獲得一個細胞或組織樣本。然後將所述的樣本固定在一個支撐上，通常為一個玻璃固體，然後與一個探針接觸，這個探針能與編碼所述標記的mRNA雜交。
由於需要根據所述標記的限制表達水準來進行選擇性地預測，因此也可以根據所述標記的規範表達水準來確定。表達水準可以通常修正一個標記的規範表達水準來規範，將其表達水準與非標記的基因表達水準相比較，如一個管家基因等可以表達的。規範的適宜基因包括管家基因，如肌動蛋白基因或上皮細胞特異性基因。這種規範使得一個樣本，如一個對象樣本與另一個樣本，如一個未患癌症樣本中的表達水準可以被比較，或者是可以比較不同來源樣本間的表達水準。
或者表達水準也可以作為一個相對的表達水準。為了確定一個標記的相對表達水準，在確定問題樣本的表達水準之前可以用10個或更多的規範樣本與分離的癌症細胞樣本進行比較獲得所述標記的表達水準，或者甚至是使用50或更多樣本大量樣本中評估的每個基因的平均表達水準，並將其作為所述標記的一個基礎表達水準。可以確定檢測樣本(限制表達水準)的所述標記表達水準於是被標記獲得的平均表達值所區分。這產生了一個相對表達水準。
在一些實施例中，基礎確定中使用的樣本可以取自同種組織類型的癌症細胞或規範細胞。細胞來源可以根據所使用的相對表達水準來選擇。使用規範組織中發現的表達作為一種平均表達成分酸是確認評估的標記是否特異於所述的從細胞中分離出的組織(較之規範細胞)。此外當計算更具 體資訊時可以修改平均表達水準，並在計算後的資訊基礎上提供更好的相對表達值。規範細胞中獲得的表達值可以形成一種方法來對癌症情況的嚴重程度分級。
在另一個實施例中是通過從一個對象樣本的細胞中製備基因組DNA或mRNA/cDNA(如轉錄多核苷酸)，並將所述的基因組DNA或mRNA/cDNA與一個對照多核苷酸雜交來評估一個標記的表達，這個多核苷酸是否個完整的多核苷酸，其含有所述的標記及標記片段。在用對照多核苷酸擴增前，可以使用任意聚合酶鏈式反應來選擇性地擴增cDNA。一個或多個標記的表達可以使用定量PCR(QPCR)來評估這個標記的表達水準。
在一個相關的實施例中，將樣本中獲得的多核苷酸轉錄混合物與一個底物接觸，該底物中固定了本發明所述一個標記中的一個完整的多核苷酸或至少一部分(如至少7，10，15，20，25，30，40，50，100，500或更多核苷酸殘基)。如果本發明所述一個標記中的一個完整的多核苷酸或至少一部分可在底物上發現不同之處(如使用不同的染色體或螢光進行檢測，或者固定到不同的選擇性位置)，那麼若干個標記的表達水準可以使用一個單獨的底物同時進行評估(如固定在選擇性位置上的多核苷酸的“基因晶片”微矩陣)。如果使用一種能評估標記表達水準的方法，其包括將一個核苷酸與另一個雜交，那麼所述的雜交可以在嚴格雜交條件下完成。
在另一個實施例中，可以使用一個組合物的方法來評估一個標記的表達。
由於本發明所述的組合物，試劑盒和方法是依賴于檢測本發明所述的一個或多個標記的表達水準或拷貝數的差別，在一些實施例中，所述標記的表達水準或拷貝數會明顯大於所述方法的最小檢測底限，其中所述的方法是用於評估至少一個規範細胞和癌症細胞中的表達或拷貝數。
3.評估表達蛋白的方法
一個標記蛋白的活性或水準也可以通過檢測或定量其表達的多肽來檢測和/或定量。所述的多肽可以用任何一種本領域普通技術人員公知的方法來檢測和定量。這些可以包括如電泳，毛細管電泳，高效液相色譜法(HPLC)，薄層色譜(TLC)，過擴散色譜法等分析生物學方法，或如液體或凝膠沉澱反應，免疫(單或雙)，免疫電泳，放射免疫分析法(RIA)法，酶聯免疫分析法(ELISA試劑盒)，免疫檢測分析法，免疫印跡法，免疫組織化學法等各種免疫學方法。一個技術人員將公知的蛋白/抗體檢測法用於檢測細胞是否表達了本發明的一個標記。
本發明所述的用於檢測一種多肽的另一種試劑是一種抗體，其可以與一種多肽結合，該多肽與本發明的一個標記相對應，如一種帶一個可檢測標記的抗體。這些抗體可以多克隆或單克隆。一個完整抗體或它的一個片段(如Fab或F(ab')2)可以使用。與探針或抗體相關的術語“標記的”指通過與直接標記的另一個試劑反應，與直接標記探針或抗體相同地將一個可檢測底物與探針或抗體連接(如物理連接)，使探針或抗體被直接標記。直接標記的實例包括使用一個螢光檢測一個初級抗體，這個螢光標記了次級抗體標記和一個帶生物素的DNA探針的末端標記，因此它可以用螢光標記的抗生蛋白鏈菌素來檢測。
在另一個實施例中，所述的抗體是標記了的，如一個無線電標記，染色體標記，螢光標記或酶標記的抗體。在另一個實施例中，一個抗體衍生物(如一個抗體與一個底物結合，或與一個蛋白配位體對中的蛋白或配位體結合{如生物素抗生蛋白鏈菌素})，或與一個抗體片段結合(如一個單鏈抗體，一個單獨的抗體高突變區)，所述的片段能與一個標記對應的蛋白特異結合，如蛋白由與標記對應的開放讀取片段編碼的，或者這種蛋白有在全部或部分經過後轉錄修飾後被使用。
免疫組織化學或IHC指利用抗原與生物組織中的抗原特異結合的原理，將抗原(如蛋白)定位在一個組織部分的細胞中的方法。免疫組織化 學著色可以廣泛地在異常細胞的診斷中使用，例如能在癌症腫瘤中找到。特異分子標記是特別多孔物的特徵，如增殖或細胞死亡(凋亡)。IHC也可以廣泛地用於研究理解生物標記和不同表達的蛋白在一個生物組織的不同部分中的分佈與定位。設想一種抗體抗原相互作用可以用許多方法實現。在最常用的例子中，一種抗本與一種酶結合，如過氧化物酶，可以催化一種生成有色產物的反應。或者該抗體也可以用一個螢光團標記，如螢光素，羅丹明，DyLight Fluor或Alexa Fluor。
細胞中的蛋白可以使用本領域普通技術人員公知的技術分離。該使用的蛋白分離法例如是那些Harlow和Lane所公開的(Harlow和Lane，1988，抗體：一種實驗指南，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。
在一個實例中，這些抗體或抗本片段可以在各種方法中使用，如Western印跡法或免疫螢光技術來檢測表達的蛋白。在這些使用中，可以將抗體或蛋白固定在一個固體支撐上。合適的固相支撐或載體包括任何可以與一個抗原或一個抗體結合的支撐。公知的支撐或載體包括玻璃，聚苯乙烯，尼龍，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，澱粉酶，天然和改性纖維素，聚丙烯醯胺，輝長岩和磁鐵礦。
本領域的普通技術人員公知許多其他的可以與抗體或抗原結合的合適載體，並可以針這些支撐在本發明中使用。例如，細胞中分離出來的蛋白可以跑一種聚丙烯醯胺凝膠，並固定在一個固相支撐上，如硝基纖維素。於是所述的支撐可以在用可檢測的標記抗體處理後再用合適的緩衝液漂洗。於是可以用緩衝液漂洗所述的固相支撐兩次以去除未結合的抗體。固相支撐上結合的標記量於是可以用現有的方法檢測出來。使用電泳技術檢測蛋白質的方法是本領域普通技術人員公知的(大致參見R.Scopes(1982)Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.；Deutscher,(1990)Methods in Enzymology Vol.182：Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.,N.Y.)。
在另一個實施例中，Western印跡(免疫印跡)分析可以用於檢測樣本中是否有一種多肽及其含量。這種技術通常包括利用根據分子品質進行的凝膠電泳使樣本蛋白質分離出來，將分離出來的蛋白質轉移到一個合適的固相支撐上(如一種醋酸纖維素膜，一種尼龍篩檢程式或一種衍生的尼龍篩檢程式)，將所述的抗體孵化到樣本中，所述的抗體與一種多肽特異地結合。所述的抗多肽抗體與固相支撐上的多肽特異地結合。這些抗體可以使用這些標記的抗體(如標記羊抗人抗體)進行直接標記或者選擇性地被整個檢測，所述的標記抗體能與抗多肽特異地結合。
在另一個實施例中，可以使用一種免疫測定來檢測多肽。如本發明所述，一種免疫測定是一種評估，它利用一種抗體與被分析物產生特定結合。因此對一種多肽與一種抗體之間特定的結合進行檢測，這種檢測可以表徵所述的免疫測定，這不同於分離，靶向或定量分析物的其他物理或化學特性。
對所述多肽的檢測和/或定量是使用任意一種良好識別的免疫結合評估(例如參見美國專利4,366,241(引用參考)；4,376,110(引用參考)；4,517,288(引用參考)；和4,837,168(引用參考)。瞭解通常的免疫可以參見Asai(1993)Methods in Cell Biology Volume 37：Antibodies in Cell Biology,Academic Press,Inc.New York；Stites & Terr(1991)Basic and Clinical Immunology 7th Edition。
