JP2012010698A - Ｖｋｏｒｃ１遺伝子の−１６３９番目の塩基の多型検出法、ならびにそのための核酸プローブおよびキット - Google Patents
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Abstract
【課題】VKORC1遺伝子の多型を検出する方法、およびそのためのキットを提供する。
【解決手段】VKORC1遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、特定の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は相同性を有し、塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなる多型検出用プローブ。VKORC1遺伝子の多型を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計し、該消光プローブを用いる融解曲線分析を行うことによる当該変異の検出。
【選択図】なし
【解決手段】VKORC1遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、特定の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は相同性を有し、塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなる多型検出用プローブ。VKORC1遺伝子の多型を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計し、該消光プローブを用いる融解曲線分析を行うことによる当該変異の検出。
【選択図】なし
Description
本発明は、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型検出法、ならびにそのための核酸プローブおよびキットに関する。
心筋梗塞や脳梗塞の患者に対して、血液の凝固を防止する薬剤として、ワーファリンが広く使用されている。ワーファリンの適量は、人種によって大きく異なり、さらに、同じ人種であっても、個人間で差が見られる。ワーファリンを大量に投与すると、例えば、鼻血や皮膚の内出血が生じたり、時には、脳内出血等の副作用を生じたりするおそれがある。このため、治療においてワーファリンの適切な量を患者ごとに決定することは極めて重要となっている。
このようなワーファリンの適量値を決定するにあたって、近年、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の多型がワーファリンの薬効に関係していることが報告されている（非特許文献１，２）。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、ワーファリン代謝酵素を作るチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子である。ＶＫＯＲＣ１遺伝子は、血液の凝固に関与するビタミンＫに作用するタンパク質をコードする遺伝子である。したがって、これら二つの遺伝子の多型を検出することは、患者に応じてワーファリンの適量を決定し、副作用を低減させるためにも非常に重要である。なお、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の多型としては、1173C>T（rs9934438）、-1639 G>A (rs9923231)などが知られている。このようなＶＫＯＲＣ１遺伝子の多型は、非特許文献３−５に記載されている。
塩基の多型を検出する方法としては、PCR-RFLP法（非特許文献３）またはパイロシーケンスにより変異を検出する方法がある（非特許文献４）。
しかしながら、非特許文献３のPCR-RFLP法は、DNAの抽出精製およびPCRを行った後、増幅産物に対して制限酵素処理し、電気泳動を行う必要があるなど、手間やコストを要する。また、PCRを行った後、増幅産物を処理する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、自動化が困難であり、複数の核酸配列を同時に検査することができないという問題点があった。
非特許文献４のパイロシーケンスはヌクレオチドがDNAに取り込まれるときに放出されるピロリン酸をATPに変化させて発光反応に用いることで、ヌクレオチドがどれくらいDNAに取り込まれたかを定量できるという原理に基づいている。実際にはデオキシリボヌクレオチドを1種類ずつ加えて発光量を測定しては除去することを繰り返すことで、配列を決定する。余剰ヌクレオチドの除去には、鋳型のDNAを何らかの固相の基質に結合させておき、反応液を洗い流して除去する固相化法とアピラーゼを加えてヌクレオチドを分解する液相法がある。このように複雑な作業を自動で行うためのシステムが発売されているが、非常に高価でありコストを要する。また、DNAの抽出精製、前処理を行わなければならないなど、手間やコストを要するという問題点があった。
しかしながら、非特許文献３のPCR-RFLP法は、DNAの抽出精製およびPCRを行った後、増幅産物に対して制限酵素処理し、電気泳動を行う必要があるなど、手間やコストを要する。また、PCRを行った後、増幅産物を処理する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、自動化が困難であり、複数の核酸配列を同時に検査することができないという問題点があった。
非特許文献４のパイロシーケンスはヌクレオチドがDNAに取り込まれるときに放出されるピロリン酸をATPに変化させて発光反応に用いることで、ヌクレオチドがどれくらいDNAに取り込まれたかを定量できるという原理に基づいている。実際にはデオキシリボヌクレオチドを1種類ずつ加えて発光量を測定しては除去することを繰り返すことで、配列を決定する。余剰ヌクレオチドの除去には、鋳型のDNAを何らかの固相の基質に結合させておき、反応液を洗い流して除去する固相化法とアピラーゼを加えてヌクレオチドを分解する液相法がある。このように複雑な作業を自動で行うためのシステムが発売されているが、非常に高価でありコストを要する。また、DNAの抽出精製、前処理を行わなければならないなど、手間やコストを要するという問題点があった。
一方、変異を含む領域をPCRで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（特許文献１，２）。しかしながら、これらの文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのGとCのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。
特許文献３には、５’末端を蛍光標識したプローブを使用して、融解曲線分析により、
VKORC1 1173C>T（rs9934438）とCYP2C9*3を同時に検出する方法が記載されている。しかしながら、VKORC1-1639 G>A (rs9923231)の多型を検出する方法は記載されていない。また、VKORC1-1639 G>A (rs9923231)の多型とCYP2C9*3変異部位の多型を同時に検出する方法も記載されていない。
VKORC1 1173C>T（rs9934438）とCYP2C9*3を同時に検出する方法が記載されている。しかしながら、VKORC1-1639 G>A (rs9923231)の多型を検出する方法は記載されていない。また、VKORC1-1639 G>A (rs9923231)の多型とCYP2C9*3変異部位の多型を同時に検出する方法も記載されていない。
