JP6205216B2 - 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット - Google Patents
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Description
本発明は、変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キットに関する。
肺がんの発症原因のひとつに遺伝子変異が挙げられる。このため、肺がんの発症に関連すると思われている遺伝子の特定が進められている。このような肺がんの発症に関連すると考えられている遺伝子変異としては、ＥＧＦＲ遺伝子変異と、ＡＬＫ遺伝子変異が挙げられる。
ＡＬＫ（anaplastic lymphoma kinase：未分化リンパ腫キナーゼ）の遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子であり、２番染色体内で逆位を起こすと、ＥＭＬ４遺伝子と融合することが知られている。この融合遺伝子（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）により、恒常的に活性化されたチロシンキナーゼが産生され、肺腺がんを発症すると考えられている。このことから、肺がん治療の分野でのＡＬＫ阻害剤の使用が試みられている。このようなＡＬＫ阻害剤としては、クリゾチニブ（crizotinib）が知られている。
しかしながら、クリゾチニブについて、初期には一定の治療的効果が認められるものの、次第に薬剤の効果が期待された以上に上がらなくなることがある。
ＡＬＫ（anaplastic lymphoma kinase：未分化リンパ腫キナーゼ）の遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子であり、２番染色体内で逆位を起こすと、ＥＭＬ４遺伝子と融合することが知られている。この融合遺伝子（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）により、恒常的に活性化されたチロシンキナーゼが産生され、肺腺がんを発症すると考えられている。このことから、肺がん治療の分野でのＡＬＫ阻害剤の使用が試みられている。このようなＡＬＫ阻害剤としては、クリゾチニブ（crizotinib）が知られている。
しかしながら、クリゾチニブについて、初期には一定の治療的効果が認められるものの、次第に薬剤の効果が期待された以上に上がらなくなることがある。
このような阻害活性の発現については、ＥＭＬ４−ＡＬＫ内に生じた２つの遺伝子変異、即ち、ＡＬＫ遺伝子のアミノ酸配列のうち１１５６番目のシステインがチロシンに置換した変異（以下、「ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）」と称する場合がある）と、ＡＬＫ遺伝子のアミノ酸配列のうち１１９６番目のロイシンがメチオニンに置換した変異（以下、「ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）」と称する場合がある）が関与していることが見いだされた（非特許文献１参照）。これらの遺伝子変異は、ＥＭＬ４−ＥＬＫ内のクリゾチニブ結合ポケット部位に生じ、その結果、結合ポケットの形状を変化させて、クリゾチニブとＥＭＬ４−ＡＬＫとの結合親和性を低下させるという共通した特性を示すことが明らかとなった。このことから、ＡＬＫ阻害剤を使用するに際して、その効果を予測するための予測因子として、これらのＡＬＫ遺伝子変異の有無を検出することが重要となってきた。
一方、近年、遺伝子変異を検出する検出試験として、融解曲線分析（Ｔｍ分析）を利用した検出が行われている。この方法では、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する（例えば、特許文献１参照）。
New England Journal of Medicine, Vol.363, pp.1734-1739 (2010)
非特許文献１では、それぞれの遺伝子変異を、それぞれの配列に基づいて直接的に検出する、いわゆるダイレクトシークエンス法で検出しているが、ＤＮＡの抽出精製およびＰＣＲを行った後、シークエンス反応を行い、シークエンサーで電気泳動を行わなければならないなど手間又はコストを要する。また増幅産物が別の反応を汚染する（コンタミネーション）恐れがある。さらに自動化が困難であり、複数の核酸配列を同時に検査することができない。
特許文献１には、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量を測定する方法が記載されている。しかしながら、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量測定を実施する上で何れの任意配列で実施できるわけではなく、変異毎に適正な配列を見つける必要がある。
特許文献１には、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量を測定する方法が記載されている。しかしながら、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量測定を実施する上で何れの任意配列で実施できるわけではなく、変異毎に適正な配列を見つける必要がある。
これらの現状を踏まえ、ＡＬＫ阻害剤の効果を予測するなどの目的のためにＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型及びＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型のＡＬＫ遺伝子における変異を検出するために効果的な技術開発が待ち望まれていた。
本発明は、ＡＬＫ遺伝子における変異を簡便に検出することを可能にする変異検出用プローブ、これを用いた変異検出方法および薬効判定方法、ならびに変異検出用キットを提供することを課題とする。
本発明は以下のとおりである。
［１］ 下記オリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出するための変異検出用プローブ：
（Ｐ１） 配列番号５に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２） 配列番号６に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３） 配列番号７に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４） 配列番号８に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７） 配列番号９に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８） 配列番号１０に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
［２］ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、［１］記載の変異検出用プローブ。
［３］ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する［２］に記載の変異検出用プローブ。
［４］ 融解曲線分析用のプローブである［１］〜［３］のいずれか１に記載の変異検出用プローブ。
［５］ ［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方の変異を検出することを含むＡＬＫ遺伝子の変異検出方法。
［６］ 配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方の変異を、同一の系で検出することを含む［５］に記載の変異検出方法。
［７］ （Ｉ）［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（II）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（III）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（IV）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＬＫ遺伝子の変異の存在を検出することと、
を含む、［５］又は［６］に記載の変異検出方法。
［８］ 更に、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む［７］に記載の変異検出方法。
［９］ ［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異を検出することを含み、さらに、
以下のＰ５プライマー及びＰ６プライマーを使用して、核酸を増幅することを含む［７］に記載の変異検出方法：
（Ｐ５） 配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー、
（Ｐ６） 配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー。
［１０］ ［５］〜［９］のいずれか１に記載の変異検出方法により、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び、検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定すること、を含む薬剤の薬効判定方法。
［１１］ ［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プロープを含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出する変異検出用試薬キット。
［１２］ 以下のプライマーの少なくとも一方を更に含む［１１］に記載の変異検出用キット：
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７又はＰ８のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマー、及び
前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマー。
［１３］ 下記のいずれかの蛍光標識オリゴヌクレオチド：
配列番号５に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号６に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号７に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号８に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号９に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号１０に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
［１］ 下記オリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出するための変異検出用プローブ：
（Ｐ１） 配列番号５に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２） 配列番号６に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３） 配列番号７に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４） 配列番号８に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７） 配列番号９に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８） 配列番号１０に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
［２］ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、［１］記載の変異検出用プローブ。
［３］ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する［２］に記載の変異検出用プローブ。
［４］ 融解曲線分析用のプローブである［１］〜［３］のいずれか１に記載の変異検出用プローブ。
［５］ ［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方の変異を検出することを含むＡＬＫ遺伝子の変異検出方法。
［６］ 配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方の変異を、同一の系で検出することを含む［５］に記載の変異検出方法。
［７］ （Ｉ）［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（II）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（III）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（IV）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＬＫ遺伝子の変異の存在を検出することと、
を含む、［５］又は［６］に記載の変異検出方法。
［８］ 更に、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む［７］に記載の変異検出方法。
［９］ ［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異を検出することを含み、さらに、
以下のＰ５プライマー及びＰ６プライマーを使用して、核酸を増幅することを含む［７］に記載の変異検出方法：
（Ｐ５） 配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー、
（Ｐ６） 配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー。
［１０］ ［５］〜［９］のいずれか１に記載の変異検出方法により、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び、検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定すること、を含む薬剤の薬効判定方法。
［１１］ ［１］〜［４］のいずれか１に記載の変異検出用プロープを含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出する変異検出用試薬キット。
［１２］ 以下のプライマーの少なくとも一方を更に含む［１１］に記載の変異検出用キット：
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７又はＰ８のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマー、及び
前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマー。
［１３］ 下記のいずれかの蛍光標識オリゴヌクレオチド：