免疫結合評估(或免疫測定)通常使用一種“捕捉劑”來特異地結合分析物並常常固定分析物(多肽或序列)。所述的捕捉劑是一個能與分析物特異結合的成分。在另一個實施例中，所述的捕捉劑是一種抗原，它能特異地結合一種多肽。所述的抗體(多肽)可以由任意一種本領域普通技術人員公知的方法來製備。
免疫測定通常也可以使用一種標記劑來特異地結合並標記所述的結合複合物，它是由捕捉劑和分析物形成的。所述的標記劑自身可以是一種包 括抗體/抗原複合物的成分。因此，所述的標記劑可以是一種標記的多肽或一種標記的抗體。或者所述的標記劑可以是一個第三成分，如另一種抗體，它能與所述的抗體/多肽複合物特異地結合。
在一個實施例中，所述的標記劑是一種帶標記的第二人體抗體。或者所述的第二抗體可以缺失一個標記，但是它可以轉而被一個標記的第三抗體結合，所述的第三抗體特異於第二抗體衍生特種的抗體。所述的第二抗體可以是用一個可檢測的成分修飾的，如生物素，這樣它就能被一種第三標記分子特異地結合，如酶標記的抗生蛋白鏈菌素。
其他能與免疫球蛋白的恒定序列特異結合的蛋白，如蛋白A或蛋白G也可以作為標記劑使用。這些蛋白是鏈狀球菌細胞壁的普通成分。它們與各種特種的免疫球蛋白恒定序列產生一種強烈的免疫原反應(大致參見Kronval,et al.(1973)J.Immunol.,111：1401-1406,and Akerstrom(1985)J.Immunol.,135：2589-2542)。
如上所述，檢測和/或定量一種多肽的免疫測定可以使用本領域普通技術人員公知的各種方法。
檢測一種多肽的優選免疫測定可以是競爭性或非競爭性的。非競爭性免疫測定可以評估能直接檢測的捕捉分析物的量。例如在一個“三明治”評估中，所述的捕捉劑(抗多肽抗體)可以與一個固相底物直接結合，並固定在底物上。於是這些固定的抗體可以補捉測試樣本中的多肽。因此所述的固定多肽於是與一個標記劑結合，如一種帶標記的第二人體抗體。
在競爭性評估中，樣本中所含的分析物(多肽)量是通過檢測一種添加(外源)分析物(多肽)的量來直接檢測，該添加分析物可以用樣本中所含的分析物從一種捕捉劑(抗肽抗體)中替換出來(或競爭)。在一個競爭性評估中，這時一種公知量的多肽可以加入到所述的樣本中，使接本與一種捕捉劑接觸。與抗體結合的多肽量與樣本中所含的多肽濃度成反比。
在另一個實施例中，所述的抗體是固定在一個固相底物中。測量一種 多肽/抗體複合物中所含的多肽量或者選擇性地測量殘留的未複合多肽量可以確定與抗體結合的多肽量。多肽量可以通過設置一個標記的多肽來檢測。
本發明所述的評估可以使用本領域普通技術人員公知的標準方法來完成(作為多肽的陽性或陰性或定量)。完成的特定方法是由評估形式和選擇標記來完成的。例如，酶標記形成的有色產物可以用於實現一種免疫印跡分析。當存在一種清晰可見的印跡或結合可以產生陰性結果時，正確分子量的一種清晰可見的有色結合或印跡可以產生陽性結果。強烈的結合或印跡可以定量地檢測多肽。
本發明所述的在各種免疫測定中使用的抗體可以如本發明所述的方法製備。
在另一個實施例中，水準(活性)是通過測量基因產物的酶活而評估出來的。評估一種酶活的方法是本領域普通技術人員公知的。
檢測一個標記蛋白的原位技術包括向一個對象中引入一個抗蛋白檢測的標記抗體。例如，所述的抗體可以標記上一個放射性標記，其存在定位於一個對象中，可以用標準成像技術來檢測。
由本發明所述的方法鑒定的一些標記可以是分泌蛋白。技術人員能簡單地確定任何特定標記蛋白是否是一種分泌蛋白。為了實現這個確定，標記蛋白在一個哺乳動物細胞，如一個人細胞系中表達，收集胞外液體，評估胞外液體是否含有所述的蛋白(例如使用一個能與蛋白特異結合的標記抗體)。
下文中所述的一種方法實例可以用於檢測一種蛋白分泌。大約8 x 105 293T細胞可以在生長培養基(杜爾貝科改進的伊格爾培養基{DMEM}其加有10%胎牛血清)培養，培養條件是37℃，通入5%(v/v)CO2,95%空氣進入約60-70%混合物中。然後使用一種標準轉染混合物轉染所述的細胞，其中每個孔的混合物中含有2微克的DNA和10微升的LipofectAMINETM(GIBCO/BRL目錄號18342-012)，其中所述的DNA具有一種編碼蛋白的表 達載體。所述的轉染混合物放置約5小時，然後換為新鮮的生長培養基，並放置在空氣中。用DMEM緩緩地沖洗每個孔兩次，其中DMEM中不含有蛋氨酸或半胱氨酸(DMEM-MC；ICN目錄號16-424-54)。再向每個孔中加入約1毫升的DMEM-MC和約50微居裏Trans-35STM反應物(ICN目錄號51006)。向這些孔通入5% CO2氣體，並在37℃下培養一個選擇性的時間。然後在隨後的培養中去除150微升的條件培養基，並離心去除浮動細胞和碎片。浮在表面上的蛋白即說明蛋白被分泌。
應明白這些對象樣本，如一個含痰，支氣管肺泡灌洗，胸腔積液，組織，全血，血清，血漿，口腔刮，唾液，腦脊液，尿液，大便，骨髓的樣本中可以含有細胞，尤其是當這些細胞可以是癌症的，尤其是當癌症是轉移性的，因此可以在本發明所述的方法中使用。在評估所述樣本中的標記表達水準之前，可以使用各種公知的後收集製備和儲存技術(如核苷酸和/或蛋白提取，固定，儲存，冷凍，超濾，濃縮，蒸發，離心等)來處理所述的細胞樣本。因此本發明所述的組合物，試劑盒和方法可以用於檢測與蛋白質對就的標記表達，這些蛋白質中至少有一種位於其表達的細胞表面。技術人員能簡單地確定與任意特定標記對應的蛋白是否包括一個細胞表面蛋白。例如免疫學方法可以用於檢測整個細胞中的這些蛋白，或者是公知的電腦支撐的序列分析法(如SIGNALP程式；Nielsen et al.,1997,Protein Engineering 10：1-6)可以用於預測至少一種胞外域的存在(如包括兩種分泌蛋白，這些蛋白至少有一個胞外域)。一個標記的表達可以不用裂解細胞就能檢測，與這個標記對應的一個蛋白質至少有一部分是位於其表達的一個細胞的表面(例如使用一種標記的抗體，它與所述蛋白的一個胞外域特異地結合)。
本發明還包括試劑盒，它們能檢測一個生物樣本，如一個含痰，支氣管肺泡灌洗，胸腔積液，組織，全血，血清，血漿，口腔刮，唾液，腦脊液，尿液，大便，骨髓的樣本中是否含有與本發明標記對應的一個多肽或 核苷酸。這些試劑盒可以用於確定一個對象是否患有癌症或具有罹患癌症的風險。例如所述的試劑盒可以包括一個標記的化合物或試劑，它能檢測一種多肽或mRNA，這種多肽或mRNA是編碼與一個生物樣本中本發明所述的標記對應的多肽，還包括確定樣本所含的多肽或mRNA量的成分(如一種與多肽結合的抗體或一種與編碼多肽的DNA或mRNA結合的寡核苷酸探針)。
例如為了抗體底物的試劑盒，所述的試劑盒包括：(1)一個第一抗體(如附在一個固相支撐上)，它與多肽結合，所述的多肽與本發明所述的一種標記對應；並選擇性的(2)一種第二不同抗體，它與多肽或第一抗體結合，並與一個可檢測的標記共軛。
例如為了抗體底物的試劑盒，所述的試劑盒包括：(1)一個寡核苷酸，如一個可檢測標記的寡核苷酸，它與一個核苷酸序列雜交，這個核苷酸序列編碼一個與本發明所述標記對應的多肽或(2)一對用於擴增一個核苷酸分子的引物，其中所述的核苷酸分子與本發明所述的一個標記對應。該試劑盒也可以包括，如一種緩衝劑，一種防腐劑或一種蛋白穩定劑。所述的試劑盒還包括那些檢測可檢測標記(如一種酶或底物)的必要成分。該試劑盒還含有一種控制樣本或一系列控制樣本，它們可以被評估並與測試樣本對比。試劑盒中的每個成分可以用一個單獨容器來封裝，所有的容器和使用試劑盒所需的說明結果的說明書一起放入一個單獨的包裝中。
4．評估結構改變的方法
本發明還包括一種評估是否有一個結構改變，如突變的方法。
另一種檢測方法是探針與等位基因特異性雜交，它使用與多態位點重疊的探針，並在所述的多態區周圍有約5，10，20，25或30個核苷酸。本發明的另一個實施例中，可以與突變特異性雜交的各種探針是附在一個固相支撐上，如一個“晶片”。寡核苷酸可以用許多方法，包括平版印刷術來與一種固相支撐結合。例如一個晶片上可以有250,000條寡核苷酸(基因 晶片，AffymetrixTM)。例如Cronin et al.(1996)Human Mutation 7：244公開了突變檢測分析，它使用了包括寡核苷酸在內的這些晶片，也稱之為“DNA探針矩陣。在一個實施例中，一個晶片包括至少一種基因多態區中的所有突變。然後所述的固相支撐與一個測試核苷酸接觸，並與待檢測的特異性探針雜交。因此，一個或多個基因上多個突變的密度可以用一個樣本雜交實驗來鑒定。例如可以用一個單獨的雜交實驗來鑒定5'上游控制因數中的核苷酸多態突變。
在其他檢測方法中，在鑒定突變之前需要首先擴增至少一部分標記。擴增可以使用本領域公知的方法，例如用PCR和/或LCR(見Wu and Wallace(1989)Genomics 4：560)來實現。在一個實施例中，一個細胞的基因組可以裂解為兩條PCR引物，並擴增許多迴圈直到其產物的量能達到擴增DNA需要的量。在一些實施例中，這些引物是在150和350堿基對之間。
