KR101798874B1

KR101798874B1 - 변이 검출용 프로브, 변이 검출 방법, 약효 판정 방법 및 변이 검출용 키트

Info

Publication number: KR101798874B1
Application number: KR1020130112031A
Authority: KR
Inventors: 가오루 구로세
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2017-11-17
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: EP2711435B1; JP6205216B2; EP2711435A1; JP2014076044A; CN103667443A; US20140087380A1; KR20140040022A; US9315871B2; CN103667443B

Abstract

본 발명은, ALK 유전자의 변이, 특히 ALK(L1196M) 변이형 및 ALK(C1156Y) 변이형을 간편하게 검출하는 변이 검출용 프로브를 제공하는 것을 과제로 한다.
이 과제를 해결하기 위해, P1∼P4, P7 및 P8로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ALK 유전자의 변이를 검출하기 위한 변이 검출용 프로브.

Description

변이 검출용 프로브, 변이 검출 방법, 약효 판정 방법 및 변이 검출용 키트{PROBE FOR DETECTING MUTATION, METHOD FOR DETECTING MUTATION, METHOD FOR DETERMINING DRUG EFFICACY AND KIT FOR DETECTING MUTATION}

본 발명은, 변이 검출용 프로브, 변이 검출 방법, 약효 판정 방법 및 변이 검출용 키트에 관한 것이다.

폐암의 발증 원인의 하나로 유전자 변이를 들 수 있다. 이 때문에, 폐암의 발증에 관련된다고 생각되고 있는 유전자의 특정이 진행되고 있다. 이러한 폐암의 발증에 관련된다고 생각되고 있는 유전자 변이로서는, EGFR 유전자 변이와, ALK 유전자 변이를 들 수 있다.

ALK(anaplastic lymphoma kinase : 미분화 임파종 키나아제)의 유전자는, 수용체형 티로신키나아제를 코드하는 유전자이며, 2번 염색체 내에서 역위를 일으키면, EML4 유전자와 융합하는 것이 알려져 있다. 이 융합 유전자(EML4-ALK)에 의해, 항상적으로 활성화된 티로신키나아제가 산생되어, 폐선암을 발증한다고 생각되고 있다. 이것으로부터, 폐암 치료의 분야에서의 ALK 저해제의 사용이 시험되고 있다. 이러한 ALK 저해제로서는, 크리조티닙(crizotinib)이 알려져 있다.

그러나, 크리조티닙에 대해서, 초기에는 일정한 치료적 효과가 인정되지만, 점차 약제의 효과가 기대된 이상으로 오르지 않게 되는 경우가 있다.

이러한 저해 활성의 발현에 대해서는, EML4-ALK 내에 생긴 2개의 유전자 변이, 즉, ALK 유전자의 아미노산 서열 중 1156번째의 시스테인이 티로신으로 치환한 변이(이하, 「ALK(C1156Y)」라고 하는 경우가 있음)와, ALK 유전자의 아미노산 서열 중 1196번째의 류신이 메티오닌으로 치환한 변이(이하, 「ALK(L1196M)」라고 하는 경우가 있음)가 관여하고 있는 것을 알아냈다(비특허문헌 1 참조). 이들의 유전자 변이는, EML4-ELK 내의 크리조티닙 결합 포켓 부위에 생기고, 그 결과, 결합 포켓의 형상을 변화시켜, 크리조티닙과 EML4-ALK의 결합 친화성을 저하시킨다는 공통된 특성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 이것으로부터, ALK 저해제를 사용하는 것에 있어서, 그 효과를 예측하기 위한 예측 인자로서, 이들의 ALK 유전자 변이의 유무를 검출하는 것이 중요해졌다.

한편, 최근, 유전자 변이를 검출하는 검출 시험으로서, 융해 곡선 분석(Tm 분석)을 이용한 검출이 행해지고 있다. 이 방법으로는, 변이를 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 염기 서열의 변이를 해석한다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).

일본국 특개2002-119291호 공보

New England Journal of Medicine, Vol.363, pp.1734-1739(2010)

비특허문헌 1에서는, 각각의 유전자 변이를, 각각의 서열에 의거하여 직접적으로 검출하는, 소위 다이렉트 시퀀스법으로 검출하고 있지만, DNA의 추출 정제 및 PCR을 행한 후, 시퀀스 반응을 행하고, 시퀀서로 전기 영동을 행해야 하는 등 수고 또는 비용을 요한다. 또한 증폭 산물이 다른 반응을 오염할(컨태미네이션) 우려가 있다. 또한 자동화가 곤란하며, 복수의 핵산 서열을 동시에 검사할 수 없다.

특허문헌 1에는, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 표적 핵산에 하이브리다이제이션시켜, 형광 색소의 발광의 감소량을 측정하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 표적 핵산에 하이브리다이제이션시켜, 형광 색소의 발광의 감소량 측정을 실시하는 것에 있어서 어느 임의 서열에서 실시할 수 있는 것은 아니며, 변이마다 적정한 서열을 찾을 필요가 있다.

이들의 현상에 의거하여, ALK 저해제의 효과를 예측하는 등의 목적을 위해 ALK(L1196M) 변이형 및 ALK(C1156Y) 변이형의 ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하기 위해 효과적인 기술 개발이 요망되고 있었다.

본 발명은, ALK 유전자에 있어서의 변이를 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 변이 검출용 프로브, 이것을 사용한 변이 검출 방법 및 약효 판정 방법, 및 변이 검출용 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 이하와 같다.

[1] 하기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하기 위한 변이 검출용 프로브 :

(P1) 서열 번호5에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P2) 서열 번호6에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P3) 서열 번호7에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P4) 서열 번호8에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P7) 서열 번호9에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P8) 서열 번호10에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

[2] 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때의 형광 강도가, 하이브리다이즈하지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 감소하거나 또는 증가하는, [1] 기재의 변이 검출용 프로브.

[3] 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때의 형광 강도가, 하이브리다이즈하지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 감소하는 [2]에 기재된 변이 검출용 프로브.

[4] 융해 곡선 분석용의 프로브인 [1]∼[3]의 어느 하나에 기재된 변이 검출용 프로브.

[5] [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 변이 검출용 프로브를 사용하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 133번째의 염기에 있어서의 변이, 및 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 244번째의 염기에 있어서의 변이의 적어도 한쪽의 변이를 검출하는 것을 포함하는 ALK 유전자의 변이 검출 방법.

[6] 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 133번째의 염기에 있어서의 변이, 및 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 244번째의 염기에 있어서의 변이의 적어도 한쪽의 변이를, 동일한 계에서 검출하는 것을 포함하는 [5]에 기재된 변이 검출 방법.

[7] (Ⅰ) [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 변이 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과,

(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시키는 것에 의해, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과,

(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm치를 측정하는 것과,

(Ⅳ) 상기 Tm치에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, ALK 유전자의 변이의 존재를 검출하는 것

을 포함하는, [5] 또는 [6]에 기재된 변이 검출 방법.

[8] 상기 (Ⅰ)의 하이브리드를 얻기 전 또는 상기 (Ⅰ)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는 [7]에 기재된 변이 검출 방법.

[9] [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 변이 검출용 프로브를 사용하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 133번째의 염기에 있어서의 변이를 검출하는 것을 포함하고, 또한,

이하의 P5 프라이머 및 P6 프라이머를 사용하여, 핵산을 증폭하는 것을 포함하는 제7항에 기재된 변이 검출 방법 :

(P5) 서열 번호14에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머,

(P6) 서열 번호15에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머.

[10] [5]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 변이 검출 방법에 의해, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 것, 및, 검출된 변이의 유무에 의거하여 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 약제의 약효 판정 방법.

[11] [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 변이 검출용 프로브를 포함하는, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 변이 검출용 시약 키트.

[12] 이하의 프라이머의 적어도 한쪽을 더 포함하는 [11]에 기재된 변이 검출용 키트 :

상기 P1, P2, P3, P7 또는 P8의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머, 및

상기 P4의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머.

[13] 하기 중 어느 하나의 형광 표지 올리고뉴클레오티드 :

서열 번호5에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

서열 번호6에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

서열 번호7에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

서열 번호8에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

서열 번호9에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

서열 번호10에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

본 발명에 의하면, ALK 유전자에 있어서의 변이를 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 ALK 유전자의 변이 검출용 프로브, 이것을 사용한 변이 검출 방법 및 약효 판정 방법, 및 변이 검출용 키트를 제공할 수 있다.

도 1(A)는, 핵산 혼합물의 융해 곡선의 일례이며, (B)는 미분 융해 곡선의 일례.
도 2(A)∼(B)는 본 발명의 실시예1에 관한 시료 ID : A를 사용했을 때의 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 3(A)∼(B)는 본 발명의 실시예1에 관한 시료 ID : B를 사용했을 때의 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 4(A)∼(B)는 본 발명의 실시예1에 관한 시료 ID : C를 사용했을 때의 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 5(A)∼(B)는 본 발명의 실시예1에 관한 전혈을 시료로 했을 때의 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 6(A)∼(D)는 본 발명의 실시예2에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 비교예1에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 8은 본 발명의 비교예2에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 9는 본 발명의 비교예3에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 10은 본 발명의 실시예3에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 11은 본 발명의 비교예4에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 12는 본 발명의 실시예4에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 13은 본 발명의 실시예5에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 14는 본 발명의 비교예5에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.
도 15는 본 발명의 비교예6에 관한 Tm 해석의 결과를 나타낸 그래프.

