JPH0491790A - ２段階ｐｃｒ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、２段階ＰＣＲ法（Ｔｗｏ　５ｔｅｐ　Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ−ａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）
に関するものである。きらに詳しくは、第一段階ＰＣＲ
におけるプライマー度が極微量である高感度で特異的な
２段階ＰＣＲ法に関するものである。

［従来の技術］ ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ法）とは、ＤＮＡポリメラーゼがプライマー
を必要とすることを利用した、特定ＤＮＡ断片の増幅法
である。このＰＣＲ法の利点は超極微量のＤＮＡを元に
して必要量のＤＮＡを増幅できることであり、その原理
は、目標塩基配列部に設定した２つのプライマー（オリ
コヌクレオチド）と４つのデオキシリボヌクレオシド　
トリフォスフエイト［ｄＮＩＰ（ｄＡＴＰ、　ｄ（ＪＰ
、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ）］を用い、二本鎖ＤＮＡの
一鎖を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより、２つのプ
ライマーで挾まれた部分の第二鎖が合成きれる、という
ものである、実際の方法は、各至適温度および時間の条
件下で、熱変性によるＤＮＡの一本鎖化（デナチュレー
ション）、プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、
ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖ＤＮＡの合成（エクス
テンション）を１サイクルとして、これを必要回数繰り
返し特定のＤＮＡ断片を増幅する（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ。

Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３
５０−１３５４．１９８５）。

実際３０回はど繰り返すことによって１０万〜１００万
倍にＤＮＡ６片を増幅することができる。

きらに、最近の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの開発により
、ＰＣＲの自動化が可能となり飛躍的に適用範囲が広く
なった（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，に、　ｅｔ　ａｌ、、　５
ｃｉｅ−ｎｃｅ　２３９．４８７−４８９．１９８８　
　Ｃｈｉｅｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＢａｃｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ　１２７．１５５０−１５５７．１９７６
）。微生物学の分野でも例外ではなく、細菌、ウィルス
等の高感度検出法として広く応用きれようとしている。

しかし、現在の一船釣ＰＣＲ法には多くの問題がある。

Ｗ、理的には無限の増幅が可能と考えられるが実際はそ
う簡単ではなく、サイクル数を上げて増幅を図ると、多
くの場合特定ＤＮＡ断片の増幅以外に非特異的なりＮＡ
断片の増幅が認められるようになる。従って、実際的に
行ない得るサイクル数には限りがあり、多くの場合、そ
のサイクル数では簡単に検出可能な十分量のＤＮＡ増幅
は得られない。そのため、ＲＩ等を利用して検出感度を
上げ、それを補うのが一般的である。しかしこの様な方
法は、Ｒ１を利用するため特殊な設備で煩雑な操作を必
要とする。その上、結果を得るのに２日から３日以上か
かるという欠点もある。

最近、上記の様な問題点を克服する試みが既に報告きれ
ている。特に極微量の鋳型ＤＮＡを用いるＰＣＲ法とし
て、繰り込みプライマーＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ−ｐｒｉ
ｍｅｒ　ＰＣＲ＞が考案せれており（ＭｕｌｌｉｓＫ、
Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、　１５５．３３５−３５０．１９８７）、コレをＢ型
肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡやヒト免疫不全ウィルス
（ＨＩＶ）ＤＮＡの検出に応用したＰＣＲ−ＰＣＲ法が
ある（Ｋａｎｅｋｏ、　Ｓｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ
１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２７．　ｌ９３０
−１９３３゜１９８９　、　Ｓｘｍｍｏｎｄｓ、　Ｐ、
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６４．８
６４−８７２．１９９（３）。この原理は、２度ＰＣＲ
を行なうことにあるが、最初のＰＣＲと二度目のＰＣＲ
に用いるプライマーセットに鍵がある。すなわち、二度
目のプライマーセットは、目標ＤＮＡの位置関係上、−
度目のプライマーセットの各々の内側近傍に位置してい
る（第１区参照）。従って、第一段階ＰＣＲでの増幅Ｄ
ＮＡを第二段階ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして増幅すること
になる。