選擇性擴增法包括：自維持序列複製(Guatelli,J.C.et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)，Q-β複製酶(Lizardi,P.M.et al.,(1988)Bio/Technology 6：1197)和自維持序列複製(Guatelli et al.,(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.87：1874)和核苷酸堿基序列複製(NABSA)或其他任何核苷酸擴增法，隨後通過使用本領域普通技術人員公知的技術來檢測擴增分子。這些檢測方案尤其可以用於檢測那些低含量的核苷酸分子。
在一個實施例中，本領域公知的任何測序反應都可以直接用於至少一部分標記的測序，並將樣本序列與對應的相關(控制)序列對比，檢測突變。優選的測序反應包括那些基於美加淨和吉伯特改進的技術(Proc.Natl Acad Sci USA(1977)74：560)or Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Nat.Acad.Sci 74：5463)。當進行對象評估時也可以使用任意排充程式(Biotechniques(1995)19：448)，包括用定量光譜測定法測序(例如參見美國專利5,547,835(引用參考))和H.Köster申請的公開號為WO 94/16101，名稱為通過核酸外切酶降解的定量光譜測定法進行DNA測序的國際專利申請(引用參考)，和 美國專利5,605,798(引用參考)和H.Köster的申請號為PCT/US96/03651，名稱為基於定量光譜測定法的DNA診斷的國際申請(引用參考)；Cohen et al.(1996)Adv Chromatogr 36：127-162；and Griffin et al.(1993)Appl Biochem Biotechnol 38：147-159)。在一些實施例中，本領域的普通技術人員能明白僅有一個，兩個或三個核苷酸堿基需要在測序反應中確定。例如，A-軌跡等僅檢測的一個核苷酸可以實現。
名稱為“使用一個混合的DNA聚合物鏈式探針的DNA測序方法”的美國專利5,580,732(引用參考)和名稱為“檢測原位DNA測序中錯位的方法”的美國專利5,571,676(引用參考)。
在一些實例中，限制酶分析物能顯示出對象DNA中標記的特異等位元基因。例如，一個特異性核苷酸多態可以在一個核苷酸序列中形成，其包括一個限制位點，並由於另一個核苷酸序列的突變而缺失。
在一個更優選的實施例中，裂解劑(如一種核苷酸，羥胺或四氧化鋨與呱啶)的保護可以用於檢測RNA/RNA DNA/DNA或RNA/DNA雜交雙鏈中產生的錯配堿基(Myers,et al.(1985)Science 230：1242)。“錯配裂解”技術通常是通過雜交一種控制核苷酸形成的雜交雙鏈開始的，所述的控制核苷酸可以選擇性地被標記，如被RNA或DNA標記，其包括一個標記突變的核苷酸序列，該序列有一個從一個組織樣本中獲得的樣本核苷酸，如RNA或DNA。所述的雙鏈可以用一種試劑處理，然後雙鏈裂解成單鏈，如雙鏈是控制和樣本鏈之間的堿基對錯配形成的。例如，RNA/DNA雙鏈可以用RNase處理，S1核苷酸酶將DNA/DNA雜交物處理為分解錯配區的酶。在另一些實施例中，DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈都可以用羥胺或四氧化鋨處理，並用派啶處理來分解錯配區。錯配區被分解之後，產生的材料於是被塗上變性聚丙烯醯胺凝膠，確定控制和樣本核苷酸是否有一個鑒定核苷酸序列或其中的核苷酸是否不同，於是被分離。例如參見Cotton et al(1988)Proc.Natl Acad Sci USA 85：4397；Saleeba et al(1992)Methods Enzymol. 217：286-295。在另一個實施例中，所述的控制或樣本核苷酸是進行了用於檢測的標記。
在另一個實施例中，可以用高能液相色譜(DHPLC)來鑒定一種突變(Oefner and Underhill,(1995)Am.J.Human Gen.57：Suppl.A266)。DHPLC使用反相離子對色譜來檢測雜交雙鏈，這些雜交雙鏈是在PCR片段擴增中，由帶該片段的雜交單體上一個特定核苷酸位點產生(Oefner and Underhill(1995)Am.J.Human Gen.57：Suppl.A266)。PCR產物通常是使用PCR引物連接到所處理DNA兩側來產生的。DHPLC分析完成，然後分析所產生的色譜，根據特異性的色譜圖鑒別出堿基對變化或刪除(參見O’Donovan et al.(1998)Genomics 52：44-49)。
在其他實施例中，電泳遷移率的變化可用於鑒別標記突變的類型。例如單鏈構型多態性(SSCP)可以用於檢測突變和各種核苷酸之間的電流遷移率差異(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 86：2766,see also Cotton(1993)Mutat Res 285：125-144；and Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9：73-79)。樣本和控制核苷酸的單鏈DNA片段可以變性和複性。單鏈核苷酸的第二結構可以根據序列而變化，而電泳遷移率的變化甚至使一個單獨堿基的檢測發生變化。DNA片段可以標記或檢測標記的。使用RNA(而不是DNA)可以提高評估敏感度，其中第二結構對序列中的變化更敏感。在另一個實施例中，所述的對象方法使用雜交分析並根據電泳遷移率的變化來分離雙鏈雜交分子(Keen et al.(1991)Trends Genet 7：5)。
在另一個實施例中，分析一個核苷酸的移動可以鑒定出一個多態區的突變，包括聚丙烯醯胺凝膠中的多態區，其含有一個使用構象多態性凝膠電泳能評估的構象多態性(DGGE)(Myers et al.(1985)Nature 313：495)。當使用DGGE作為分析方法時，DNA可以被修飾來保證它不會完全變性，例如利用PCR加入高溶解GC-濃縮DNA的一種約40bp GC。在一個進一步的實施例中，一個溫度變化可以用於代替變性劑的變化，來鑒定修飾後的控 制和樣本DNA的差異(Rosenbaum and Reissner(1987)Biophys Chem 265：1275)。
檢測兩個核苷酸產至少一個核苷酸差異的技術實例非限制性的包括選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴增或選擇性引物延伸。例如寡核苷酸探針製備時是集中地替換公知的多態性核苷酸(等位基因特異性探針)，然後在僅發現一個最佳配對的雜交許可條件下與目標DNA雜交(Saiki et al.(1986)Nature 324：163)；Saiki et al(1989)Proc.Natl Acad.Sci USA 86：6230；and Wallace et al.(1979)Nucl.Acids Res.6：3543)。這種等位基因特異性寡核苷酸雜交技術可以用於同時地檢測在標記的不同多態區內發生的各種核苷酸變化。例如如果寡核苷酸具有特異性突變的核苷酸序列，那麼它附在一個雜交薄膜上，於是這個薄膜與標記的樣本核苷酸雜交。然後分析雜交信號可以獲得對樣本核苷酸的核苷酸的檢測。
或者根據選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技術可以在本發明的實施例中使用。寡核苷酸可以作為引物在合適的條件下，在分子中間或者在一個引物的3'端，特異性地擴增需擴增的突變，這樣能防止發生錯配或減少聚合酶的延伸(因此擴增是根據不同的雜交進行的)(Gibbs et al(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)。這項技術也可以稱為“PROBE”，它用於探針寡核苷酸堿基的延伸。此外它還在突變區引出了一個新的限制性位點，從而形成堿基裂解檢測(Gasparini et al(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。
在另一個實施例中，美國專利4,998,617和Landegren,U.et al.,(1988)Science 241：10771080公開了使用一種寡核苷酸連接評估(OLA)來鑒定突變。所述的OLA方案使用兩種寡核苷酸，它們可以與相鄰的一個單獨目標鏈序列雜交。一種寡核苷酸與一個單獨的標記，如生物素化的標記連接，另一個被可檢測地標記了。如果在一個目標分子中發現了精確互補的序列，那麼這些寡核苷酸會雜交，因此它們的位置相鄰，形成一個連接底物。然後連接可以使用抗生物素蛋白或其他生物素配位元體來覆蓋標記的寡核 苷酸。Nickerson,D.A.等公開了一種核苷酸檢測評估，它將PCR和OLA的特性結合起來(Nickerson,D.A.et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：89238927)。在這個方法中，PCR用於完成目標DNA的指數擴增，而所述的目標DNA可以使用OLA來檢測。
