DE69620006T2

DE69620006T2 - Sequenzierverfahren

Info

Publication number: DE69620006T2
Application number: DE69620006T
Authority: DE
Inventors: Allan Asp; Peder Carstenius
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1995-11-16
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2016-11-14
Also published as: JP2000500024A; US20020098499A1; US6337185B1; DE69620006D1; EP0861332A1; WO1997018328A1; SE9504099D0; CA2237841A1; EP0861332B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Sequenz eines Polynucleotids von Interesse. Genauer betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung beider Stränge des Polynucleotids, wobei die Stränge an einem festen Träger immobilisiert sind.
Die DNA-Sequenzierung ist eine der wichtigsten Techniken, durch welche die genaue Reihenfolge von Nucleotiden in einem DNA-Stück im Genom von lebenden Organismen bestimmt werden kann. Es werden zwei gut eingeführte Methoden angewendet: Das chemische Abbauverfahren von A. Maxam und W. Gilbert und das Kettenterminationsverfahren von F. Sanger und A.R. Coulson. Heute sind die Sequenzierverfahren mit einer automatisierten Vorrichtung durchgeführte Routineprozesse. Die meisten automatisierten Sequenzanalysengeräte basieren auf dem Kettenterminationsverfahren und verwenden einen Fluoreszenznachweis.
Gemäß dem Kettenterminationsverfahren wird das zu analysierende doppelsträngige Polynucleotid in einem ersten Schritt getrennt, worauf ein Sequenzierungsprimer mit den Einzelsträngen hybridisiert wird. Das Problem bei diesem Schritt ist, daß die Reassoziation der zwei Stränge mit der Primerhybridisierung konkurriert. Ein Verfahren um dies zu vermeiden, welches während der letzten Jahre entwickelt worden ist, ist die Festphasen-Sequenzierung. Ein Strang des doppelsträngigen Polynucleotids wird mit einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaares versehen. Das andere Mitglied des Bindungspaares wird auf einen festen Träger aufgetragen. Dieses Bindungspaar wird verwendet, um das Polynucleotid an den Träger zu binden. Nach der Bindung wird das Polynucleotid denaturiert, und der Strang ohne das Anlagerungsmitglied wird abgespült, wobei der Träger mit einem daran gebundenen Polynucleotideinzelstrang zurückbleibt. Dann werden die Sequenzierungsprimer zugegeben, und es gibt keine Kompetition durch die Reassoziation des anderen Strangs. Auf diese Weise werden viel reinere Sequenzierungsprodukte erhalten. Reinere Sequenzierungsprodukte ergeben bessere oder schärfere Banden oder Signale durch die Nachweisgeräte. Dies ist sehr wichtig, z.B. beim Nachweis von Mutationen. Mit der Festphasen-Sequenzierungstechnik ist es auch leicht, die Handhabung der Proben zu automatisieren.
Üblicherweise wurde bei der Festphasen-Technik nur einer der zwei Stränge eines doppelsträngigen Moleküls mit einem Bindungsmitglied eines spezifischen Bindungspaares versehen. Auf diese Weise wurde nur einer der zwei Stränge an dem festen Träger eingefangen und bei der Sequenzierungsreaktion verwendet. Es wurde angenommen, daß nur einer der Stränge infolge der Probleme verwendet werden kann, welche mit der Arbeit mit zwei komplementären Strängen gleicher Größe, welche zur Reassoziation neigen, verbunden sind.
Für viele Anwendungen ist es wünschenswert, beide Stränge zu sequenzieren; zum Beispiel um eine doppelte Überprüfung des Sequenzierungsergebnisses zu erhalten. EP-371 437 betrifft ein Festphasen-Sequenzierungsverfahren, welches in einer Ausführungsform beide Stränge des Moleküls verwendet. Jedoch werden in diesem Patent unterschiedliche Bindungsmitglieder an die zwei Stränge gebunden, und die Stränge werden an zwei verschiedenen festen Matrizen eingefangen. So brachte auch bei diesem Verfahren das Risiko für eine Reassoziation die Notwendigkeit mit sich, die zwei Stränge getrennt zu behandeln.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein verbessertes Verfahren zur Sequenzierung an einem festen Träger zu erhalten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Sequenzierverfahren an einem festen Träger vorzustellen, durch das beide Stränge eines doppelsträngigen Polynucleotids zur gleichen Zeit an demselben festen Träger sequenziert werden können.
Die Ziele der Erfindung werden durch das Verfahren erreicht, wie es in den Patentansprüchen beansprucht ist. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Analyse einer Sequenz eines Polynucleotids von Interesse erhalten. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
a) Einführen eines Mitglieds eines spezifischen Bindungspaares in das Ende eines jeden Strangs eines doppelsträngigen Polynucleotids von Interesse, wobei das Mitglied für beide Stränge gleich ist;
b) Immobilisieren beider Stränge des Polynucleotids an einem festen Träger, welcher mit dem anderen Mitglied des spezifischen Bindungspaares versehen ist;
c) Anlagern von Sequenzierungsprimern an die immobilisierten Stränge; und
d) Sequenzieren beider Stränge durch das Kettenterminationsverfahren.
Es ist festgestellt worden, daß die Festphasen-Technik es ermöglicht, beide Stränge eines Polynucleotids in einer solchen Orientierung einzufangen, daß deren Neigung zur Reassoziation vermieden oder größtenteils reduziert wird. Normalerweise lagern sich die zwei Stränge in einer Art und Weise aneinander an, daß sich das 5'-Ende eines Strangs an das 3'-Ende des komplementären Strangs anlagert. Es wurde festgestellt, daß es möglich war, ein Bindungsmitglied an das 5'-Ende eines jeden Strangs zu binden und jeden Strang an dem festen Träger durch dieses Bindungsmitglied einzufangen. Dann werden die zwei Stränge mittels Denaturierung getrennt, oder das Einfangen wird unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Das Einfangen der zwei Stränge durch ihre 5'-Enden macht es für die zwei Stränge schwieriger, zueinander zu "finden", da die Orientierung der Stränge für eine erfolgende Anlagerung "falsch" ist. Es wurde überraschend festgestellt, daß diese "falsche" Orientierung ausreichend war, um eine Reassoziation zu verhindern. Die erwartete "Umlagerung" der Stränge zur Reassoziation trat nicht ein. Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, beide Stränge einer doppelsträngigen DNA zur gleichen Zeit an demselben festen Träger zu sequenzieren. Durch die Verwendung von zwei unterschiedlich markierten Sequenzierungsprimern, einen für jeden Strang, wird die doppelte Menge an Information durch die Sequenzierungsreaktion erhalten. Daher ist es möglich, die Zahl der Sequenzierungsreaktionen um die Hälfte zu verringern, da zwei "verschiedene" DNA-Stränge als Matrizen in derselben Sequenzierungsreaktion verwendet werden können.