これにより、上記の問題点はほぼ解決された。簡易な検
出手段でも検出できるに十分な増幅度が確保でき、きら
に理論的に以前の方法より高い特異性も得られる。

［発明が解決しようとする課題〕 このように、ＰＣＲ法は、より簡潔な方法で、より高い
特異性が得られるように、日々改良いれてきた。ところ
が本発明者等が研究を行なった結果、上記の様な単純に
ＰＣＲを二度行なう方法は完成されたものではないとい
うことが分がった。

すなわち、通常検体中の目標ＤＮＡの量は不明であるが
、検体間で目標ＤＮＡの量（コピー数）に極微量から多
量までの大きな開きのある場合、第一段階ＰＣＲと第二
段階ＰＣＲの検出条件が同じであるこの方法では特異性
に問題があった。

そこで本発明者等は、以上のような問題点を克服するた
め、より特異的で、簡易に、高感度に、＆微量のＤＮＡ
を検出できるＰＣＲ法の研究開発を行なった。すなわち
本発明の目的は、今まで不可能であった極微量のＤＮＡ
の検出を、簡易に、短時間に、安全に、経済的に行なう
ことができ、さらに従来の技術以上の特異性をもったＰ
ＣＲ法を提供することにある。

１１題を解決するための手段］ 本発明者等は、上記の目的を達成すへく種々の研究を重
ねた結果、第一段階ＰＣＲでのプライマー濃度を通常使
用きれている濃度より低くすることにより可能になるこ
とを見出し、妨らに研究を重ねて本発明を完成するに至
った。

すなわち、本発明は、 （υ　２度ＰＣＲを行なうＰＣＲ法において、第一段階
ＰＣＲにおけるプライマー濃度が０．００５〜０、０２
５μＭである２段階ＰＣＲ法に関し、■　第一段階ＰＣ
Ｒのプライマー濃度が００１〜００２５μＭである２段
階ＰＣＲ法に関し、■）鋳型ＤＮＡがＨＴＬＶ−１ｔ７
）ＤＮＡ−ｒある場合、第一段階ＰＣＲのプライマー濃
度が０００５〜０．０２５μＭであり、ざらに好ましく
は０．０２５μＭである２段階ＰＣＲ法に関し、 （４）鋳型ＤＮＡがＨＴＬＶ−２のＤＮＡである場合、
第一段階ＰＣＲのプライマー濃度が０．００５〜００２
５μＭであり、さらに好ましくは００１μＭである２ｐ
ｊ階ＰＣＲ法に関し、 （５）ｉ型ＤＮＡがＨＩＶ−１のＤＮＡである場合、第
一段階ＰＣＲのプライマー濃度が０．００５〜００２５
μＭであり、芒らに好ましくは０．０１〜０．０２５μ
Ｍである２段階ＰＣＲ法に関し、 （６）　　該ＰＣＲ法が繰り込みプライマーＰＣＲ法で
ある２段階ＰＣＲ法に関するものである。

本発明における第一段階ＰＣＲのプライマー濃度は、一
般的な１μＭより４０〜１００分の１低い濃度であり、
前記の目的を達するに必要かつ十分な量である。それ以
外の濃度ではゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド
染色で検出する際に、非特異的ハンドが現れたり、逆に
肉眼での検出が不可能になる。第一段階ＰＣＲのプライ
マー濃度は、鋳型ＤＮＡの種類に応し、また実験製電の
精度に応じて上記の範囲内において、その時々に実際に
対処して決定するのが望ましい。

本発明で使用した鋳型ＤＮＡは、ＨＴＬＶ−１感染細胞
株ＤＮＡ（１００ｎ　ｇ／１１１　　）　、　ＨＴＬＶ
　−２りＯ−ンブラスミドＤＮＡ（１，２ｘｌ　Ｏ＆コ
ピー／ｐｇ／μＩ　　）、Ｈｌｖ−１感染細胞株ＤＮＡ
（１００ｎｇ／μｌ　　）の３種類であり、以上３種が
すべて陰性の対照細胞株のＤＮＡで１０−１〜１ｏ−７
−１倍希釈して用いる。ただし、これ以外にもエプスタ
イン・バーウィルス（ＥＢ）、ヒトパピローマウィルス
（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）などあらゆる
ウィルスのＤＮＡに応用可能である。