본 발명에 관한 ALK 유전자의 변이 검출용 프로브(이하, 단지 「변이 검출용 프로브」라고 하는 경우가 있음)는, 상기 P1, P2, P3, P4, P7 및 P8의 각 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 변이 검출용 프로브로 하는 것이다.

본 발명의 ALK 유전자의 변이 검출 방법은, 상기 변이 검출용 프로브를 사용하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 133번째의 염기에 있어서의 변이, 및 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 244번째의 염기에 있어서의 변이의 적어도 한쪽을 검출하는 것을 포함하는 변이 검출 방법이다.

본 발명에 있어서의 약효 판정 방법은, 상기 ALK 유전자의 변이 검출 방법에 의해 ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 것, 및, 검출된 변이의 유무에 의거하여 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 약제의 약효 판정 방법이다.

또한 본 발명의 변이 검출용 시약 키트는, 상기 변이 검출용 프로브를 포함하는, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 변이 검출용 시약 키트이다.

즉, 본 발명에서는, 변이 검출용 프로브로서, 변이를 나타내는 염기에 대응하는 염기를 포함하고, 또한 특정의 위치에 형광 표지된 시토신을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것에 의해, 융해 곡선 분석 등의 자동 검출 가능한 검출 방법에 적용 가능하며 또한 목적으로 하는 ALK 유전자 변이를 간편하게 검출할 수 있다. 또한, 이 변이 검출용 프로브를 사용하는 것에 의해, ALK 유전자 변이에 의거하는 약효 판정을 간편하게 행할 수 있다.

본 발명에 있어서의 「ALK 유전자」는, 이미 공지이며, 그 염기 서열은, NCBI의 Reference Sequence : NC_000002.11 중 29415640번째의 염기∼30144477번째의 염기의 서열에 상당한다. 또, 본 명세서에 있어서는, 특히 언급하지 않는 한 「ALK 유전자」는, 서열 번호2 또는 서열 번호4에 나타내는 염기 서열을 의미하는 것으로 한다.

서열 번호1의 염기 서열은, NCBI의 Reference Sequence : NT_022184.15 중 8265650번째의 염기∼8265351번째의 염기를 제1∼300번째의 염기로 하고, 8265518번째의 염기에 대응하는 133번째의 염기를 「A(아데닌)」으로 하는 변이형의 염기 서열이다.

서열 번호2의 염기 서열은, NCBI의 Reference Sequence : NT_022184.15 중 8265650번째의 염기∼8265351번째의 염기를 제1∼300번째의 염기로 하고, 8265518번째의 염기에 대응하는 133번째의 염기를 「C(시토신)」으로 하는 야생형의 염기 서열이다.

또한 서열 번호3의 염기 서열은, NCBI의 Reference Sequence : NT_022184.15 중 8267388번째의 염기∼8267089번째의 염기를 제1∼300번째의 염기로 하고, 8267145번째의 염기에 대응하는 244번째의 염기를 「A(아데닌)」으로 하는 변이형의 염기 서열이다.

또한 서열 번호4의 염기 서열은, NCBI의 Reference Sequence : NT_022184.15 중 8267388번째의 염기∼8267089번째의 염기를 제1∼300번째의 염기로 하고, 8267145번째의 염기에 대응하는 244번째의 염기를 「G(구아닌)」으로 하는 야생형의 염기 서열이다.

본 발명에 있어서, 검출 대상이 되는 시료 중의 시료 핵산, 변이 검출용 프로브 또는 프라이머의 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특히 언급하지 않는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대하여 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대하여 상보적인 당해 서열에 대하여 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 「Tm치」란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)로서, 일반적으로, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA로 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이것에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. Tm치는, 이 현상에 의거하여 설정된다. 본 발명에 있어서의 Tm치는, 특히 언급하지 않는 한, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도를 말한다.

본 명세서에 있어서 Tm치를 산출할 경우, 얻어진 Tm치는, 특히 언급하지 않는 한, 소프트웨어 「Meltcalc 99 free」(http://www.meltcalc.com/)를 사용하고, 설정 조건 : Oligoconc[μM] 0.2, Na eq.[mM] 50의 조건에서 산출한 값으로 한다. 이 소프트웨어는, 당업계에서 공지의 것이며, Clinical Chemistry Vol.54, No.6, pp.990-999(2008) 등에서도 프로브의 설계에 사용되고 있다.

본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 서열에 관하여 「3' 말단으로부터 세어 1∼3번째」라고 하는 경우에는, 올리고뉴클레오티드쇄의 3' 말단에 있는 염기를 1번째로서 센다. 마찬가지로 「5' 말단으로부터 세어 1∼3번째」라고 하는 경우에는, 올리고뉴클레오티드쇄의 5' 말단에 있는 염기를 1번째로서 센다.

본 발명에 있어서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 「올리고뉴클레오티드」로서는, 올리고뉴클레오티드 외에, 수식된 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

상기 올리고뉴클레오티드의 구성 단위로서는, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 인공 핵산 등을 들 수 있다. 상기 인공 핵산으로서는, DNA, RNA, RNA 아날로그인 LNA(Locked Nucleic Acid); 펩티드 핵산인 PNA(Peptide Nucleic Acid); 가교화 핵산인 BNA(Bridged Nucleic Acid) 등을 들 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는, 상기 구성 단위 중, 1종류의 구성 단위로 구성되어도 되며, 복수 종류의 구성 단위로 구성되어도 된다.

본 발명에 있어서 하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그것에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등에 따라 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.

본 명세서에 있어서 「공정」이라는 말은, 독립한 공정뿐만이 아닌, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없을 경우여도 본 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

또한, 본 발명에 있어서 「∼」을 사용하여 나타낸 수치 범위는, 「∼」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소치 및 최대치로서 포함하는 범위를 나타낸다.

또한, 본 발명에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재할 경우에는, 특히 언급하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

본 명세서에 있어서 변이란, 야생형의 염기 서열의 일부의 염기가 치환, 결실, 중복 또는 삽입되는 것에 의해 생기는 새로운 염기 서열을 의미한다.

이하, 본 발명에 대해서 설명한다.

본 발명의 ALK 유전자의 변이 검출용 프로브(이하, 단지 「변이 검출용 프로브」라고도 함)은, 상기 P1, P2, P3, P4, P7 및 P8로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ALK 유전자의 변이를 검출하기 위한 변이 검출용 프로브이다.

ALK 유전자의 야생형에서는, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 133번째에 대응하는 염기는, C(시토신)이지만, 변이형에 있어서는 A(아데닌)로 변이하고 있으며(이하, 「ALK(L1196M) 변이형」이라고도 함), 당해 염기는, ALK 유전자의 8265650번째의 염기∼8265351번째의 염기 중, 8265518번째의 염기에 해당한다.

ALK 유전자의 야생형에서는, 서열 번호3에 나타내는 서열 중 244번째에 대응하는 염기는, G(구아닌)이지만, 변이형에 있어서는 A(아데닌)로 변이하고 있으며(이하, 「ALK(C1156Y) 변이형」이라고도 함), 당해 염기는, ALK 유전자의 8267388번째의 염기∼8267089번째의 염기 중, 8267145번째의 염기에 해당한다.

상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, ALK(L1196M) 변이를 검출할 수 있는 프로브이며, 상기 P4의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, ALK(C1156Y) 변이를 검출할 수 있는 프로브이다. 이들의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 변이 검출용 프로브를 사용하는 것에 의해, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출할 수 있다.

상기 P1, P2, P3, P4, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열을 표 1에 나타낸다.

P1의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 123번째∼139번째의 염기로 이루어지는 염기 길이 17의 염기 서열에 상보적인 서열로서, 123번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 염기 서열을 갖는다. P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, P1의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 되는 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 123번째의 염기에 대응하는 염기인 시토신이 형광 색소로 표지되어 있다.

P2의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 123번째∼141번째의 염기로 이루어지는 염기 길이 19의 염기 서열로서, 141번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 염기 서열을 갖는다. P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, P2의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 되는 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 141번째의 염기에 대응하는 염기인 시토신이 형광 색소로 표지되어 있다.

P3의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 123번째∼138번째의 염기로 이루어지는 염기 길이 16의 염기 서열에 상보적인 서열로서, 138번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 염기 서열을 갖는다. P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, P3의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 되는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 138번째의 염기에 대응하는 염기인 시토신이 형광 색소로 표지되어 있다.

P4의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 235번째∼252번째의 염기로 이루어지는 염기 길이 18의 염기 서열로서, 252번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 염기 서열을 갖는다. P4의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, P4의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 되는 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 252번째의 염기에 대응하는 염기인 시토신이 형광 색소로 표지되어 있다.