Das Einführen eines Mitglieds des spezifischen Bindungspaares kann in herkömmlicher Weise erreicht werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Polynucleotid von Interesse vor oder in Verbindung mit Schritt a) des Verfahrens amplifiziert. Es können verschiedene Amplifikationsverfahren angewendet werden, wie die Amplifikation durch einen Vektor, wie sie z.B. in US-5,405,746 beschrieben ist. Gemäß diesem Verfahren wird das Mitglied des spezifischen Bindungspaares dadurch in die Vektor-DNA eingeführt, daß der Vektor zuerst mit Restriktionsenzymen linearisiert wird. Dann wird das Bindungsmitglied durch Ligierung oder durch eine DNA-Polymerase eingeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Polynucleotid durch Verlängerung mittels der Polymerasekettenreaktion eines ersten und zweiten Amplifikationsprimers amplifiziert, wobei ein Primer an jedem Strang des doppelsträngigen Polynucleotids angelagert ist. Beide Primer umfassen das Mitglied des spezifischen Bindungspaares, und das Mitglied ist für beide Primer gleich, d. h. es wird nur ein Typ eines Bindungspaares verwendet. Auf diese Art und Weise werden Kopien von beiden Strängen des Polynucleotids hergestellt, welche an das Mitglied des spezifischen Bindungspaares gebunden sind. Das Bindungsmitglied kann in das 5'-Ende des Primers oder innerhalb des Primers eingeführt sein.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein übliches, gut bekanntes Amplifikationsverfahren, welches in einer selektiven Amplifikation eines ausgewählten Teils eines DNA-Moleküls resultiert. Der Teil des DNA-Moleküls wird durch ein Primerpaar definiert, welches an das Molekül angelagert ist, wobei ein Primer an jedem Strang des doppelsträngigen Moleküls gebunden ist.
Das spezifische Bindungspaar kann ein beliebiges Paar von Verbindungen sein, welche eine starke Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern des Paares aufweisen. Weiterhin muß es möglich sein, eines der Mitglieder des Paares in Desoxynucleotide einzuführen und einen festen Träger mit dem anderen Mitglied zu versehen. Die Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern des Paares muß während des ganzen Prozesses stabil sein. Beispiele solcher Bindungspaare sind Biotin-Avidin, Biotin-Streptavidin, Cystein- Thiolgruppen, Antigen-Antikörper und Lectin-Zucker.
Die Immobilisierung der Stränge wird in herkömmlicher Weise durchgeführt. Der Denaturierungsschritt kann während der Immobilisierung oder danach durchgeführt werden. Die Stränge können durch gut bekannte Verfahren, wie Temperaturerhöhung oder NaOH-Zugabe, getrennt werden.
Der erfindungsgemäß verwendete feste Träger kann ein beliebiger sein, welcher auf dem Fachgebiet bekannt ist, z.B. magnetische oder andere Kügelchen, Kapillaren und Mikrotitervertiefungen. Jedoch ist der feste Träger vorzugsweise eine Verzweigung mit einer Vielzahl von einzelnen Festphasenelementen. Die Festphasenelemente sind für das Zusammenwirken mit einem entsprechenden Satz von Aufnahmegefäßen angepaßt, welche die Lösungen für die verschiedenen Reaktionsschritte enthalten. Ein solches bevorzugtes System ist in PCT/SE93/00929 offenbart.
Nach dem Immobilisierungsschritt werden die Bedingungen für die Sequenzierung gemäß einem beliebigen, gut bekannten Standardprotokoll angepaßt. Die Sequenzierungsprodukte werden in geeigneter Weise durch das Einführen von bekannten Markern markiert. Als ein solcher kann ein Isotop, wie ³²P, oder eine fluoreszierende Gruppe erwähnt werden. Vorzugsweise sind die Sequenzierungsprimer markiert. Sie müssen unterschiedlich markiert sein. Am meisten bevorzugt sind die Marker zwei unterschiedlich fluoreszierende Farbstoffe.
Die Sequenzierungsprodukte werden getrennt und durch bekannte Mittel, z.B. durch Gelelektrophorese, nachgewiesen. Falls die Marker zwei unterschiedlich fluoreszierende Farbstoffe sind, können die Sequenzierungsprodukte zum Beispiel durch ein Doppellaser-Instrument nachgewiesen werden. Auf diese Weise können die Produkte aus der Sequenzierung beider Stränge gleichzeitig nachgewiesen werden.
Die Erfindung umfaßt auch einen Kit zur Verwendung bei der Analyse der Sequenz eines Polynucleotids von Interesse. Der Kit umfaßt:
(a) einen festen Träger,
(b) Amplifikationsprimer, umfassend ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares, wobei das Mitglied für beide Primer gleich ist, und
(c) Sequenzierungsprimer.
Vorzugsweise ist der feste Träger eine Verzweigung mit einer Vielzahl von einzelnen Festphasenelementen, und die Sequenzierungsprimer sind mit fluoreszierenden Farbstoffen unterschiedlich markiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestimmung von einer oder mehreren Nucleotidvariationen, wie ein(e) Nucleotidaustausch, -deletion oder -insertion, in dem Polynucleotid von Interesse angewendet werden. Das Verfahren ist für eine bestätigende Sequenzierung, z.B. DNA-Diagnose, bei einer gerichtsmedizinischen Analyse oder einer HLA-Typisierung besonders geeignet.
Die Erfindung wird nun durch das folgende Beispiel veranschaulicht, welches jedoch die Erfindung nicht begrenzen soll.