プライマーとしては１５〜４０ｎｅ　ｔ、好ましくは約
３０ｎｅ　ｒのオリゴヌクレオチドを、各鋳型ＤＮＡに
対しそねぞれ４組（ｐｉ、　ｐ２．　ｐ３．　ｐ４−第
１図参照）を自動合成機で合成する。このプライマーは
、第一段階ＰＣＲではｐｌ、　ｐ４を用い、第二段階Ｐ
ＣＲではｐ２．　ｐ３を用いる。ただし、ｐｌとｐ２　
、　ｐ３とｐ４が同しでもかまわない。

ＰＣＲの条件は、第一段ＮＰＣＲの場合、デナテユレー
ション工程は９２〜９６℃で０５〜２分、好ましくは９
４℃で１分、アニーリング工程が５０〜７２°Ｃで０５
〜２分、好ましくは６０〜６３℃で１分、エクステンシ
ョン工程が７０〜７４°Ｃで１〜３分、好ましくは７２
℃で２分の条件であり、これらの工程を１サイクルとし
て２０〜３０サイクル、好ましくは２５サイクル行なう
。

第二段階ＰＣＲの場合は、プライマー濃度は通常の量、
例えは０．５〜１ｔ１Ｍを用い、テナチュレーンヨン工
程が９２〜９６℃で０５〜２分、好ましくは９４℃で０
，５〜１分、アニ−ＩＪ　ン’ｊ工程が５０〜７２℃で
０５〜２分、好ましくは６５〜６８℃で１分、エクステ
ンション工程が７２〜７４℃で１〜３分、好ましくは７
２℃で１５〜２分の条件であり、２５〜３５サイクル、
好ましくは３０サイクル行なう。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは第一段階、第二段階共にア
ッセイ当り２〜３単位、好ましくは２゜５ｊＩＬ位用い
る。

増幅きれたＤＮＡ断片の検出方法としては、アガロース
とヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ：商品名、宝酒造）の混合
ゲルで分子量マーカーと共に電気泳動を行ない、エテ〉
ラムブロマイド染色し、紫外線照射により検出する。

［発明の作用・効果コ 本発明の２段ｊｉｉＰｃＲ法は、従来のＰＣＲ法にはな
い高特異性と高精度をもっており、目的とするＤＮＡが
１分子以上あれは肉眼検出が可能となる。さらに従来の
ようにプロッティング、ハイブノダイゼーンヨン、ＲＩ
およびビオチン等の標識を必要とせず、簡単に、短時間
に、安全かつ経済的に検出することができる。

よって、ＨＴＬＶ−１やＨＩＶを始めとするあらゆるウ
ィルスＤＮＡ診断、またその他の微生物ＤＮＡの診断に
応用可能であり、さらに一般的な遺伝学や法医学で利用
諮れている遺伝子診断等のＰＣＲ法で応用されている全
ての方法に広汎に利用可能で有用である。特にフビー数
の少ない検体や多い検体が混ざっている検体の鋳型ＤＮ
Ａを対象とするＰＣＲ検査に威力を発揮する。

このように、本発明の２段階ＰＣＲ法は公知のＰＣＲ法
にはない顕著な有用性を示すものである。

［実施例コ 以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例により何等限定きれるものではない。

実施例−１（鋳型ＤＮＡの調製） 次の各種ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとした。ただし、（ｄ）は
ＤＮＡ濃度を一定にするための希釈液として用いた。