P7의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 129번째∼145번째의 염기로 이루어지는 염기 길이 17의 염기 서열에 상보적인 서열로서, 129번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 염기 서열을 갖는다. P7의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, P7의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 되는 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 129번째의 염기에 대응하는 염기인 시토신이 형광 색소로 표지되어 있다.

P8의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 129번째∼146번째의 염기로 이루어지는 염기 길이 18의 염기 서열로서, 146번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 염기 서열을 갖는다. P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, P8의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 되는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 146번째의 염기에 대응하는 염기인 시토신이 형광 색소로 표지되어 있다.

또, 표 1에 있어서, P1, P2, P3, P7 및 P8에 대해서는, 서열 번호1의 133번째의 염기에 대응하는 염기를 대문자로 표기했다. 또한, 서열 번호1의 133번째에 대응하는 염기가 C(야생형) 또는 A(변이형)의 경우인 시료 핵산과, 각각의 각 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리드의 Tm치를 산출하고, 아울러 나타냈다.

또한, 표 1에 있어서, P4에 대해서는, 서열 번호3의 244번째의 염기에 대응하는 염기를 대문자로 표기했다. 또한, 서열 번호3의 244번째에 대응하는 염기가 G(야생형) 또는 A(변이형)의 경우인 시료 핵산과, 각각의 각 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리드의 Tm치를 아울러 나타냈다.

[표 1]

또, 본 발명에 따른 변이 검출용 프로브에 있어서의 상기 P1, P2, P3, P4, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 각 염기 서열로부터, 1개∼3개의 염기가 신장, 단축, 삽입, 결실, 또는 치환된 염기 서열을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드여도, 본 발명에 따른 변이 검출용 프로브와 동등하게, ALK(L1196M) 변이 또는 ALK(C1156Y) 변이를 검출 가능한 프로브가 존재할 수 있다. 이러한 본 발명에 따른 변이 검출용 프로브와 1개∼3개의 염기가 신장, 단축, 삽입, 결실, 또는 치환된 염기 서열을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브 중 변이를 검출 가능한 변이 검출용 프로브도 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 변이 검출용 프로브에 있어서의 P1, P2, P3, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 각 염기 서열로부터, 1개∼3개의 염기가 신장, 단축, 삽입, 결실, 또는 치환된 염기 서열을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호1에 있어서의 제133번째의 변이를 인식하는 프로브 중 변이를 검출 가능한 변이 검출용 프로브도, 본 발명에 포함된다.

또, 「서열 번호1에 있어서의 제133번째의 변이를 인식한다」 등의 표현은, 「서열 번호1에 있어서의 제133번째의 변이를 나타내는 염기에 결합한다」는 의미이다.

본 발명에 따른 변이 검출용 프로브에 있어서의 P4의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기 서열로부터, 1∼3개의 염기가 신장, 단축, 삽입, 결실, 또는 치환된 염기 서열을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호3에 있어서의 제244번째의 변이를 인식하는 프로브 중 변이를 검출 가능한 변이 검출용 프로브도, 본 발명에 포함된다.

또, 「서열 번호3에 있어서의 제244번째의 변이를 인식한다」 등의 표현은, 「서열 번호3에 있어서의 제244번째의 변이를 나타내는 염기에 결합한다」는 의미이다.

본 발명의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그 중에서도 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 구아닌 소광 프로브로 불리고 있으며, 소위 QProbe(등록상표)로서 알려져 있다. 그 중에서도, 올리고뉴클레오티드를, 3' 말단 혹은 5' 말단이 시토신(C)이 되도록 설계하고, 그 말단의 C가, 구아닌(G)에 근접하면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 올리고뉴클레오티드인 것을 들 수 있다.

이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

또, QProbe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이러한 검출 양식으로서는, Taq-man Probe법, Hybridization Probe법, Moleculer Beacon법 또는 MGB Probe법 등을 들 수 있다.

상기 형광 색소로서는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 이들의 형광 색소의 시판품으로서는, 예를 들면, Pacific Blue, BODIPY FL, FluorePrime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.

형광 표지 올리고뉴클레오티드의 검출 조건은 특히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 의해 적의 결정할 수 있다. 예를 들면, Pacific Blue는, 검출 파장 445㎚∼480㎚, TAMRA는, 검출 파장 585㎚∼700㎚, BODIPY FL은, 검출 파장 520㎚∼555㎚로 검출할 수 있다.

이러한 형광 색소를 갖는 프로브를 사용하면, 각각의 형광 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합은, 통상의 방법, 예를 들면 일본국 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

또한 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 3' 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 두는 것에 의해, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분히 억제할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있다. 그때, 3' 말단에 인산기가 부가된 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 이것을 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다.

또한, 3' 말단에 상술한 바와 같은 표지화 물질(형광 색소)을 부가하는 것에 의해서도, 같은 효과가 얻어진다.

상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, ALK 유전자에 있어서의 변이, 특히 ALK(L1196M) 변이형을 검출하는 ALK 유전자 변이 검출용 프로브로서 사용할 수 있고, 또한, ALK 유전자 변이 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용의 프로브로서 사용할 수 있다.

상기 P4의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, ALK 유전자에 있어서의 변이, 특히 ALK(C1156Y) 변이형을 검출하는 ALK 유전자 변이 검출용 프로브로서 사용할 수 있고, 또한, ALK 유전자 변이 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용의 프로브로서 사용할 수 있다.

또, 상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 경우에는 123번째의 염기에 대응하는 염기, 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 경우에는 141번째의 염기에 대응하는 염기, 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 경우에는 138번째의 염기에 대응하는 염기가, 상기 P7의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 경우에는 145번째의 염기에 대응하는 염기가, 상기 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 경우에는 146번째의 염기에 대응하는 염기가, 각각 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지된 염기를 사용하는 이외는, 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서 알려져 있는 공지의 방법, 예를 들면 일본국 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 제작할 수 있다.

또한, 상기 P4의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서 252번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지된 염기를 사용하는 이외는, 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서 알려져 있는 공지의 방법, 예를 들면 일본국 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 제작할 수 있다.

<프라이머>

후술하는 ALK 유전자 변이 검출 방법으로는, 검출 대상이 되는 ALK 유전자 변이를 포함하는 서열을 PCR법에 의해 증폭할 경우에는, 프라이머가 사용된다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 프라이머는, 목적으로 하는 검출 대상이 되는 ALK 유전자의 변이가, ALK(L1196M) 변이형의 경우에는 서열 번호1로 나타내는 염기 서열 중 133번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 핵산, ALK(C1156Y) 변이형의 경우에는 서열 번호3로 나타내는 염기 서열 중 244번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 핵산을, 각각 증폭 가능하면 특히 제한되지 않는다.

PCR법에 적용하는 프라이머는, 본 발명의 변이 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 서열 번호1∼서열 번호4에 나타내는 염기 서열로부터, 당업자라면 적의 설계할 수 있다. 프라이머의 길이 및, 프라이머가 하이브리다이즈하는 1본쇄 핵산에 대한 Tm치는, 12mer∼40mer 및 40℃∼70℃, 또는 16mer∼30mer 및 55℃∼60℃로 할 수 있다.

또한, 프라이머 세트의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되며, 양 프라이머의 Tm치는 거의 동일(또는, Tm치의 양 프라이머에서의 차가 5℃ 이내)이어도 된다.

본 발명에 관한 ALK 유전자 변이 검출 방법이 ALK(L1196M) 변이형을 검출 대상으로 하는 ALK 유전자 변이 검출 방법인 경우에는, 상기 P5 및 P6을 프라이머로서 사용하여, 시료 핵산을 증폭할 수 있다.

상기 P5 프라이머는, ALK(L1196M) 변이형의 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 하여 효율 좋게 핵산을 증폭할 수 있다. 상기 P6 프라이머는, ALK 유전자의 야생형의 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 하여 효율 좋게 핵산을 증폭할 수 있다. 이 때문에, P5 및 P6 프라이머를, 상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하면, ALK(L1196M) 변이형을, 감도 좋게 검출할 수 있다. 특히, P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하는 것이, 보다 높은 감도로 ALK(L1196M) 변이형을 검출할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, 핵산 증폭 반응에 있어서, 프라이머가 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는 핵산을 주형 핵산이라고 하는 경우가 있다.

또, 본 발명에 따른 변이 검출용 프라이머에 있어서의 P5 및 P6의 프라이머의 각 염기 서열로부터, 1∼3개의 염기가 신장, 단축, 삽입, 결실, 또는 치환된 염기 서열을 갖는 프라이머여도, 본 발명에 따른 변이 검출용 프라이머와 동등하게, 본 발명에 따른 변이 검출용 프로브와 조합시켜서 사용하여 ALK(L1196M) 변이 또는 ALK(C1156Y) 변이를 검출 가능한 프라이머가 존재할 수 있다. 이러한 본 발명에 따른 변이 검출용 프라이머와 1개∼3개의 염기가 신장, 단축, 삽입, 결실, 또는 치환된 염기 서열을 갖는 프라이머 중 본 발명에 따른 변이 검출용 프로브와 조합시켜서 변이를 검출 가능한 프라이머도 본 발명에 따른 변이 검출용 프라이머에 포함된다.