配列番号５に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号６に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号７に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号８に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号９に示す塩基配列を有し、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号１０に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
本発明によれば、ＡＬＫ遺伝子における変異を簡便に検出することを可能にするＡＬＫ遺伝子の変異検出用プローブ、これを用いた変異検出方法および薬効判定方法、ならびに変異検出用キットを提供することができる。
本発明にかかるＡＬＫ遺伝子の変異検出用プローブ（以下、単に「変異検出用プローブ」ということがある）は、前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ７及びＰ８の各蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを変異検出用プローブとするものである。
本発明のＡＬＫ遺伝子の変異検出方法は、前記変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方を検出することを含む変異検出方法である。
本発明における薬効判定方法は、前記ＡＬＫ遺伝子の変異検出方法によりＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び、検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定すること、を含む薬剤の薬効判定方法である。
また本発明の変異検出用試薬キットは、前記変異検出用プローブを含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出する変異検出用試薬キットである。
本発明のＡＬＫ遺伝子の変異検出方法は、前記変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方を検出することを含む変異検出方法である。
本発明における薬効判定方法は、前記ＡＬＫ遺伝子の変異検出方法によりＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び、検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定すること、を含む薬剤の薬効判定方法である。
また本発明の変異検出用試薬キットは、前記変異検出用プローブを含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出する変異検出用試薬キットである。
即ち、本発明では、変異検出用プローブとして、変異を示す塩基に対応する塩基を含み、且つ特定の位置に蛍光標識されたシトシンを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを設計することにより、融解曲線分析などの自動検出可能な検出方法に適用可能で且つ目的とするＡＬＫ遺伝子変異を簡便に検出することができる。また、この変異検出用プローブを用いることにより、ＡＬＫ遺伝子変異に基づく薬効判定を簡便に行うことができる。
本発明における「ＡＬＫ遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０００００２．１１のうち２９４１５６４０番目の塩基〜３０１４４４７７番目の塩基の配列に相当する。なお、本明細書においては、特に断らない限り「ＡＬＫ遺伝子」は、配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列を意味するものとする。
配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＴ_０２２１８４．１５のうち８２６５６５０番目の塩基〜８２６５３５１番目の塩基を第１〜３００番目の塩基とし、８２６５５１８番目の塩基に対応する１３３番目の塩基を「Ａ（アデニン）」とする変異型の塩基配列である。
配列番号２の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＴ_０２２１８４．１５のうち８２６５６５０番目の塩基〜８２６５３５１番目の塩基を第１〜３００番目の塩基とし、８２６５５１８番目の塩基に対応する１３３番目の塩基を「Ｃ（シトシン）」とする野生型の塩基配列である。
配列番号２の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＴ_０２２１８４．１５のうち８２６５６５０番目の塩基〜８２６５３５１番目の塩基を第１〜３００番目の塩基とし、８２６５５１８番目の塩基に対応する１３３番目の塩基を「Ｃ（シトシン）」とする野生型の塩基配列である。
また配列番号３の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＴ_０２２１８４．１５のうち８２６７３８８番目の塩基〜８２６７０８９番目の塩基を第１〜３００番目の塩基とし、８２６７１４５番目の塩基に対応する２４４番目の塩基を「Ａ（アデニン）」とする変異型の塩基配列である。
また配列番号４の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＴ_０２２１８４．１５のうち８２６７３８８番目の塩基〜８２６７０８９番目の塩基を第１〜３００番目の塩基とし、８２６７１４５番目の塩基に対応する２４４番目の塩基を「Ｇ（グアニン）」とする野生型の塩基配列である。
また配列番号４の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＴ_０２２１８４．１５のうち８２６７３８８番目の塩基〜８２６７０８９番目の塩基を第１〜３００番目の塩基とし、８２６７１４５番目の塩基に対応する２４４番目の塩基を「Ｇ（グアニン）」とする野生型の塩基配列である。
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、変異検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
本明細書においてＴｍ値を算出する場合、得られたＴｍ値は、特に断らない限り、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した値とする。このソフトウェアは、当業界で公知のものであり、Clinical Chemistry Vol.54, No.6, pp.990−999 (2008)等でもプローブの設計に使用されている。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端にある塩基を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端にある塩基を１番目として数える。
本発明において、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける「オリゴヌクレオチド」としては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類の構成単位から構成されてもよいし、複数種類の構成単位から構成されてもよい。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類の構成単位から構成されてもよいし、複数種類の構成単位から構成されてもよい。
本発明においてハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において変異とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。
以下、本発明について説明する。
以下、本発明について説明する。
＜ＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブ＞
本発明のＡＬＫ遺伝子の変異検出用プローブ（以下、単に「変異検出用プローブ」ともいう）は、前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ７及びＰ８からなる群より選択された少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＡＬＫ遺伝子の変異を検出するための変異検出用プローブである。
ＡＬＫ遺伝子の野生型では、配列番号１に示す配列のうち１３３番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異しており（以下、「ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型」ともいう）、当該塩基は、ＡＬＫ遺伝子の８２６５６５０番目の塩基〜８２６５３５１番目の塩基のうち、８２６５５１８番目の塩基に該当する。
ＡＬＫ遺伝子の野生型では、配列番号３に示す配列のうち２４４番目に対応する塩基は、Ｇ（グアニン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異しており（以下、「ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型」ともいう）、当該塩基は、ＡＬＫ遺伝子の８２６７３８８番目の塩基〜８２６７０８９番目の塩基のうち、８２６７１４５番目の塩基に該当する。
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異を検出することができるプローブであり、前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異を検出することができるプローブである。これらの蛍光標識オリゴヌクレオチドである変異検出用プローブを用いることにより、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出することができる。
本発明のＡＬＫ遺伝子の変異検出用プローブ（以下、単に「変異検出用プローブ」ともいう）は、前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ７及びＰ８からなる群より選択された少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＡＬＫ遺伝子の変異を検出するための変異検出用プローブである。
ＡＬＫ遺伝子の野生型では、配列番号１に示す配列のうち１３３番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異しており（以下、「ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型」ともいう）、当該塩基は、ＡＬＫ遺伝子の８２６５６５０番目の塩基〜８２６５３５１番目の塩基のうち、８２６５５１８番目の塩基に該当する。
ＡＬＫ遺伝子の野生型では、配列番号３に示す配列のうち２４４番目に対応する塩基は、Ｇ（グアニン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異しており（以下、「ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型」ともいう）、当該塩基は、ＡＬＫ遺伝子の８２６７３８８番目の塩基〜８２６７０８９番目の塩基のうち、８２６７１４５番目の塩基に該当する。
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異を検出することができるプローブであり、前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異を検出することができるプローブである。これらの蛍光標識オリゴヌクレオチドである変異検出用プローブを用いることにより、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出することができる。
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４，Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列を表１に示す。
Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２３番目〜１３９番目の塩基からなる塩基長１７の塩基配列に相補的な配列であって、１２３番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ１のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１２３番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２３番目〜１４１番目の塩基からなる塩基長１９の塩基配列であって、１４１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ２のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１４１番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ３のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列において、１２３番目〜１３８番目の塩基からなる塩基長１６の塩基配列に相補的な配列であって、１３８番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ３のオリゴヌクレオチドの５’末端となる配列番号２に示す塩基配列の１３８番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ４のオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列において、２３５番目〜２５２番目の塩基からなる塩基長１８の塩基配列であって、２５２番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ４のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号３に示す塩基配列の２５２番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２３番目〜１３９番目の塩基からなる塩基長１７の塩基配列に相補的な配列であって、１２３番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ１のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１２３番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２３番目〜１４１番目の塩基からなる塩基長１９の塩基配列であって、１４１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ２のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１４１番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ３のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列において、１２３番目〜１３８番目の塩基からなる塩基長１６の塩基配列に相補的な配列であって、１３８番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ３のオリゴヌクレオチドの５’末端となる配列番号２に示す塩基配列の１３８番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ４のオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列において、２３５番目〜２５２番目の塩基からなる塩基長１８の塩基配列であって、２５２番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ４のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号３に示す塩基配列の２５２番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２９番目〜１４５番目の塩基からなる塩基長１７の塩基配列に相補的な配列であって、１２９番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ７の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ７のオリゴヌクレオチドの５’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１２９番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ８のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２９番目〜１４６番目の塩基からなる塩基長１８の塩基配列であって、１４６番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ８のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１４６番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
Ｐ８のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、１２９番目〜１４６番目の塩基からなる塩基長１８の塩基配列であって、１４６番目の塩基に対応する塩基がシトシンである塩基配列を有する。Ｐ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、Ｐ８のオリゴヌクレオチドの３’末端となる配列番号１に示す塩基配列の１４６番目の塩基に対応する塩基であるシトシンが蛍光色素で標識されている。
なお、表１において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８については、配列番号１の１３３番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記した。また、配列番号１の１３３番目に対応する塩基がＣ（野生型）又はＡ（変異型）の場合である試料核酸と、それぞれの各蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を算出し、併せて示した。
また、表１において、Ｐ４については、配列番号３の２４４番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記した。また、配列番号３の２４４番目に対応する塩基がＧ（野生型）又はＡ（変異型）の場合である試料核酸と、それぞれの各蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。
また、表１において、Ｐ４については、配列番号３の２４４番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記した。また、配列番号３の２４４番目に対応する塩基がＧ（野生型）又はＡ（変異型）の場合である試料核酸と、それぞれの各蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。
なお、本発明に係る変異検出用プローブにおける前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４，Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドの各塩基配列から、１個〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであっても、本発明に係る変異検出用プローブと同等に、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異又はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異を検出可能なプローブが存在しうる。このような本発明に係る変異検出用プローブと１個〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブのうち変異を検出可能な変異検出用プローブも本発明に包含される。
本発明に係る変異検出用プローブにおけるＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドの各塩基配列から、１個〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであって、配列番号１における第１３３番目の変異を認識するプローブのうち変異を検出可能な変異検出用プローブも、本発明に包含される。
なお、「配列番号１における第１３３番目の変異を認識する」等の表現は、「配列番号１における第１３３番目の変異を示す塩基に結合する」の意味である。
なお、「配列番号１における第１３３番目の変異を認識する」等の表現は、「配列番号１における第１３３番目の変異を示す塩基に結合する」の意味である。
本発明に係る変異検出用プローブにおけるＰ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基配列から、１〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであって、配列番号３における第２４４番目の変異を認識するプローブのうち変異を検出可能な変異検出用プローブも、本発明に包含される。
なお、「配列番号３における第２４４番目の変異を認識する」等の表現は、「配列番号３における第２４４番目の変異を示す塩基に結合する」の意味である。
なお、「配列番号３における第２４４番目の変異を認識する」等の表現は、「配列番号３における第２４４番目の変異を示す塩基に結合する」の意味である。
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることができる。
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、オリゴヌクレオチドを、３'末端もしくは５'末端がシトシン（Ｃ）となるように設計し、その末端のＣが、グアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが挙げられる。
このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ遺伝子における変異、特にＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブとして使用することができ、また、ＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ遺伝子における変異、特にＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型を検出するＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブとして使用することができ、また、ＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＡＬＫ遺伝子における変異、特にＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型を検出するＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブとして使用することができ、また、ＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
なお、前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドの場合には１２３番目の塩基に対応する塩基、前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドの場合には１４１番目の塩基に対応する塩基、前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドの場合には１３８番目の塩基に対応する塩基が、前記Ｐ７の蛍光標識オリゴヌクレオチドの場合には１４５番目の塩基に対応する塩基が、前記Ｐ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドの場合には１４６番目の塩基に対応する塩基が、それぞれシトシンであり、当該シトシンが蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
また、前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列において２５２番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、当該シトシンが蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
＜プライマー＞
後述するＡＬＫ遺伝子変異検出方法では、検出対象となるＡＬＫ遺伝子変異を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＡＬＫ遺伝子の変異が、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の場合には配列番号１で示される塩基配列のうち１３３番目の塩基に対応する塩基を含む核酸、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の場合には配列番号３で示される塩基配列のうち２４４番目の塩基に対応する塩基を含む核酸を、それぞれ増幅可能であれば特に制限されない。
後述するＡＬＫ遺伝子変異検出方法では、検出対象となるＡＬＫ遺伝子変異を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＡＬＫ遺伝子の変異が、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の場合には配列番号１で示される塩基配列のうち１３３番目の塩基に対応する塩基を含む核酸、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の場合には配列番号３で示される塩基配列のうち２４４番目の塩基に対応する塩基を含む核酸を、それぞれ増幅可能であれば特に制限されない。
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の変異検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅できるものであれば特に制限されず、例えば、配列番号１〜配列番号４で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及び、プライマーがハイブリダイズする一本鎖核酸に対するＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよく、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であってもよい。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよく、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であってもよい。
本発明にかかるＡＬＫ遺伝子変異検出方法がＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出対象とするＡＬＫ遺伝子変異検出方法である場合には、前記Ｐ５及びＰ６をプライマーとして使用して、試料核酸を増幅することができる。
前記Ｐ５プライマーは、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の塩基配列を有する核酸を鋳型として効率よく核酸を増幅することができる。前記Ｐ６プライマーは、ＡＬＫ遺伝子の野生型の塩基配列を有する核酸を鋳型として効率よく核酸を増幅することができる。このため、Ｐ５及びＰ６プライマーを、前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドと共に使用すると、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を、感度よく検出することができる。特に、Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドと共に使用することが、より高い感度でＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出することができる。
なお、本発明において、核酸増幅反応において、プライマーがハイブリダイズ可能な塩基配列を有する核酸を鋳型核酸と称することがある。
なお、本発明において、核酸増幅反応において、プライマーがハイブリダイズ可能な塩基配列を有する核酸を鋳型核酸と称することがある。
なお、本発明に係る変異検出用プライマーにおけるＰ５及びＰ６のプライマーの各塩基配列から、１〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有するプライマーであっても、本発明に係る変異検出用プライマーと同等に、本発明に係る変異検出用プローブと組み合わせて使用してＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異又はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異を検出可能なプライマーが存在し得る。このような本発明に係る変異検出用プライマーと１個〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有するプライマーのうち本発明に係る変異検出用プローブと組み合わせて変異を検出可能なプライマーも本発明に係る変異検出用プライマーに包含される。
前記Ｐ５プライマーの塩基配列（配列番号１４）及びＰ６プライマーの塩基配列（配列番号１５）は、それぞれ配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列の１３３番目の塩基に対応する塩基を含む。これにより、例えば、目的とする塩基配列を有する核酸の増幅効率を高めることができる。