（ａ）ＨＴＬＶ−１感染細胞（ＴＬ−３Ｕ、（Ｓｕ−ｇ
ａｍｕｒａ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉａｔ、　Ｊ、
　Ｃａｎｃｅｒ　３４．２２１−２２８、１９８４＞）
の高分子ＤＮＡ：１１００ｎ／μｍ（ｂ）ＨＴＬＶ−２
クローンプラスミドＤＮＡ（ｐＨ６−８３，５＞　（Ｓ
ｈｉｍｏｔｏｈｎｏ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ−１、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８
２．３１０１−３１０５．１９８５）　：　１２Ｘ１０
’コピ一／ｐｇ／μｍ （ｃ）ＨＩＶ−１感染細胞（ＨＴＬＶ−１１［ｂ感染モ
ルト４細胞、　（Ｍａｔｓｕｙａｍａ、　Ｔ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒ−ｏｌｏｇｙ　６３．２５０４
−２５０９．１９８９））の高分子ＤＮＡ：１１００ｎ
／μ　１ （ｄ）ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩ　Ｖ−１全て
陰性の対照細胞株（ヒト神経膠芽細胞腫細胞株；　Ａ　
１７２　＋　（Ｉｇａｒａｓｈｉ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、
　、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｌ、　７９−８５．１９８７）
）の高分子ＤＮＡ：１００ｎＨ／μｍ 実施例−２（プライマーの作製） プライマーとして約３０　ｍ　ｅ　ｒのオリコツクレオ
チド４組（ｐｉ、　ｐ２．　ｐ３．　ｐ４）を各々自動
合成機（Ｃｙｃｌｏｎｅ、　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社〉で
合成した。以下に、各々の鋳型ＤＮＡに対する各々のプ
ライマーセントの塩基配列、その位置（ｎｔ）および長
さを示した。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１＜５ｅｉｋｉ、　　Ｍ、　　ｅｔ　
ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　ＮａｔｌＡｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ　８０．　３６１８−３６２２．　１
９８３）　；ｐＩＸｌ　　：　５’ＣＣＣＡＣＴＴＣＣ
ＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣ３ｎｔ；
　７３２４−７３５３．　３０ｍｅｒｐｌＸ２　　：　
５’ＣＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧｒＧｒｒＴＧ
ＧＡＧＡＣＴＧＴ３ｎｔ；　　７３５８−７３８８．　
　３１ｍａｒｐＩＸ３　　：　５’ＧＡＧＣＣＧＡＴＡ
ＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＣＣ３ａｔ；
　　７４８７−７５１６．　　３０ｒｎｅｔｐＩＸ４：
５°ＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡ
ＴＡＡＧＧＡＡ　３ｎｔ；　　７５２７−７５５６．　
　３０ｍａｒＨＴ　Ｌ　Ｖ　−２（Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎ
ｏ、に、ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ−ａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　８２．　３１０１−
３１０５．　１９８５＞ｐＩＩＥｌ　：　５’ＣＡＣＡ
ＣＡＩＴＴＴＣＣＡＣＴＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣ
Ｇ３ｎｔｉ　　５２１５−５２４４．　　３０ｍａｒｐ
ＩＩＥ２　：　５’ＣＴＣＡＣＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴ
ＣＣＴＣＣＴＡＣＣＡＣＴＣＣ３ｎｔ：　５２５２−５
２８１．　　３０ｍａｒｐＩＩＥ３　：　５’１ＴＡＧ
ＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＧＴＣ
Ｃ３ｎｔ；　　５３４４−５３７３．　　３０ｍａｒｐ
ＩＩＥ４　：　５’ＧＡＡＧＧＣＧＡＧＩＡＧＴＡＣＣ
ＣｆｆＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧ３ｎｔ；　　５４４６
−５４７５．　　３０ｍａｒＨＩ　Ｖ　−１（Ｒａｔｎ
ｅｒ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３，２７
７−２８４．１９８５）： ｐＨｌＸ１　：　５゛ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＣ
ＡＧＡＡＩＡＧＧＣＧＴＴＡＣＩ３ｎｔ；　　５７８１
−５８１０．　　３０ｍａｒｐＨＩＸ２　：　５　’Ａ
ＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡ
ＧＣＣＣ３ｎｔ；　　５８３０−５８５９．　　３０ｍ
ａｒｐＨＩＸ３　：　５’ＣＧＣＴＩＣＴＴＣＣＴＧＣ
ＣＡＩＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＩＡＡＧ３ｎｔ；　　５９
５５−５９８４．　　３０ｍａｒｐＨＩＸ４　：　　５
’ＡＧＧＡＧＧ丁ＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ
ＣＴＩＣＴＴ３ｎｔ；　　５９７７−６００６．　　３
０ｍａｒ実施例−３（２段階ＰＣＲ法） ＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ　Ｅ
ＬＭＥＲＣＥＴＬＩＳ　；宝酒造〉を用い、反応にはＰ
ＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲＣＥＩＵＳヂＮＡ　Ｔｈｅｒｍ
ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを使用して行なった。検体としては
、実施例−１の鋳型Ｄ　ＮＡ（ａ）　、　（ｂ）　、　
（ｃ）を各々（ｄ）で１０倍段階希釈（１０−’〜１０
−’−’）して用いた。これにより、目標とするＤＮＡ
の高コピー数（１０′コピー）から　低コピー数（１コ
ピー以下）を段階的に保有するモデル検体が作られる。