상기 P5 프라이머의 염기 서열(서열 번호14) 및 P6 프라이머의 염기 서열(서열 번호15)은, 각각 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 133번째의 염기에 대응하는 염기를 포함한다. 이에 따라, 예를 들면, 목적으로 하는 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭 효율을 높일 수 있다.

상기 P6 프라이머는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열과 다른 염기(미스매치 염기)를 갖는다. 미스매치 염기란, G(구아닌)-C(시토신)와는 다른 염기의 조합 또는 A(아데닌)-T(티민)와는 다른 염기의 조합을 의미하고, 구체적으로는, G-G, G-A, G-T, A-A, A-C, C-T, C-C, T-T의 염기의 조합을 의미한다.

이하에 본 발명의 변이 검출 방법에 있어서의 본 발명의 변이 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 예를 나타낸다. 또, 이들은 예시로서, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

이하의 ALK L1196M-mt-F10은, 5' 말단 측에 7염기의 부가 서열을 갖고, 3' 말단에 서열 번호1에 있어서의 133번째의 염기에 상당하는 「A」를 갖는 P5 프라이머이다. ALK L1196M-WT-F6은, 5' 말단 측에 6염기의 부가 서열을 갖고, 3' 말단에 서열 번호2에 있어서의 133번째의 염기에 상당하는 「C」를 갖고, 3' 말단 측에서 5염기째의 위치에 서열 번호2의 128번째의 염기에 대응하는 염기와는 다른 미스매치 염기(「a」)를 갖는 P6 프라이머이다.

[표 2]

변이의 검출 방법은, 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 프로브로서 이용하는 방법이면, 특히 제한되지 않는다. 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 변이 검출 방법의 일례로서, Tm 해석을 이용한 변이 검출 방법에 대해서, 이하에 설명한다.

<변이 검출 방법>

본 발명에 관한 ALK 유전자 변이 검출 방법은, 상기 ALK 유전자 변이 검출용 프로브를 적어도 1종 사용하여, ALK 유전자의 변이를 검출하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출 방법이다.

본 발명에 관한 변이 검출 방법에 따르면, 상기 변이 검출용 프로브를 적어도 1종 포함하는 것에 의해, ALK 유전자의 변이, 특히 ALK(L1196M) 변이형 및 ALK(C1156Y) 변이형의 적어도 한쪽을 간편하게, 감도 좋게 검출 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 변이 검출 방법은, ALK 유전자에 있어서의 변이의 검출 방법으로서, 하기 공정(Ⅰ)∼공정(Ⅳ)을 포함할 수 있고, 하기 공정(Ⅴ)을 포함하고 있어도 된다. 또, 본 발명의 변이 검출 방법은, 상기 변이 검출용 프로브를 사용하는 것이 특징으로서, 그 외의 구성 및 조건 등은, 이하의 기재에 제한되지 않는다.

(Ⅰ) 상기 변이 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것.

(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시키는 것에 의해, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것.

(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm치를 측정하는 것.

(Ⅳ) 상기 Tm치에 의거하여, ALK 유전자에 있어서의 변이의 존재를 검출하는 것.

(Ⅴ) 상기 변이의 존재에 의거하여 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 변이를 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 공정(Ⅰ)∼(Ⅳ) 또는 상기 공정(Ⅰ)∼(Ⅴ)에 더하여, 또한, 공정(Ⅰ)의 하이브리드를 얻기 전 또는 공정(Ⅰ)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 것을 포함하고 있어도 된다.

또, (Ⅲ)에서 Tm치를 측정하는 것에는, 하이브리드의 해리 온도를 측정하는 것뿐만이 아닌, 하이브리드 형성체의 융해 시에 온도에 따라 변동하는 형광 시그널의 미분치의 크기를 측정하는 것을 포함해도 된다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 핵산은, 1본쇄 핵산이어도 되며 2본쇄 핵산이어도 된다. 상기 핵산이 2본쇄 핵산의 경우에는, 예를 들면, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 것에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 핵산을 융해(해리)시켜서 1본쇄 핵산으로 하는 것을 포함하는 것을 들 수 있다. 2본쇄 핵산을 1본쇄 핵산으로 해리하는 것에 의해, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈가 가능해진다.

본 발명에 있어서, 검출 대상인 시료에 포함되는 핵산은, 예를 들면, 생체 시료에 원래 포함되는 핵산이어도 되지만, 검출 정밀도를 향상할 수 있으므로, 생체 시료에 원래 포함되어 있는 핵산을 주형으로 하여 PCR 등에 의해 ALK 유전자가 변이한 부위를 포함하는 영역을 증폭시킨 증폭 산물인 것을 들 수 있다. 증폭 산물의 길이는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50mer∼1000mer, 또는 80mer∼200mer로 할 수 있다. 또한, 시료 중의 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 유래의 RNA(토탈 RNA, mRNA 등)로부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성한 cDNA여도 된다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 변이 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은 특히 제한되지 않는다. 시료 중의 DNA에 대하여 예를 들면 1배 이하를 들 수 있다. 또한, 충분한 검출 시그널 확보의 관점으로부터, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 변이 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 0.1배 이하로 할 수 있다.

여기에서, 시료 중의 핵산이란, 예를 들면, 검출 목적의 변이가 발생하여 있는 검출 대상 핵산과 상기 변이가 발생하여 있지 않은 비검출 대상 핵산과의 합계여도 되며, 검출 목적의 변이가 발생하여 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 변이가 발생하여 있지 않은 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과의 합계여도 된다. 또, 시료 중의 핵산에 있어서의 상기 검출 대상 핵산의 비율은, 통상, 불분명하지만, 결과적으로, 상기 변이 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여 10배 이하로 할 수 있다. 또한, 상기 변이 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대해서, 5배 이하, 또는 3배 이하로 할 수 있다. 또한, 그 하한은 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.001배 이상, 0.01배 이상, 또는 0.1배 이상으로 할 수 있다.

상기 DNA에 대한 본 발명의 변이 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

본 발명에 있어서, Tm치를 결정하기 위한 온도 변화에 따른 시그널 변동의 측정은, 상술한 바와 같은 원리로부터 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 상기 변이 검출용 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거하는 시그널로서, 1본쇄 DNA와 상기 변이 검출용 프로브와의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정하는 것을 들 수 있다. 이 때문에, 상기 변이 검출용 프로브로서, 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 들 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 형광 시그널을 나타내거나, 형광 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 해리하면 형광 시그널을 나타내게 되거나, 형광 시그널이 증가한다.

또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 형광 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 해리하면 형광 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 형광 표지에 의거하는 형광 시그널의 변화를 형광 표지 특유의 조건(형광 파장 등)에서 검출하는 것에 의해, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 같이, 융해의 진행 및 Tm치의 결정을 행할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 변이 검출 방법에 대해서, 형광 색소에 의거하는 시그널의 변화를 검출하는 방법에 대하여 구체예를 들어서 설명한다. 또, 본 발명의 변이 검출 방법은, 상기 변이 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 외의 공정 및 조건에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료로서는, 핵산, 특히 ALK 유전자를 함유하는 핵산을 포함하는 시료이면 되며, 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 대장, 폐 등의 조직, 백혈구 세포 등의 혈구, 전혈, 혈장, 객담, 구강 점막 현탁액, 손톱, 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 요(尿), 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하거나 또는 유래할 수 있는 것을 들 수 있다. 또, 시료의 채취 방법, 핵산을 포함하는 시료의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 모두 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전처리한 후에 사용할 수 있다.

예를 들면, 전혈을 시료로 할 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.

다음으로, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 변이 검출용 프로브를 첨가한다.

상기 변이 검출용 프로브는, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가해도 되며, 적당한 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매로서는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

상기 변이 검출용 프로브의 첨가의 타이밍은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 후술하는 PCR 등의 증폭 처리를 행할 경우, 증폭 처리 후에, PCR 증폭 산물에 대하여 첨가해도 되며, 증폭 처리 전에 첨가해도 된다.

이와 같이 PCR 등에 의한 증폭 처리 전에 상기 검출용 프로브를 첨가하는 경우에는, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 그 3' 말단에, 형광 색소를 부가하거나, 인산기를 부가하거나 할 수 있다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면 폴리머라제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 그 예로서는, PCR법, ICAN법, LAMP법, NASBA법 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우에는, 본 발명 프로브의 존재하에서 증폭을 행하는 것을 들 수 있다. 사용하는 프로브 및 폴리머라제에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 따라, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm치를 해석하는 것만으로 변이의 유무를 판정할 수 있으므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요가 없고, 자동화도 용이하다.

또한 PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용되는 DNA 폴리머라제를 특히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, GeneTaq(닛폰진사제), PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제), Taq 폴리머라제 등을 들 수 있다.

폴리머라제의 사용량으로서는, 통상 사용되고 있는 농도이면 특히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용할 경우, 예를 들면, 반응 용액량 50㎕에 대하여 0.01U∼100U의 농도로 할 수 있다. 이에 따라, ALK 유전자 변이의 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.

또한 PCR법은, 통상 사용되는 조건을 적의 선택함으로써 행할 수 있다.