Beispiel:

Bestimmung der Sequenz von pUC-18-DNA

Zehn verschiedene Proben der gleichen Sequenz wurden unter Verwendung des AutoLoadTM Festphasen-Sequenzierungskits zusammen mit AutoLoadTM Heizblock-Insertionen von Pharmacia Biotech gleichzeitig behandelt.

Amplifikationsreaktion

Die folgenden Komponenten wurden zu einem PCR-Röhrchen zugegeben:
5 ul 10x PCR-Puffer
5 ul 10x dNTP-Lösung
2 ul 5 umol jedes Primers
1-2 E (E = Einheiten) Taq-Polymerase von Perkin-Elmer
5-20 ng pUC-18-Matrize
steriles Wasser zum Erhalt eines Gesamtvolumens von 50 ul
Das Röhrchen wurde 30 Zyklen behandelt, wobei jeder Zyklus eine Denaturierung bei 95ºC für 30 s und eine Primeranlagerung und -verlängerung bei 70ºC für 120 s umfaßt. Die Amplifikation wurde mit dem GeneAmpTM PCR-System 9600 von Perkin-Elmer durchgeführt.
10x PCR-Puffer:
100 mM Tris-HCl(pH 8,3), 15 mM MgCl&sub2;, 500 mM KCl, 1% Tween 20.
10x dNTP: 2 mM jedes dNTP.