Simone Rost et al., Nature Vol.427 2004 letters to nature
Mark J. Rieder et al., The New England Journal of Medicine 352; 22, 2005
TDM研究 Vol. 25 No. 4（2008） 141-144
BLOOD, 1 SEPTEMBER 2007 VOLUME 110, NUMBER 5
Genet Med. 2008 Feb; 10(2): 89-98
本発明は、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出するのに有効な消光プローブを特定し、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出する方法、およびそのためのキットを提供することを課題とする。
本発明者は、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計し、該消光プローブを用いる融解曲線分析を行うことにより当該変異を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出するためのプローブであって、配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号80〜89を含む10〜50塩基長の塩基配列であり、配列番号1または2における80番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号1または2に相同性を有し、塩基番号80に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
（２）前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号80に対応する塩基を5’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、（１）に記載の多型検出用プローブ。
（３）前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号80に対応する塩基を5’末端に有する、（１）に記載の多型検出用プローブ。
（４）前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（５）前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、（４）に記載の多型検出用プローブ。
（６）前記オリゴヌクレオチドの塩基長が10〜40である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（７）前記オリゴヌクレオチドの塩基長が15〜30である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（８）前記オリゴヌクレオチドの塩基長が15〜25である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（９）前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（１０）前記オリゴヌクレオチドが配列番号６で示される、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の多型検出プローブ。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるVKORC1遺伝子近傍領域の多型検出方法。
（１２）（Ｉ）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッド形成体を得ること、
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を決定すること、並びに
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、VKORC1遺伝子における多型の存在または多型を有する核酸の存在比を決定すること、を含む、（11）に記載の多型検出方法。
（１３）さらに、前記工程（Ｉ）の前または工程（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、（12）に記載の多型検出方法。
（１４）ワーファリンの適量を判断する方法であって、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の多型検出方法により、VKORC1遺伝子近傍領域における多型を検出すること、および、検出された多型の有無に基づいて、ワーファリンの適量を判断することを含む、方法。
（１５）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用キット。
（１６）配列番号1に示す塩基配列において、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、（１５）に記載の多型検出用キット。
（１７）前記プライマーが配列番号3と4に記載のプライマーである、（１６）に記載の多型検出キット。
（１８）さらに、配列番号8, 9に記載のプライマーおよび配列番号10に記載のプローブを含む、（１６）または（１７）に記載の多型検出用キット。
なお、上記においてVKORC1遺伝子の多型とは同遺伝子の近傍領域の多型をも含む。
（１）VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出するためのプローブであって、配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号80〜89を含む10〜50塩基長の塩基配列であり、配列番号1または2における80番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号1または2に相同性を有し、塩基番号80に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
（２）前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号80に対応する塩基を5’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、（１）に記載の多型検出用プローブ。
（３）前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号80に対応する塩基を5’末端に有する、（１）に記載の多型検出用プローブ。
（４）前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（５）前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、（４）に記載の多型検出用プローブ。
（６）前記オリゴヌクレオチドの塩基長が10〜40である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（７）前記オリゴヌクレオチドの塩基長が15〜30である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（８）前記オリゴヌクレオチドの塩基長が15〜25である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（９）前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
