DE69617274T2

DE69617274T2 - Verfahren und vorrichtung für diagnostischen dns-test

Info

Publication number: DE69617274T2
Application number: DE69617274T
Authority: DE
Inventors: Daizong Li; Jan Vijg
Original assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Current assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: EP0873419A1; US5814491A; CN1198188A; ES2168472T3; CA2223061C; AU5775596A; CA2223061A1; JP4484967B2; MX9709706A; DE69617274D1; EP0873419B1; WO1996039535A1; CN1151269C; AU699613B2; JPH11506916A

Description

Vorliegende Erfindung betrifft das diagnostische Testen von DNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verstärkung im Anschluß an die elektrophoretische Trennung der resultierenden Fragmente, um mögliche Genvarianten von Mutations-Defekten und dergleichen zu detektieren; die Erfindung ist insbesondere auf neue und verbesserte Multiplex-PCR-Techniken in Verbindung mit vorzugsweise zweidimensionaler elektrophoretischer Trennung in denaturierenden Gradientengelen gerichtet.
Insbesondere betrifft die Erfindung Testverfahren zur Feststellung von DNA-Mutationen bei Patienten mit vererbten Krankheiten, einschließlich Geburtsdefekten (z. B. zystischer Fibrose) und genetischen Veranlagungen für bei Erwachsenen auftretenden chronischen Krankheiten (z. B. Krebs). Des weiteren betrifft die Erfindung das rasche Präparieren von Gen-Fragmenten und ihrer anschließenden effizienten und exakten Prüfung auf Mutationen mit Hilfe einer neuartigen zweistufigen Polymerase- Kettenreaktions-(PCR)-Amplifikation.

Hintergrund der Erfindung

Gene mit Mutations-Defekten (Gen-Varianten oder Allele) können durch die DNA- Diagnostik-Tests identifiziert werden. Gen-Varianten können von Eltern auf Kinder übertragen werden. Manche Gen-Varianten haben einen sehr starken Einfluß und sind an sich in der Lage, Krankheiten zu verursachen. Beispiele hierfür sind viele Mutations- Varianten der zystischen Fibrose-Transmembran-Leitungsregler (CFTR)-Gene, die zystische Fibrose verursachen. Andere Gen-Varianten wirken in Verbindung mit Gen- Varianten von anderen Stellen. Beispiele schließen viele der allgemeinen (polygenen) Krankheiten, wie z. B. Herzfehler und Krebs, mit ein. Es ist möglich, Tests auf Gen- Defekte in einem frühen Stadium durchzuführen, d. h. in Zellen aus dem Embryo (pränatales Testen), aber auch in einem wesentlich späteren Zustand bei jungen Erwachsenen oder alten Personen.
Durch diagnostisches DNA-Testen werden Informationen über eine Krankheit erhalten, manchmal bevor sie in Erscheinung tritt. Dies ermöglicht, die Krankheit zu bekämpfen, z. B. durch präventive Behandlung. Beispielsweise ist es möglich, Tests auf das Vorhandensein bestimmter Gen-Varianten bei Krebs oder infektiösen Krankheitsursachen durchzuführen, um ein Ansprechen auf eine Therapie vorherzusagen, z. B. den Verlauf der Krankheit. Es ist ferner möglich, einzelne Personen darauf zu testen, ob sie eine bestimmte Gen-Variante führen, die sie nicht auf ihre Nachkommen übertragen wollen (Träger-Test). Schließlich ist es möglich, Individuen jeder Zeit (von der pränatalen Stufe bis in das hohe Alter) auf vererbte, gencodierte Veranlagungen für die Krankheit zu testen. Ein Beispiel von einem Ende des Spektrums aus gesehen ist die zystische Fibrose, für die ein pränatales Testen und Träger-Überprüfen bereits recht üblich geworden ist. Das andere Ende des Spektrums umfaßt spät auftretende Krankheiten, wie z. B. Krebs und neurodegenerative Erkrankungen.
Das diagnostische DNA-Testen umfaßt eine Analyse der Sequenz-Integrität individueller Gene. Derzeit ist dies kostspielig, da ein exaktes Testen das Sequenzieren oder Decodieren des Gens erforderlich macht, was sehr arbeitsintensiv ist. Insoweit steht kein kosteneffektives, universell anwendbares, standardisiertes System für DNA-Diagnostiken zur Verfügung. Hierzu sei auf Cotton, 1993, Current methods of mutation detection, Mutat. Res. 285 : 125-144 verwiesen. Damit ein DNA- Diagnostiksystem als kosteneffektiv und als weithin akzeptiert angesehen werden kann, muß es exakte Ergebnisse liefern (über 95%), einen hohen Durchsatz haben und darf nicht arbeitsintensiv sein.