また、（ｄ）を陰性対照検体とした。

実施例−２で作製した各々のプライマーセｙｈ（表１）
は、第１図に示したようにｐｉ、　ｐａの対でＡが、ｐ
２．　ｐ３の対でＢのサイズのＤＮＡが増幅される。ｐ
１〜ｐ４のプライマーのうちｐＬ　Ｘ）２はセンスｐ３
．　ｐ４はアンチセンスである。

表１ を１．０〜０．０００１μＭ、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを２．５車位／アッセイ、以上を混和し全液量を１０
０μｌ　とした。各々の鋳型ＤＮＡ毎のデナチュレーシ
ョン工程、アニーリング工程、エクステン／コン工程お
よび全サイクル数は表２に示した通りである。これらの
条件は、それぞれ種々検討して設定した。

表２ （１）第一段階ＰＣＲ 各段階希釈の鋳型ＤＮＡを５．ｚｌ（０，５量ｇＤＮＡ
相当）、１０倍反応緩衝液［５００ｍＭＫＣｌ　、　１
００　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３＞　、　
１５　ｍＭＭｇＣＩ、　、　０　、１％（ｗ／Ｖ）ゼラ
チンコを１０μｌ、ｄ−ＮＴＰｓミックス［１、２５ｍ
Ｍ　ｄＮＴＰ（ｄＡ’ｒＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、
　ｄＴＴＰ）コを１６μｌ、各プライマー（ｐｌ、　ｐ
４）（り第二段階ＰＣＲ 鋳型ＤＮＡとして、第一段階ＰＣＲで生成された各産物
を各々１０μｌ、第一段階で使用したものと同様の１０
倍反応緩衝液を１０μ１．ｄＮＩＰＳミ／クス［１、２
５ｍＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＧＩＰ
、　ｄＴＩＦ）コを１６μ！、各プライマー（ｐ２．　
ｐ３）を１０量Ｍ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを２．５
車位／アッセイ、以上を混和し全液量を１００μｌとし
た。各々の鋳型ＤＮＡ毎のデナチュレーション工程、ア
ニーリング工程、エクステンション工程、および全サイ
クル数は表３に示した。これらの条件は各々、種々検討
して設定した。

表３ ＮＡ分子量マーカーとともに電気泳動を行ない、エチジ
ウムブロマイド染色像を紫外線照射により得て、ポラロ
イド写真撮影を行なった後、検出判定した。表４に各々
の鋳型ＤＮＡに対する理論上の標的サイズ（第二段階Ｐ
ＣＲ産物）を示した。

表４ （３）ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色に
よる、増幅きれた遺伝子断片の検出第二段階ＰＣＲで生
成された各産物の１０分の１量、１０μｌを２．０％ヌ
シーブ（商品名。

宝酒造社）と１０％アガロースの混合ゲルでＤ（荀結果 〉　第一段階ＰＣＲ時のプライマー濃度を１．０．０．
１．０．０１．０．００１．０．０００１μＭの５段階
用い、鋳型ＤＮＡとしてＨＴＬＶ−１のＤＮＡを用いて
２段階ＰＣＲを行なった結果を以下に示す。

この結果、検出感度と特異性を十分満足するプライマー
濃度は０．０１μＭであることが示された。

ｉ）　）〉の結果から、第一段階ＰＣＲ時ブラプライマ
ー濃度００１μＭがよいことが分かったので、この００
１μＭを中心にしてきらに詳しく０，０５、０．０２５
．０．０１．０．００５μＭの４点について検豹を加え
た結果を下記に示す。なお、応用範囲の拡大の可能性を
確認するため、実施例−１で示した３種類の鋳型Ｄ　Ｎ
　Ａ　（ａ）、　（ｂ）、　（ｃ）を用いて行なった。

以上の結果より ■ＨＴＬＶ−１の場合；検出感度および特異性を十分満
足するプライマー濃度は０．００５〜０．０２５μＭで
、その内最適プライマー濃度は０．０２５μＭであり、
１０１希釈まで特異的に検出可能であることが分かった
。ここで用いたＴＬ−５ｕ細胞は、細胞あたり１０から
２０コピーのＨＴ　Ｌ　Ｖ−１ゲノムを保有しているこ
と、また、ヒト細胞１０６個のＤＮＡ量は約１μｇに相
当することから１０−７希釈の５μ！（０５μｇ）中に
はＴＬ−５ｕ細胞が１０−１個、ＨＴＬＶ−１ゲノムで
はおおよそ０．１から０．２コピーあると計算きれる。