（１０）前記オリゴヌクレオチドが配列番号６で示される、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の多型検出プローブ。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるVKORC1遺伝子近傍領域の多型検出方法。
（１２）（Ｉ）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッド形成体を得ること、
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を決定すること、並びに
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、VKORC1遺伝子における多型の存在または多型を有する核酸の存在比を決定すること、を含む、（11）に記載の多型検出方法。
（１３）さらに、前記工程（Ｉ）の前または工程（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、（12）に記載の多型検出方法。
（１４）ワーファリンの適量を判断する方法であって、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の多型検出方法により、VKORC1遺伝子近傍領域における多型を検出すること、および、検出された多型の有無に基づいて、ワーファリンの適量を判断することを含む、方法。
（１５）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用キット。
（１６）配列番号1に示す塩基配列において、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、（１５）に記載の多型検出用キット。
（１７）前記プライマーが配列番号3と4に記載のプライマーである、（１６）に記載の多型検出キット。
（１８）さらに、配列番号8, 9に記載のプライマーおよび配列番号10に記載のプローブを含む、（１６）または（１７）に記載の多型検出用キット。
なお、上記においてVKORC1遺伝子の多型とは同遺伝子の近傍領域の多型をも含む。
本発明のプローブを遺伝子増幅系中に添加しておくことで、PCR反応終了後、融解曲線分析（Tm解析）を行うだけで、複数の遺伝子変異型のタイピングが可能となる。さらに、全血や口腔粘膜懸濁液を直接検査することが可能であるため、手間やコストを低減することができる。
本発明のプローブは、特異性が高く、検出感度が高い。
本発明の方法を用いることにより、PCRを行う場合であっても、増幅産物を取り出す必要がないため、コンタミネーションの危険性がほぼ無い。また、本発明の方法は、機構が簡単なので自動化が容易である。
本発明の方法により、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型とＣＹＰ２Ｃ９＊３変異部位の多型とを同時に検出することもできる。
本発明のプローブは、特異性が高く、検出感度が高い。
本発明の方法を用いることにより、PCRを行う場合であっても、増幅産物を取り出す必要がないため、コンタミネーションの危険性がほぼ無い。また、本発明の方法は、機構が簡単なので自動化が容易である。
本発明の方法により、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型とＣＹＰ２Ｃ９＊３変異部位の多型とを同時に検出することもできる。
＜１＞本発明プローブおよび本発明検出方法
本発明のプローブは、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出するためのプローブであって、配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号80〜89を含む10〜50塩基長の塩基配列であり、配列番号1または2における80番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号1または2に相同性を有し、塩基番号80に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。ここで、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基は、配列番号１，２の８８番目の塩基である。
本発明のプローブは、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出するためのプローブであって、配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号80〜89を含む10〜50塩基長の塩基配列であり、配列番号1または2における80番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号1または2に相同性を有し、塩基番号80に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。ここで、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基は、配列番号１，２の８８番目の塩基である。
本発明プローブは、配列番号１に示す塩基配列（VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基における野生型の塩基を有する配列）または配列番号２に示す塩基配列（VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基における変異型（多型）の塩基を有する配列）において上記特定された配列を有する他は、特許文献１，２に記載された消光プローブと同様にして作製できる。なお、本発明の配列番号１に示す配列は、GeneBankのアクセッションナンバーNG_011564の３５０１番目から３６８０番目である。本発明のプローブの長さとしては、１０〜５０塩基長、好ましくは１０〜４０塩基長、より好ましくは１５〜３０、最も好ましくは１５〜２５である。
本発明に使用されるプローブの塩基配列の例としては、5'-cattggccrggtgcggt-3'（配列番号５）が挙げられる。配列中、“ｒ”はaまたはgを表す。より好ましくは、5'-cattggccaggtgcggt-3'（配列番号６）である。
蛍光色素としては、特許文献１，２に記載されたものが使用できるが、具体例としては、Pacific Blue(商標)、FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY(商標) FL等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１，２に記載
の方法に従って行うことができる。
本発明に使用されるプローブの塩基配列の例としては、5'-cattggccrggtgcggt-3'（配列番号５）が挙げられる。配列中、“ｒ”はaまたはgを表す。より好ましくは、5'-cattggccaggtgcggt-3'（配列番号６）である。
蛍光色素としては、特許文献１，２に記載されたものが使用できるが、具体例としては、Pacific Blue(商標)、FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY(商標) FL等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１，２に記載
の方法に従って行うことができる。