前記Ｐ６プライマーは、配列番号２に示される塩基配列と異なる塩基（ミスマッチ塩基）を有する。ミスマッチ塩基とは、Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン）とは異なる塩基の組み合わせ又はＡ（アデニン）−Ｔ（チミン）とは異なる塩基の組み合わせを意味し、具体的には、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｔ、Ａ−Ａ、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｃ、Ｔ−Ｔの塩基の組み合わせを意味する。
以下に本発明の変異検出方法における本発明の変異検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
以下のＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１０は、５’末端側に７塩基の付加配列を有し、３’末端に配列番号１における１３３番目の塩基に相当する「Ａ」を有するＰ５プライマーである。ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ＷＴ−Ｆ６は、５’末端側に６塩基の付加配列を有し、３’末端に配列番号２における１３３番目の塩基に相当する「Ｃ」を有し、３’末端側から５塩基目の位置に配列番号２の１２８番目の塩基に対応する塩基とは異なるミスマッチ塩基（「ａ」）を有するＰ６プライマーである。
以下のＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１０は、５’末端側に７塩基の付加配列を有し、３’末端に配列番号１における１３３番目の塩基に相当する「Ａ」を有するＰ５プライマーである。ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ＷＴ−Ｆ６は、５’末端側に６塩基の付加配列を有し、３’末端に配列番号２における１３３番目の塩基に相当する「Ｃ」を有し、３’末端側から５塩基目の位置に配列番号２の１２８番目の塩基に対応する塩基とは異なるミスマッチ塩基（「ａ」）を有するＰ６プライマーである。
変異の検出方法は、前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる変異検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した変異検出方法について、以下に説明する。
＜変異検出方法＞
本発明にかかるＡＬＫ遺伝子変異検出方法は、前記ＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＡＬＫ遺伝子の変異を検出することを含むＡＬＫ遺伝子変異検出方法である。
本発明にかかる変異検出方法によれば、前記変異検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＡＬＫ遺伝子の変異、特にＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型及びＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の少なくとも一方を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の変異検出方法は、ＡＬＫ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜工程（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の変異検出方法は、前記変異検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成及び条件等は、以下の記載に制限されない。
本発明にかかるＡＬＫ遺伝子変異検出方法は、前記ＡＬＫ遺伝子変異検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＡＬＫ遺伝子の変異を検出することを含むＡＬＫ遺伝子変異検出方法である。
本発明にかかる変異検出方法によれば、前記変異検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＡＬＫ遺伝子の変異、特にＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型及びＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の少なくとも一方を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の変異検出方法は、ＡＬＫ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜工程（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の変異検出方法は、前記変異検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成及び条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記変異検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＡＬＫ遺伝子における変異の存在を検出すること。
（Ｖ）前記変異の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、変異を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＡＬＫ遺伝子における変異の存在を検出すること。
（Ｖ）前記変異の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、変異を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は工程（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが挙げられる。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＡＬＫ遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが挙げられる。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の変異検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の変異検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下とし得る。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の変異が発生している検出対象核酸と前記変異が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の変異が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記変異が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記変異検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下とし得る。また、前記変異検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下とし得る。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上とし得る。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の変異が発生している検出対象核酸と前記変異が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の変異が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記変異が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記変異検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下とし得る。また、前記変異検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下とし得る。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上とし得る。
前記ＤＮＡに対する本発明の変異検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記変異検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記変異検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが挙げられる。このため、前記変異検出用プローブとして、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが挙げられる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。従って、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。従って、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
次に、本発明の変異検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体例を挙げて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、前記変異検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程及び条件については何ら制限されない。
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＡＬＫ遺伝子を含む核酸を含む試料であればよく、特に制限されない。例えば、大腸、肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む変異検出用プローブを添加する。
前記変異検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
前記変異検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
前記変異検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが挙げられる。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで変異の有無を判定できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＡＬＫ遺伝子変異の検出感度が高まるなどの傾向がある。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＡＬＫ遺伝子変異の検出感度が高まるなどの傾向がある。
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）のコピー数又は存在比を検出することができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）のコピー数又は存在比を検出することができる。
本発明の変異検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積又は濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する（図１参照）。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
具体例として、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した直後では前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した直後は、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した直後は、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
本発明の変異検出方法においては、ＡＬＫ（Ｌ１１９７Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型との少なくとも一方の変異型を検出することを含む。即ち、以下のいずれかの態様を含む：
（１）前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種である蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用し、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドである蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用せずに、ＡＬＫ（Ｌ１１９７Ｍ）変異型のみを検出するもの、
（２）前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種である蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用せず、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドである蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用して、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型のみを検出するもの、又は
（３）前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種である蛍光標識オリゴヌクレオチドと、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドである蛍光標識オリゴヌクレオチドとを共に使用して、ＡＬＫ（Ｌ１１９７Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型との双方を検出するもの。
（１）前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種である蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用し、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドである蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用せずに、ＡＬＫ（Ｌ１１９７Ｍ）変異型のみを検出するもの、