本發明還提供了在一個標記中檢測單獨核苷酸多態性的方法。由於可以用同樣序列區域在各種單獨核苷酸多態性位點的兩側擴增，因此它們的分析不要求鑒定單獨的核苷酸存在於各種位點上，不也需要為每個對象確定一個完整的基因序列。各種改良的方法可以便利於這些單獨核苷酸多態性的分析。
在一個實施例中，單獨的堿基多態性可以使用一個特異性的抗核酸外切酶，例如如Mundy,C.R.所述的(美國專利4,656,127(引用參考))。根據所述的方法，一個引物與所述的定位基因序列緊接的3'互補，因此多態性位點可以與一個從特定動物或人體上獲得的目標分子雜交。如果目標分子上的多態性位點含有一個核苷酸，它與所存在的特定抗核酸外切酶衍生物互補，然後衍生物可以與雜交引物的末端連接。這些連接使引物能抗外切酶，因此能實現對它的檢測。雖然抗核酸外切酶衍生物的鑒定實例是公知的，但還是發現氘核這的引物可以變成抗外切酶反轉的，目標分子的多態性位點上存在原核苷酸與反應中使用的核苷酸衍生物互補。這種方法的優點是它不需要確定大量外源序列的資訊。
在本發明的另一個實施例中，一種基於溶液的方法是用於鑒定一種多態性位點的核苷酸(Cohen,D.et al.French Patent 2,650,840；PCT公佈號：WO91/02087(引用參考))。如美國專利4,656,127(引用參考)所述的芒迪法所述，使用的引物與定位基因序列緊接的3'互補成為一個多態性位點。所述的方法能使用標記的雙去氧核苷酸衍生物來鑒定該位點的核苷酸，如果它與多態位點的核苷酸互補，那麼就可以與引物的末端連接。
Goelet,P.等(PCT申請號92/15712(引用參考))公開了一種選擇性方 法，即基因印跡分析法或GBA。Goelet,P.等的這個方法使用標記的末端和一個引物的混合物，其中引物與序列3'的互補形成一種多態性位點。所述的標記末端被連接，因此利用所述的與之互補的核苷酸來檢測，該核苷酸存在於所評估目標分子的多態位元點中。與Cohen等的方法(French Patent 2,650,840；PCT公佈號：WO91/02087(引用參考))相比，Goelet,P.等的方法是一種雜交相評估，其中所述的引物或目標分子是固定在一個固相上。
用於評估DNA中多態位點的各種引導引物核苷酸連接程式已經公開(Komher,J.S.et al.,(1989)Nucl.Acids.Res.17：77797784；Sokolov,B.P.,(1990)Nucl.Acids Res.18：3671；Syvanen,A.C.,et al.,(1990)Genomics 8：684692；Kuppuswamy,M.N.et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：11431147；Prezant,T.R.et al.,(1992)Hum.Mutat.1：159164；Ugozzoli,L.et al.,(1992)GATA9：107112；Nyren,P.(1993)et al.,Anal.Biochem.208：171175)。這些方法與GBA不同之處在於它們均是連接標記的去氧核苷酸來區分一個多態性位點的多個堿基。這樣雖然信號與相連的去氧核苷酸數量成比例，但是跑相同核苷酸所出現的多態性可以產生與跑動長度成比例的信號(Syvanen,A.C.,et al.,(1993)Amer.J.Hum.Genet.52：4659)。
為了鑒別一個位於一個標記編碼區的多態性序列的突變，還可以使用與上述方法不同的方法。例如，使用一種抗體可以鑒定一種編碼一個突變標記的突變，所述的抗體能特異地識別突變的蛋白，如在免疫組織化學或免疫中。可以使用公知的方法來製備抗體到野生型標記或突變型標記。
或者也可以測量一個標記的活性，如與一個標記配位元體結合。結合評估是本領域公知的，包括如從一個對象體上獲得細胞，用一個標記的配位元體完成結合實驗，確定與突變蛋白的結合是否不同於與野生型蛋白的結合。
VI.基於ALK抑制劑的優選篩選法
本發明還提供了鑒定底物，抑制ALK多肽(如EML4-ALK多肽)， 從而抑制癌症細胞增殖，生長，突變，凋亡和/或轉移的方法。這些方法包括將一個測試化合物與一個ALK多肽(如表1所列多肽)接觸。在一些實施例中，所述的ALK多肽包括一個變體(如表1所列的多態)，它會增加用一種或多種ALK抑制劑形成的抑制不完整或不回應的風險。一種化合物是一種腫瘤轉移的抑制劑，根據一種測試化合物對ALK多肽變體的活性測量的效果就能鑒定這種化合物(例如包括配位體結合，如ATP結合和/或酪氨酸激酶的活性)。在一個特定的實施例中，一種測試化合物會抑制酪氨酸激酶的活性，將這個活性與沒有測試化合物存在時的活性相比較就能鑒定出該測試化合物是否能作為一種酪氨酸激酶的抑制劑。如果一種ALK的化合物抑制劑活性改變，那麼它就能進一步地評估其抑制腫瘤生長或轉移的能力。
優選的活化酪氨酸激酶突變包括本發明表1所列的新標記(如ALK突變)，它能用於鑒定出用於治療，改善或抗癌的化合物，例如掏或防止癌細胞增殖，生長，突變，凋亡和/或轉移。可控制，如抑制，中和，激化或類比分子的篩選化學庫是本領域公知的。所述的化學庫例如可以是肽庫，擬肽類庫，化學合成庫，重組，如抗菌素顯示庫和原位底物轉錄庫，其他非肽合成有機物庫。
篩選或形成，鑒定，選擇本發明表1所列的新生物標記的合適高同源抑制劑(如ALK突變)可以用各種方法實現。概括地說它們非限制性地包括兩類方案。一類是使用目標蛋白的結構知識來設計一個能精確作用的優選分子。一個實例是電腦輔助分子設計，尤其是基於圖6所示的新的結構功能資訊。另一類是使用組合的或其他分子庫，因此一個大分子庫可以被篩選用於親和相關的目標酶，或者能夠抑制目標酶的活性。在一個進一步的實施例中，可以篩選一板能抑制目標酶的抗體。
本發明所述的一些實施例包括確定一個特定化合物能抑制本發明表1所列的新生物標記(如ALK突變)。可以比較測試化合物與公知用於治療 腫瘤性病變的化合物的活性，來評估測試化合物直接或間接治療腫瘤性病變的能力。例如，測試化合物抑制抗本發明表1所列新生物標記的配位元體結合，如ATP結合和/或酪氨酸激酶活性(如ALK突變)的能力可以與公知的ALK抑制劑，如PF-02341066和/或PDD相比。在一個實施例中，同樣評估條件下，這些測試化合物對本發明表1中所列的新生物標記(如ALK突變)的抑制作用至少是公知ALK抑制劑的99.6%、99.5%、99.4%、99.3%、99.2%、99.1%、99%、98.5%、98%、97.5%、97%、96.5%、96%、95.5%、94%、93.5%、93%、92.5%、92%、91.5%、91%、90.5%、90%、89.5%、89%、88.5%、88%、87.5%、87%、86.5%、86%、85.5%、85%、84.5%、84%、83.5%、83%、82.5%、82%、81.5%、81%、80.5%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、50%或在這些範圍之內。在一些實施例中，細胞可以轉染一個結構，該結構會編碼本發明表1所列的新生物標記(如ALK突變)，並與一個測試化合物接觸，這個化合物標有一種可檢測的標記，然後分析是否存在結合的測試化合物。在一些實施例中，所述的轉染細胞會與測試化合物結合，將這些細胞與那些已經轉染本發明表1所列的新生物標記(如ALK突變)的細胞相比，說明測試化合物已經與本發明表1所列的新生物標記(如ALK突變)結合，其中的生物標記是由這些細胞表達的。所述化合物的這種結合通常是由任意一種本領域公知的評估確定的，如ELISA，RIA和BIAcore評估。
使用所述酶的一種重組表達突變或是從另一個物種分離得到的一個同族體或直系同源體都可以根據化合物對本發明表1中所列的新生物標記(如ALK突變)活性的抑制或其他效果來篩選這些化合物。或者這些新生物標記多肽的細胞表達可以用一種測試化合物處理，在一種特異性目標的磷酸化上的測試化合物效果可以被確定，例如使用一種本發明所述的技術。在 一個實施例中，酪氨酸激酶活性被確定。確定酪氨酸激酶影響活性的方法(如抑制)是本領域普通技術人員公知的。在一些實施例中，酪氨酸激酶活性也可以通過評估一個標記的磷酸鹽(如32P-標記的磷酸鹽)與一個底物的結合來確定，其中所述的底物可以用本發明表1所列的新生物標記(如ALK突變)來磷酸化(如一部分或一個肽片段，尤其是那些下流信號成分)。在其他實施例中，酪氨酸激酶活性可以使用一種普通的酪氨酸激酶活性試劑盒來檢測(例如普通的酪氨酸激酶檢測試劑盒(Takara Bio,Inc.,Madison,Wis.)；酪氨酸激酶檢測試劑盒(Millipore,Billerica,Mass.))