本願における「相同性」とは、特定の塩基配列において、塩基配列に８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する配列を有している塩基配列をさす。すなわち、本発明のプローブは、配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号８０から８９を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に相同的な配列であるが、完全に同一ではなく、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基、または１塩基のみ異なっていてもよい。
本発明プローブは、標的配列にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の蛍光が減少または増加することが好ましい。本発明プローブは、好ましくは、ハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の蛍光が消光する、消光プローブである。
また、本発明プローブは、５’または３’が蛍光色素により標識化されていることが好ましい。
なお、本明細書において、「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、５’末端を１番目として数え、「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、３’末端を１番目として数える。
本発明プローブは、標的配列にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の蛍光が減少または増加することが好ましい。本発明プローブは、好ましくは、ハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の蛍光が消光する、消光プローブである。
また、本発明プローブは、５’または３’が蛍光色素により標識化されていることが好ましい。
なお、本明細書において、「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、５’末端を１番目として数え、「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、３’末端を１番目として数える。
本実施例の表２に示されるように、配列番号６のオリゴヌクレオチドを用いることにより、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出することができる。
本発明検出方法は、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて多型を検出する方法であって、核酸プローブは本発明プローブであることを特徴とする。
本発明検出方法は、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型の部位を含む領域を増幅すること、および、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅および融解曲線分析（Tm分析）の方法に従って行うことができる。
本発明の検出方法は、好ましくは、本発明のプローブを使用し、以下の工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加して前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から目的の多型の有無または多型を有する塩基配列の存在比を決定する工程。
（Ｉ）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加して前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から目的の多型の有無または多型を有する塩基配列の存在比を決定する工程。
本発明検出方法は、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅および融解曲線分析（Tm分析）の方法に従って行うことができる。また、本発明の検出方法は、前記工程（Ｉ）の前または工程（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含んでいてもよい。
核酸増幅の方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、PCR、ICAN、LAMP等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのTm値を解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
本発明において、試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次のハイブリダイズ工程において、検出用プローブとのハイブリダイズが可能となる。
本発明において、前記試料中のＤＮＡに対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、試料中のＤＮＡに対して１倍以下が好ましく、０．３倍以下がより好ましい。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象ＤＮＡと前記多型が発生していない非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける前記検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象ＤＮＡ（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１００倍以下となることが好ましく、より好ましくは５０倍以下、さらに、好ましくは３０倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．２倍以上である。
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであってＤＮＡとプローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ、または標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さないか、シグナルが弱いが、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示すようになるか、シグナルが増加する。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化をシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりであるが蛍光色素標識化プローブが好ましい。
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸としては、核酸を含んでいればよく、特に制限されないが、例えば、血液、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものである。鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