（２）前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種である蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用せず、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドである蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用して、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型のみを検出するもの、又は
（３）前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７及びＰ８のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種である蛍光標識オリゴヌクレオチドと、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドである蛍光標識オリゴヌクレオチドとを共に使用して、ＡＬＫ（Ｌ１１９７Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型との双方を検出するもの。
ＡＬＫ遺伝子における複数の変異は、同一の系で検出してもよく、異なる系で検出してもよい。同一の系で検出する場合の検出方法としては、特に制限されるものではない。例えば、各変異を検出できる各プローブを予め混合し、試料に添加してもよいし、一本鎖核酸を含む試料に各変異を検出できる各プローブを連続的に添加してもよい。
ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッドとを含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
なお、本変異検出方法に使用可能な各プローブ及びプライマーの好ましい態様又は配列については、上述の各プローブ及びプライマーに関する説明を適用することができる。
ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッドとを含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
なお、本変異検出方法に使用可能な各プローブ及びプライマーの好ましい態様又は配列については、上述の各プローブ及びプライマーに関する説明を適用することができる。
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した変異検出方法によりＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び、前記検出結果、即ち、検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した変異検出方法では、本発明における変異検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＡＬＫ遺伝子のＬ１１９６Ｍ変異またはＣ１１５６Ｙ変異を検出するので、ＡＬＫ遺伝子におけるこれらの変異に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
本発明の薬効判定方法は、上述した変異検出方法によりＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び、前記検出結果、即ち、検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した変異検出方法では、本発明における変異検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＡＬＫ遺伝子のＬ１１９６Ｍ変異またはＣ１１５６Ｙ変異を検出するので、ＡＬＫ遺伝子におけるこれらの変異に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
また、ＡＬＫ遺伝子における変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、ＡＬＫ遺伝子における変異の有無に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、ＡＬＫ阻害剤を有効成分とする抗がん剤が挙げられ、特に抗がん剤、中でも肺がん治療用の抗癌剤、例えば、クリゾチニブ等が挙げられる。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、ＡＬＫ阻害剤を有効成分とする抗がん剤が挙げられ、特に抗がん剤、中でも肺がん治療用の抗癌剤、例えば、クリゾチニブ等が挙げられる。
＜変異検出用試薬キット＞
本発明の変異検出用試薬キットは上述した変異検出用プローブを含む。
この変異検出用試薬キットには、上述の変異検出用プローブの少なくとも１種を含むことにより、例えばＡＬＫ遺伝子の変異の検出をより簡便に行うことができる。
本発明の変異検出用試薬キットは上述した変異検出用プローブを含む。
この変異検出用試薬キットには、上述の変異検出用プローブの少なくとも１種を含むことにより、例えばＡＬＫ遺伝子の変異の検出をより簡便に行うことができる。
変異検出用試薬キットは、上述のプローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーをさらに含むことができる。
これにより、本発明における変異検出用試薬キットは、精度よくＡＬＫ遺伝子の変異の検出を行うことができる。
変異検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
これにより、本発明における変異検出用試薬キットは、精度よくＡＬＫ遺伝子の変異の検出を行うことができる。
変異検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
変異検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは、混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
また、２種以上の前記プローブが混合された状態で前記変異検出用キットに含まれる場合又は、前記変異検出キットに別個の試薬として含まれた２種以上のプローブを、例えば使用時に同じ反応系で混合して使用する場合、２種以上の各プローブは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を行うことも可能になる。
また、２種以上の前記プローブが混合された状態で前記変異検出用キットに含まれる場合又は、前記変異検出キットに別個の試薬として含まれた２種以上のプローブを、例えば使用時に同じ反応系で混合して使用する場合、２種以上の各プローブは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を行うことも可能になる。
また、本発明における検出用試薬キットは、前記プローブ及び前記プライマーの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
変異部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に変異を検出することができる。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
変異部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に変異を検出することができる。
さらに本発明の変異検出用試薬キットは、前記変異検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことができる。
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
［実施例１］
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）の変異部位を含む塩基配列（配列番号１）又はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）の変異部位を含む塩基配列（配列番号３）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２３番目〜１３９番目の塩基に対応する塩基からなり、１２３番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ１蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３ＰＢ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｒ１（配列番号５：ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型検出用）と、配列番号３に示す塩基配列の２３５番目〜２５２番目の塩基に対応する塩基からなり、２５２番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ４蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫＣ１１５６Ｙ−ｍｔ−Ｆ２（配列番号８：ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型検出用）をそれぞれ設計し、常法に従って作製した（表３参照）。シトシンの標識化は、常法に従って、それぞれ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（以下、「ＰＢ」）又はＴＡＭＲＡを用いて行った。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。表３に示す塩基配列中、大文字は、変異の位置を示す。以下同様である。
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）の変異部位を含む塩基配列（配列番号１）又はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）の変異部位を含む塩基配列（配列番号３）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２３番目〜１３９番目の塩基に対応する塩基からなり、１２３番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ１蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３ＰＢ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｒ１（配列番号５：ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型検出用）と、配列番号３に示す塩基配列の２３５番目〜２５２番目の塩基に対応する塩基からなり、２５２番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ４蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫＣ１１５６Ｙ−ｍｔ−Ｆ２（配列番号８：ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型検出用）をそれぞれ設計し、常法に従って作製した（表３参照）。シトシンの標識化は、常法に従って、それぞれ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（以下、「ＰＢ」）又はＴＡＭＲＡを用いて行った。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。表３に示す塩基配列中、大文字は、変異の位置を示す。以下同様である。
下記表４及び表５に示す試薬を用いて全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）でＰＣＲ及びＴｍ解析を行い、本発明の変異検出用の蛍光標識オリゴヌクレオチドによるプローブの性能を確認した。なお、表４及び表５中の「％」は質量％を意味する（以下、同じ）。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び６１℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの場合は、それぞれ３６５ｎｍ〜４１５ｎｍ、４４５ｎｍ〜４８０ｎｍであり、蛍光色素ＴＡＭＲＡの場合はそれぞれ、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍであった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び６１℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの場合は、それぞれ３６５ｎｍ〜４１５ｎｍ、４４５ｎｍ〜４８０ｎｍであり、蛍光色素ＴＡＭＲＡの場合はそれぞれ、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍであった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
＜核酸混合液＞
核酸混合液は、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異又はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異の各変異部位に対応する配列を含む配列番号１８〜配列番号２１に示す核酸配列（表６参照）を、ｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、次いでＥｃｏＲＩで処理したプラスミド、Ｍｔ（Ｌ１１９６Ｍ）、Ｗｔ（Ｌ１１９６Ｍ）、Ｍｔ（Ｃ１１５６Ｙ）及びＷｔ（Ｃ１１５６Ｙ）を所定の割合で含む。サンプルＡ〜Ｃにおける核酸混合液中のプラスミドの含有比率（１μＬあたりのコピー数）は、表７に記載した。
＜前処理全血＞
全血１０μｌを７０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを７０μｌの希釈液２に加えた。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られた。この４μｌを全量、反応液に添加した。希釈液１及び希釈液２の組成は表８のとおりである。
核酸混合液は、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異又はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異の各変異部位に対応する配列を含む配列番号１８〜配列番号２１に示す核酸配列（表６参照）を、ｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、次いでＥｃｏＲＩで処理したプラスミド、Ｍｔ（Ｌ１１９６Ｍ）、Ｗｔ（Ｌ１１９６Ｍ）、Ｍｔ（Ｃ１１５６Ｙ）及びＷｔ（Ｃ１１５６Ｙ）を所定の割合で含む。サンプルＡ〜Ｃにおける核酸混合液中のプラスミドの含有比率（１μＬあたりのコピー数）は、表７に記載した。
＜前処理全血＞