在另一個實施例中，所述的篩選方法還包括確定所述的化合物是否減緩了腫瘤細胞的生長，例如公知腫瘤細胞會表達一種活化的酪氨酸激酶突變，如本發明表1所列的一種新生物標記(如ALK突變)。可以使用各種細胞系，選擇的依據其組織是本領域的普通技術人員公知能檢測的(如BA/F3細胞)。例如各種細胞系被很好地表徵，並且被例如美國國家癌症研究所(NCI)用在其研發的新型抗癌藥物的篩選程式中。
高效和顯著高效的腫瘤細胞生長抑制劑，如在100μM,90μM,80μM,70μM,60μM,50μM,40μM,30μM,20μM,10μM,9μM,8μM,7μM,6μM,5μM,4.5μM,4μM,3.5μM,3μM,2.5μM,2μM,1.5μM,1μM,900nM,850nM,800nM,750nM,700nM,650nM,600nM,550nM,500nM,450nM,400nM,350nM,300nM,250nM,200nM,150nM,100nM,95nM,90nM,85nM,80nM,75nM,70nM,65nM,60nM,55nM,50nM,45nM,40nM,35nM,30nM,25nM,20nM,15nM,10nM,5nM,4nM,3nM,2nM,1nM或更低劑量時有效率大於50%，它還說明所述的化合物能有效地用於治療腫瘤性病變。一種IC50值可以確定並用於對比。這個值是通過50%相對於控制所需要抑制腫瘤細胞生長的藥物濃度。
這些值還可以使用其他標準。例如在另一些實施例中，本發明所述的篩選法還包括確定測試化合物是否會引起培養中的腫瘤細胞發生凋亡。細 胞死亡的兩種不同形式可以用形態學和生物指示來描述：壞死和凋亡。增加等離子體薄膜的滲透率可以隨之產生壞死，因此細胞膨脹，而等離子體薄膜在幾秒鐘內破裂。薄膜起泡，細胞質冷凝和內源性核酸內切酶的活性是凋亡的特徵。
正常組織更新和器官，四肢的胚芽發育時會自然地產生凋亡。各種刺激因素通過電離輻射和一些化療藥物也會誘導凋亡產生，包括細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞。凋亡的異常控制是在包括癌症、AIDS或阿爾茨海默氏病等各種病理學情況下充當了一個重要的作用。
在上述條件下培養腫瘤細胞，然後篩選測試化合物對細胞凋亡的誘導。這些篩選方法的一些實施例中，用測試化合物處理細胞包括在各種濃度的測試化合物中前或後融合培養基並處理一至七天。在培養基的附著或“漂浮”部分都可以測量凋亡的細胞。這兩者都可以這樣收集：去除表面漂浮物，胰酶消化附著細胞，在一個離心沖洗步驟(10分鐘，2000rpm)之後組合兩種製備。用一種測試化合物處理之後，培養基可以評估用於凋亡和壞死，例如在標記了吖啶橙和溴乙錠之後使用螢光顯微鏡。各種測量凋亡細胞的方法是本領域普通技術人員公知的，例如Duke & Cohen公開了一種測量凋亡細胞數量的方法(Curr.Prot.Immuno.,Coligan et al.,eds.,3.17.1-3.17.1,1992)。例如使用胰蛋白酶並用PBS沖洗三次，收集漂浮和附著的細胞。於是細胞的等分部分被離心。所述的顆粒再次懸浮在媒介中，一種含有吖啶橙和溴乙錠的染料混合物在PBS中製備而成，並被平緩地混合。然後所述的混合物可以固定在一個顯微鏡滑槽中，檢查其凋亡的形態特徵。測量細胞中DNA片段的增加量也可以定量地檢測凋亡，其中的細胞已經用測試化合物處理了。可以使用商業光度酶免疫測定(EIA)來定量地檢測胞質蛋白-相關的-DNA-片段(單體和寡核苷酸)(如Cell Death Detection ELISA,Boehringer Mannheim)。
在另外的實施例中，本發明的篩選法還包括確定測試化合物是否降低 了腫瘤的移植，如在一個移植的動物模型。評估腫瘤移植的方法是本領域普通技術人員公知的(例如參見Khanna and Hunter,Carcinogenesis 26：513-523,2005)。一種移植模型包括人-鼠異種移植，其中人體癌細胞系或組織可以移植到免疫系統受損傷的小鼠中(如SCID小鼠或裸小鼠)。在相似的方法中，一個細胞系可以設計為表達本發明表1所列的一種新型生物標記(如ALK突變)，它可以移植到一種免疫系統受損傷的小鼠中。在一個實施例中，腫瘤細胞或細胞系可以直接注入到系統迴圈中。注入的位點大半地確定了移植生長在這些實驗系統中的位元點。實驗轉移模型中最常用的腫瘤細胞注入位點是在小鼠尾靜脈兩側，它主要是在肺轉移中產生。腫瘤細胞中的脾內或肝門靜脈注射是在活體中培育移植的最常用位點，而細胞的心臟內注射會在轉移中產生多個位點，包括骨。腫瘤細胞或其他細胞系注入到迴圈之後，在目標位元點(如肺)上培育的轉移可以在若干天或周之後監測到。
評估腫瘤轉移的另一種模型是使用常位元移植，其中癌症細胞可以移植給常位元或組織，於是一個腫瘤從這裏衍生(例如直接注入或外科培植腫瘤片段)。常位腫瘤中產生的自然轉移可以在幾天或幾周內評估。一種測試化合物降低或防止腫瘤轉移的能力可以通過將一種測試化合物皮下注射，肌肉注射，血液迴圈或原位移植地注入到腫瘤細胞中。轉移培育的數量，大小或時間是可以評估的。一種抑制腫瘤轉移的化合物會減少轉移的數量，例如比控制樣本至少減少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,or even 100%。一種能抑制腫瘤轉移的化合物也能使轉移的大小比一個控制樣本小。相似地，一種抑制腫瘤轉移的化合物也可以減緩轉移培育的開始，例如至少一周，兩周，一個月，6個月，一年或者甚至是無限期的。
VII.較佳的ALK抑制劑
本發明所述的方法包括鑒定一種對象是否能用本發明表1所列的新型 生物標記(如ALK突變)來治療，誘導腫瘤細胞死亡，阻礙腫瘤生長或降低腫瘤轉移的風險。ALK多肽抑制劑是本領域公知的。例如PF-02341066，PDD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4,5,6,11,12,13-六氫-2H-吲唑[5,4-α]吡咯[3,4-c]哢唑-8-基[4-(二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(1S,2S,3R,4R)-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2,3,4,5-四氫-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯並氮雜卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-甲醯胺，和NVP-TAE684，例如參見PNAS 104：270-275,2007；Choi,Y.L.et al.(2008)Cancer Res.68：4971-2976；以及Biochemistry 48：3600-3609,2009，它們在此是引用參考的。
引用參考
每個單獨出版物，專利或專利申請特別而單獨地表示將納入參考時，本發明所述的所有出版物，專利和專利申請全部被納入作為參考。當它們相互矛盾時，本申請，包括本發明的所有定義將起決定性作用。
另外在其全部納入參考公共資料庫中與其全文相關的評估數有關的任何多核苷酸和多肽序列，例如由基因組研究所(TIGR)在tigr.org處的萬維網上保持的那些和/或國家生物技術資訊中心(NCBI)在ncbi.nlm.nih.gov處的萬維網上保持的那些。
例子
本發明通過以下例子作進一步地說明，不應理解為限制。所有涉及到的內容，數位，序列表，專利和引用的公開專利文獻均屬於本發明申請範圍。
例1-用於例2-4的原料與方法
a.DNA測序
寡聚(dT)-引物cDNAs來自樣品RNAs使用EZ1系統(Qiagen,Valencia,CA)萃取並用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan) 和引物ALK-TK-F(5’-TACAACCCCAACTACTGCTTTGCT-3’)和ALK-TK-R1(5’-AGGCACTTTCTCTTCCTCTTCCAC-3’)通過聚合酶鏈反应(PCR)30個循环(包括98℃時10秒鐘和68℃時2分鐘)得到。PCR產物與ALK激酶結構域相同，然後分散並用Illumina基因組分析系統II(GAII)進行測序，通過配對端測序系統(Illumina,San Diego,CA)得到兩端為76基質。讀取原始數據是以存在的PCR原始順序和品質20為基礎的品質-滲透的所有基質。滲透通過所讀取的然後用鲍蒂算法(提供在萬維網bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml上)來校準ALK cDNA順序。
用3130xl基因分析儀(應用生物系統公司，福斯特市，加利福尼亞州)來毛細管測序，PCR產物與所希望的cDNAs具有相同的引物結構或具有EA-F-g-S(5’-CCACACCTGGGAAAGGACCTAAAG-3’)和ALK-TK-R2(5’-CCTCCAAATACTGACAGCCACAGG-3’)引物的序列。
b.突變EML4-ALK
把cDNA編碼FLAG抗原表位元標記EML4-ALK變體1(Soda,M.et al.(2007)Nature 448：561-566)插入到pMX-iresCD8逆轉錄病毒載體(Yamashita Y.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：39012-39020)中得到同時表達的FLAG-標記EML4-ALK和鼠CD8。核苷酸變化與C1156Y和L1196M一致，ALK的突變引進獨個的質粒或用於EML4-ALK(C1156Y)，EML4-ALK(L1196M)，或EML4-ALK(C1156Y/L1196M)表達的組合。基于這些質的重組逆轉錄病毒採用包裝細胞系，BOSC23(Pear,W.S.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8392-8396)，和採用感染小鼠白細胞介素-3-依賴細胞系BA/F3(Palacious,R.et al.(1985)Cell 41：727-734)來產生。其結果CD8-陽性細胞採用miniMACS細胞分離柱和磁性玻璃粉來純化並用共軛到對CD8的抗體上(兩者均來自Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)。PF-02341066購自塞萊克。
為了檢驗EML4-ALK的酪氨酸磷酸化，BA/F3細胞表達融合蛋白暴露 在ALK抑制劑下15小時，之後EML4-ALK從細胞裂解物中免疫沈澱出具有對FLAG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的抗體和用對Tyr1604-磷酸化ALK(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)抗體的受免疫分析。體外激酶測定是在室溫下用合成YFF肽(Operon Biotechnologies,Huntsville,AL)操作30分鐘，如早先(Donella-Deana,A.et al.(2005)Biochemistry 44：8533-8542)所述的。
例2-新型突變ALK與抗ALK酪氨酸激酶抑制劑的聯繫