또, 증폭 시, 리얼타임 PCR에 의해 증폭을 모니터링하여, 시료에 포함되는 DNA(검출 대상 서열)의 카피수를 조사할 수도 있다. 즉, PCR에 의한 DNA(검출 대상 서열)의 증폭에 따라 하이브리드를 형성하는 프로브의 비율이 늘어나므로 형광 강도가 변동한다. 이것을 모니터링함으로써, 시료에 포함되는 검출 대상 서열(정상 DNA 또는 변이형 DNA)의 카피수 또는 존재비를 검출할 수 있다.

본 발명의 변이 검출 방법에 있어서는, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 양자를 하이브리다이즈시킨다. 시료 중의 1본쇄 핵산은, 예를 들면, 상술한 바와 같이 하여 얻어진 PCR 증폭 산물을 해리함으로써 조제할 수 있다.

상기 PCR 증폭 산물의 해리(해리 공정)에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도면 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 85℃∼95℃이다. 가열 시간도 특히 제한되지 않는다. 가열 시간은, 예를 들면 1초∼10분, 또는 1초∼5분으로 할 수 있다.

또한, 해리한 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시키는 것에 의해 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면, 40℃∼50℃이다.

하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적 또는 농도는, 특히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서의 DNA의 농도는, 예를 들면, 0.01μM∼1μM, 또는 0.1μM∼0.5μM으로 할 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 농도는, 예를 들면, 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 만족하는 범위이며, 예를 들면, 0.001μM∼10μM, 또는 0.001μM∼1μM으로 할 수 있다.

그리고, 얻어진 상기 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따른 형광 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면, QProbe를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 해리한 상태에 비하여 형광 강도가 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따른 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온∼85℃, 또는 25℃∼70℃로 할 수 있다. 종료 온도는, 예를 들면, 40℃∼105℃로 할 수 있다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃/초∼20℃/초, 또는 0.3℃/초∼5℃/초로 할 수 있다.

다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm치로서 결정한다(도 1 참조). 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분치(-d 형광 강도/dt)를 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm치로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm치로서 결정할 수도 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아닌, 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상술한 바와 같이, 하이브리드를 가열하여, 온도 상승에 따른 형광 시그널 변동(바람직하게는 형광 강도의 증가)을 측정하지만, 이 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때의 상기 온도 강하에 따르는 형광 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, QProbe를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가한 직후에서는 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 크지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 가열한 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.

한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가한 직후는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 작지만(또는 소광), 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

본 발명의 변이 검출 방법에 있어서는, ALK(L1197M) 변이형과 ALK(C1156Y) 변이형의 적어도 한쪽의 변이형을 검출하는 것을 포함한다. 즉, 이하 중 어느 하나의 태양을 포함한다 :

(1) 상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 올리고뉴클레오티드의 적어도 1종인 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 상기 P4의 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않고, ALK(L1197M) 변이형만을 검출하는 것,

(2) 상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 올리고뉴클레오티드의 적어도 1종인 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않고, 상기 P4의 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하여, ALK(C1156Y) 변이형만을 검출하는 것, 또는

(3) 상기 P1, P2, P3, P7 및 P8의 올리고뉴클레오티드의 적어도 1종인 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 상기 P4의 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 모두 사용하여, ALK(L1197M) 변이형과 ALK(C1156Y) 변이형의 쌍방을 검출하는 것.

ALK 유전자에 있어서의 복수의 변이는, 동일한 계에서 검출해도 되며, 다른 계에서 검출해도 된다. 동일한 계에서 검출할 경우의 검출 방법으로서는, 특히 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 각 변이를 검출할 수 있는 각 프로브를 미리 혼합하고, 시료에 첨가해도 되며, 1본쇄 핵산을 포함하는 시료에 각 변이를 검출할 수 있는 각 프로브를 연속적으로 첨가해도 된다.

여기에서, 「계」란, 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 1본쇄 핵산이 하이브리다이즈한 하이브리드를 포함하는 시료로 형성되는 1개의 독립한 반응계를 의미한다.

또, 본 변이 검출 방법에 사용 가능한 각 프로브 및 프라이머의 바람직한 태양 또는 서열에 대해서는, 상술의 각 프로브 및 프라이머에 관한 설명을 적용할 수 있다.

<약효 판정 방법>

본 발명의 약효 판정 방법은, 상술한 변이 검출 방법에 의해 ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 것, 및, 상기 검출 결과, 즉, 검출된 변이의 유무에 의거하여 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함한다.

상술한 변이 검출 방법으로는, 본 발명에 있어서의 변이 검출용 프로브를 사용하여, 감도 좋게 또한 간편하게 ALK 유전자의 L1196M 변이 또는 C1156Y 변이를 검출하므로, ALK 유전자에 있어서의 이들의 변이에 의거하여 약제의 판정을 감도 좋게 또한 간편하게 행할 수 있다.

또한, ALK 유전자에 있어서의 변이의 유무에 의거하여 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정할 수 있다. 그리고, 본 발명의 약효 판정 방법은, ALK 유전자에 있어서의 변이의 유무에 의거하여, 약제의 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경 등으로의 전환 등의 질병의 치료 방침을 결정하는데도 유용하다.

또한, 판정 대상이 되는 약제로서는, 구체적으로는, ALK 저해제를 유효 성분으로 하는 항암제를 들 수 있고, 특히 항암제, 그 중에서도 폐암 치료용의 항암제, 예를 들면, 크리조티닙 등을 들 수 있다.

<변이 검출용 시약 키트>

본 발명의 변이 검출용 시약 키트는 상술한 변이 검출용 프로브를 포함한다.

이 변이 검출용 시약 키트에는, 상술의 변이 검출용 프로브의 적어도 1종을 포함하는 것에 의해, 예를 들면 ALK 유전자의 변이의 검출을 보다 간편하게 행할 수 있다.

변이 검출용 시약 키트는, 상술의 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함할 수 있다.

이에 따라, 본 발명에 있어서의 변이 검출용 시약 키트는, 정도(精度) 좋게 ALK 유전자의 변이의 검출을 행할 수 있다.

변이 검출용 시약 키트에 포함될 수 있는 프로브 및 프라이머에 대해서는, 상술한 사항을 그대로 적용할 수 있다.

변이 검출용 프로브로서 2종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함할 경우, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 혼합된 상태에서 포함되어 있어도, 별개로 포함되어 있어도 된다.

또한, 2종 이상의 상기 프로브가 혼합된 상태에서 상기 변이 검출용 키트에 포함될 경우 또는, 상기 변이 검출 키트에 별개인 시약으로서 포함된 2종 이상의 프로브를, 예를 들면 사용 시에 같은 반응계에서 혼합하여 사용할 경우, 2종 이상의 각 프로브는 발광 파장이 서로 다른 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하다.

이와 같이 형광 물질의 종류를 바꿈으로써, 같은 반응계여도, 각각의 프로브에 대해서의 검출을 행하는 것도 가능해진다.

또한, 본 발명에 있어서의 검출용 시약 키트는, 상기 프로브 및 상기 프라이머 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행함에 필요하게 되는 시약류를 더 포함하고 있어도 된다. 또한, 프로브, 프라이머 및 그 외의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되며, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

또, 「별개로 수용」이란, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있도록 구분된 것이면 되며, 반드시 독립하여 취급 가능한 개별 용기에 수용될 필요는 없다.

변이 부위를 포함하는 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 포함함으로써, 예를 들면, 보다 고감도로 변이를 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 변이 검출용 시약 키트는, 상기 변이 검출용 프로브를 사용하여, 검출 대상인 핵산을 포함하는 시료에 대하여 미분 융해 곡선을 작성하고, 그 Tm치 해석을 행하여, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 것이 기재된 취급 설명서, 또는 검출용 시약 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종의 시약에 대하여 기재된 사용 설명서를 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에서 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 그들에 조금도 한정되는 것은 아니다.

[실시예1]

ALK(L1196M)의 변이 부위를 포함하는 염기 서열(서열 번호1) 또는 ALK(C1156Y)의 변이 부위를 포함하는 염기 서열(서열 번호3)에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 123번째∼139번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 123번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 P1 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 3PB-ALK L1196M-mt-R1(서열 번호5 : ALK(L1196M) 변이형 검출용)과, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 235번째∼252번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지며, 252번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 P4 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 3T-ALKC1156Y-mt-F2(서열 번호8 : ALK(C1156Y) 변이형 검출용)를 각각 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 3 참조). 시토신의 표지화는, 통상의 방법에 따라, 각각, Pacific Blue(이하, 「PB」) 또는 TAMRA를 사용하여 행했다. 또, 프로브 중의 3' 말단의 괄호 안은 형광 색소의 종류를 나타낸다. 표 3에 나타내는 염기 서열 중, 대문자는, 변이의 위치를 나타낸다. 이하와 같다.

[표 3]

하기 표 4 및 표 5에 나타내는 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 PCR 및 Tm 해석을 행하고, 본 발명의 변이 검출용의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 의한 프로브의 성능을 확인했다. 또, 표 4 및 표 5 중의 「%」는 질량%를 의미한다(이하, 같음).

PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 61℃에서 30초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다.