全血１０μｌを７０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを７０μｌの希釈液２に加えた。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られた。この４μｌを全量、反応液に添加した。希釈液１及び希釈液２の組成は表８のとおりである。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図２〜図５を得た。図２〜図４は、試料として核酸混合液を含む試料ＩＤ：Ａ〜Ｃを用いた結果をそれぞれ示す。図５は試料として全血を用いた場合の結果を示す。また図２〜図５において、（Ａ）はＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を示し、（Ｂ）はＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の有無を示す。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
その結果、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の検出を確認した図２（Ａ）〜図５（Ａ）において、野生型（Ｃ／Ｃ）では４９℃にピークが観察され、変異型（Ａ／Ａ）では５８℃にピークが観察された。ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の検出を確認した図２（Ｂ）〜図５（Ｂ）において、野生型（Ｇ／Ｇ）では５１℃にピークが観察され、変異型（Ａ／Ａ）では５８℃にピークが観察された。変異型及び野生型を混合した試料液ＩＤ：Ｂでは、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型による５８℃と、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型による５８℃にそれぞれピークが観察された（図３参照）。
また、血液検体を試料とした場合でも、容易にＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型とを同時に検出できることが明らかとなった。
従って、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型とを同時に検出できることが明らかとなった。
また、血液検体を試料とした場合でも、容易にＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型とを同時に検出できることが明らかとなった。
従って、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型とＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型とを同時に検出できることが明らかとなった。
［実施例２］
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）の変異部位を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２３番目〜１４１番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ２蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ７を設計し、常法に従って作製した（表９）。標識化Ｃの標識は、常法に従ってＴＡＭＲＡを用いて行った。
また、配列番号１に示す塩基配列に基づき、配列番号１に示す配列の１３３番目の塩基に対応する塩基を有するＰ５プライマーの一例としてのプライマー、ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１０と、配列番号２に示す塩基配列に基づき、配列番号２に示す配列の１３３番目の塩基に対応する塩基を有し且つ、ミスマッチ塩基を含むＰ６プライマーとしてのプライマー、ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ＷＴ−Ｆ６を設計し、常法に従って作製した（表１０）。なお、表１０において下線は、ミスマッチ塩基を示す。また配列番号１の配列に基づき、リバース用のプライマー、ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ Ｒ−３を設計し、常法に従って製造した（表１０）。
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）の変異部位を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２３番目〜１４１番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ２蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ７を設計し、常法に従って作製した（表９）。標識化Ｃの標識は、常法に従ってＴＡＭＲＡを用いて行った。
また、配列番号１に示す塩基配列に基づき、配列番号１に示す配列の１３３番目の塩基に対応する塩基を有するＰ５プライマーの一例としてのプライマー、ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１０と、配列番号２に示す塩基配列に基づき、配列番号２に示す配列の１３３番目の塩基に対応する塩基を有し且つ、ミスマッチ塩基を含むＰ６プライマーとしてのプライマー、ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ−ＷＴ−Ｆ６を設計し、常法に従って作製した（表１０）。なお、表１０において下線は、ミスマッチ塩基を示す。また配列番号１の配列に基づき、リバース用のプライマー、ＡＬＫ Ｌ１１９６Ｍ Ｒ−３を設計し、常法に従って製造した（表１０）。
下記の試薬を用いて全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）でＰＣＲ及びＴｍ解析を行い、本発明の変異検出用の蛍光標識オリゴヌクレオチドによるプローブの性能を確認した。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５２℃で１５秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、ＰＣＲ後に９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）であった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
Ｔｍ解析は、ＰＣＲ後に９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）であった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
＜核酸混合液＞
核酸混合液は、実施例１で使用したものと同じプラスミド、Ｍｔ（Ｌ１１９６Ｍ）又はＷｔ（Ｌ１１９６Ｍ）を含む。サンプルＤ〜Ｇにおける核酸混合液中のプラスミドの含有比率（１μＬあたりのコピー数）は、表１２に記載した。
核酸混合液は、実施例１で使用したものと同じプラスミド、Ｍｔ（Ｌ１１９６Ｍ）又はＷｔ（Ｌ１１９６Ｍ）を含む。サンプルＤ〜Ｇにおける核酸混合液中のプラスミドの含有比率（１μＬあたりのコピー数）は、表１２に記載した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図６を得た。図６（Ａ）はサンプルＩＤ：Ｄを用いた結果を示し、図６（Ｂ）はサンプルＩＤ：Ｅを用いた結果を示し、図６（Ｃ）はサンプルＩＤ：Ｆを用いた結果を示し、図６（Ｄ）はサンプルＩＤ：Ｇを用いた結果を示す。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量／ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
図６に示されるように、野生型（Ｃ／Ｃ）では５４℃にピークが観察され、変異型（Ａ／Ａ）では６３℃にピークが観察された。
従って、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用すると共に、ミスマッチ塩基を含むプライマー（本実施例では野生型核酸配列増幅用のプライマー）を使用すると、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を、変異型０．３％含有比率（ｍｔ０．３％、２００００ｃｐ／ｔｅｓｔ）の場合でも、容易に且つ高特異的に検出できることが明らかとなった。
従って、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用すると共に、ミスマッチ塩基を含むプライマー（本実施例では野生型核酸配列増幅用のプライマー）を使用すると、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を、変異型０．３％含有比率（ｍｔ０．３％、２００００ｃｐ／ｔｅｓｔ）の場合でも、容易に且つ高特異的に検出できることが明らかとなった。
［比較例１］
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２６番目〜１４２番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応する塩基がシトシン以外であり、且つ５’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、３ＰＢ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１（配列番号２２）を設計し、常法に従って作製した（表１３参照）。
また鋳型核酸としては、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号２３）及び変異型（配列番号２４））を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表１４に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１（モル比、以下同じ）で混合したものを用いた。
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２６番目〜１４２番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応する塩基がシトシン以外であり、且つ５’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、３ＰＢ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１（配列番号２２）を設計し、常法に従って作製した（表１３参照）。
また鋳型核酸としては、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号２３）及び変異型（配列番号２４））を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表１４に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１（モル比、以下同じ）で混合したものを用いた。
下記の試薬を用いて全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）でＴｍ解析を行い、３ＰＢ−ＡＬＫＬ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ１の性能を確認した。なお、表１５中、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒは、ニッポンジーン社製を使用した。核酸混合液は、５μＭの鋳型オリゴヌクレオチドとなるように濃度に調整後、４μＬを反応液に添加した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、それぞれ３６５ｎｍ〜４１５ｎｍ、４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ（ＰＢ）であった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図７を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量／ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、四角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、菱形で表すパターンは、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、三角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドと変異型の鋳型オリゴヌクレオチドとを１：１混合したものを鋳型核酸として用いた場合の結果を示す。
図７において、野生型では５１℃にピークが観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型では５５℃にピークが観察された。野生型１００％の場合とＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型１００％の場合とでは、上述した計算値とは異なりＴｍ値の差は４℃しかなく、ピークを見分けにくかった。
また、変異型及び野生型の各鋳型オリゴヌクレオチド１：１を鋳型核酸とした場合には、５４℃にブロードなピークがひとつ観察されるだけであり、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の検出ができなかった。
また、変異型及び野生型の各鋳型オリゴヌクレオチド１：１を鋳型核酸とした場合には、５４℃にブロードなピークがひとつ観察されるだけであり、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の検出ができなかった。
［比較例２］
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２６番目〜１４２番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応する塩基以外となる５’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ５（配列番号２５）を設計し、常法に従って作製した（表１６参照）。
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、配列番号１に示す塩基配列の１２６番目〜１４２番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応する塩基以外となる５’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ５（配列番号２５）を設計し、常法に従って作製した（表１６参照）。