患者是一名28歲的男人，沒有吸菸史，在2008年4月臨床階段被診斷為肺腺癌T4N3M1。鑑於腫瘤沒有任何突變EGFR生存，此患者接受常规化療，其結果是疾病出現連續多次在大腦和骨骼中轉移。在2008年11月，通過逆轉錄-PCR痰液分析以及通過組織樣本的螢光原位雜交分析，發現mRNA的EML4-ALK變體1在腫瘤中存在。因此，該患者登記到PF-02341066試驗中，並在他的體力狀況明顯改善(從4级減少為2)開始。雖然他在治療過程中表現出“局部反應”，他的胸腔積液並非完全根除。然而，經過5個月的治療，腫瘤突然開始再次增長，導致胸腔積液增大並在雙肺上形成多個癌小瘤。患者在2009年5月放棄試驗，並對胸腔積液進行分子學分析。
儘管持續的給予ALK抑制劑但腫瘤還是恢復增長，這表明腫瘤產生了次生遺傳變化具有對藥物的抗藥性。此外，由於抗TKIs往往是在激酶靶上產生突變導致的，並對EML4-ALK它自身經過了氨基酸的變化的可能進行了驗證。
分別對患者腫瘤治療前和後的痰(IDJ-# 1)及胸腔積液(IDJ-# 113)標本進行了分子學分析可知，鑑於這兩個標本腫瘤細胞的比例可能會有所不同，新一代測序儀用來對採自這樣標本的EML4-ALK的cDNAs進行了深度的序列分析。兩個標本的詳情結果是cDNAs與ALK酪氨酸激酶結構 域相同(第1圖A)，分散並用GAII系統進行核苷酸順序分析。作為比較，EML4-ALK的陽性非小細胞肺癌細胞系H2228，和其他三個也是融合蛋白質陽性的臨床標本進行相同的分析。一個已知的單核苷酸多態性rs3795850，在四個標本中均發現有cDNAs(第1圖B)。此外，在J-#1 cDNAs中低概率(8.9%)發現在人類野生型ALK cDNA(基因庫登記號，NM_004304)的相當於核苷酸4230位置有一个T→C的變化。而且，兩個新的變化，在J-#113 cDNAs中發現在野生型ALK cDNA的相當於核苷酸4374和4493位置有G→A和C→A的變化，其概率分別是41.8%和14.0%。在採自其他標本的激酶結構域cDNAs中沒有出現其他經常性的改變(出現讀取率在5%的)。
這些核苷酸的變化隨後使用桑格測序證實。要排除這種突變是發生在內源性野生型ALK內而不是在EML4-ALK內的可能性，用PCR來檢測前端引物目標至EML4 cDNA，以致於只將融合型cDNA擴增(第1圖A)。採自J-#1的幾百個融合型cDNAs中T4230C沒有發現變化，這表明在原始的PCR或GAII測序步驟中它是人工產物。
然而，G4374A和C4493A的變變化都可以通過桑格測序很容易的得到證實。為J-# 113克隆測序73融合cDNA中，G4374A的34克隆(46.6%)为陽性，C4493A的11克隆(15.1%)为陽性，其餘(38.4%)為野生型(第1圖C)。由於PCR分析在相同的產品中涵蓋了兩個核苷酸位點，沒有產品包含兩個突變，這表明每一個突變都是獨立的。圍繞G4374或C4493位置的基因組片段也通過PCR擴增並進行核苷酸測序，其結果是在腫瘤中的每個基因組各自變化得到證實(第2圖)。
G4374A和C4493A的替換結果是在相當於野生型人類ALK的氨基酸1156和1196位置上有半胱氨酸→酪氨酸和亮氨酸→蛋氨酸的變化。
例3-新型突變ALK具有對ALK酪氨酸激酶抑制劑的抗藥性
下一步研究的是ALK抑制劑對EML4-ALK的氨基酸變變化影響的敏感性。野生型EML4-ALK，單突變EML4-ALK(C1156Y)和EML4-ALK(L1196M)，和雙突變EML4-ALK(C1156Y/L1196M)分別在BA/F3細胞和與ALK抑制劑接觸後的細胞上表達。PF-02341066在濃度依賴型生長長的BA/F3細胞上表達野生型EML4-ALK的抑制作用(第4圖A)。與此相反，細胞突變表達要麼C1156Y要麼L1196M突變證實對藥物敏感性顯著減低，重複試驗表明BA/F3細胞表達的EML4-ALK(L1196M)比表達的EML4-ALK(C1156Y)對PF-02341066的抗藥性更大(第3圖)。存在的這兩個突變並沒有導致細胞對PF-02341066抗藥性的疊加作用。因此，這些資料表明C1156Y和L1196M突變分別具有對藥物的抗藥性。
通過使用在Tyr1604上ALK磷酸化特異性抗體的免疫分析來驗證EML4-ALK酪氨酸磷酸化。雖然BA/F3細胞暴露於PF-02341066下可明顯抑制野生型EML4-ALK酪氨酸磷酸化，它沒有對EML4-ALK(C1156Y)或EML4-ALK(L1196M)的重大影響(第4圖B)。根據這些發現，在體外激酶試驗中發現EML4-ALK的C1156Y和L1196M突變比野生型蛋白用PF-02341066對酶活性的抑制敏感性更小(第4圖C)。作為抑制細胞生長的案例(第4圖A)，L1196M突變比C1156Y突變用PF-02341066對激酶活性的抑制更加困難(第4圖C)。
例4-新型突變ALK與抗ALK酪氨酸激酶抑制劑之間的结構-功能關系
第5圖顯示Cys1156和Leu1196在基於激酶，胰島素受體的晶體結構上ALK激酶結構域的三維立體結構模型中的位置，前者殘體位於與預測螺旋αC相連的氨基端也就是接近ATP-結構組織帽子上端的位置。在其他酪氨酸激酶中還沒有關於在這個位置上有活性突變的報導。ALK的Leu1196相當於ABL1的Thr315和EGFR的Thr790，在這些激酶中的這些位置每一個都非常容易突變成具有對TKIs的抗藥性(Deininger,M.et al.(2005)Blood 105：2640-2653；Linardou,H.et al.(2009)Nat.Rev.Clin.Oncol.6：352-366)。這些“看門人”位置位於ATP-結構組織的底面上(第5圖)，並在這些位置具有大側鏈的氨基酸存在是來阻止大量TK1s的黏合(Shah,N.P.et al.(2002)Cancer Cell2：117-125；Tsao,M.S.et al.(2005)N.Engl.J.Med.353：133-144)。
因此，對在EML4-ALK的激酶结構域的兩頭具有對多重ALK抑制劑的抵抗性進行了識別，鑑於沒有觀察到EML4-ALK cDNAs的兩種突變，可認為每一個突變在腫瘤的不同亞克隆內獨立發生。
如果沒有上述所述的反彈，從患者治療前的痰液預先得到的cDNAs不含有與C1156Y或L1196M突變一樣的變化核苷酸，很可能是在用PF-02341066治療的腫瘤亞克隆过程中獲得重新突變。然而，在治療前無法對胸腔積液進行檢查，患者入院初期沒有完全排除的早已存在胸腔積液中可能生存有腫瘤細胞的C1156Y或L1196M突變。如果是這样的情況下，在5個月用PF-02341066治療期內腫瘤可能已经獲得其他目前未知的突變，並允许其隨後的快速增長。然而，具有C1156Y或L1196M突變的腫瘤細胞亞克隆在治療初期很難治療，並在治療过程中有擴增的可能。相反，在至少5個月內患者沒有腫瘤擴增的信號，這表明C1156Y和L1196M突變發生在用PF-02341066治療期間。這種觀點通過EGFR的T790M突變實事進一步得到支持，在患者事先用TKIs治療中經常發現對吉非替尼或埃羅替尼具有抵抗性，而很難找到沒有進行治療的個案(Pao,W.et al.(2005)PLoS Med.2：e73)。
在用TKIs治療腫瘤中發現一些酪氨酸激酶的看門人位置發生氨基酸替換(Kobayashi,S.et al.(2005)N.Engl.J.Med.352：786-792；Pao,W.et al.(2005)PLoS Med.2：e73；Shah,N.P.et al.(2002)Cancer Cell 2：117-125；Cools,J.et al.(2003)N.Engl.J.Med.348：1201-1214；Tamborini,E.et al.(2004)Gastroenterology 127：294-299)。但事先還沒有用EML4-ALK或ALK在這個位置突變的報導，各種在NPM-ALK，其他融合型ALK的看門人位置的 人為氨基酸替換的影響最近得到驗證((Lu,L.et al.(2009)Biochemistry 48：3600-3609)。與體內腫瘤細胞分析一致，發現在這個位置引進蛋氨酸使NPM-ALK對多重ALK抑制劑具有最大抵抗性。
相比看門人替換，在其他酪氨酸激酶中還沒有在αC螺旋接近氨基末端的(ALK中的Cys1156)這個位置有活性突變的報導。在NSCLC病例中有在EGFR的相應位置存在Thr→Ile變化的闡述，但沒有對藥物敏感性進行驗證(Tsao,M.S.et al.(2005)N.Engl.J.Med.353：133-144)。用於絲氨酸-蘇氨酸激酶的重要αC螺旋的酶活性變構規則已得到驗證(Hindie,V.et al.(2009)Nat.Chem.Biol.5：758-764)。ALK的Cys1156變化直接參與到了激酶結構域和TKIs之間的物理作用中。
等同
那些在本領域技術人員將認識到或能夠確定使用但不超過常規的試驗，與本發明在這裏所述的具體實施例有很多等同。這些等同包含在本發明的權利要求中。
第1圖所示的是本發明所述的能抗ALK酪氨酸激酶抑制劑的新型ALK突變。第1圖A是EML4-ALK蛋白的結構示意圖。圖中顯示了激酶結構域中兩個de novo突變的位置，並用實心或空心箭頭分別圖示了上述用於擴增激酶結構域或融合cDNA的那些PCR引物。第1圖B顯示了ALK激酶結構域cDNA的深度測序結果。NSCLC細胞系H2228或編號為J-#1,J-#12,J-#113,J-#127或LK-#33的樣本中獲得的約1000bp的PCR產物是用GAII系統測序的。激酶結構域cDNA的每個位置上的總讀數(總)和錯配讀數(錯配)的數目分別用藍色和紅色菱形表示。並放大地顯示了樣本J-#1和J-#113中cDNA5’端處的插入(用綠色方塊表示)。第1圖C是G4374和C4493周圍ALK cDNA克隆的電泳圖。PCR是用cDNA來完成的，所述的cDNA分別是從未治療前採樣的痰中(開始)和已經惡化後採樣的胸腔積液 細胞中(惡化)提取的。取代的A核苷酸用紅色顯示。
第2圖顯示了ALK cDNA中G4374和C4493對應位置處的基因序列。病患的胸腔積液細胞中分離出來的基因DNA可以用Platinum @DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)，下述引物(5，-GGTAAGAAGTGGCTCACTCTTGAG-3’和5’-CACAACAACTGCAGCAAAGACTGG-3’)進行PCR，94℃下15s，60℃下30s，68℃下2分鐘，35個迴圈，獲得的產物導入到質粒pT7Blue-2(Takara Bio)中。然後將插入後的質粒用3130xl基因分析儀測序，以鑒別含有G4374A(圖左側)or C4493A(圖右側)取代的PCR克隆。取代的A核苷酸用紅色顯示。
第3圖顯示了用PF-02341066處理BA/F3細胞的結果。BA/F3表達了EML4-ALK(野生型)，EML4-ALK(C1156Y)，EML4-ALK(L1196M)，或雙突變的EML4-ALK(C1156Y/L1196M)，它是在所示濃度的PF-02341066中培養48小時，然後用相差顯微鏡來觀察其細胞形態。比例尺：20μm。