Immobilisierung der amplifizierten DNA an einem festen Träger

Als fester Träger wurde ein Kamm mit 8 Zähnen verwendet, welche mit Streptavidin beschichtet waren. Die Zähne waren auf dem Kamm in zwei Reihen von 4 Zähnen angeordnet. Der Kamm war zur Verwendung zusammen mit Platten mit Vertiefungen angepaßt. Es wurden 10 Platten mit Vertiefungen in allen Schritten bis zu den Sequenzierungsreaktionen verwendet. Eine Reihe von 4 Zähnen des Kamms wurde in jede Vertiefung eingebracht. Für die Sequenzierung wurde eine Platte mit 40 Vertiefungen verwendet, und ein Zahn des Kamms wurde in jede Vertiefung eingebracht. Dies steht im Einklang mit Fig. 7 in der oben erwähnten PCT/5E93/00929.
80 ul einer Bindungs/Waschlösung, bestehend aus 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 10 Vertiefungen zugegeben. 40-50 ul des Reaktionsgemisches aus der PCR-Reaktion wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Streptavidin-beschichteten Kämme wurden in die Vertiefungen eingebracht und vorsichtig auf und ab bewegt, um eine Vermischung zu erhalten. Dann wurde die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um die vollständige Immobilisierung der biotinylierten PCR-Produkte an den Kämmen sicherzustellen. Die immobilisierten Produkte wurden in der gleichen Bindungs/Waschlösung wie vorstehend gewaschen.
Die immobilisierte DNA wurde denaturiert, indem die Kämme in die Vertiefungen einer Platte mit 10 Vertiefungen eingebracht und die Kämme 5 Minuten inkubiert wurden. Jede Vertiefung enthielt 100 ul einer 0,1 M NaOH-Lösung. Die denaturierte DNA wurde gewaschen, zuerst mit 1x TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8)) und dann mit sterilem Wasser.

Sequenzierung der immobilisierten DNA

Primeranlagerung:

Die folgenden Komponenten wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 10 Vertiefungen zugegeben, wobei eine Vertiefung für jedes zu sequenzierende PCR-Produkt erforderlich ist:
12 ul Anlagerungspuffer (1 M Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl&sub2;)
4 umol (4 ul) Primer 1 (M13-"Universal"-Primer), markiert mit Cy-5TM (rotes Indocarbocyanin-Fluorophor)
4 umol (4 ul) Primer 2 (M13-"Rückwärts"-Primer), markiert mit einem "blauen" Marker (Fluorescein)
100 ul steriles Wasser
Die Kämme mit der immobilisierten DNA wurden in die Vertiefungen eingebracht, welche für 10 Minuten auf 65ºC erwärmt wurden. Dann wurden die Vertiefungen mindestens 10 Minuten auf Raumtemperatur gekühlt.

Sequenzierungsreaktionen:

Die folgenden Reagenzien wurden zu vier verschiedenen Mischungen, die Mischung A, C, G und T, vermischt:
30 ul Terminationsmischung A, C, G bzw. T
20 ul Anlagerungspuffer
10 ul Verlängerungspuffer
120 ul steriles Wasser
10 ul verdünnte T7-DNA-Polymerase
10 ul Dimethylsulfoxid
Jede Terminationsmischung besteht aus: 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM c7dGTP, 50 mM NaCl und 40 mM Tris-HCl (pH 7,6). Die Terminationsmischung A besteht weiterhin aus 5 um ddATP, die Mischung C aus 5 um ddCTP, die Mischung G aus 5 um ddGTP und die Mischung T aus 5 um ddTTP.
Der verwendete Anlagerungspuffer war: 1 M Tris-HCl (pH 7,6) und 100 mM MgCl&sub2;.
Verlängerungspuffer: 304 mM Citronensäure, 324 mM DTT (Dithiothreitol) und 40 mM MnCl&sub2; (pH 7,5).
T7-DNA-Polymerase: 8 Einheiten/ul in 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 5 mM DTT und 50% Glycerin. Diese Polymeraselösung wurde mit einem Puffer, bestehend aus Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 100 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin) und 5% Glycerin, bis zu einer Konzentration von 2,0 Einheiten/ul verdünnt. 4 ul dieser verdünnten Stammlösung sind für jede Matrize (Satz von vier Reaktionen) erforderlich.
Jeweils 19 ul der Mischung A, C T und G wurden zu der jeweiligen Vertiefung in der Platte für die Sequenzierungsreaktion mit 40 Vertiefungen zugegeben. Die Platte wurde auf 37ºC erwärmt, danach wurden die Kämme zugegeben. Die Kämme wurden bei 37ºC 5 Minuten inkubiert und dann gekühlt.
Die Auftrennung und der Nachweis der Sequenzierungsprodukte wurden mit einem modifizierten ALFTM DNA-Sequenzanalysengerät von Pharmacia Biotech durchgeführt. Das Sequenzanalysengerät umfaßt ein Elektrophoresemodul für die Auftrennung und einen Doppellaser für den Nachweis. Vor dem Einbringen der Proben in das Sequenzanalysengerät wurden 10 ul Stopplösung zu jeder Gelvertiefung in dem Sequenzanalysengerät zugegeben. Die Temperatur wurde auf 50ºC erhöht, und dann wurden die Kämme in ihre jeweiligen Vertiefungen eingebracht. Nach 10-minütiger Inkubation wurden die Kämme entfernt, und die Elektrophorese wurde gestartet.
Die Erfindung ist in Fig. 1 schematisch veranschaulicht. In Fig. 1a) ist Biotin (B1 und B2 in Fig. 1) in das Ende eines jeden Strangs eines doppelsträngigen Polynucleotids eingeführt worden. In Fig. 1b) sind die biotinylierten Stränge an einen festen Träger immobilisiert worden, und in c) sind ein blauer bzw. ein roter Sequenzierungsprimer an die Stränge angelagert worden.
Das Ergebnis des Beispiels ist in Fig. 2 gezeigt. In Fig. 2 sind die mit dem roten Marker erhaltenen Graphen in dem unteren Diagramm gezeigt, und die mit dem blauen Marker erhaltenen Graphen sind in dem oberen Diagramm gezeigt. Wenn das untere Diagramm von rechts nach links und das obere Diagramm von links nach rechts gelesen wird, ist erkennbar, daß die zwei Diagramme und folglich die zwei Stränge zueinander komplementär sind. Das erste Nucleotid des unteren Strangs ist ein A, das zu dem T komplementär ist, welches das erste Nucleotid in dem oberen Strang ist. Das nächste Nucleotid ist ein G, welches komplementär ist zu C, und C ist komplementär zu G, etc.

Claims

1. Verfahren zur Analyse einer Sequenz eines Polynucleotids von Interesse, umfassend die Schritte:

a) Einführen eines Mitglieds eines spezifischen Bindungspaars in das Ende jeden Strangs eines doppelsträngigen Polynucleotids von Interesse, wobei das Mitglied für beide Stränge gleich ist;

b) Immobilisieren beider Stränge des Polynucleotids an einen festen Träger, welcher mit dem anderen Mitglied des spezifischen Bindungspaars versehen ist;

c) Anlagern von Sequenzierungsprimern an die immobilisierten Stränge; und

d) Sequenzieren beider Stränge durch das Kettenterminationsverfahren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynucleotid von Interesse vor oder in Verbindung mit Schritt a) amplifiziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynucleotid durch die Polymerasekettenreaktionsverlängerung eines ersten und zweiten Amplifikationsprimers amplifiziert wird, wobei ein Primer an jeden Strang des doppelsträngigen Polynucleotids angelagert ist, wobei beide Primer das Mitglied des spezifischen Bindungspaars umfassen und wobei das Mitglied für beide Primer gleich ist, wodurch Kopien beider Stränge des Polynucleotids, welches an das Mitglied des spezifischen Bindungspaars gebunden ist, hergestellt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung in Schritt b) unter Denaturierungsbedingungen durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stränge nach der Immobilisierung in Schritt b) denaturiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzierungsprimer unterschiedlich markiert sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker unterschiedlich fluoreszierende Farbstoffe sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger eine Verzweigung mit einer Vielzahl von einzelnen Festphasenelementen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenelemente für das Zusammenwirken mit einem entsprechenden Satz von Aufnahmegefäßen angepaßt sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Bindungspaar aus Biotin-Avidin, Biotin-Streptavidin, Cystein-Thiolgruppen, Antigen-Antikörper und Lectin-Zucker ausgewählt ist.

11. Kit zur Verwendung bei der Analyse der Sequenz eines Polynucleotids von Interesse, umfassend:

(a) einen festen Träger;

(b) Amplifikationsprimer, umfassend ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, wobei das Mitglied für beide Primer gleich ist; und

(c) Sequenzierungsprimer.

12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger eine Verzweigung mit einer Vielzahl von einzelnen Festphasenelementen ist und daß die Sequenzierungsprimer unterschiedlich markiert sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10 für eine bestätigende Sequenzierung, z.B. DNA-Diagnose, bei einer gerichtsmedizinischen Analyse oder einer HLA-Typisierung.