Allgemeine Ausführungen zur Analyse-Technik

Zunächst werden kurz die allgemein üblichen Techniken erörtert, die bei einer PCR- Amplifikation und bei der elektrophoretischen Trennung von Fragmenten eingesetzt werden, und wo diese Technik angewandt wird.
Eine Probe von Zellen, wie sie aus dem Blut entnommen wird, wird zunächst chemisch und physikalisch so behandelt, daß DNA-Stränge extrahiert werden, die Gene führen, welche nur etwa 2% des gesamten DNA-Materials in einem Zell-Genom einnehmen, wobei der übrige Teil des DNA-Materials ungeordnet den Hintergrund bildet. Während jede Zelle zwei Kopien eines jeden Gens hat und diese durch den Aufbau von Blöcken oder Basenpaaren, die durch Folgen von Buchstaben A, C, G und T als Buchstabencode festgelegt sind, identifiziert werden können, stellen sie einen so kleinen Teil des langen DNA-Stranges dar, daß sie durch Herstellung vieler Kopien verstärkt werden müssen, damit ihre Betrachtung möglich ist. Dies wird dadurch erreicht, daß die DNA-Strang-Paare durch Wärme getrennt oder denaturiert werden, mit entsprechenden Primern gemischt werden, um eine Bindung oder ein Annealen zu Beginn und am Ende der Genfragmente (z. B. Gen-Exonen oder Codierbereichen), die untersucht werden sollen, zu erreichen, wie weiter unten noch näher ausgeführt wird, und eine ausreichende Anzahl von Baublöcken hinzuzufügen, um Kopien der Gen- Exone zu generieren. Die fortlaufende Wiederholung dieses Zyklus von Schritten bewirkt ein kumulatives Kopieren der Exone zur Erzeugung einer gereinigten und verstärkten Menge - ein Vorgang, der allgemein als die vorstehend erwähnte Polymerase-Kettenreaktion- oder PCR-Amplifikation bezeichnet wird, und die im einzelnen beispielsweise in Molecular Pathology, Hein und Silverman, Carolina Academic Press, 1994, Kapitel 2, Molecular Techniques and Their Automation in the Clinical Laboratory, Seiten 5-31 (Winn-Deen) beschrieben ist.
In dieser Stufe erfolgt dann das Inspizieren oder Analysieren der Gen-Exone, um festzustellen, ob Mutationen von der Normalität vorhanden sind. Dies geschieht generell durch elektrophoretisches Trennen der DNA-gereinigten Fragmente, vorzugsweise auf der Basis sowohl der Größe als der Basenpaar-Sequenz, wie näher durch den Mitanmelder Vijg and A. G. Uitterlinden in Two-dimensional DNA- Typisierung: A Parallel Approach to Genome Analysis, Ellis Horwood, 1994, insbesondere Seiten 33-40, beschrieben ist.
Elektrophorese ist nicht nur zur DNA-Fragment-Trennung, sondern auch zum Trennen von anderen Substanzen als Genen, z. B. zur Protein-Analyse, verwendet worden, wie in Electrophoresis 1993, 14, 1091-1198, beschrieben. Es sind Geräte für das eindimensionale DNA-Trennen durch Elektrophorese mit Fluoreszenz-Farbstoff- Markierung, z. B. der ABI Prism 377 DNA-Sequenzer von Perkin Eimer, und für das zweidimensionale DNA-Typisieren, wie durch den Mitanmelder Vijg und E. Mullaart et al. in Nature 365, 30. September 1993, Parallel genome analysis by twodimensional DNA typing, Seiten 469-471, die eine Einrichtung von Ingeny B. V., Niederlande, beschreibt, im Einsatz. Das Anlegen des elektrischen Feldes in der ersten Dimension (z. B. in der Horizontalen) an eine entsprechende Gel-Matrix (weiter unten beschrieben), in die die gereinigten DNA-Fragmente eingeführt worden sind, bewirkt eine Trennung der Fragmente nach der Größe, wobei größere Partikel sich langsamer bewegen als kleinere Partikel. Durch Anlegen des elektrischen Feldes in orthogonaler Richtung (vertikal) mit einem chemischen Gradienten, wie z. B. mit aufeinanderfolgend höher konzentriertem Harnstoff-Formamid, das in dem Gel angeordnet ist, oder einem Temperaturgradienten, der in Verbindung damit erstellt wird, wandern die DNA-Fragmente (dieses Mal vertikal), bis sie schmelzen und in ihrer Position in der Gel-Matrix an bestimmten vertikalen durch die Sequenz bestimmten Stellen festgelegt werden. Um ein Schmelzen der gesamten DNA-Fragmente zu verhindern, können letztere (vor dem Elektrophorese-Prozeß) mit einer Anzahl von nur G's und C's verbunden werden, die in höherem Maße gegen Schmelzen widerstandsfähig sind als die A's und T's. Dieses sogenannte GC-Klemmen verriegelt effektiv jedes Fragment in seiner Position, die vollständig durch die Sequenz des Exon- Teils der Fragmente bestimmt ist. Wenn diese Sequenz in nur einer Position geändert wird, beispielsweise durch den Ersatz eines AT-Paares anstelle eines GC-Paares, schmilzt es später oder früher und wird damit in einer unterschiedlichen vertikalen Position im Vergleich zu dem normalen Bezugs-Fragment verriegelt.