Tm 해석은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 형광 색소 Pacific Blue의 경우에는, 각각 365㎚∼415㎚, 445㎚∼480㎚이며, 형광 색소 TAMRA의 경우에는 각각, 520㎚∼555㎚, 585㎚∼700㎚였다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

[표 4]

[표 5]

<핵산 혼합액>

핵산 혼합액은, ALK(L1196M) 변이 또는 ALK(C1156Y) 변이의 각 변이 부위에 대응하는 서열을 포함하는 서열 번호18∼서열 번호21에 나타내는 핵산 서열(표 6 참조)을, pUC57의 EcoRV 부위에 삽입하고, 이어서 EcoRI로 처리한 플라스미드, Mt(L1196M), Wt(L1196M), Mt(C1156Y) 및 Wt(C1156Y)를 소정의 비율로 포함한다. 샘플A∼C에 있어서의 핵산 혼합액 중의 플라스미드의 함유 비율(1μL당의 카피수)은, 표 7에 기재했다.

<전처리 전혈>

전혈 10㎕를 70㎕의 희석액1에 가하여, 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10㎕를 70㎕의 희석액2에 가했다. 이 혼합액 17㎕를 95℃ 10분으로 가열하면 4㎕의 전처리가 완료된 전혈이 얻어졌다. 이 4㎕를 전량, 반응액에 첨가했다. 희석액1 및 희석액2의 조성은 표 8과 같다.

[표 6]

[표 7]

[표 8]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 2∼도 5를 얻었다. 도 2∼도 4는, 시료로서 핵산 혼합액을 포함하는 시료 ID : A∼C를 사용한 결과를 각각 나타낸다. 도 5는 시료로서 전혈을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다. 또한 도 2∼도 5에 있어서, (A)는 ALK(L1196M) 변이형의 유무를 나타내고, (B)는 ALK(C1156Y) 변이형의 유무를 나타낸다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.

그 결과, ALK(L1196M) 변이형의 검출을 확인한 도 2(A)∼도 5(A)에 있어서, 야생형(C/C)에서는 49℃에 피크가 관찰되며, 변이형(A/A)에서는 58℃에 피크가 관찰되었다. ALK(C1156Y) 변이형의 검출을 확인한 도 2(B)∼도 5(B)에 있어서, 야생형(G/G)에서는 51℃에 피크가 관찰되며, 변이형(A/A)에서는 58℃에 피크가 관찰되었다. 변이형 및 야생형을 혼합한 시료액ID : B에서는, ALK(L1196M) 변이형에 의한 58℃와, ALK(C1156Y) 변이형에 의한 58℃에 각각 피크가 관찰되었다(도 3 참조).

또한, 혈액 검체를 시료로 한 경우에도, 용이하게 ALK(L1196M) 변이형과 ALK(C1156Y) 변이형을 동시에 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명에 따른 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 것에 의해, ALK(L1196M) 변이형과 ALK(C1156Y) 변이형을 동시에 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.

[실시예2]

ALK(L1196M) 변이형을 검출하기 위한 프로브로서, ALK(L1196M)의 변이 부위를 포함하는 염기 서열(서열 번호1)에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 123번째∼141번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 141번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 P2 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 3T-ALK L1196M-mt-F7을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 9). 표지화C의 표지는, 통상의 방법에 따라 TAMRA를 사용하여 행했다.

또한, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 서열의 133번째의 염기에 대응하는 염기를 갖는 P5 프라이머의 일례로서의 프라이머, ALK L1196M-mt-F10과, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 의거하여, 서열 번호2에 나타내는 서열의 133번째의 염기에 대응하는 염기를 가지며 또한, 미스매치 염기를 포함하는 P6 프라이머로서의 프라이머, ALK L1196M-WT-F6을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 10). 또, 표 10에 있어서 밑줄은, 미스매치 염기를 나타낸다. 또한 서열 번호1의 서열에 의거하여, 리버스용의 프라이머, ALK L1196M R-3을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제조했다(표 10).

[표 9]

[표 10]

하기의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 PCR 및 Tm 해석을 행하고, 본 발명의 변이 검출용의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 의한 프로브의 성능을 확인했다.

PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 52℃에서 15초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다.

Tm 해석은, PCR 후에 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃로부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 520㎚∼555㎚, 585㎚∼700㎚(TAMRA)였다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

[표 11]

<핵산 혼합액>

핵산 혼합액은, 실시예1에서 사용한 것과 같은 플라스미드, Mt(L1196M) 또는 Wt(L1196M)를 포함한다. 샘플D∼G에 있어서의 핵산 혼합액 중의 플라스미드의 함유 비율(1μL당의 카피수)은, 표 12에 기재했다.

[표 12]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 6을 얻었다. 도 6(A)는 샘플 ID : D를 사용한 결과를 나타내고, 도 6(B)는 샘플 ID : E를 사용한 결과를 나타내고, 도 6(C)는 샘플 ID : F를 사용한 결과를 나타내고, 도 6(D)는 샘플 ID : G를 사용한 결과를 나타낸다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.

도 6에 나타내는 바와 같이, 야생형(C/C)에서는 54℃에 피크가 관찰되며, 변이형(A/A)에서는 63℃에 피크가 관찰되었다.

따라서, 본 발명에 따른 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용함과 함께, 미스매치 염기를 포함하는 프라이머(본 실시예에서는 야생형 핵산 서열 증폭용의 프라이머)를 사용하면, ALK(L1196M) 변이형의 유무를, 변이형 0.3% 함유 비율(mt 0.3%, 20000cp/test)의 경우에도, 용이하게 또한 고특이적으로 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.

[비교예1]

ALK(L1196M) 변이형을 포함하는 염기 서열(서열 번호1)에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 129번째∼141번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 140번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신 이외이며, 또한 5' 말단의 시토신이 형광 표지된 프로브, 3PB-ALK L1196M-mt-F1(서열 번호22)을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 13 참조).

또한 주형 핵산으로서는, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호23) 및 변이형(서열 번호24))를 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 14에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1(몰비, 이하 같음)로 혼합한 것을 사용했다.

[표 13]

[표 14]

하기의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 Tm 해석을 행하고, 3PB-ALK L1196M-mt-F1의 성능을 확인했다. 또, 표 15 중, Gene Taq Universal buffer는, 닛폰진사제를 사용했다. 핵산 혼합액은, 5μM의 주형 올리고뉴클레오티드가 되도록 농도로 조정 후, 4μL를 반응액에 첨가했다.

Tm 해석은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 또, Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 365㎚∼415㎚, 445㎚∼480㎚(PB)였다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

[표 15]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 7을 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 사각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 마름모꼴로 나타내는 패턴은, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 삼각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드와 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1 혼합한 것을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.

도 7에 있어서, 야생형에서는 51℃에 피크가 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형에서는 55℃에 피크가 관찰되었다. 야생형 100%의 경우와 ALK(L1196M) 변이형 100%의 경우에서는, 상술한 계산치와는 달리 Tm치의 차는 4℃밖에 되지 않고, 피크를 분별하기 어려웠다.

또한, 변이형 및 야생형의 각 주형 올리고뉴클레오티드 1:1을 주형 핵산으로 했을 경우에는, 54℃에 브로드(broad)한 피크가 한 개 관찰될 뿐이며, ALK(L1196M) 변이형의 검출을 할 수 없었다.

[비교예2]

ALK(L1196M) 변이형을 포함하는 염기 서열(서열 번호1)에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 126번째∼142번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 141번째의 염기에 대응하는 염기 이외로 되는 5' 말단의 시토신이 형광 표지된 프로브, 5T-ALK-L1196M-mt-F5(서열 번호25)를 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 16 참조).

[표 16]

하기 표 17의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 PCR 및 Tm 해석을 행하고, 프로브, 5T-ALK-L1196M-mt-F5의 성능을 확인했다. 주형 핵산으로서는, 실시예1에서 사용한 것과 같은 플라스미드를 포함하는 핵산 혼합액을 사용했다. 핵산 혼합액에 있어서의 각 플라스미드의 카피수는, 표 18과 같다.

PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 52℃에서 15초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다. 프라이머로서는, 실시예2에서 사용한 것과 같은 것을 사용했다.

Tm 해석은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다.

Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 520㎚∼555㎚, 585㎚∼700㎚(TAMRA)이었다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

[표 17]

[표 18]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 8을 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.

도 8에 나타내는 바와 같이, 실시예2에서 사용한 고감도 검출용의 미스매치 염기를 포함하는 프라이머를 사용해도, 54℃에 하나의 피크가 관찰될 뿐이며, ALK(L1196M) 변이형의 검출은 할 수 없었다.

[비교예3]

ALK(C1156Y) 변이형을 포함하는 염기 서열(서열 번호3)에 의거하여, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 229번째∼245번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 252번째의 염기에 대응하는 염기 이외로 되는 3' 말단의 시토신이 형광 표지된 프로브, 3T-ALK-C1156Y-mt-F4(서열 번호26)를 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 19 참조).

또한 주형 핵산으로서는, 서열 번호3 또는 서열 번호4에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호27) 및 변이형(서열 번호28))을 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 20에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

상기의 프로브, 주형 핵산을 사용하여, 여기 파장 및 검출 파장을 각각, 520㎚∼555㎚, 585㎚∼700㎚로 한 이외는, 비교예1과 마찬가지로 Tm 해석을 행하고, 프로브의 성능을 확인했다.