以下、PCRを用いる場合を例として、さらに説明する。PCRに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のPCRにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さおよびTm値は、通常には、12mer〜40merで40〜70℃、好ましくは16mer〜30merで55〜60℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのTmはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Tm値は最近接塩基対(Nearest Neighbor)法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号３，４に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
PCRは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を取り扱う操作を行うことなくTm分析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのTm値やPCRの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常25〜50回繰り返す。
(1) 変性、90〜98℃、1〜60秒
(2) アニーリング、50〜70℃、10〜60秒
(3) 伸長、60〜75℃、10〜180秒
(1) 変性、90〜98℃、1〜60秒
(2) アニーリング、50〜70℃、10〜60秒
(3) 伸長、60〜75℃、10〜180秒
アニーリングおよび伸長を一ステップで行う場合には、55〜70℃、10〜180秒の条件が
挙げられる。
挙げられる。
Tm分析は、本発明プローブの蛍光色素の蛍光を測定する他は通常の方法に従って行うことができる。蛍光の測定は、蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光波長の光を測定することに行うことができる。Tm分析における昇温速度は、通常には、0.1〜1℃／秒である。Tm分析を行うときの反応液の組成は、プローブとその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されないが、通常には、一価の陽イオン濃度が1.5〜5 mM、pHが７〜９である。PCR等のDNAポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、通常、この条件を満たすので、増幅後の反応液をそのままTm分析に用いることができる。
Tm分析の結果に基づくVKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出を包含する。
なお、本発明のプローブおよび方法により、変異の有無の検出が可能であるため、変異の有無に基づいて、ワーファリンの適量を判断することも本発明に含まれる。具体的には、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基がＡとなっている場合には、ワーファリンに対する感受性が高く、必要投与量が減少することが示唆される。また、本発明の方法により、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型とＣＹＰ２Ｃ９＊３変異部位の多型とを同時に検出することも可能であり、ＣＹＰ２Ｃ９＊３の変異がある場合も同様に、ワーファリンに対する感受性が高く、必要投与量が減少することが示唆される。
なお、CYP2C9の多型であるCYP2C9*3の遺伝子配列及びその変異部位の多型を検出することが可能なプローブの塩基配列は、例えば、ＷＯ２００８／０６６１６３、ＷＯ２００８／１１７７８２などに記載されている。具体的には、３’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、ＷＯ２００８／０６６１６３の配列番号28又は29（ＷＯ２００８／１１７７８２の配列番号44又は45）の塩基配列からなる核酸プローブである。
本発明のVKORC1遺伝子の多型と同時にCYP2C9*3変異部位の多型とを同時に検出（すなわち、同一の系で検出）を行なうことができるプローブとしては、上記ＷＯ２００８／０６６１６３及びＷＯ２００８／１１７７８２に記載の核酸プローブが挙げられる。
なお、本発明のプローブおよび方法により、変異の有無の検出が可能であるため、変異の有無に基づいて、ワーファリンの適量を判断することも本発明に含まれる。具体的には、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基がＡとなっている場合には、ワーファリンに対する感受性が高く、必要投与量が減少することが示唆される。また、本発明の方法により、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型とＣＹＰ２Ｃ９＊３変異部位の多型とを同時に検出することも可能であり、ＣＹＰ２Ｃ９＊３の変異がある場合も同様に、ワーファリンに対する感受性が高く、必要投与量が減少することが示唆される。
なお、CYP2C9の多型であるCYP2C9*3の遺伝子配列及びその変異部位の多型を検出することが可能なプローブの塩基配列は、例えば、ＷＯ２００８／０６６１６３、ＷＯ２００８／１１７７８２などに記載されている。具体的には、３’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、ＷＯ２００８／０６６１６３の配列番号28又は29（ＷＯ２００８／１１７７８２の配列番号44又は45）の塩基配列からなる核酸プローブである。
本発明のVKORC1遺伝子の多型と同時にCYP2C9*3変異部位の多型とを同時に検出（すなわち、同一の系で検出）を行なうことができるプローブとしては、上記ＷＯ２００８／０６６１６３及びＷＯ２００８／１１７７８２に記載の核酸プローブが挙げられる。
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が変化する核酸プローブ（好ましくは、消光プローブ）であって、上記オリゴヌクレオチドからなる核酸プローブを含むことを特徴とする。なお、本発明のキットは、ワーファリンの適量を判断するのにも使用できる。
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が変化する核酸プローブ（好ましくは、消光プローブ）であって、上記オリゴヌクレオチドからなる核酸プローブを含むことを特徴とする。なお、本発明のキットは、ワーファリンの適量を判断するのにも使用できる。
プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
本発明検出キットは、プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にDNAポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
本発明検出キットにおいてプローブ、プライマーおよびその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例1（シングル、精製ゲノム）
VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型の部位を含む塩基配列（配列番号１（野生型））に基づき、多型の部位を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表２中、ＦプライマーおよびＲプライマーの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。プローブ１の位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。