Eine derartige zweidimensionale Gen-Abtastung (TDGS) verspricht, zu einem kosteneffektiven und weithin akzeptierten DNA-Diagnosesystem zu werden. Bei diesem System werden, wie vorstehend beschrieben, eine große Anzahl von DNA- Fragmenten, die durch Polymerase-Ketten-Reaktions-(PCR)-Amplifikation aus einer gegebenen DNA-Probe erhalten, elektrophoretisch auf der Basis sowohl der Größe als auch der Basenpaar-Sequenz getrennt. Dieses System arbeitet sehr genau (etwa 99%), da die Trennung in der zweiten Dimension auf einer Denaturier-Gradienten-Gel- Elektrophorese (DGGE) basiert. In der Tat ist DGGE das einzige System, mit dem eine so hohe Genauigkeit erzielt werden kann (Sheffield et al., 1993, The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions, Genomics 16, 325-332; Grompe, 1993, The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids, Nature Genet. 5, 111-117; Guldberg et al., 1993, Molecular analysis of phenylketonuria in Denmark: 99% of the mutations detected by denaturing gradient gel electrophoresis, Genomics 17, 141-146). Automatisierte Geräte für TDGS stehen teilweise zur Verfügung und sind teilweise in Entwicklung. TDGS ermöglicht die Detektion aller möglichen Mutationen in DNA-Fragmenten, die aus einem oder mehreren Genen gleichzeitig bei hohem Durchsatz und mit einem Minimum an manueller Beeinflussung erhalten werden.
Ein wesentlicher Hinderungsgrund für die breit gestreute Anwendung von TDGS in der DNA-Diagnostik ist die Schwierigkeit, viele Fragmente gleichzeitig im gleichen Reaktionsrohr durch PCR (Multiplex PCR) zu verstärken. Es ist häufig nicht einmal möglich, PCR-Primer-Stellen zu finden, die die relevanten Gen-Fragmente verstärken und gleichzeitig die Anforderungen - sowohl an PCR als auch die Denaturierungs- Gradienten-Gel-Elektrophorese - erfüllen, d. h. optimale PCR-Reaktionen und optimales Schmelzverhalten der verstärkten Fragmente. Der jeweilige Vorgang beginnt mit der Verstärkung von Bereichen des Target-DNA, üblicherweise den proteincodierten Bereichen (Exonen) eines Gens, durch PCR. Diese Amplifikations-Reaktionen werden getrennt durchgeführt, z. B. wenn 27 Exone in einem Gen analysiert werden, müssen 27 getrennte PCR-Reaktionen durchgeführt werden. In der Praxis ist es üblicherweise möglich, einige wenige PCR-Reaktionen miteinander in einem Rohr durchzuführen (z. B. Edwards und Gibbs, 1994, Multiplex PCR: advantages, development, and application, PCR Methods and Applications 3, S. 65-75).
Wenn eine große Anzahl von Individuen getestet werden sollen, und wenn mehr als ein Gen gleichzeitig mit dem gleichen TDGS-Test getestet werden soll, wird eindeutig die gesamte Anzahl von Pipettier-Schritten und individuellen Reaktionen, die ausgeführt werden, sehr hoch. Dies erhöht die Arbeits-Intensität des Tests, macht sie aber auch komplizierter in Bezug auf eine höhere Quote menschlicher Fehler. In der Tat löst im Hinblick auf diese Komplexheit selbst eine vollständige Automatisierung des Labors, bei der alle Pipettier-Schritte automatisch durchgeführt werden, dieses Problem nicht.
Die Schwierigkeit dafür, daß man nicht in der Lage ist, PCR-Verstärkungs- Mehrfachfragmente gleichzeitig unter identischen Reaktionsbedingungen im gleichen Rohr durchzuführen, stellt eine wichtige technische Hürde für TDGS dar, um die Kriterien für klinische Tests zu erfüllen, z. B. nutzerfreundliche Handhabung im Labor. Das Reduzieren der Anzahl von PCR-Reaktionen über Multiplexen, d. h. das Durchführen verschiedener PCR-Amplifikationen in einer Reaktion durch Verwendung von Mehrfachsätzen von Primern, ist eine nicht-triviale Entwicklung.
Derzeitige Annäherungen zum Multiplexen sind manchmal so einfach wie das Kombinieren einiger weniger Sätze von Primern, für die Reaktionsbedingungen getrennt bestimmt worden sind. In den meisten Fällen jedoch müssen Multiplex-PCRs sorgfältig für die zu verstärkenden Bereiche, die relativen Größenabmessungen der Fragmente, die Dynamik der Primer und die Optimierung von PCR- Versuchsbedingungen zur Anpassung an Mehrfach-Fragmente sorgfältig entwickelt werden.
Ein Schlüsselproblem ist die Positionierung der Primer. Für die Gendiagnose zielt man im allgemeinen auf die Verstärkung der Exon-Sequenzen, Splicestellen und Regulationsbereiche ab. Primer für Exon-verstärkende PCR-Reaktionen werden in idealer Weise in Intronik-Sequenzen in der Nähe der Exone plaziert. Dies ergibt einen gewissen Spielraum für die Einstellung von Fragment-Länge oder Amplifikations- Qualität wie auch Informationen über Mutationen, die Splicestellen beeinflussen. Dies sind die ersten Beschränkungen in Bezug auf die Primer-Wahl.
Des weiteren sollen Primer so positioniert werden, daß eine nicht-spezifische Amplifikation an anderen Stellen als an den Target-Sequenzen auftritt. In der Tat ist das menschliche Genom 3 · 109 Basenpaare lang, was eine sehr große Möglichkeit für zufällige Sequenz-Homologie zwischen dem Target und anderen Nicht-Target- Sequenzen ergibt. Dieses Problem ist nicht typisch für das Multiplexen, sondern kann auch auftreten, wenn man nur ein Fragment gleichzeitig verstärken will. Dies ist die zweite Beschränkung für die Auswahl des Primers.
Zum Multiplexen sollen Primer so ausgewählt werden, daß ihre vorhergesagten Hybridisier-Kinetiken ähnlich denen anderer Primer in der Multiplex-Reaktion ist. Dies ist eine dritte Beschränkung für die Wahl des Primers. Diese Beschränkungen bei der Wahl des Primers mit der gesamten genomischen DNA als Templat sind die Gründe dafür, warum Multiplex-Gruppen üblicherweise klein sind (typischerweise kleiner als 5 Fragmente).