下記表１７の試薬を用いて全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）でＰＣＲ及びＴｍ解析を行い、プローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔ−Ｆ５の性能を確認した。鋳型核酸としては、実施例１で使用したものと同じプラスミドを含む核酸混合液を使用した。核酸混合液における各プラスミドのコピー数は、表１８の通りである。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５２℃で１５秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。プライマーとしては、実施例２で使用したものと同じものを用いた。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）であった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５２℃で１５秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。プライマーとしては、実施例２で使用したものと同じものを用いた。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）であった。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図８を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
図８に示されるように、実施例２で使用した高感度検出用のミスマッチ塩基を含むプライマーを使用しても、５４℃に一つのピークが観察されるだけであり、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の検出はできなかった。
図８に示されるように、実施例２で使用した高感度検出用のミスマッチ塩基を含むプライマーを使用しても、５４℃に一つのピークが観察されるだけであり、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の検出はできなかった。
［比較例３］
ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型を含む塩基配列（配列番号３）に基づき、配列番号３に示す塩基配列の２２９番目〜２４５番目の塩基に対応する塩基からなり、２５２番目の塩基に対応する塩基以外となる３’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｃ１１５６Ｙ−ｍｔ−Ｆ４（配列番号２６）を設計し、常法に従って作製した（表１９参照）。
また鋳型核酸としては、配列番号３又は配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号２７）及び変異型（配列番号２８））を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２０に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
上記のプローブ、鋳型核酸を使用し、励起波長及び検出波長をそれぞれ、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍとした以外は、比較例１と同様にＴｍ解析を行い、プローブの性能を確認した。
ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型を含む塩基配列（配列番号３）に基づき、配列番号３に示す塩基配列の２２９番目〜２４５番目の塩基に対応する塩基からなり、２５２番目の塩基に対応する塩基以外となる３’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｃ１１５６Ｙ−ｍｔ−Ｆ４（配列番号２６）を設計し、常法に従って作製した（表１９参照）。
また鋳型核酸としては、配列番号３又は配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号２７）及び変異型（配列番号２８））を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２０に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
上記のプローブ、鋳型核酸を使用し、励起波長及び検出波長をそれぞれ、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、５８５ｎｍ〜７００ｎｍとした以外は、比較例１と同様にＴｍ解析を行い、プローブの性能を確認した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図９を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、四角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、菱形で表すパターンは、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、三角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドと変異型の鋳型オリゴヌクレオチドとを１：１混合したものを鋳型核酸として用いた場合の結果を示す。
図９において、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型では６６℃にピークが観察されるものの、野生型のピークが検出されず、野生型及び変異型を混合したサンプルの場合にはピークが１つしか検出されなかった。このように、ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型の検出はできなかった。
［実施例３］
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２３番目〜１３８番目の塩基に対応する塩基からなり、１３８番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ３蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−Ｒ１：配列番号７）を設計し、常法に従って作製した（表２１）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号２９）及び変異型（配列番号３０）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２２に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
上記のプローブ、鋳型核酸を使用し、励起波長については５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長については５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
なお、表２２において「Ｓ」及び「Ｙ」は、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異以外の他の変異部位に相当する塩基であり、「Ｓ」は「ｇ又はｃ」を示し、「Ｙ」は「ｔ又はｃ」を意味する。
ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２３番目〜１３８番目の塩基に対応する塩基からなり、１３８番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ３蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−Ｒ１：配列番号７）を設計し、常法に従って作製した（表２１）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号２９）及び変異型（配列番号３０）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２２に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
上記のプローブ、鋳型核酸を使用し、励起波長については５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長については５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
なお、表２２において「Ｓ」及び「Ｙ」は、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異以外の他の変異部位に相当する塩基であり、「Ｓ」は「ｇ又はｃ」を示し、「Ｙ」は「ｔ又はｃ」を意味する。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図１０を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、四角で表すパターンは、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、三角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドと、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドとを１：１混合して用いたものを鋳型核酸として用いた場合の結果を示す。
図１０において、野生型では６０℃にピークが観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型では５４℃にピークが観察された。野生型と変異型１：１の混合液をサンプルとした場合でも、５４℃及び６０℃の２つのピークが区別可能に観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を良好に検出することができた。
［比較例４］
野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２３番目〜１３９番目の塩基に対応する塩基からなり、１３８番目の塩基に対応する塩基がシトシン以外の塩基であり且つ５’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−Ｆ５（配列番号３１）を設計し、常法に従って作製した（表２３参照）。
また鋳型核酸としては、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３２）及び変異型（配列番号３３））を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２４に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
上記プローブ及び鋳型核酸を使用した以外は、実施例３と同様にＴｍ解析を行い、プローブの性能を確認した。
野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２３番目〜１３９番目の塩基に対応する塩基からなり、１３８番目の塩基に対応する塩基がシトシン以外の塩基であり且つ５’末端のシトシンが蛍光標識されたプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−Ｆ５（配列番号３１）を設計し、常法に従って作製した（表２３参照）。
また鋳型核酸としては、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３２）及び変異型（配列番号３３））を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２４に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
上記プローブ及び鋳型核酸を使用した以外は、実施例３と同様にＴｍ解析を行い、プローブの性能を確認した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図１１を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量／ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、四角で表すパターンは、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、三角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドと変異型の鋳型オリゴヌクレオチドとを１：１混合したものを鋳型核酸として用いた場合の結果を示す。
図１１において、野生型では６６℃にピークが観察され、変異型では５５℃にピークが観察されたが、野生型と変異型１：１の混合液をサンプルとした場合には、プローブの反応性が弱く、変異型を示すピークを充分に検出することが困難であった。
［実施例４及び実施例５］
実施例４の、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２９番目〜１４５番目の塩基に対応する塩基からなり、１４５番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ７蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔＲ５：配列番号９）を設計し、常法に従って作製した（表２５）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３４）及び変異型（配列番号３５）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２６に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
実施例４の、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２９番目〜１４５番目の塩基に対応する塩基からなり、１４５番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ７蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔＲ５：配列番号９）を設計し、常法に従って作製した（表２５）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３４）及び変異型（配列番号３５）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２６に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
また、実施例５の、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１３３番目〜１４１番目の塩基に対応する塩基からなり、１４１番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有するＰ８蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ＷＴＦ１２：配列番号１０）を設計し、常法に従って作製した（表２７）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３６）及び変異型（配列番号３７）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２８に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３６）及び変異型（配列番号３７）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表２８に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