第4圖顯示了本發明所述的能抗ALK酪氨酸激酶抑制劑的新型ALK突變的性能。第4圖A顯示了5×105個BA/F3細胞在PF-02341066的所示濃度下培養48h後表達EML4-ALK(野生型)，EML4-ALK(C1156Y)，EML4-ALK(L1196M)或雙突變EML4-ALK(C1156Y/L1196M)的數量。圖中顯示了BA/F3表達野生型EML4-ALK相對的可用細胞的百分比。資料是指三個單獨實驗獲得的±s.d.。第4圖B顯示了在野生型的酪氨酸磷酸化作用中或者突變型EML4-ALK中PF-02341066的效果。BA/F3細胞表達了FLAG標記的野生型EML4-ALK或其突變，將其置於所示濃度的PF-02341066中15小時，然後EML4-ALK從細胞溶解產物中免疫沉澱出來，然後進行免疫印跡分析抗體對Tyr1604磷酸化的ALK或FLAG表位(ALK).的特異性。將表達一種EML4-ALK(KM)不活躍突變的細胞作為陰性對照。第4圖C顯示了一種體外激酶評估，它能用於評估從BA/F3細胞(未轉入ALK抑制劑 中)中免疫沉澱出來的FLAG標記的野生型EML4-ALK或其突變。所述的免疫沉澱是在[γ-32P]ATP，一種合成肽和所述濃度的PF-02341066中進行的。肽底物免疫沉澱的磷酸化作用分別用於免疫印跡分析抗體抗FLAG的性能(圖下側)。
第5圖是ALK激酶結構域的三維結構域模型圖。ALK的氨基酸位置是重疊在胰島素受體的晶體結構上，該胰島素受體有一個結合的ATP同源物(日本蛋白資訊銀行中的編號為“1ir3”，可以在pdbj.org/index.html的萬維網上查詢)。右側圖顯示了從左側所示的模型左側獲得的蛋白結構。A螺旋和β折疊分別用紅色和黃色來表示。圖中還顯示了螺旋αC,Cys1156,and Leu1196的位置。
<110> 自治醫科大學
<120> 對ALK抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療
<140> TW100103831
<141> 2011-02-01
<150> US61/377,465
<151> 2010-02-04
<160> 4
<170> PatentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 6222
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 24
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<220>
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Claims (23)

  1. 一種用於識別一個患有癌症或具有罹患癌症風險的對象在使用ALK抑制劑治療時是否會產生對治療無反應的額外風險的方法，其特徵在於包括：分析一從受試者來的樣本，檢測是否具有一或多個突變的ALK多核苷酸分子，將突變的ALK多肽編碼，該突變ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括在胺基酸1156及/或1196位置之突變，以檢測一或多個突變ALK多肽之存在，該一或多個突變ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括在位置1156及/或位置1196之突變，其中一個或多個突變的ALK多核苷酸分子或突變的ALK多肽的存在說明該患者具有一個對ALK抑制劑治療無反應的額外風險。
  2. 如申請專利範圍第1所述的方法，其特徵在於所述的患者事先沒有使用一種ALK抑制劑進行治療，或者事先已經使用了一種ALK抑制劑進行治療，並對ALK抑制劑已經至少產生了一部分的抗性。
  3. 如申請專利範圍第1所述的方法，其特徵在於所述的癌症包括間變性大細胞淋巴瘤，神經母細胞瘤，乳腺癌，大腸癌，炎性肌纖維瘤和非小細胞肺癌。
  4. 如申請專利範圍第1所述的方法，其特徵在於所述的ALK抑制劑包 括PF-02341066，PDD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4,5,6,11,12,13六氫-2H-吲唑[5,4-α]吡咯[3,4-c]哢唑-8-基[4-(二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(1S,2S,3R,4R)-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2,3,4,5-四氫-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯並氮雜卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)雙環[2.2.1]庚-5-烯-2-甲醯胺和NVP-TAE684。
  5. 如申請專利範圍第1所述的方法，其特徵在於所述的樣本包括痰液，支氣管肺泡灌洗，胸腔積液，組織，全血，血清，血漿，口腔刮，唾液，腦脊液，尿液，糞便，迴圈腫瘤細胞，迴圈核酸和骨髓。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其特徵在於所述的樣本是組織，並且所述的組織是一種腫瘤或癌症組織。
  7. 如申請專利範圍第1所述的方法，其特徵在於所述的樣本包括細胞。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其特徵在於使用一種核苷酸雜交檢測來檢測一個或多個ALK突變。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其特徵在於使用一種聚合酶鏈式反應來檢測一個或多個ALK突變。
  10. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其特徵在於使用一種試劑來檢測一個或多個ALK多肽的表達水準，其中所述的試劑是與一個或多 個ALK多肽形成特定結合的。
  11. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其特徵在於所述的試劑包括一種抗體，一種抗體衍生物和一種抗體片段。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其特徵在於在第一時點與至少一隨後時點檢測了一個或多個ALK突變。
  13. 如申請專利範圍第1所述的方法，其特徵在於所述的樣本包括生殖細胞系或體細胞基因組DNA。
  14. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其特徵在於該ALK抑制劑係PF-02341066。
  15. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其特徵在於一或多個突變的ALK多核苷酸分子或突變ALK多肽係選自以下所構成群組：突變的ALK多核苷酸分子，其將突變ALK蛋白質編碼，該突變ALK蛋白質係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括Cys1156Tyr突變及/或Leu1196Met突變；以及突變ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，其包括Cys1156Tyr突變及/或Leu1196Met突變。
  16. 一種用於確定一個癌症患者的化學敏感性從而對其使用一種ALK抑制劑進行治療的試劑盒，其特徵在於包括：一試劑，其特定接合至：一個或多個突變的ALK多核苷酸分子，其將突變ALK多肽編碼，該突變ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK 之序列，並包括在位置1156之突變及/或在位置1196之突變；或突變ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，其包括在位置1156之突變及/或在位置1196之突變；一ALK抑制劑；以及一有關該試劑與該ALK抑制劑之使用說明書。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的試劑盒，其特徵在於所述的試劑包括一個或多核苷酸探針，其中每一個探針包括一個多核苷酸序列，這個多核苷酸序列與選一核苷酸序列互補，該核苷酸序列將突變的ALK多肽編碼，該突變ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括在位置1156及/或1196之突變。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的試劑盒，其特徵在於所述的探針包括長度為50-107個核苷酸的多核苷酸。
  19. 如申請專利範圍第17項所述的試劑盒，其特徵在於所述的探針由以下所構成之群組選出：寡核苷酸，cRNA分子，RNA分子，以及由鹼基組成的合成基因探針。
  20. 如申請專利範圍第16項所述的試劑盒，其特徵在於該ALK抑制劑係PF-02341066。
  21. 如申請專利範圍第16項所述的試劑盒，其特徵在於所述的試劑包括一種抗體，一種抗體衍生物或一種抗體片段，該片段與突變的ALK 多肽特異性結合，該突變的ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包含在位置1156及/或1196的突變。
  22. 一種突變的ALK多核苷酸分子，其特徵為其將一突變的ALK多肽編碼，該突變的ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括在位置1156之突變及/或在在位置1196之突變，使用於診斷一對罹患癌症具有額外風險的對像；或該突變的ALK多核苷酸分子將一突變的ALK多肽編碼，該突變的ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括在位置1156之突變及/或在位置1196之突變，使用於診斷一對ALK抑制劑治療無反應之額外風險之患者。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之突變的ALK多核苷酸分子，其特徵為該突變的ALK多核苷酸分子或該突變的ALK多肽係選自以下所構成群組：該突變的ALK多核苷酸分子，其將突變ALK蛋白質編碼，該突變ALK蛋白質係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，並包括Cys1156Tyr突變及/或Leu1196Met突變；以及該突變的ALK多肽係選自SEQ ID NO：17 EML4-ALK之序列，其包括Cys1156Tyr突變及/或Leu1196Met突變。
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WO (1) WO2011095894A2 (zh)
ZA (1) ZA201205831B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8383793B2 (en) * 2010-04-15 2013-02-26 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors
WO2012019132A2 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