Für eine optimale Trennung in TDGS ist eine vierte, sehr schwerwiegende Beschränkung für die Auswahl des Primers gegeben. TDGS erfordert DNA-Fragmente von im Mittel 100-600 bp. Einer der beiden Primer soll mit einem GC-reichen Fragment gekoppelt werden, um eine GC-Klammer als höchste Schmelzdomäne in dem durch PCR generierten Fragment zu erzielen. Dies ist wesentlich, um die höchste Empfindlichkeit für die Detektion von Mutationen in dem zweiten (Denaturier- Gradienten) Dimensions-Gel zu garantieren (Myers et al., 1985, Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis, Nucl. Acids Res. 13, 3131-3145; Myers, et al., 1987, Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis, Meth. Enzymol., 155, 501-527). Dann sollen die Primer in solcher Weise positioniert werden, daß das Target-Fragment nur eine einzige Domäne aufweist, die früher schmilzt (bei einer niedrigeren Harnstoff-Formamid-Konzentration oder Temperatur) als die GC-Klammer, die mit ihr verbunden ist. Es hat sich herausgestellt, daß optimale PCR-Bedingungen sowohl für PCR (geschweige denn Multiplexen) als auch optimale Schmelz-Profile schwierig, wenn nicht unmöglich zu realisieren sind (vergleiche z. B. RB DGGE-Design von Blanquet et al., 1993, ldentification of germline mutations in the RB1 gene by denaturant gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction direct sequencing, Hum. Molec. Genet. 2, 975-979, with our present design).
Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Kombination sogenannter langer PCR mit kurzer PCR. Kürzlich wurden PCR-Amplifikations-Methoden entwickelt, die die Amplifikation von großen Fragmenten (bis zu 40 kb) aus der Genom-DNA ermöglichen. Von dieser Entwicklung wird dadurch Gebrauch gemacht, daß eine lange PCR verwendet wird, um zuerst alle Codierbereiche des Target-Gens oder der Target- Gene in der kleinstmöglichen Anzahl von Fragmenten zu verstärken. Verwendet man diese langen Amplikonen als Templat, werden dann die kleinen Fragmente, die für TDGS erforderlich sind, in ein Multiplex-Format PCR-verstärkt. Auf diese Weise wird zuerst die Target-Sequenz entfernt von der verunreinigenden Genom-DNA verstärkt, was ermöglicht, daß die kleinen PCR-Fragmente unter identischen Bedingungen aus diesem vorgereinigten Templat erhalten werden.
Unter Verwendung des obigen Vorganges zeigten Primer-Sets, die nur auf der Basis von optimalem Schmelz-Verhalten der PCR-Amplikonen ausgewählt wurden, ein ausgewähltes optimales Verhalten bei PCR und ermöglichten sogar einen extensiven Multiplexbetrieb. Teilweise kann dieses Phänomen der Vor-Reinigung der langen PCR zugeschrieben werden. In der Tat erhöht die lange PCR die Mengen an Target- Sequenzen relativ zu anderen Genom-DNA-Sequenzen erheblich, wodurch die Komplexität der Reaktion entscheidend verringert und ihre Spezifität erhöht wurde.
Obgleich das vorbeschriebene Phänomen durch die Herabsetzung der Komplexität aufgrund der Bereitstellung eines gereinigten Templats erläutert werden kann, ist eine exakte Erklärung nicht möglich. In der Tat ist die reine Größe des Effekts überraschend und macht eine Neubewertung der Faktoren, die an der PCR-Optimierung beteiligt sind, notwendig. Eines ist jedoch klar. Vorliegende Erfindung allein ermöglicht es, einen effizienten TDGS-Test auszulegen und durchzuführen, weil nunmehr Primer auf der Basis eines Schmelz-Profils allein ausgewählt werden können und ein Multiplex- Vorgang entscheidend vereinfacht wird.
Die Erfindung ist auch allgemein anwendbar. So ist die Auswahl von Primern bei jeder diagnostischen Reaktion auf PCR-Basis ein entscheidender Vorgang und es zeigt sich, daß viele mögliche Primer-Stellen magere Ergebnisse liefern. Das Multiplexen wirft dann zusätzliche Probleme auf, der Grund dafür ist, daß es nicht in großem Umfang verwendet wird. Das Lang-PCR/Kurz-PCR-Zweistufen-Amplifikations-System bietet eine unmittelbare und einfache Lösung für dieses Problem.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues und verbessertes Verfahren sowie eine neue und verbesserte Einrichtung zum diagnostischen DNA-Testen anzugeben, das bzw. die die vorbeschriebenen Schwierigkeiten löst.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine neuartige Detektion von Mutationen in Genen durch eine zwei Stufen umfassende Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions- Amplifikation anzugeben, die lange und kurze Multiplex-PCR verwendet, an die sich eine zweidimensionale elektrophoretische Trennung der Fragmente auf der Basis sowohl der Größe als auch der Basenpaar-Sequenz anschließt.
Weitere Ziele der Erfindung werden in Verbindung mit der nachstehenden Beschreibung und den Ansprüchen erläutert.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Analysieren vorbestimmter, von DNA abgeleiteter Gen-Exone vorgeschlagen, das umfaßt: die Zugabe von Primer-Paaren zu aufeinanderfolgenden Gruppen der Gen-Exone, das anschließende Durchführen von Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikationen in einem Rohr als erster Schritt und relativ lange Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion, das Hinzufügen weiterer Primer-Paare zu jedem der Gen-Exone, und das Durchführen von Polymerase-Kettenreaktions- Amplifikationen in dem gemeinsamen Rohr als zweiter Schritt und kurze Multiplex- Polymerase-Kettenreaktion, sowie das elektrophoretische Trennen der Gen-Fragmente. Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der anschließenden Beschreibung und den Patentansprüchen.