次に、表２に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表２中、プローブ１の位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。３’末端のPは、リン酸化されていることを示す。TAMRAによる標識は、常法に従って行った。
VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型の部位を含む塩基配列（配列番号１（野生型））に基づき、多型の部位を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表２中、ＦプライマーおよびＲプライマーの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。プローブ１の位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。
次に、表２に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表２中、プローブ１の位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。３’末端のPは、リン酸化されていることを示す。TAMRAによる標識は、常法に従って行った。
融解温度（Ｔｍ）は、http://www.m-neko.net/tm_calc/のNearest Neighbor method、primer conc. 250nM、Na+ conc.50mMで計算した。
サンプルとして全血から精製したヒトゲノム（100コピー/反応液）（表4のヒトゲノム１および２）を用い、全自動SNPs検査装置（商品名i-densy（商標）、アークレイ社製）を用いてPCRおよびTm分析を行った。PCRおよびTm分析の条件は表5の通り、ＰＣＲ反応液組成は表3の通りである。
Tm分析における励起波長および検出波長は、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）であった。
Tm分析における励起波長および検出波長は、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）であった。
表２のプローブを用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ヒトゲノム１については、TAMRAのピークが５６℃および６４℃付近に見られ、ヒトゲノム２については、TAMRAのピークが６４℃付近に見られた（図１）。
実施例2（シングル、全血）
サンプルとして全血を用い、その他は実施例1と同様に反応させた。
サンプルとして全血を用い、その他は実施例1と同様に反応させた。
表２のプローブを用いてPCRおよびTm分析を行った結果、実施例１と同様に、ヒトゲノム１については、TAMRAのピークが５６℃および６４℃付近に見られ、ヒトゲノム２については、TAMRAのピークが６４℃付近に見られた（図２）。
比較例
表6のＰＣＲ反応液組成を用い、その他は実施例1と同様に反応させた。
表6のＰＣＲ反応液組成を用い、その他は実施例1と同様に反応させた。
表７のプローブを用いてPCRおよびTm分析を行った結果、ヒトゲノム１および２について、TAMRAのピークがともに５９℃付近に見られるのみであり、ヘテロとホモを見分けることはできなかった（図３）。従って、プローブの５’または３’末端のＣが蛍光標識されていればどんなプローブ配列でもよいというわけではなく、配列番号６のプローブのように、８０番目のＣが蛍光標識されていることが重要であることが理解される。
実施例１，２および比較例の結果より、配列番号６のプローブを用いたとき、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型について、Tm分析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、この変異についてヘテロ接合体であるヒトゲノム１は５６℃および６４℃付近に２つのピークを有し、変異型であるヒトゲノム２は６４℃付近に１つのみピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。また、これらの結果から、この変異について野生型であるヒトゲノムで反応させた場合は、５６℃付近に１つのみピークを有することが分かる。
従って、配列番号６のプローブを用いることにより、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出することができる。
従って、配列番号６のプローブを用いることにより、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出することができる。
実施例３（マルチ、精製ゲノム）
表８のＰＣＲ反応液組成を用い、その他は実施例1と同様に反応させた。
Tm分析における励起波長および検出波長は、それぞれ420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）、または、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）であった。
表８のＰＣＲ反応液組成を用い、その他は実施例1と同様に反応させた。
Tm分析における励起波長および検出波長は、それぞれ420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）、または、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）であった。
なお、上記CYP2C9*3プローブ１は、ＷＯ２００８／０６６１６３の配列番号２９、ＷＯ２００８／１１７７８２の配列番号４５に記載された塩基配列からなる。
ＴＡＭＲＡの蛍光により評価を行った結果、ヒトゲノム１については、TAMRAのピークが５２℃および６０℃付近に見られ、ヒトゲノム２については、TAMRAのピークが６０℃付近に見られた（図４）。また、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの蛍光により評価を行った結果、ヒトゲノム１については、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬのピークが４９℃付近に見られ、ヒトゲノム２については、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬのピークが４９℃および５６℃付近に見られた（図５）。
実施例4（マルチ、全血）
サンプルとして全血を用い、その他は実施例3と同様に反応させた。なお、全血は下記の前処理を行ったものを用いた。
全血10μlを下記希釈液(1) 70μlに加え、よく混合した後、この混合液10μlを下記希釈液(2) 70μlに加えた。この混合液17μlを95℃10分で加熱して4μlの前処理済全血を得、これをサンプルとして用いた。
希釈液(1)
10mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA(pH8.0)
0.3%(v/v)SDS
希釈液(2)
10mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA(pH8.0)
サンプルとして全血を用い、その他は実施例3と同様に反応させた。なお、全血は下記の前処理を行ったものを用いた。