実施例４及び実施例５の各プローブ、それぞれの鋳型核酸及び以下の反応試薬を使用し、励起波長については５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長については５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。表２９中、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒは、ニッポンジーン社製を使用した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図１２（実施例４）及び図１３（実施例５）を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、四角で表すパターンは、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、三角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドと、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドとを１：１混合して用いたものを鋳型核酸として用いた場合の結果を示す。
実施例４では、図１２に示されるように、野生型では５４℃にピークが観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型では６４℃にピークが観察された。野生型と変異型１：１の混合液をサンプルとした場合でも、５３℃及び６３℃の２つのピークが区別可能に観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を良好に検出することができた。
実施例５では、図１３に示されるように、野生型では７０℃にピークが観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型では６０℃にピークが観察された。野生型と変異型１：１の混合液をサンプルとした場合でも、６０℃及び７０℃の２つのピークが区別可能に観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を良好に検出することができた。
実施例５では、図１３に示されるように、野生型では７０℃にピークが観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型では６０℃にピークが観察された。野生型と変異型１：１の混合液をサンプルとした場合でも、６０℃及び７０℃の２つのピークが区別可能に観察され、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型の有無を良好に検出することができた。
［比較例５及び比較例６］
比較例５の、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２４番目〜１３９番目の塩基に対応する塩基からなり、１３９番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔＦ９：配列番号３８）を設計し、常法に従って作製した（表３０）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３９）及び変異型（配列番号４０）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表３１に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
比較例５の、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１２４番目〜１３９番目の塩基に対応する塩基からなり、１３９番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、３Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ｍｔＦ９：配列番号３８）を設計し、常法に従って作製した（表３０）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号３９）及び変異型（配列番号４０）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表３１に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
なお、表３１において「Ｓ」及び「Ｒ」は、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異以外の他の変異部位に相当する塩基であり、「Ｓ」は「ｇ又はｃ」を示し、「Ｒ」は「ｇ又はａ」を意味する。
また比較例６の、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型を検出するためのプローブとして、野生型の塩基配列（配列番号２）に基づき、配列番号２に示す塩基配列の１１９番目〜１３６番目の塩基に対応する塩基からなり、１１９番目の塩基に対応し且つ蛍光標識されたシトシンを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであるプローブ、５Ｔ−ＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍ−ＷＴＦ１１：配列番号４１）を設計し、常法に従って作製した（表３２）。標識化シトシンの標識は、常法に従って行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号４２）及び変異型（配列番号４３）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表３３に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
比較例５及び比較例６のプローブ、それぞれの鋳型核酸を使用し、励起波長については５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長については５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した以外は、実施例４と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
また、鋳型核酸として、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド（野生型（配列番号４２）及び変異型（配列番号４３）を用いた。鋳型オリゴヌクレオチドの配列を表３３に示す。サンプルとしては、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみ、野生型の鋳型オリゴヌクレオチド及び変異型の鋳型オリゴヌクレオチドを１：１で混合したものを用いた。
比較例５及び比較例６のプローブ、それぞれの鋳型核酸を使用し、励起波長については５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長については５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した以外は、実施例４と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図１４（比較例５）及び図１５（比較例６）を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、四角で表すパターンは、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドのみを鋳型核酸として用いた場合の結果を示し、三角で表すパターンは、野生型の鋳型オリゴヌクレオチドと、変異型の鋳型オリゴヌクレオチドとを１：１混合して用いたものを鋳型核酸として用いた場合の結果を示す。
比較例５では、図１４に示されるように、野生型では５７℃、変異型では６０℃にピークが観察されたが、野生型及び変異型の混合液を用いた場合にも５９℃にひとつのピークしか観察されなかった。
また比較例６では、図１５に示されるように、野生型では６９℃、変異型では５９℃にピークが観察されたが、野生型及び変異型の混合液を用いた場合には、明瞭なピークは５９℃のピークのみであった。
従って、比較例５及び比較例６のプローブは、いずれもＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）の変異の検出には適さないことがわかった。
また比較例６では、図１５に示されるように、野生型では６９℃、変異型では５９℃にピークが観察されたが、野生型及び変異型の混合液を用いた場合には、明瞭なピークは５９℃のピークのみであった。
従って、比較例５及び比較例６のプローブは、いずれもＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）の変異の検出には適さないことがわかった。
このように本発明によれば、ＡＬＫ遺伝子の変異、即ち、ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）変異型及びＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）変異型を、同時に又は個別に感度よく簡便に検出することができる。
これにより、ＡＬＫ遺伝子変異に基づく薬剤、例えば、ＡＬＫ阻害剤を有効成分とする抗癌剤等の薬剤の薬効の判定を簡便に行うことが可能である。
これにより、ＡＬＫ遺伝子変異に基づく薬剤、例えば、ＡＬＫ阻害剤を有効成分とする抗癌剤等の薬剤の薬効の判定を簡便に行うことが可能である。
Claims (13)
- 下記オリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出するための変異検出用プローブ：
（Ｐ１） 配列番号５に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２） 配列番号６に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３） 配列番号７に示す塩基配列であり且つ、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４） 配列番号８に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７） 配列番号９に示す塩基配列であり且つ、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８） 配列番号１０に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。 - 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、請求項１記載の変異検出用プローブ。
- 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する請求項２に記載の変異検出用プローブ。
- 融解曲線分析用のプローブである請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の変異検出用プローブ。
- 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方の変異を検出することを含むＡＬＫ遺伝子の変異検出方法。
- 配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異、及び配列番号３に示す塩基配列の２４４番目の塩基における変異の少なくとも一方の変異を、同一の系で検出することを含む請求項５に記載の変異検出方法。
- （Ｉ）請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の変異検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（II）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（III）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（IV）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＬＫ遺伝子の変異の存在を検出することと、
を含む、請求項５又は請求項６に記載の変異検出方法。 - 更に、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む請求項７に記載の変異検出方法。
- 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の変異検出用プローブを用いて、配列番号１に示す塩基配列の１３３番目の塩基における変異を検出することを含み、更に、
以下のＰ５プライマー及びＰ６プライマーを使用して、核酸を増幅することを含む請求項７に記載の変異検出方法：
（Ｐ５） 配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー、
（Ｐ６） 配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー。 - 請求項５〜請求項９のいずれか１項に記載の変異検出方法により、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出すること、及び
検出された変異の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定すること、
を含む薬剤の薬効判定方法。 - 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の変異検出用プローブを含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出する変異検出用試薬キット。
- 以下のプライマーの少なくとも一方を更に含む請求項１１に記載の変異検出用試薬キット：
前記Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７又はＰ８のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマー、及び
前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマー。 - 下記のいずれかの蛍光標識オリゴヌクレオチド：
配列番号５に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号６に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号７に示す塩基配列であり且つ、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号８に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号９に示す塩基配列であり且つ、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
配列番号１０に示す塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
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