[표 19]

[표 20]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 9를 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 사각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 마름모꼴로 나타내는 패턴은, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 삼각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드와 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1 혼합한 것을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.

도 9에 있어서, ALK(C1156Y) 변이형에서는 66℃에 피크가 관찰되지만, 야생형의 피크가 검출되지 않고, 야생형 및 변이형을 혼합한 샘플의 경우에는 피크가 1개밖에 검출되지 않았다. 이와 같이, ALK(C1156Y) 변이형의 검출은 할 수 없었다.

[실시예3]

ALK(L1196M) 변이형을 검출하기 위한 프로브로서, 야생형의 염기 서열(서열 번호2)에 의거하여, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 123번째∼138번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 138번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 P3 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 5T-ALK-L1196M-R1 : 서열 번호7)을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 21). 표지화 시토신의 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 주형 핵산으로서, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호29) 및 변이형(서열 번호30)을 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 22에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

상기의 프로브, 주형 핵산을 사용하여, 여기 파장에 대해서는 520㎚∼555㎚로 하고, 검출 파장에 대해서는 585㎚∼700㎚로 하여 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정한 이외는, 실시예1과 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

또, 표 22에 있어서 「S」 및 「Y」는, ALK(L1196M) 변이 이외의 다른 변이 부위에 상당하는 염기로서, 「S」는 「g 또는 c」를 나타내고, 「Y」는 「t 또는 c」를 의미한다.

[표 21]

[표 22]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 10을 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 마름모꼴로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 사각으로 나타내는 패턴은, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 삼각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드와, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1 혼합하여 사용한 것을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.

도 10에 있어서, 야생형에서는 60℃에 피크가 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형에서는 54℃에 피크가 관찰되었다. 야생형과 변이형 1:1의 혼합액을 샘플로 한 경우에도, 54℃ 및 60℃의 2개의 피크가 구별 가능하게 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형의 유무를 양호하게 검출할 수 있었다.

[비교예4]

야생형의 염기 서열(서열 번호2)에 의거하여, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 123번째∼139번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 138번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신 이외의 염기이며 또한 5' 말단의 시토신이 형광 표지된 프로브, 3T-ALK-L1196M-F5(서열 번호31)를 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 23 참조).

또한 주형 핵산으로서는, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호32) 및 변이형(서열 번호33))를 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 24에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

상기 프로브 및 주형 핵산을 사용한 이외는, 실시예3과 같이 Tm 해석을 행하고, 프로브의 성능을 확인했다.

[표 23]

[표 24]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 11을 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 마름모꼴로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 사각으로 나타내는 패턴은, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 삼각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드와 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1 혼합한 것을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.

도 11에 있어서, 야생형에서는 66℃에 피크가 관찰되며, 변이형에서는 55℃에 피크가 관찰되었지만, 야생형과 변이형 1:1의 혼합액을 샘플로 했을 경우에는, 프로브의 반응성이 약하고, 변이형을 나타내는 피크를 충분히 검출하는 것이 곤란했다.

[실시예4 및 실시예5]

실시예4의, ALK(L1196M) 변이형을 검출하기 위한 프로브로서, 변이형의 염기 서열(서열 번호1)에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 129번째∼145번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 145번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 P7 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 5T-ALK-L1196M-mtR5 : 서열 번호9)을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 25). 표지화 시토신의 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 주형 핵산으로서, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호34) 및 변이형(서열 번호35)을 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 26에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

[표 25]

[표 26]

또한, 실시예5의, ALK(L1196M) 변이형을 검출하기 위한 프로브로서, 야생형의 염기 서열(서열 번호2)에 의거하여, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 129번째∼146번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 146번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 P8 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 3T-ALK-L1196M-WTF12 : 서열 번호10)을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 27). 표지화 시토신의 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 주형 핵산으로서, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호36) 및 변이형(서열 번호37)을 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 28에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

[표 27]

[표 28]

실시예4 및 실시예5의 각 프로브, 각각의 주형 핵산 및 이하의 반응 시약을 사용하여, 여기 파장에 대해서는 520㎚∼555㎚로 하고, 검출 파장에 대해서는 585㎚∼700㎚로 하여 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정한 이외는, 실시예1과 같이 하여, Tm 해석을 행했다. 표 29 중, Gene Taq Universal buffer는, 닛폰진사제를 사용했다.

[표 29]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 12(실시예4) 및 도 13(실시예5)을 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 마름모꼴로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 사각으로 나타내는 패턴은, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 삼각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드와, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1 혼합하여 사용한 것을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.

실시예4에서는, 도 12에 나타내는 바와 같이, 야생형에서는 54℃에 피크가 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형에서는 64℃에 피크가 관찰되었다. 야생형과 변이형 1:1의 혼합액을 샘플로 한 경우여도, 53℃ 및 63℃의 2개의 피크가 구별 가능하게 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형의 유무를 양호하게 검출할 수 있었다.

실시예5에서는, 도 13에 나타내는 바와 같이, 야생형에서는 70℃에 피크가 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형에서는 60℃에 피크가 관찰되었다. 야생형과 변이형 1:1의 혼합액을 샘플로 한 경우에도, 60℃ 및 70℃의 2개의 피크가 구별 가능하게 관찰되며, ALK(L1196M) 변이형의 유무를 양호하게 검출할 수 있었다.

[비교예5 및 비교예6]

비교예5의, ALK(L1196M) 변이형을 검출하기 위한 프로브로서, 변이형의 염기 서열(서열 번호1)에 의거하여, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 124번째∼139번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 139번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 3T-ALK-L1196M-mtF9 : 서열 번호38)을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 30). 표지화 시토신의 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 주형 핵산으로서, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호39) 및 변이형(서열 번호40)을 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 31에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

또, 표 31에 있어서 「S」 및 「R」은, ALK(L1196M) 변이 이외의 다른 변이 부위에 상당하는 염기이며, 「S」는 「g 또는 c」를 나타내고, 「R」은 「g 또는 a」를 의미한다.

[표 30]

[표 31]

또한 비교예6의, ALK(L1196M) 변이형을 검출하기 위한 프로브로서, 야생형의 염기 서열(서열 번호2)에 의거하여, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 119번째∼136번째의 염기에 대응하는 염기로 이루어지고, 119번째의 염기에 대응하며 또한 형광 표지된 시토신을 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 프로브, 5T-ALK-L1196M-WTF11 : 서열 번호41)을 설계하고, 통상의 방법에 따라 제작했다(표 32). 표지화 시토신의 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 주형 핵산으로서, 서열 번호1 또는 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열 번호42) 및 변이형(서열 번호43)을 사용했다. 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 33에 나타낸다. 샘플로서는, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드 및 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합한 것을 사용했다.

비교예5 및 비교예6의 프로브, 각각의 주형 핵산을 사용하여, 여기 파장에 대해서는 520㎚∼555㎚로 하고, 검출 파장에 대해서는 585㎚∼700㎚로 하여 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정한 이외는, 실시예4와 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

[표 32]

[표 33]

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광치의 변화량을 나타내는 도 14(비교예5) 및 도 15(비교예6)를 얻었다. 도면 중, 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 횡축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 마름모꼴로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 사각으로 나타내는 패턴은, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드만을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타내고, 삼각으로 나타내는 패턴은, 야생형의 주형 올리고뉴클레오티드와, 변이형의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1 혼합하여 사용한 것을 주형 핵산으로서 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.

비교예5에서는, 도 14에 나타내는 바와 같이, 야생형에서는 57℃, 변이형에서는 60℃에 피크가 관찰되었지만, 야생형 및 변이형의 혼합액을 사용했을 경우에도 59℃에 한 개의 피크밖에 관찰되지 않았다.

또한 비교예6에서는, 도 15에 나타내는 바와 같이, 야생형에서는 69℃, 변이형에서는 59℃에 피크가 관찰되었지만, 야생형 및 변이형의 혼합액을 사용했을 경우에는, 명료한 피크는 59℃의 피크뿐이었다.

따라서, 비교예5 및 비교예6의 프로브는, 모두 ALK(L1196M)의 변이의 검출에는 적합하지 않은 것을 알 수 있었다.

이와 같이 본 발명에 의하면, ALK 유전자의 변이, 즉, ALK(L1196M) 변이형 및 ALK(C1156Y) 변이형을, 동시에 또는 개별적으로 감도 좋게 간편하게 검출할 수 있다.