同し鋳型ＤＮＡを用いた繰り返し実験結果では、１０−
″希釈まで検出きれることが多かったのでこれを採用す
るとＨＴＬＶ−１ゲノムの１から２コピ一以上が検出可
能であると言える。

■ＨＴＬＶ−２の場合；検出感度および特異性を十分満
足するプライマー濃度は０００５〜００２５μＭで、そ
の内最適プライマー濃度は００１μＭであり、１０−７
希釈まで特異的に検出可能であることが分かった。ここ
で用いたＨＴＬＶ−２りＤ　−ンブラスミドＤＮＡは１
．２Ｘ１０−’コピー／ｐｇ／μｍ　に相当するＨＴＬ
Ｖ−２ゲノムを保有していることから、１０−７希釈の
５μｌ　中にはＨＴＬＶ−２ゲノムはおおよそ０．６０
ビーある七計算きれる。同じ鋳型ＤＮＡを用いた繰り返
し実験結果では、１０−’希釈までしか検出きれないこ
ともあったので、ＨＴＬＶ−２ゲノムの０６〜６コピ一
以上が検出可能であると言える。

■ＨＩ　Ｖ−１の場合；検出感度および特異性を十分満
足するプライマー濃度はｏ、　ｏｏｓ〜００２５μＭで
、その内最適プライマー濃度は０．０１〜０．０２５μ
Ｍであり、１０−′希釈まで特異的に検出可能であるこ
とが分かった。ここで用いたＨＩＶ−１感染細胞は細胞
あたりの明確なＨｒ　Ｖ−１ゲノムの数は不明でおるが
、ヒト細胞１０６個のＤＮＡ量は約１μｇに相当するこ
とから、１０−′希釈の５μＩ　（０，５μｇ）中には
ＨＩ　Ｖ−１感染細胞が０５個と計算され、従って、こ
の場合の検出限界は感染細胞０．５個と言える。

以上の結果を総合すると、本発明の２段階ＰＣＲ法にお
ける第一段階ＰＣＲでのプライマー濃度はｏ、　ｏｏｓ
〜０．０２５μＭの範囲が良いと思われ、さらに好まし
くは、０．０１〜００２５μＭの範囲が最適であると思
われる。しかし、検体の鋳型ＤＮＡコピー数が極端に少
ない（１〜１０コピー）と予想きれる場合は、０．０２
５μＭの方が無難と考える。実験に際しては、この濃度
の範囲内で、実験精度等に応じて実際的に対処して決定
するのが良い。

きらに、現実的にはｊＪＸ数点以下のコピー数は有り得
ないこと、実験上の最高検出限界の振れ（上記■や■で
、実験により１０−７でバンドが出たり出なかったりし
たこと）は希釈誤差およびサンブノング誤差によるもの
と解釈きれることにより、この２段階ＰＣＲ法は１コピ
ーの鋳型ＤＮＡを検出するのに十分可能な！ｆ！、度を
有していると結論することができる。また、特異性に関
しても、鋳型ＤＮＡのコピー数が１０６から１までの検
体で非特異的ハンドは検出されず、実用上十分に満足で
きることが示きれた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の２段階ＰＣＲにおけるプライマーの相
対的配置を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）２度ＰＣＲを行なうＰＣＲ法において、第一段階
   ＰＣＲにおけるプライマー濃度が０．００５〜０．０２
   ５μＭである２段階ＰＣＲ法。
2. （２）第一段階ＰＣＲのプライマー濃度が０．０１〜０
   ．０２５μＭである請求項（１）記載の２段階ＰＣＲ法
   。
3. （３）鋳型ＤＮＡがＨＴＬＶ−１のＤＮＡ、ＨＴＬＶ−
   ２のＤＮＡ、またはＨＩＶ−１のＤＮＡである請求項（
   １）または２記載の２段階ＰＣＲ法。
4. （４）該ＰＣＲ法が繰り込みプライマーＰＣＲ法である
   請求項（１）〜（３）のいずれかに記載の２段階ＰＣＲ
   法。