Kurzbeschreibung der Figuren

Nachstehend wird die Erfindung in Verbindung mit den Zeichnungen erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 die Folge von Verfahrensschritten zur Durchführung der Erfindung;
Fig. 2 die Schmelzkurven für RB-Exon 12 mit und ohne GC-Klammer (d. h. Retinal- Blastoma-Gen);
Fig. 3 Auftragungen des Tumor-Suppressor-Gens RB, wobei die Positionen der PCR- Primer für die langen und kurzen PCR-Reaktionen angegeben sind;
Fig. 4 einen Computerausdruck mit den vorhergesagten Positionen der kurzen PCR- Fragmente in einem 2-D-Gel-Elektrophorese-Muster mit den angegebenen Spezifikationen;
Fig. 5 das aktuelle Gel-Trenn-Muster, das eine Übereinstimmung mit dem theoretisch vorhergesagten Muster zeigt;
Fig. 6 zeigt, daß bei dem langen PCR-Produkt für Exone 18-23 als Templat alle sechs kurzen PCR-Fragmente erhalten werden (Bahnen 7-12), während bei einer totalen Genom-DNA als Templat die meisten Produkte fehlen (Bahnen 1-6); es ist ferner gezeigt, daß nur 5 ng totale Genom-DNA als Startmaterial für das lange PCR (Bahn 13) ausreichend sind, und daß alle kurzen PCR-Produkte mit den langen PCR-Produkten als Template erhalten werden (Bahnen 20-24);
Fig. 7 zeigt Details von Wildtypen (homozygose normal)-Fragmenten und verschiedene heterozygose Mutanten.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Mit vorliegender Erfindung wird die Planung und Ausführung eines exakten und effizienten Mutations-Detektions-Tests auf der Basis einer minimalen Anzahl von zweistufigen Multiplex-PCR-Reaktionen in Verbindung mit einer automatischen zweidimensionalen Trennung der Fragmente zum gleichzeitigen Detektieren aller möglichen Mutationen in dem Gen bzw. den Genen gleichzeitig vorgeschlagen. Tabelle 1 gibt die verschiedenen Schritte zur Auslegung und Durchführung eines TDGS-Tests an, wobei das RB (Retinoblastoma)-Tumor-Suppressor-Gen als ein Modell gewählt ist. Zuerst werden die Gen-Sequenzen aus einer Datenbank (z. B. Genbank) ermittelt und die Target-Regionen, d. h. Exone, Splice-Stellen, Regulationsbereiche werden definiert. Dann werden die Primer so positioniert, daß alle Target-Bereiche als die kleinste mögliche Anzahl von Fragmenten erhalten werden, die durch eine lange PCR, d. h. bis zu mindestens 20 kb erhalten werden (TaKaRa LA PCR Kit. Produkt- Einsatz). Manche allgemeinen Richtlinien bei der Auswahl von Primer-Sequenzen für Lang-PCR sind bereits beschrieben (Foord and Rose, 1994, Long-distance PCR, PCR Methods and Applications 3, Seiten 149-161), aber empirische Bestimmungen von optimalen Primern sind nach wie vor notwendig.