JP6205216B2 (ja) * 2012-09-24 2017-09-27 アークレイ株式会社 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット
US9428812B2 (en) * 2014-04-28 2016-08-30 Insight Genetics, Inc. Kit comprising primers for amplifying ALK kinase domain nucleic acids
DK4074735T3 (da) * 2014-08-28 2025-07-14 Bioatla Inc Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler
WO2017207696A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel mutations in anaplastic lymphoma kinase predicting response to alk inhibitor therapy in lung cancer patients
KR101872624B1 (ko) * 2016-12-27 2018-06-28 (주) 바이오인프라생명과학 Alk 표적 치료제에 대한 폐암의 치료 반응성을 예측하는 방법
CN107828823A (zh) * 2017-09-29 2018-03-23 暨南大学 一种评价eml4‑alk抑制剂对肺癌治疗效果的方法
RU2717309C2 (ru) * 2018-08-01 2020-03-20 Общество с ограниченной ответственностью "ОНКОДИАГНОСТИКА АТЛАС" Способ определения микросателлитной нестабильности
CN112424380B (zh) 2018-11-01 2025-03-04 Illumina公司 用于体细胞变体检测的方法和组合物
BR112022021020A2 (pt) 2020-04-22 2023-02-14 Iovance Biotherapeutics Inc Método de fabricação de um produto de terapia celular, métodos de tratamento do paciente com o produto de terapia celular de expansão e fabricado, e, método de fabricação de um produto de terapia celular
WO2024017352A1 (zh) * 2022-07-22 2024-01-25 四川大学 用于rdaa阳性疾病的诊断和治疗的方法和试剂盒

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
US5447841A (en) 1986-01-16 1995-09-05 The Regents Of The Univ. Of California Methods for chromosome-specific staining
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0264166B1 (en) 1986-04-09 1996-08-21 Genzyme Corporation Transgenic animals secreting desired proteins into milk
US4998617A (en) 1986-09-15 1991-03-12 Laura Lupton Inc Facial cosmetic liquid make up kit
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
DE68926504T2 (de) 1988-07-20 1996-09-12 David Segev Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU4308689A (en) 1988-09-02 1990-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
JP3152927B2 (ja) 1988-12-16 2001-04-03 アクゾ・ノベル・ナムローゼ・フェンノートシャップ 自己持続性、配列複製システム
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
IE66597B1 (en) 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
WO1991001140A1 (en) 1989-07-25 1991-02-07 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
AU647741B2 (en) 1989-12-01 1994-03-31 Regents Of The University Of California, The Methods and compositions for chromosome-specific staining
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU8229291A (en) 1990-07-10 1992-02-04 Smithkline Beecham Corporation Oxamides
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6277569B1 (en) 1990-09-20 2001-08-21 Vysis, Inc. Methods for multiple direct label probe detection of multiple chromosomes or regions thereof by in situ hybridization
US5491224A (en) 1990-09-20 1996-02-13 Bittner; Michael L. Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
ES2330052T3 (es) 1991-03-01 2009-12-03 Dyax Corporation Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas.
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
CA2087413A1 (en) 1992-01-17 1993-07-18 Joseph R. Lakowicz Fluorescent energy transfer immunoassay
EP0636186B1 (en) 1992-04-03 1998-11-25 The Perkin-Elmer Corporation Probe composition and method
FR2690691B1 (fr) 1992-04-29 1999-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'arn necessitant une seule etape de manipulation.
JPH08509857A (ja) 1993-01-07 1996-10-22 シーケノム・インコーポレーテッド マススペクトロメトリーによるｄｎａ配列決定法
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
AU687801B2 (en) 1993-03-19 1998-03-05 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5571676A (en) 1995-06-07 1996-11-05 Ig Laboratories, Inc. Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6261775B1 (en) 1999-04-09 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Detection of chromosome copy number changes to distinguish melanocytic nevi from malignant melanoma
JP2003504073A (ja) * 1999-07-09 2003-02-04 ザ バーナム インスティチュート Ｂａｇ発現のレベルを測定することによる、癌患者の予後を決定するための方法
WO2005080393A1 (en) * 2004-02-14 2005-09-01 Irm Llc Compounds and compositions as protein kinase inhibitors
US7700339B2 (en) * 2006-04-14 2010-04-20 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
KR101362284B1 (ko) 2007-04-13 2014-02-12 셀 시그널링 테크놀러지, 인크. 인간 고형 종양에서 유전자 결손 및 돌연변이 ａｌｋ 카이네이즈
US20110206691A1 (en) * 2008-02-15 2011-08-25 Mosse Yael P Methods and Compositions for Treating Neuroblastoma
WO2009103061A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for identifying, diagnosing, and treating neuroblastoma
JP2011513427A (ja) 2008-03-06 2011-04-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド ｃ−ｍｅｔ及びＥＧＦＲアンタゴニストの併用療法
CN102575287B (zh) 2009-05-15 2016-11-16 因赛特遗传学公司 用于诊断和治疗癌症的涉及alk融合物的方法和组合物
US9031642B2 (en) 2013-02-21 2015-05-12 Medtronic, Inc. Methods for simultaneous cardiac substrate mapping using spatial correlation maps between neighboring unipolar electrograms

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