全血10μlを下記希釈液(1) 70μlに加え、よく混合した後、この混合液10μlを下記希釈液(2) 70μlに加えた。この混合液17μlを95℃10分で加熱して4μlの前処理済全血を得、これをサンプルとして用いた。
希釈液(1)
10mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA(pH8.0)
0.3%(v/v)SDS
希釈液(2)
10mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA(pH8.0)
ＴＡＭＲＡの蛍光により評価を行った結果、実施例３と同様に、ヒトゲノム１については、TAMRAのピークが５１℃および６０℃付近に見られ、ヒトゲノム２については、TAMRAのピークが６０℃付近に見られた（図６）。また、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの蛍光により評価を行った結果、ヒトゲノム１については、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬのピークが４９℃付近に見られ、ヒトゲノム２については、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬのピークが４９℃および５６℃付近に見られた（図７）。
実施例３，４の結果より、配列番号６のプローブを用いたとき、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型について、Tm分析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、この変異についてヘテロ接合体であるヒトゲノム１は５２℃および６０℃付近に２つのピークを有し、変異型であるヒトゲノム２は６０℃付近に１つのみピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。また、これらの結果から、この変異について野生型であるヒトゲノムで反応させた場合は、５２℃付近に１つのみピークを有することが分かる。
さらに、CYP2C9*3変異部位の多型についても、Tm分析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、この変異について野生型であるヒトゲノム１は４９℃付近に１つのみピークを有し、ヘテロ接合型であるヒトゲノム２は４９℃および５６℃付近に２つのピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。また、これらの結果から、この変異について変異型であるヒトゲノムで反応させた場合は、５６℃付近に１つのみピークを有することが分かる。
従って、配列番号６，１０のプローブを同時に用いることにより、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型およびCYP2C9*3変異部位の多型を同時に検出することができる。
さらに、CYP2C9*3変異部位の多型についても、Tm分析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、この変異について野生型であるヒトゲノム１は４９℃付近に１つのみピークを有し、ヘテロ接合型であるヒトゲノム２は４９℃および５６℃付近に２つのピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。また、これらの結果から、この変異について変異型であるヒトゲノムで反応させた場合は、５６℃付近に１つのみピークを有することが分かる。
従って、配列番号６，１０のプローブを同時に用いることにより、VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型およびCYP2C9*3変異部位の多型を同時に検出することができる。
Claims (18)
- VKORC1遺伝子の-1639番目の塩基の多型を検出するためのプローブであって、配列番号１または２に示す塩基配列において塩基番号80〜89を含む10〜50塩基長の塩基配列であり、配列番号1または2における80番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号1または2に相同性を有し、塩基番号80に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号80に対応する塩基を5’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号80に対応する塩基を5’末端に有する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項４に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドの塩基長が10〜40である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドの塩基長が15〜30である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドの塩基長が15〜25である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
- 前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドが配列番号６で示される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多型検出プローブ。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるVKORC1遺伝子近傍領域の多型検出方法。
- （Ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッド形成体を得ること、
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を決定すること、並びに
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、VKORC1遺伝子における多型の存在または多型を有する核酸の存在比を決定すること、を含む、請求項11に記載の多型検出方法。 - さらに、前記工程（Ｉ）の前または工程（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、請求項12に記載の多型検出方法。
- ワーファリンの適量を判断する方法であって、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の多型検出方法により、VKORC1遺伝子近傍領域における多型を検出すること、および、検出された多型の有無に基づいて、ワーファリンの適量を判断することを含む、方法。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用キット。
- 配列番号1に示す塩基配列において、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、請求項１５に記載の多型検出用キット。
- 前記プライマーが配列番号3と4に記載のプライマーである、請求項１６に記載の多型検出キット。
- さらに、配列番号8, 9に記載のプライマーおよび配列番号10に記載のプローブを含む、請求項１６または１７に記載の多型検出用キット。
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