Tabelle 1 Auslegung eines TDGS-Tests

1. Auffinden der Sequenz aus der Datenbank
2. Positionieren von Primern für eine lange PCR, um alle gewünschten Bereiche abzudecken (z. B. Codiersequenzen, Splice-Stellen, Regulationsbereiche, Mutations- Heißstellen) mit der kleinstmöglichen Anzahl von Amplikonen
3. Positionieren von Primern für eine kurze PCR entsprechend den folgenden Kriterien: a. die gewünschten Target-Sequenzen sollen durch Amplikone zwischen 100 und 600 bp abgedeckt werden;
b. Amplikone sollen optimales Schmelzverhalten haben, d. h. aus einer möglichst niedrig schmelzenden Domäne zusätzlich zu der GC-Klammer, die mit einem der Primer verbunden ist, bestehen;
c. eine optimale Amplikon-Verteilung über das 2-D-Gel;
d. ähnliche Reaktions-Kinetiken.
4. Aufbauen von PCR-Konditionen getrennt für jeden Primersatz mit den langen PCR- Produkten als Templat
5. Entwickeln von Multiplex-Co-Amplifikations-Bedingungen durch Gruppieren von Primer-Sätzen und Einstellen von Reaktions-Komponenten.
Wie in Tabelle 1, Punkt 3. aufgeführt, werden unter Verwendung der Lang-PCR- Fragmente als Templat Primer für eine kurze PCR ausgewählt, um Fragmente zwischen 100 und 600 bp zu erzielen. Das Haupt-Auswählkriterium hier ist notwendigerweise das Schmelzverhalten der Fragmente. In der idealen Situation soll jedes Amplikon nur eine Schmelzdomäne aufweisen, die niedriger (weniger stabil) sein soll als die GC- Klammer, die mit ihr verbunden ist. Die Verbindung einer 30-40 bp GC-Klammer wird dadurch erzielt, daß sie Teil eines der Primer gemacht wird (Sheffield et al. 1989, The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions, Genomics 16, 325-332). Ein optimales Schmelzverhalten wird von jeder Kandidaten-Target-Sequenz durch Verwenden eines Computerprogramms bestimmt (z. B. MELT 87; Lerman und Silverstein, 1987, Computational simulation of DNA melting and its application to denaturing gradient gel electrophoresis, Meth. Enzymol. 155, 482-501). Ein Beispiel eines Amplikon mit optimiertem Schmelzverhalten durch die GC-Klammer ist in Fig. 2 in Verbindung mit Exon 12 für RB gezeigt.
Allgemein wird eine Kollektion von Primern ausgewählt, die eine optimale Verteilung sowohl in Bezug auf Größe als in Bezug auf DGGE-Dimension über dem 2-D-Gel ermöglichen. Aufgrund der hohen Auflösung von 2-D-Gelen (5-10 bp Größen- Differenzen werden leicht aufgelöst) ist dies im allgemeinen nicht zu schwierig. Bei 50 Fragmenten oder weniger ist jedoch eine Punktverteilung kein Thema und Primer können einfach entsprechend ihrem Schmelzverhalten ausgewählt werden.
Fig. 3 zeigt die Kollektion von Amplikonen, die für das RB-Gen ausgewählt werden, zusammen mit den Lang-PCR-Fragmenten, die als Template gedient haben. Zusammen stellen die Kurz-PCR-Fragmente mehr als 90% des RB-Codierbereiches dar.
Die Fig. 4 und 5 zeigen die theoretische und die empirische Punktverteilung für die 24 Exone des RB-Gens, die von den Amplikonen nach Fig. 3 abgedeckt sind.
Obgleich Unterschiede bestehen, am bemerkenswertesten der Spot, der Exon 11 repräsentiert, ist die Schlußfolgerung, daß insgesamt das Schmelzprogramm exakt Spot- Positionen vorhersagt.
Es ist wichtig festzuhalten, daß ohne den ersten Lang-PCR-Schritt das optimale Schmelz-Kriterium üblicherweise mit anderen Primer-Konstruktionskriterien, die der PCR mit der gesamten genomischen DNA als Templat aufgegeben werden, in Konflikt steht. Für das RB-Gen hat sich herausgestellt, daß es tatsächlich unmöglich ist, Konditionen auszuwählen, die sowohl für eine optimale Trennung in DGGE wie auch eine optimale Vorbereitung in PCR geeignet sind. Der Vor-Reinigungsschritt, der durch das lange PCR dargestellt wird, ist offensichtlich unbedingt erforderlich für die Konstruktion eines optimalen Satzes von PCR-Primern in TDGS.
Wenn das Testformat aufgebaut ist, werden die zweistufigen PCR-Amplifikationen in einem Multiplex-Format durchgeführt. Es besteht die Möglichkeit, Multiplex-PCR- Reaktionen auszulegen und durchzuführen, die den Kern vorliegender Erfindung darstellen. Die Notwendigkeit des ersten Lang-PCR-Schrittes für eine erfolgreiche Multiplex-PCR wird durch die in Fig. 6 dargestellten Resultate demonstriert. In Fig. 6 enthalten die sechs Bahnen auf der linken Seite PCR-Produkte, die nach Durchführung einer Multiplex-PCR von Exonen 18-23 (6 Anteile) des RB-Gens erhalten werden, wobei unterschiedliche Beträge der gesamten genomischen DNA als Templat verwendet werden. Es werden praktisch keine Produkte der gewünschten Längen erhalten. Letzteres steht im Gegensatz zu den Bahnen 7-12, in denen die Produkte der gleichen Multiplex-PCR-Reaktion aufgegeben werden, dieses Mal jedoch mit dem Lang-PCR-Produkt als Templat. Das Lang-PCR wurde in verschiedenen Zyklen durchgeführt, und es ist klar, daß nur 5-10 Zyklen benötigt werden, um ein ausreichendes Templat für ein erfolgreiches Multiplex-PCR zu generieren.
Die Bahnen 13-19 enthalten die Multiplex-Kurz-PCR-Produkte, die mit den Lang-PCR- Produkten als Templat erreicht werden, bei unterschiedlichen Mengen an Ausgangsmaterial, d. h. unterschiedlichen Mengen an gesamter genomischer DNA, die in der Lang-PCR-Reaktion verwendet wird. Erstaunlicherweise sind 5 ng Gesamt- Genom-DNA ausreichend, um alle die Produkte zu erhalten. Da klinisches Material manchmal nicht in größeren Mengen zur Verfügung steht (z. B. Brustkrebs-Nadel- Biopsien), ist dies ein wichtiges Resultat, das angibt, daß ein erfolgreicher Test mit sehr geringen Mengen an DNA durchgeführt werden kann.
Schließlich enthalten die Bahnen 20-24 der Fig. 6 die Produkte der fünf Multiplex- PCRs entsprechend den sechs Lang-PCR-Sätzen (Lang-PCR-Gruppen 1 und 6 wurden kombiniert; siehe auch Fig. 3 und die später erörterte Tabelle 2). Weitere Einstellungen von PCR-Bedingungen und/oder Primern sollen möglich machen, daß eine noch kleinere Anzahl von Multiplex-Sätzen für dieses Gen erhalten wird. Es gibt keinen Grund, warum der gesamte RB-Gen-Codierbereich nicht in nur einer einzigen PCR- Reaktion verstärkt werden könnte. Nach der zweiten PCR wird den Fragmenten ermöglicht, eine vollständige Runde einer Denaturierung/Renaturierung durchzuführen, um die Bildung von Heteroduplexen zu erleichtern. In Tabelle 2 ist eine Auflistung der Primer-Paare für TDGS für den Fall von RB dargestellt; die Exon- Zahlen sind in der Tabelle ganz links, mit Lang-PCR-Primer-Codes für sechs Exon- Gruppen (0 bis 24-27) und kurzen PCR-Primern für die individuellen 27 Exone aufgelistet.
Anschließend an die PCR wird die Mischung von Fragmenten einer 2-D-Elektrophorese in einem Denaturier-Gradienten-Gel (Fig. 1) unterzogen. Die Verfügbarkeit eines automatisierten Gerätes vereinfacht diesen Vorgang erheblich. Das hier benutzte Gerät ermöglicht den gleichzeitigen Durchlauf von 10 Gel ohne manuelle Beeinflussung, d. h. Ausschneiden von Bahnen und Aufbringen dieser Bahnen auf ein zweites Gel. Alle Experimente, die eine Optimierung der experimentiellen Konditionen umfassen, wurden unter Verwendung von Handinstrumenten durchgeführt. Nach der 2-D- Elektrophorese werden die Gele zwischen den Glasplatten freigegeben und mit Äthidium-Bromid oder mit einem anderen Färbemittel gefärbt. Tabelle 2 Primer-Paare für TDGS von RB RB: Lang-PCR
Die resultierenden Muster wurden dokumentiert und auf das Auftreten von Mutationen hin (mit dem Auge und durch Bildanalyse) bewertet. Unter den angelegten Bedingungen, d. h. GC-Klammen und Heteroduplexieren, ergeben heterozygose Mutationen vier Spots: die zwei homoduplexen Varianten und die zwei heteroduplexen Varianten (dargestellt in Fig. 7). Letztere sind nicht immer getrennt. Da Mutationen auch in einem homozygosen Zustand auftreten können, kann es erforderlich sein, jede Probe vor der PCR mit einer Kontroll-Probe zu mischen, um sicherzustellen, daß heteroduplexe Moleküle vorhanden sind.
Nachstehend werden Details über die Art und Weise angegeben, in der die Ausführungsformen nach vorliegender Erfindung hergestellt und verwendet werden, um eine exakte und effiziente Herstellung und Prüfung von Gen-Fragmenten beim diagnostischen DNA-Testen zu erzielen. Die Beschreibung, die auf ein Bild- oder Modellgen abzielt, z. B. das Tumor-Suppressor-Gen RB, auf das vorstehend Bezug genommen worden ist, ist nicht so aufgebaut, daß die Erfindung speziell beschränkt wird. Der gleiche Vorgang kann bei anderen Genen verwendet werden, oder aber, um mehr PCR-Fragmente im gleichen Rohr zu kombinieren, und wird als in den Schutzbereich vorliegender Erfindung fallend angesehen.

A. Design des RB Zwei-Schritt-PCR-TDGS-Tests

Sequenz-Wiedergewinnung. Die Sequenz des RB-Gens wird aus einer Datenbank, z. B. Genbank wiedergewonnen. Die Target-Bereiche, z. B. Exone, Splice-Stellen, Regulationsbereiche sind definiert.
Primer-Auswahl für Multiplex-Lang-PCR-Primer-Paare für eine Lang-PCR werden so positioniert, daß sie alle Target-Bereiche durch die kleinstmögliche Anzahl von Fragmenten abdecken können, die noch über eine Lang-PCR verstärkt werden können. Lang-PCR-Primer werden auch für höchste Spezifizierung, optimale Anneal-Temperatur und minimale Selbst-Komplementierung für eine Multiplex-Lang-PCR ausgewählt, wobei eine Primer-Design-Software verwendet wird. Das Design des Lang-PCR- Multiplex ist relativ einfach im Hinblick auf den großen Positionierbereich der Primer.