이에 따라, ALK 유전자 변이에 의거하는 약제, 예를 들면, ALK 저해제를 유효 성분으로 하는 항암제 등의 약제의 약효의 판정을 간편하게 행하는 것이 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> PROBE FOR DETECTING MUTATION, METHOD FOR DETECTING MUTATION, METHOD FOR DETERMINING DRUG EFFICACY AND KIT FOR DETECTING MUTATION <130> P1479A <150> JP2012-210057 <151> 2012-09-24 <150> JP2013-186532 <151> 2013-09-09 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtttaagat ttgcccagac tcagctcagt taattttggt tacatccctc tctgctctgc 60 agcaaattca accaccagaa cattgttcgc tgcattgggg tgagcctgca atccctgccc 120 cggttcatcc tgatggagct catggcgggg ggagacctca agtccttcct ccgagagacc 180 cgccctcgcc cggtgagtga gaaccagtct ttgctgcagt tgttgtgcca aggacaggag 240 caaggatgga aggagcaaga gtgggcagcc tgggtagcaa gttcctcgat ggaacccagg 300 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agtttaagat ttgcccagac tcagctcagt taattttggt tacatccctc tctgctctgc 60 agcaaattca accaccagaa cattgttcgc tgcattgggg tgagcctgca atccctgccc 120 cggttcatcc tgctggagct catggcgggg ggagacctca agtccttcct ccgagagacc 180 cgccctcgcc cggtgagtga gaaccagtct ttgctgcagt tgttgtgcca aggacaggag 240 caaggatgga aggagcaaga gtgggcagcc tgggtagcaa gttcctcgat ggaacccagg 300 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtctcctctt gtcttctcct ttgcacaggg gtctgggcca tggcgccttt ggggaggtgt 60 atgaaggcca ggtgtccgga atgcccaacg acccaagccc cctgcaagtg gctgtgaagg 120 taagaagtgg ctcactcttg agcctgccct tggcttgcgg actctgtagg ctgcagttct 180 cagctcacag cctcctcctc ctccccaccc tccccttctc tgcccagacg ctgcctgaag 240 tgtactctga acaggacgaa ctggatttcc tcatggaagc cctgatcatc aggtaaagcc 300 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtctcctctt gtcttctcct ttgcacaggg gtctgggcca tggcgccttt ggggaggtgt 60 atgaaggcca ggtgtccgga atgcccaacg acccaagccc cctgcaagtg gctgtgaagg 120 taagaagtgg ctcactcttg agcctgccct tggcttgcgg actctgtagg ctgcagttct 180 cagctcacag cctcctcctc ctccccaccc tccccttctc tgcccagacg ctgcctgaag 240 tgtgctctga acaggacgaa ctggatttcc tcatggaagc cctgatcatc aggtaaagcc 300 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3PB-ALKL1196M-mt-R1 <400> 5 gctccatcag gatgaac 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-ALKL1196M-mt-F7 <400> 6 gttcatcctg atggagctc 19 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T-ALK-L1196M-R1 <400> 7 ctccagcagg atgaac 16 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-ALKC1156Y-mt-F2 <400> 8 ctgaagtgta ctctgaac 18 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T-ALKL1196M-mt-R5 <400> 9 ccatgagctc catcagg 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-ALK-L1196M-WTF12 <400> 10 cctgctggag ctcatggc 18 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK C1156Y-F1 <400> 11 ggactctgta ggctgcagtt ctc 23 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK C1156Y-R4 <400> 12 tgatcagggc ttccatgagg aaatccag 28 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK L1196M F-1 <400> 13 cattggggtg agcctgcaat c 21 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK L1196M-mt-F10 <400> 14 tgcatcaccc tgccccggtt catcctga 28 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK L1196M-WT-F6 <400> 15 ctacgacctg ccccggttca acctgc 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK L1196M R-2 <400> 16 cttggcacaa caactgcagc aaagac 26 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK L1196M R-3 <400> 17 ggacggacgg accttggcac aacaactgca gcaaagac 38 <210> 18 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mt ALK (L1196M ) insert <400> 18 agtttaagat ttgcccagac tcagctcagt taattttggt tacatccctc tctgctctgc 60 agcaaattca accaccagaa cattgttcgc tgcattgggg tgagcctgca atccctgccc 120 cggttcatcc tgatggagct catggcgggg ggagacctca agtccttcct ccgagagacc 180 cgccctcgcc cggtgagtga gaaccagtct ttgctgcagt tgttgtgcca aggacaggag 240 caaggatgga aggagcaaga gtgggcagcc tgggtagcaa gttcctcgat ggaacccagg 300 <210> 19 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt ALK (L1196M ) insert <400> 19 agtttaagat ttgcccagac tcagctcagt taattttggt tacatccctc tctgctctgc 60 agcaaattca accaccagaa cattgttcgc tgcattgggg tgagcctgca atccctgccc 120 cggttcatcc tgctggagct catggcgggg ggagacctca agtccttcct ccgagagacc 180 cgccctcgcc cggtgagtga gaaccagtct ttgctgcagt tgttgtgcca aggacaggag 240 caaggatgga aggagcaaga gtgggcagcc tgggtagcaa gttcctcgat ggaacccagg 300 <210> 20 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mt ALK (C1156Y ) insert <400> 20 gtccggaatg cccaacgacc caagccaagc cccctgcaag tggctgtgaa ggtaagaagt 60 ggctcactct tgagcctgcc cttggcttgc ggactctgta ggctgcagtt ctcagctcac 120 agcctcctcc tcctccccac cctccccttc tctgcccaga cgctgcctga agtgtactct 180 gaacaggacg aactggattt cctcatggaa gccctgatca tcaggtaaag ccacagagag 240 acaccctcac cccaactccc ctctgccccc aaagaacctg gagaggtttc taacagatcg 300 <210> 21 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt ALK (C1156Y ) insert <400> 21 gtccggaatg cccaacgacc caagccaagc cccctgcaag tggctgtgaa ggtaagaagt 60 ggctcactct tgagcctgcc cttggcttgc ggactctgta ggctgcagtt ctcagctcac 120 agcctcctcc tcctccccac cctccccttc tctgcccaga cgctgcctga agtgtgctct 180 gaacaggacg aactggattt cctcatggaa gccctgatca tcaggtaaag ccacagagag 240 acaccctcac cccaactccc ctctgccccc aaagaacctg gagaggtttc taacagatcg 300 <210> 22 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3PB-ALKL1196M-mt-F1 <400> 22 cctgatggag ctc 13 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Comp. oligo L1196M (WT) <400> 23 atgagctcca gcaggatgaa ccggggc 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Comp. oligo L1196M (Mt) <400> 24 atgagctcca tcaggatgaa ccggggc 27 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T-ALK-L1196M-mt-F5 <400> 25 catcctgatg gagctca 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-C1156Y-mt-F4 <400> 26 cgctgcctga agtgtac 17 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Comp. oligo C1156Y (WT) <400> 27 gttcagagca cacttcaggc agcgtct 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Comp. oligo C1156Y (Mt) <400> 28 gttcagagta cacttcaggc agcgtct 27 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-WT-F <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> g or c <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> t or c <400> 29 ccsgttcatc ctgctggagc tyatg 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-mt-F <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> g or c <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> t or c <400> 30 ccsgttcatc ctgatggagc tyatg 25 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-ALK-L1196M-F5 <400> 31 gttcatcctg ctggagc 17 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALKL1196MWTR <400> 32 atgagctcca gcaggatgaa ccggggc 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALKL1196MmtR <400> 33 atgagctcca tcaggatgaa ccggggc 27 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK WT2souhosa1306 <400> 34 tcctgctgga gctcatggc 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK mt2souhosa1306 <400> 35 tcctgatgga gctcatggc 19 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK WT3souhosa1306 <400> 36 cgccatgagc tccagcagga 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK mt3souhosa1306 <400> 37 cgccatgagc tccatcagga 20 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-ALKL1196M-mtF9 <400> 38 ttcatcctga tggagc 16 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-L1196M WT-R <400> 39 cccccsgcca tragctccag caggatgaac sggggcaggg 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-L1196M mt-R <400> 40 cccccsgcca tragctccat caggatgaac sggggcaggg 40 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T-ALK-L1196M-WTF11 <400> 41 cccggttcat cctgctgg 18 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK WT1souhosa1306 <400> 42 gctccagcag gatgaaccgg ggc 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK mt1souhosa1306 <400> 43 gctccatcag gatgaaccgg ggc 23

Claims

하기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하기 위한 변이 검출용 프로브 :
(P1) 서열 번호5에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2) 서열 번호6에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3) 서열 번호7에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P4) 서열 번호8에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7) 서열 번호9에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P8) 서열 번호10에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때의 형광 강도가, 하이브리다이즈하지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 감소하거나 또는 증가하는 변이 검출용 프로브.
제2항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때의 형광 강도가, 하이브리다이즈하지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 감소하는 변이 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
융해 곡선 분석용의 프로브인 변이 검출용 프로브.
제1항에 기재된 변이 검출용 프로브를 포함하는, ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 변이 검출용 시약 키트.
제1항에 기재된 변이 검출용 프로브와,
이하의 프라이머의 적어도 한쪽
을 포함하는 ALK 유전자에 있어서의 변이를 검출하는 변이 검출용 시약 키트 :
상기 P1, P2, P3, P7 또는 P8의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머, 및
상기 P4의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머.
하기 중 어느 하나의 형광 표지 올리고뉴클레오티드 :
서열 번호5에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
서열 번호6에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
서열 번호7에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
서열 번호8에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
서열 번호9에 나타내는 염기 서열을 갖고, 5' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
서열 번호10에 나타내는 염기 서열을 갖고, 3' 말단의 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.