Primer-Auswahl für Multiplex-Kurz-PCR

Primer-Paare für eine kurze PCR werden auf der Basis folgender Kriterien ausgewählt:
a. die gewünschten Target-Sequenzen sollen durch Amplikone zwischen 100 und 600 bp abgedeckt werden;
b. Amplikone sollen optimales Schmelzverhalten haben, d. h. aus einer sehr niedrig schmelzenden Domäne zusätzlich zu der GC-Klammer, die mit einem der Primer verbunden ist, bestehen;
c. optimale Amplikon-Verteilung über das 2-D-Gel;
d. ähnliche Reaktions-Kinetiken.
Das Kriterium b. oben steht häufig im Gegensatz zu Standard-Primer-Design-Kriterien, wenn es einer gesamten Genom-DNA aufgegeben wird. Vorliegende Erfindung weist nach, daß es für das Design und die Leistung einer TDGS sowohl notwendig als auch ausreichend für eip rasches, exaktes und praktisches Werkzeug zur Mutations- Detektion in dem RB-Gen ist.
Multiplex-Gruppen werden empirisch auf der Basis des Verhaltens der Primer in verschiedenen Multiplex-Reaktionen ausgewählt. Vier RB-Multiplex-Gruppen wurden entsprechend der Lang-PCR erstellt.D. h. daß alle Kurz-PCRs mit einem Lang-PCR- Fragment als Schablone miteinander als eine Multiplex-Gruppe verstärkt wurden. Zwei Lang-PCR-Gruppen wurden als eine Multiplex-Gruppe kombiniert. Alle Kurz-PCR- Fragmente können auch miteinander verstärkt werden, wie vorstehend erläutert. Tabelle 2 listet die Primer-Paare, die für die Lang- und Kurz-PCRs verwendet wurden, Fragment-Größen, Anneal-Temperaturen, Schmelztemperaturen und die fünf unterschiedlichen Multiplex-Gruppen auf.

B. PCR-Reaktionen und Heteroduplexieren

Primer (von Schutz befreit und entsalzt) können aus verschiedenen Quellen erhalten werden. Unsere Primer wurden aus Gibco BRL erhalten. Für eine Langzeitspeicherung sollen Primer z. B. in einer Vorratslösung von 100 uM in ultrareinem Wasser bei -20ºC gehalten werden. Für Kurzzeit-Verwendung werden sie bei -20ºC als eine Lösung von 12,5 uM in ultrareinem Wasser gehalten.
Wir haben unsere PCR-Reaktionen in Thermowell-Rohren (Costar, Cambridge, MA) in einem GeneE-Thermozykler (Techne, Cambridge, UK), der mit einem beheizten Deckel ausgerüstet war, durchgeführt, wobei die Notwendigkeit für einen Ölüberzug auf den Proben beseitigt wurde. Multiplex-Lang-PCR-Reaktionen (6 Fragmente) wurden in einem Volumen von 100 ul mit einer 5-500 ng Genom-DNA als Templat und 0,2 uM eines jeden Primers durchgeführt, wobei ein LA PCR-Bausatz (TaKaRa) verwendet wurde. PCR-Reaktionen werden entsprechend den Hersteller-Instruktionen durchgeführt. Die Bedingungen waren folgende: Zuerst wird ein Zyklus bei 94ºC eine Minute lang und anschließend werden 30 Zyklen bei 98ºC, 20 Sekunden lang/68ºC, 12 Minuten lang mit Schritten pro Zyklus von 10 Sekunden, und schließlich wird ein Zyklus bei 72ºC 12 Minuten lang durchgeführt. Die PCR-Produkte werden bei -20ºC zur weiteren Verwendung gespeichert.
Es werden Kurz-PCR-Reaktionen unter Verwendung des gleichen GeneE- Thermozyklers in einem Volumen von 50 ul mit einem 2 ul Lang-PCR-Produkt, 0,2-0,5 uM eines jeden Primers, 0,25 mM dNTPs, 2,5-4,5 mM MgCl&sub2;, 3 Einheiten Taq-Polymerase (Gibco BRL oder Promega) durchgeführt. Die PCR-Bedingungen sind folgende: Ein Zyklus bei 94ºC von 2 Minuten Dauer, dann 30 Zyklen bei 94ºC von 40 Sekunden Dauer/41ºC von 40 Sekunden Dauer/69ºC von 2 Minuten Dauer (mit einer 2 Sekunden dauernden schrittweisen Erhöhung pro Zyklus), und schließlich ein Zyklus bei 72ºC von 10 Minuten Dauer.
Nach der Kurz-PCR werden Fragmente durch eine komplette Runde einer Denaturierung/Renaturierung heterodupliziert, d. h. bei 98ºC 10 Minuten lang/bei 55ºC 30 Minuten lang/bei 41ºC 30 Minuten lang.
Nach der PCR und der Heteroduplexierung werden die Inhalte der Rohre gemischt und es wird ein Füllpuffer mit 1/10 des Volumens hinzugefügt. Basierend auf einer Äthidium-Bromid-Grundierung ist üblicherweise ausreichend Probenmaterial für mehrere Durchgänge vorhanden. Wenn das gesamte Volumen für die Slotkapazität zu groß ist, muß die Probe (vor dem Hinzufügen von Füllpuffer) mit Ethanol ausgefällt und in einem kleineren Volumen erneut aufgelöst werden.

C. Zweidimensionale Elektrophorese

Geräte sowohl für die manuelle als auch die automatische 2-D-Elektrophorese wurden von der vorerwähnten Firma Ingeny B. V. (Leiden, Niederlande) bezogen. Für die manuelle Elektrophorese wurden die Mischungen von DNA-Fragmenten zuerst einer Trennung nach Größe unter Verwendung eines 0,75 mm dicken 9%igen PAA-Gels bei 45ºC über einen Zeitraum von 5 bis 6 Stunden unterzogen. Das Trennungsschema wurde durch Äthidium-Bromid-Grundieren über eine Dauer von 10 Minuten und UV- Durchleuchten des Gels, das auf eine Glasplatte aufgelegt wird, um die DNA- Fragmente gegen Beschädigung durch das UV-Licht zu schützen, sichtbar gemacht. Der 100 bis 600 bp-Bereich im mittleren Teil der Bahn (die Kanten nicht eingeschlossen) wurde rasch ausgeschnitten und einem 1 mm dicken, 9%igen PAA- Gel aufgegeben, das einen 0-60% (RB) oder 30-90% (p53) Harnstoff/Formamid (UF) Gradienten enthielt. Gradienten wurden unter Verwendung eines einfachen Gradienten-Formers (Gibco BRL) gegossen. Eine Elektrophorese wurde über einen Zeitraum von 7,5-11 Stunden bei 60ºC und 200 V durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit 0,5 ug/ml Äthidium-Bromid 15 bis 20 Minuten lang grundiert und die Grundierung in Wasser während weiterer 15 Minuten aufgehoben. Die Proben wurden bei UV-Beleuchtung unter Verwendung einer Polaroid-Kamera dokumentiert.
Für eine automatische 2-D-Elektrophorese wurden Gele, und zwar jeweils zehn gleichzeitig, in die Gel-Gießvorrichtung eingegossen, die dem automatischen 2-D- Elektrophorese-Gerät beigegeben ist, und zwar unter Berücksichtigung der Herstellerangaben (Ingeny B. V., Leiden, Niederlande). Nach einer Polarisation werden die Gele (zwischen Glasplatten) aus dem Gel-Gießkasten entfernt und mit einem feuchten Tuch gereinigt. Sie werden dann entsprechend den Herstellerangaben in das Gerät eingesetzt, d. h. in zwei die Gele aufnehmenden Kassetten mit seitlichen Abdichtungen mittels Silikon. Das Gerät, das einen auf 45ºC erhitzten Puffer enthält, wird im 1-D-Modus bei abgeschalteter Energie eingesetzt. Nach dem Beigeben eines Füllpuffers werden Proben (bis zu 40 ul) in die V-förmigen Rohre der Gele in das automatische 2-D-Elektrophorese-Gerät eingeführt. Die Gele mit 9% Acrylamid, 0,25% TAE wurden mit einem Gradienten von 0-60% Harnstoff/Formamid verwendet. Die erste Dimension wird mit 180 V vier Stunden lang bei 45ºC betrieben. Die zweite Dimension wurde mit 200 V über einen Zeitraum von 7,5 bis 11 Stunden bei 60ºC betrieben. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Äthidium-Bromid grundiert, und die Muster unter UV-Beleuchtung dokumentiert, wie für die Handgeräte beschrieben.
Während vorliegende Erfindung in Verbindung mit zweistufigen (Lang- und Kurz-) Multiplexpolymerase-Kettenreaktion-Amplifikationen mit anschließender zweidimensionaler elektrophoretischer Trennung beschrieben worden ist, ist dies auch anwendbar auf eindimensionale Elektrophorese oder in Verbindung mit anderen Verfahren zur Mutations-Detektion, die PCR-verstärkte Target-Sequenzen erforderlich machen.

Claims

1. Verfahren zur Analyse vorbestimmter, von DNA abstammender Gen-Exone, das umfaßt: das Zugeben von Primer-Paaren zu aufeinanderfolgenden Gruppen der Gen-Exone, anschließend das Durchführen von Polymerase-Kettenreaktions- Amplifikationen davon in einem gemeinsamen Rohr als ein erster Schritt und lange Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion; das Zugeben weiterer Primer-Paare zu jedem der Gen-Exone und das Durchführen von Polymerase-Kettenreaktions- Amplifikationen davon in dem gemeinsamen Rohr als ein zweiter Schritt und Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion von 100-600 bp; und das elektrophoretische Trennung der Genfragmente.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Gen-Fragmente auf der Basis der Größe entlang einer Dimension elektrophoretisch getrennt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Gen-Fragmente außerdem einer weiteren elektrophoretischen Basenpaar-Sequenz-Trennung entlang einer orthogonalen Dimension und entlang eines Temperatur- oder denaturierenden chemischen Gradienten unterzogen werden, um die Gen-Fragmente entlang der orthogonalen Dimension an speziellen Sequenz-Stollen zu verteilen; und vergleichen solcher Stellen mit denen normaler Gen-Fragmente, um genetische Mutationen nachzuweisen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Primer mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Oligonucleotid-Primer sind.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die in der Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Nucleotid-Bausteine fluoreszenzmarkiert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die elektrophoretische Trennung in einem denaturierenden Gradientengel durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem ein Harnstoff- und Formamidgradient in einem Gel angewendet wird, um die Fragmente zu trennen.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem ein Temperaturgradient in einem Gel angewendet wird, um die Fragmente zu trennen.

9. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem für das Retinoblastom-Gen die Gen-Exon- Gruppen der langen PRC die Exone 1-2, 3-6, 7-11, 12-17, 18-23 und 24-27 sind.

10. Verfahren zur Analyse vorbestimmter, von DNA abstammender Gen-Exons, das umfaßt: das Zugeben von Primer-Paaren zu aufeinanderfolgenden Gruppen der Gen-Exone, anschließend das Durchführen von Polymerase-Kettenreaktions- Amplifikationen davon in einem gemeinsamen Rohr als ein erster Schritt und lange Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion; und das Zugeben weiterer Primer- Paare zu jedem der Gen-Exone und das Durchführen von Polymerase- Kettenreaktions-Amplifikationen davon in dem gemeinsamen Rohr als ein zweiter Schritt und Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion von 100-600 bp.